分析樣品中非復合形式的前列腺特異抗原以改進前列腺癌檢測的方法

專利名稱：分析樣品中非復合形式的前列腺特異抗原以改進前列腺癌檢測的方法
相關發明本申請是2002年5月24日提交的U.S.申請No.10/154,715，1999年4月30日提交的U.S.申請No.09/303,208，以及1999年4月30日提交的U.S.申請No.09/303,339的部分繼續申請，所述申請的內容在此以其全文引作參考。
發明
背景技術：
領域總的來說，本發明涉及檢測和鑒定作為診斷標記、具有潛在用途的蛋白，以及蛋白的各種形式和亞基。具體而言，本發明涉及檢測或確定前列腺特異抗原在人的生物流體中的失活形式，以及涉及提高檢測前列腺癌的方法。
現有技術描述血清前列腺特異抗原(PSA)的測量廣泛用于篩選和早期診斷前列腺癌[1-3]。通過當今臨床免疫分析可測量的血清PSA主要以游離“非復合的”形式(游離PSA)存在或以與α-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)的復合物形式存在[1-5]。血清中游離PSA與總PSA的比例已顯示可顯著提高PCa與BPH的辨別，以更高的比例相關于較低風險的前列腺癌[1-7]。
游離PSA水平在血清中變化的生物學機理是未知的。已經變成復合的血清PSA可能是相對均一的，因為它代表了酶活性的完整的PSA。從PAS-ACT復合物釋放的PSA在前列腺癌(PCa)和良性前列腺增生(BPH)血清中發現與精漿PSA是不可區分的，正確認了這種假設[8]。由此得出結論，游離PSA可提供更好的生化指標(insight)，以及表征游離PSA的分子形式可幫助闡明其前列腺起源和釋放到血清中的機理。
含有失活形式的PSA的各種PSA的混合物已經從前列腺組織和精漿中分離出來。BPH組織的PSA已經以更普遍的方式被表征為內部更高度截短的形式[9]，盡管沒有單個或多個形式的PSA分離自本發明所研究的截短和未截短的PSA形式的混合物。精漿中的PSA通過色譜法已經被分離成組分，顯示含有截短和非截短的PSA的各種混合物[10]。然而，在這些研究中沒有一個研究表明，抗體被開發為任何單個形式的失活PSA，或者這些PSA形式在血清中得到證實。
在血清中，現在已知游離(未復合的)PSA包含至少兩種特異形式的失活PSA。一種形式已被鑒定成酶原，或PSA的前體形式(pPSA)，包括與癌癥更相關的pPSA的截短形式[11-13]。第二特異形式的PSA稱為BPSA，其是內部切割或降解形式的PSA，與BPH更高度相關[14；15]。BPSA被分離并且廣泛表征為同源物種的PSA。有關BPSA和pPSA的詳細綜述最近已經公布[16]。
另一描述和測量血清中游離形式的PSA的亞群的方法也已由Nurmikko[17]報道。在此情況下，完整PSA(PSA-I)定義為在Lys145位點處未被截短的游離PSA。該試驗識別在Lys145位點處不被內部截短的游離PSA形式，Lys145位點是PSA在精漿中降解的最常見的形式。通過該方法測量的PSA的性質還未完全明確，除了在Lys145位點處不被截短之外。照此，該試驗測量的是pPSA形式與其他未表征的失活形式的PSA的混合物，所述失活形式的PSA在Lys145位點處不被截短。
由于血清中存在的PSA在臨床上有用濃度低于10ng/ml，因此必須開發免疫測定或其他非常靈敏的方法才能測量PSA。利用當前市售的游離PSA免疫測定方法測量的所有形式的游離PSA，總和水平通常低于2ng/ml。pPSA，BPSA和PSA-I的抗體和免疫測定保持僅有的被報道的研究免疫測定，用于測量血清中亞形式的游離PSA。所以，仍需要開發測量不同形式的游離PSA的新方法，以及進一步研究其與不同前列腺病狀態的聯系。
發明概述本發明的一個方面提供幫助區分個體中前列腺癌與良性疾病的方法。所述方法包括下列步驟a)確定個體生物樣品中所含的總PSA的量，b)確定同一樣品中游離PSA的量，并且計算游離PSA與總PSA的比例，c)確定同一樣品中inPSA的量，以及d)基于總PSA的水平以及游離PSA與總PSA的比例，通過將inPSA的量與用已知癌癥和良性疾病診斷的對照樣品所建立的預定值進行比較，使樣品中所含的inPSA的量與個體中前列腺癌的存在相關。
優選地，免疫測定用于確定不同形式的PSA。根據本發明的一個實施方案，通過利用特異于pPSA和BPSA的封閉抗體來封閉樣品中所含的pPSA和BPSA，然后以確定inPSA量的方式測量同一樣品中所含的游離PSA的量，從而可以確定inPSA的量。此外，在不同的實施方案中，所述方法進一步包括確定BPSA和pPSA的量的步驟。從游離PSA的量中減去BPSA和pPSA的量，可以確定inPSA的量。
根據本發明的實施方案，相關步驟可以同是使單獨inPSA的量，或者使inPSA與總PSA，游離PSA，BPSA和pPSA進行數學組合后的量同預先確定的值相關的步驟。數學組合可以為加，減，除或其組合。
根據本發明的實施方案，總PSA可以在低于20ng/ml的任意水平，或更優選低于10ng/ml，或最優選處于2.5-10ng/ml的范圍內。游離PSA與總PSA的比例可以是通常在患者血清中發現的游離PSA的任意范圍1-50％，盡管在本發明的一個實施方案中，優選的范圍大于20％，而最優選大于25％。pPSA可以是[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5，-7]pPSA或這三種形式的天然和截短的pPSA的總和，以pPSA表示。樣品可以是任何生理流體，盡管血清或血漿是優選的。
附圖描述

圖1示出了pPSA，BPδA和inPSA在癌癥血清中的常見比例。
圖2示出了接受者操作特征(ROC)分析覆蓋圖，其中比較了患有癌癥或BPH以及總血清PSA為4-10ng/ml的男人中游離PSA(F)，總PSA(T)，inPSA(i)，pPSA(P)和BPSA(B)。
圖3示出了患有癌癥或BPH以及總血清PSA為4-10ng/ml的男人中游離PSA/總PSA，inPSA/總PSA以及BPSA/總PSA的ROC分析。
圖4示出了患有癌癥或BPH以及總血清PSA為4-10ng/ml的男人中inPSA/游離PSA和pPSA/游離PSA的ROC分析。
圖5示出了患有癌癥或BPH以及總血清PSA為4-10ng/ml的男人中inPSA，inPSA/pPSA以及游離PSA的ROC分析。
圖6示出了患有癌癥或BPH以及總血清PSA為4-10ng/ml的男人中pPSA+inPSA，pPSA+BPSA以及BPSA+inPSA的ROC分析。
圖7示出了患有癌癥或BPH以及總血清PSA為4-10ng/ml的男人中pPSA減BPSA，inPSA減BPSA以及inPSA減pPSA的ROC分析。
圖8示出了患有癌癥或BPH以及總血清PSA為4-10ng/ml的男人中inPSA減pPSA，(inPSA減pPSA)/總PSA，以及(inPSA減pPSA)/游離PSA的ROC分析。
圖9示出了患有癌癥或BPH，總血清PSA為4-10ng/ml以及游離PAS大于25％的男人中inPSA/pPSA，以及inPSA/[-2]pPSA的ROC分析。
圖10示出了患有癌癥或BPH以及總血清PSA為2.5-4ng/ml的男人中inPSA/pPSA，inPSA減pPSA以及游離PSA/總PSA的ROC分析。
圖11示出了患有癌癥或BPH以及總血清PSA為2.5-4ng/ml的男人中游離PSA以及inPSA/[-2]pPSA的ROC分析。
圖12示出了患有癌癥或BPH以及總血清PSA為2.5-10ng/ml的男人中游離PSA/總PSA以及inPSA/pPSA的ROC分析。
圖13示出了患有癌癥或BPH以及總血清PSA為2.5-10ng/ml的男人中游離PSA/總PSA以及inPSA減pPSA的ROC分析。
圖14示出了所有形式的失活精漿PSA的陽離子交換色譜圖。
圖15示出了還原條件下的SDS-PAGE凝膠，其中泳道1為含有所有形式的失活精漿PSA的原始出發材料，以及泳道2為圖14所示的inPSA的純化峰，含有純化的完整的非天然的PSA。
圖16示出了成熟PSA的全長氨基酸序列。
發明詳述定義如上所述，血清前列腺特異抗原(PSA)有不同形式。對于本發明而言，術語“總PSA”是指所有可檢測形式的PSA，包括游離PSA和復合有ACT的PSA。如本發明所用的術語“游離PSA”是指在溶液中不與其他任何蛋白復合，分子量卻有約30kDa的PSA。
一種形式的游離PSA為pPSA或proPSA。如本發明所用的pPSA和proPSA是指前體形式的PSA。全長前體形式的PSA包括7個氨基酸的前肽，APLILSR，其位于237個氨基酸的成熟PSA蛋白的前面。proPSA的全長氨基酸序列在本領域是公知的，并且被充分描述在參考文獻[18]中，相關內容在此以其全文引作參考。對本發明而言，前肽序列的最后一個氨基酸“R”計成[-1]氨基酸。例如，[-7]proPSA為其末端起始于前肽-7aa處的proPSA。它含有全長proPSA。[-5]proPSA表示proPSA的末端起始于前肽的-5aa處，并且含有proPSA的前肽序列的最后5個氨基酸序列，依此類推。對于本發明而言，本發明的proPSA既包括全長形式的proPSA又包括其末端起始于proPSA前肽的任意氨基酸處的截短形式的proPSA。本發明proPSA的例子包括但不限于[-1]pPSA，[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5]pPSA以及[-7]pPSA。對本發明而言，不帶任何前綴的術語“pPSA”總是表示[-2]pPSA，[-4]pPSA和[-5，-7]pPSA的總和。如本發明所用的[-5，-7]pPSA是指[-5]與[-7]的總和，這是因為在某些情況下，識別[-5]形式的抗體也能識別[-7]形式。
proPSA無活性，即其缺乏胰凝乳蛋白酶樣酶活性，因而以游離PSA的形式而非以PSA抗胰凝乳蛋白酶復合物的形式存在于血清中。本發明的proPSA可采用本領域公知的方法制備，所述方法諸如蛋白純化技術，重組蛋白技術以及蛋白合成技術，但不限于此。制備和檢測本發明的proPSA的細節公開在下列在審U.S.專利申請中于1997年4月30日提交的發明名稱為“前列腺特異抗原的形式及其檢測方法”的No.08/846,408，以及于2002年5月24日提交的發明名稱為“分析血清中前列腺特異抗原的酶原形式以提高前列腺癌檢測的方法”的No.08/846,408，相關內容在此以其全文引作參考。
另一形式的游離PSA是BPSA。如本發明所用的術語“BPSA”是指在成熟PSA的氨基酸序列的Lys182處含有至少一個截斷(clip)的PSA形式。成熟形式的PSA具有237個氨基酸殘基，其分子量為28,400道爾頓[19]，氨基酸序列充分描述在參考文獻中[20]。成熟形式的PSA的序列示于圖16中。本發明的BPSA在成熟PSA的氨基酸序列的Lys182處含有至少一個截斷。換言之，本發明的BPSA與成熟形式的PSA具有相同的氨基酸序列，除了本發明的PSA的多肽鏈在殘基182和183之間已被水解之外。本發明BPSA還可在成熟PSA的氨基酸序列的Ilel，Lys145和Lys146處另有一個或多個截斷。在本發明的一個實施方案中，本發明的BPSA由Lys145和Lys182處的兩個截斷組成。
BPSA無活性，即其缺乏胰凝乳蛋白酶樣酶活性，并因此以游離PSA形式而非以PSA抗胰凝乳蛋白酶復合物的形式存在于血清中。BPSA的詳細描述以及制備和檢測BPSA的方法公開在1999年4月30日提交的發明名稱為“特異于良性前列腺增生(BPH)的新型前列腺特異抗原(PSA)及其應用方法”的在審U.S.專利申請No.09/303,208中，相關內容在此以其全文引作參考。
如本發明所用的術語“inPSA”包括除了pPSA和BPSA之外所有形式的游離PSA。inPSA為酶法失活游離PSA的形式。它表示完整的分子量約30kDa的非天然形式的PSA。在天然條件下由于內部二硫鍵內部截短的PSA保持完整，這是指在諸如含有2-巰基乙醇的SDS-聚丙烯酰胺電泳的還原變性條件下，仍保留分子量約30kDa，并且不形成肽片段的PSA。由于折疊錯誤，內部二硫鍵的畸形，側基酰化，或影響其二級或三級結構的其他因素所導致的結構或構型差異，這種形式的PSA可包括酶法失活的PSA。通過如本發明所述的公知免疫測定，本發明的inPSA可不包括任何可檢測水平的pPSA或BPSA形式，但可包括低水平(＜10％)的具有除Lys182位點之外的內肽鍵切割的PSA，并且可包括任意百分比的PSA，其N-端或C-端去除的氨基酸不超過20個。因此，本發明的inPSA基本上含有完整的非天然PSA，但不包括BPSA和pPSA。所以，對于本發明而言，inPSA等于游離PSA減BPSA和pPSA。
不帶任何前綴的術語“pPSA”總是表示[-2]pPSA，[-4]pPSA和[-5，-7]pPSA的總和，其中“pPSA”在數學等式中以BPSA或inPSA表示。
本發明是基于下列意想不到的發現，血清中inPSA的測量改進了癌癥預測的值。此外，inPSA與總PSA，游離PSA以及其他單個形式的游離PSA，BPSA和pPSA的各種數學組合相對于總PSA也改進了對前列腺癌的檢測。這包括但不限于inPSA減pPSA，或者inPSA除以pPSA的值。pPSA所示為所有天然和截短形式的pPSA的組合。然而，當具體說明時，也可指inPSA與單個天然或截短的pPSA形式，[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5]pPSA和[-7]pPSA的比例([-5]pPSA加[-7]pPSA可以[-5，-7]pPSA表示，這是因為[-7]pPSA的試驗同樣識別[-5]pPSA)。除了inPSA，這包括BPSA和pPSA之間的數學關系，諸如BPSA減pPSA。本發明描述了inPSA，BPSA和pPSA之間非線性和非顯而易見的相互作用關系，但是通過實驗已經表明提高前列腺癌的檢測。因此，通過確定inPSA，pPSA和BPSA的水平，以及尤其是inPSA與BPSA和pPSA的比例或減/加的差/和，本發明提供了手段幫助檢測前列腺癌。
因此，本發明的一個方面提供了幫助區分個體中前列腺癌與良性疾病的方法。所述方法包括下列步驟a)確定個體生物樣品中所含的總PSA的量，b)確定同一樣品中游離PSA的量，并且計算游離PSA與總PSA的比例，c)確定同一樣品中inPSA的量，以及d)基于總PSA的水平以及游離PSA與總PSA的比例，通過將inPSA的量或者inPAS和BPSA或pPSA的數學組合與用已知癌癥和良性疾病診斷的對照樣品所建立的預定值進行比較，使樣品中所含的inPSA的量或者inPAS和BPSA或pPSA的數學組合與個體中存在的前列腺癌的存在相關。
測量總PSA和游離PSA的方法在本領域中是眾所周知的，因此在此不再贅述。
inPSA量的確定可以采用本發明所述或本領域公知或將來開發的方法，只要能夠確定除BPSA或pPSA之外的游離PSA的濃度就行。例如，inPSA可直接或間接加以測量。根據本發明的一個實施方案，inPSA的測量可通過包括下列步驟的方法進行向樣品中加入足夠量的BPSA或pPSA的抗體以封閉樣品中所含的BPSA和pPSA，以及測量游離PSA的量，其等于inPSA的量。對于本發明而言，如果抗體可以結合全部樣品中所含的相應BPSA或pPSA，并且封閉BPSA和pPSA與游離PSA的抗體的結合，則抗體的量是足夠的。如果BPSA或pPSA不可結合到游離PSA的抗體，則它們被封閉。
根據本發明的另一實施方案，樣品中所含的inPSA可通過從樣品中所含的游離PSA的量減去BPSA和pPSA的量而進行計算。該方法要求分別測量樣品中所含的游離PSA，pPSA和BPSA的量。然后，從游離PSA中減去BPSA和pPSA的值以確定inPSA的量。
根據本發明的實施方案，pPSA或BPSA或游離PSA的測量可通過免疫測定方法進行，并且用于計算inPSA。游離PSA試驗可從市場上獲得，并且在本領域是眾所周知的。可用于測量pPSA的量的抗體和免疫測定描述在在審U.S.申請No.09/251,686，09/302,965，09,792,692；和09,792,534中，內容在此以其全文引作參考。可用于測量BPSA的量的抗體和免疫測定描述在最近授權的專利，U.S.申請No.09/303,208中，內容在此以其全文引作參考。可用于測量BPSA和pPSA的量的抗體和免疫測定以及利用這些測量因子以相互之間的比例檢測前列腺癌的方法描述在最近授權的專利，U.S.申請No.09/303,339中，內容在此以其全文引作參考。
根據本發明的一個實施方案，生物樣品中所含的inPSA的量的計算方法可包括下列步驟將特異性與目的PSA結合的抗體與樣品在允許形成含有PSA和抗體的二元復合物的條件下接觸；(b)檢測和確定復合物的量，以及(c)從游離PSA的量中減去pPSA和BPSA的量確定inPSA的量。
對于本發明而言，能夠與pPSA，BPSA或游離PSA形成可檢測的復合物的任何因子可視為抗體的等同物。潛在的分子種類的例子包括但不限于抗體，衍生自抗體的抗原結合片段，以及抗體的等同物，諸如但不限于適體(aptamer)等。對于本發明而言，采用本領域公知的方法，可選擇特異于pPSA或BPSA或游離PSA的因子。例如，任何公知結合試驗可用來確定任何給定因子的特異性結合活性。
通常，樣品中要求計算本發明inPSA的任何形式的PSA的定性和/或定量確定都可通過競爭或非競爭性免疫測定步驟以直接或間接方式完成。這種免疫測定的例子有放射性免疫測定(RIA)和夾心(免疫測定(immunometric assay))試驗。利用本發明的單克隆抗體檢測抗原可以通過以正向，反向或雙向的方式運行的免疫測定，包括對生理學樣品進行的免疫組織化學試驗來實施。本領域的專業技術人員會知道，或者可容易地辨別其他免疫測定方式而無需過多的實驗。
術語“免疫測定試驗”或“夾心免疫測定”包括雙向夾心，正向夾心以及反向夾心的免疫測定。這些術語為本領域專業技術人員所熟知。本領域的專業人員還會意識到，本發明的抗體在試驗的其他變體和形式中將是有用的，這些變體和形式無論是當今公知的還是將來有待開發的，都欲包括在本發明的范圍內。
對于本發明而言，生物樣品可以是含有本發明的inPSA的人生理流體樣品。人生理生理流體樣品的例子包括但不限于血清，精液，尿和血漿，盡管血清和血漿是優選的。此外，單克隆和多克隆抗體均可使用，只要這種抗體對本發明所提供的抗原具有必要的特異性。優選的是采用單克隆抗體。
根據本發明的實施方案，免疫測定包括特異于[-2]pPSA，[-4]pPSA和[-5，-7]pPSA的試驗。例如，在患有已知前列腺癌或BPH的男人的血清中測量特異形式的pPSA，以及這些分析物的水平與inPSA一起用來開發算法以區分前列腺癌和良性前列腺病。本發明的試驗可用來幫助區分前列腺癌和良性前列腺增生。
本發明令人驚奇地發現，當分析含有2-10ng/ml總PSA的血清樣本時，inPSA具有顯著升高的癌癥指示值。此外，inPSA與其他形式的總PSA，游離PSA，BPSA和pPSA一起的各種數學算法也改進了前列腺癌的檢測。對于本發明而言，術語“數學組合”是指但不限于加，減，除及其組合。例如，數學組合可包括inPSA減pPSA，或inPSA除以pPSA的值。在此情形下，pPSA可以是所有天然和截短形式的pPSA或單個[-2]，[-4]和[-5，-7]pPSA形式的組合。除了inPSA，這還包括BPSA和pPSA之間的數學關系，諸如BPSA減pPSA。本發明描述了非線性和非顯而易見的3種單個形式的游離PSA之間的關系，所述3種單個形式的游離PSA，即inPSA，BPSA和pPSA，構成了總游離PSA。這種關系是通過實驗發現的。因此，通過確定inPSA，pPSA和BPSA的水平，尤其通過inPSA與BPSA和pPSA的比例或其差值，本發明提供了手段幫助檢測前列腺癌。
在游離PSA％高度升高的特定亞群的總PSA中，inPSA除以pPSA以及inPSA減pPSA也具有顯著提高的癌癥指示值。inPSA和pPSA之間的關系在游離PSA％大于20％，尤其大于25％的男人中提高了癌癥的檢測。
根據本發明的實施方案，總PSA可以是低于20ng/ml的任意濃度，或更優選低于10ng/ml，或最優選在2.5-10ng/ml的范圍。在一個優選的實施方案中，總PSA介于2.5-4ng/ml。在另一優選的實施方案中，總PSA介于4-10ng/ml。游離PSA與總PSA的比例可以是通常在患者血清中發現的游離PSA的任意范圍1-50％，盡管在本發明的一個實施方案中，游離PSA優選的范圍大于20％，而最優選地大于25％。在特殊的實施方案中，總PSA介于4-10ng/ml，而游離PSA的比例大于20％，或25％的范圍。pPSA可以是[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5，-7]pPSA或這三種形式的天然和截短的pPSA的總和，以pPSA表示。inPSA可以優選表示成血清中ng/ml的inPSA，inPSA除以pPSA，或inPSA減pPSA。樣品可以是任何生理流體，盡管血清或血漿是優選的。
對于本發明而言，在患者樣品中檢測的單獨inPSA的量及其與總PSA和游離PSA，pPSA和BPSA的組合可以以任何生成診斷值用于確定前列腺癌存在的方式與前列腺癌的存在相關。根據本發明的實施方案，將inPSA的量或其與總PSA，游離PSA，BPSA或pPSA數學組合與預定值比較用于確定前列腺癌的存在。鑒于本發明的教導，本領域專業技術人員通過常規實驗可容易地確定“預定的界限值”(或閾值)或其他對在確定前列腺癌的存在中使用inPSA的水平所必需的分析參數。例如，可在診斷有前列腺癌的個體與沒患有前列腺癌或BPH的個體中比較上述inPSA的比例，以確定界限值。接受者操作特征(ROC)分析可以以要求的特異性和靈敏度用來確定界限值。ROC分析在本領域中是公知的，并且詳細描述在參考文獻22(22)中，相關內容在此以其全文引作參考。然后，樣品中inPSA的量或其數學組合可與預定的界限值進行比較，以確定個體中前列腺癌的存在，如同從ROC分析中確定的一樣，其中較高或較低水平的inPSA或其與其他PSA形式的數學組合可以指示前列腺癌。根據本發明的教導，本領域技術人員基于ROC分析能夠確定，較高或較低水平是否指示前列腺癌。以要求的特異性和靈敏度確定界限值的這種方法和其他方法在本領域是眾所周知的，無需在此重復(23-29)。
參照下列實施例進一步對本發明加以描述。
實施例1分析患有癌癥和良性疾病的男人的含有總PSA為4-10ng/ml的血清材料和方法開發針對BPSA和pPSA的單克隆抗體(mAbs)針對[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5，-7]pPSA和BPSA的單克隆抗體在先已經描述[12-16]。[-7]pPSA mAb也識別[-5]pPSA形式的pPSA。對于這些實施例而言，無論什么情況下，術語[-7]pPSA表示[-5]加[-7]pPSA。術語pPSA表示[-2]加[-4]加[-5]加[-7]pPSA。
免疫測定PSAPSA在血清和純化的制劑中的濃度通過Tandem-MP PSA和Tandem-MP游離PSA試驗(Hybritech Incorporated，San Diego，CA；Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA)確定。
免疫測定[-2]，[-4]和[-5，-7]pPSA本發明人已經開發了如下用于測量pPSA形式的免疫測定。將50ul生物素酰化的抗PSA Ab PSM 773的TandemPSA零cal稀釋劑(5ug/ml)加入EG&G Wallac鏈親和素包被的微滴定板，并且在室溫下振蕩反應1小時。然后，用TandemE洗滌液洗滌板5次。接著將50ul的TandemPSA零cal稀釋劑加入板中，隨后加入50ul的待測血清或抗原。如上讓混合物室溫下反應2小時。用TandemE洗滌液洗滌板5次。向板中加入100ul合適的銪標記的檢測mAb的ImA溶液，用于測量各種形式的pPSA。對于[-2]pPSA，檢測mAb為PS2X373；對于[-4]pPSA，為PS2V 411；以及對于[-5，-7]pPSA，為PS2P309。如上使混合物室溫下反應1小時。然后用TandemE洗滌液洗滌板5次，并且在EG&G Wallac Victor儀上讀數。
免疫測定BPSABPSA試驗方案如下。將生物素酰化的捕獲抗PSA mAb，PSM773(100uL，0.25mg/L)振蕩下在鏈親和素微滴定板中溫育1小時。板用封閉緩沖液(50uL)洗滌，接著加入50uL校準品或樣品，并且振蕩下溫育2小時。洗滌板，加入堿性磷酸酶標記的抗BPSA mAbPS2E290(100uL，2ug/ml)，并且振蕩下溫育1小時。洗滌板，加入100uL的4-甲基傘形酮酰磷酸鹽，并且振蕩下溫育5分鐘。然后，在5，60和120分鐘對板進行讀數。采用1234 Delfia研究熒光計(Wallac，EG&G)測量相對熒光。
接受者操作特征(ROC)曲線分析采用MedCalc軟件程序(MedCalc Software，Belgium，(info@medcalc.be))生成ROC分析和圖。理論和實踐描述在Zwieg和Campbell，接受者操作特征(ROC)臨床醫學中的基本評價工具(a fundamental evaluation tool in clinical medicine)，Clinical Chemistry，39，561-577，1993。
結果單個游離PSA形式，BPSA，pPSA和inPSA在總PSA為4-10ng/ml的癌癥血清中的典型平均比例示于圖1中。單個pPSA和BPSA樣品的范圍為從0到大于70％的游離PSA。這表明單個游離PSA形式可分別表示顯著和可變百分比的游離PSA，并且支持的數據顯示inPSA單獨及其與BPSA和pPSA組合代表了獨特的血清圖，所述血清圖可改進癌癥血清的檢測。采用近1100個診斷有癌癥或良性疾病、總PSA范圍為2-10ng/ml的血清樣品，進行ROC曲線和分析。對各個樣品測量游離PSA值。測量各個樣品中的BPSA以及單個pPSA形式，[-2]pPSA，[-4]pPSA，和[-5，-7]pPSA。除非另有所指，pPSA表示所有3種pPSA形式的總和。inPSA計算成游離PSA減BPSA和pPSA。
為了生成ROC曲線分析，將各個PSA異型的值輸入MedCalc程序。ROC是統計學方法，其對一群中的各個樣品賦予癌癥的陽性和陰性預測值，并且是最廣泛使用的方法以評價作為癌癥預測器的PSA以及游離PSA試驗的值和性能。以最簡單的術語，對于各個ROC分析曲線下面積AUC用于評價試驗預測值。較高的AUC值指示更好的總預測值。ROC值范圍從0.5(隨機機會上沒有改進)到1.0(100％預測值的完全試驗)。ROC曲線的內標如下T＝總PSA，F＝游離PSA，i＝inPSA，B＝BPSA，P＝pPSA，2p＝[-2]pPSA。例如，在等式中，(i-P)/T等于inPSA減pPSA后除以總PSA。
在大多數情況下，ROC分析的目的是使辨別患有癌癥的男人的最大化，以及使那些沒患有癌癥，即假陽性的男人的活檢最小化。當分析諸如血清中PSA的生物樣品時，在真陽性和假陽性的檢測之間存在平衡。例如，取決于所需的結果，最期望的是檢測95％的癌癥，而對那些患有良性疾病的男人，這不可避免地伴隨著較高的假陽性率。在游離PSA％的情形下，例如，為了檢測95％的癌癥，它要求對游離PSA小于25％的所有男人進行活檢。然而，這卻伴隨著80％的假陽性率。這些假設的例子表示ROC分析的評價和值不是絕對的，并且在本發明采用inPSA的情形下，將需要常規試驗以建立有待在實踐中使用的真正參數。但是，鑒于本發明的教導，本領域技術人員應該能夠容易地確定必要的參數，而無需過多的試驗。下文給出的實施例表明在以給定組的標準檢測給定群體中癌癥的情形下，inPSA，inPSA與pPSA和BPSA的組合以及pPSA與BPSA的組合的值和功效，但是這些參數的用途和界限不限于這些實施例。
圖2示出了總PSA，inPSA，BPSA和游離PSA在血清中的ROC曲線的覆蓋圖，以ng/ml表示。inPSA具有最高的曲線下面積(AUC)，這表明inPSA比其他參數更好地區分癌癥和良性疾病。在PSA測試的領域中，已知游離PSA％在總PSA為4-10ng/ml的早期癌癥檢測范圍中，與單獨總PSA比較，改進癌癥檢測。游離PSA％，即F/T已表明是癌癥測試的最好的診斷用PSA，并可被視為判斷新測試的標準。圖3示出了％inPSA(inPSA/總PSA)優于游離PSA％。圖4示出了以與游離PSA的比例表示的inPSA可比得上以與總PSA的比例表示的游離PSA。這些例子示出了inPSA和以與游離或總PSA的比例表示的inPSA同單獨總PSA或游離PSA相比，給出的癌癥檢測是優良的。
圖5-8示出了inPSA與其他游離形式的PSA的各種數學組合甚至比單獨inPSA可提高癌癥檢測。圖5示出了inPSA/pPSA可比得上單獨inPSA，但是好于游離PSA。圖6示出了inPSA，pPSA和BPSA相互之間的各種可能的組合。BPSA加inPSA給出了最好的AUC，因而是最好的癌癥檢測。在這些組合中，pPSA加inPSA效果稍差，而pPSA加BPSA效果最差。圖7示出了pPSA，BPSA和inPSA之間相減的各種可能的組合。由這些數學組合獲得的值通過任何試驗方法本身不能被推知或測量。所有組合都給出了顯著的AUC，從而相對于游離或總PSA提高了癌癥檢測。圖8示出了inPSA減pPSA后與游離和總PSA各種更多的比例。利用以與總PSA的比例表示的inPSA減pPSA，相對于僅僅是inPSA減pPSA提高了ROC。圖5-8中各個ROC實施例表明，inPSA，pPSA和BPSA的多種組合和比例在ROC分析中提供了顯著的AUC，并且相對于單獨的游離和總PSA可提高癌癥的檢測。
圖9示出了利用inPSA提高癌癥檢測的另一實施例。在這種情形下，本發明人對患有前列腺癌和游離PSA％升高的男人進行了檢查。在該圖中，只分析了游離PSA％大于25％的男人。在真正隨機篩選的群體中，游離PSA大于25％的男人建議不對癌癥進行活檢，這是因為癌癥發現的可能性只有大約8％。因此，在正常環境下，由于在該組中常規血檢不能預測癌癥，這組男人中的癌癥往往保持不被檢測。圖9示出了在這組中inPSA/總PSA和inPSA/[-2]pPSA對癌癥具有高度增強的預測值。在特定范圍或界限的游離PSA％中，inPSA會顯示出選擇的癌癥預測，這是未預料到的。
實施例II分析患有癌癥和良性疾病的男人的含有總PSA為2.5-4ng/ml的血清如實施例1一樣，在這群總PSA值為2.5-4ng/ml的患者中，測量了同樣系列的PSA試驗。2.5-4g/ml的范圍為一區域，其中在隨機篩選的群體中存在許多癌癥，但出現機會低于4-10ng/ml的患者。總PSA在此范圍不會區分癌癥，目前試圖用％F來提高該范圍中的癌癥檢測尚未顯示出診斷價值。
圖10和11示出了在范圍為2.5-4ng/ml中，inPSA比游離形式的PSA是更好的前列腺癌的預測器。在圖10中，inPSA/pPSA和inPSA減pPSA給出了相似的AUC，得到癌癥的陽性區分，而F/T幾乎沒有給出癌癥的區分。在圖11中，inPSA/[-2]pPSA也給出了陽性癌癥區分，但游離PSA給出很小或沒有癌癥區分。
這些實施例示出，當總PSA低于4ng/ml時，inPSA也給出了陽性前列腺癌區分，而正常參數的游離和總PSA不能區分癌癥和良性疾病。
實施例III分析患有癌癥和良性疾病的男人的含有總PSA為2.5-10ng/ml的血清目前用于早期診斷前列腺癌的PSA范圍為4-10ng/ml。PSA在此范圍內的男人建議接受活檢以確定是否存在癌癥。對是否將PSA界限降低至4ng/ml以下，有可能低至2.5ng/ml，在臨床文獻中還有爭論。在這種情形下，目前的診斷PSA和游離PSA會用于推薦活檢，除非有其他改進的測試可用。
圖12和13示出了在2.5-10ng/ml的整個范圍，相對于當前的試驗，inPSA可用于提高癌癥檢測。在圖12中，相對于F/T PSA，inPSA/pPSA提高了癌癥檢測。在圖13中，與F/T PSA比較，inPSA減pPSA給出了甚至更好的改進。由于F/T PSA是如今所用的最好的PSA診斷標記，因此這說明inPSA對癌癥辨別具有顯著的潛力。
實施例IV純化inPSA以及制備inPSA抗體的方法方法1在用血清體外溫育精漿后純化inPSA10ml精漿與50ml雌性血清混合，并在37℃下溫育3小時。用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7)以1∶2稀釋此混合物，0.2μm濾膜過濾，并施加到含有單克隆抗體mAb PSM773的免疫親和柱上。PSM773先前已經證明可結合所有形式的游離PSA以及與ACT復合的PSA。然后將洗脫自免疫親和柱的PSA施加到S12大小排阻層析柱，收集以約33kDa洗脫的游離PSA。純化的失活PSA透析到組成為25 mM Mes(2-[N-嗎啉]乙烷磺酸)和40％乙腈pH 5.6(緩沖液A)的緩沖液中，并且施加到平衡在緩沖液A中的0.8×5cm MA7S陽離子交換柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。PSA形式采用圖14所示的梯度以組成為400 mM乙酸鈉，40％乙腈，pH7.0的緩沖液B洗脫。收集圖14中的峰，對PBS透析，濃縮，并在2-巰基乙醇的還原條件下施加到4-18％梯度聚丙烯酰胺凝膠上。蛋白在標準條件下用考馬斯亮蘭染色。
方法II在用血清體外溫育精漿后免疫親和純化inPSA10ml精漿與50ml雌性血清混合，并在37℃下溫育3小時。用PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7)以1∶2稀釋此混合物，0.2μm濾膜過濾，并施加到含有單克隆抗體mAb PSM773的免疫親和柱上。PSM773先前已經證明可結合所有形式的游離PSA以及與ACT復合的PSA。然后將洗脫自免疫親和柱的PSA施加到S12大小排阻層析柱，和收集以約33kDa洗脫的游離PSA。純化的失活PSA對PBS透析，并且施加到含有選自下列抗體的組合的免疫親和柱PS2P309，PS2P446，PS2X094，PS2X373，PS2V411和PS2V476以去除這些pPSA形式的PSA。穿過峰施加到含有mAbs PS2E290和/或PS2E055的免疫親和柱上以去除溶液中的BPSA。此時的穿過峰含有inPSA，即為不含BPSA和pPSA的游離PSA。
針對inPSA的單克隆抗體的制備可將純化的inPSA注射到小鼠中，腹水中產生的抗體采用組織培養和篩選的標準技術[21]測試其對inPSA的反應性。這包括抗原免疫耐受作用(tolerization)和在inPSA上采用抗PSA封閉抗體以使對顯性PSA表位的反應最小化的技術。對于篩選而言，抗體可對釋放自PSA-ACT的PSA加以篩選。已知活性天然的PSA經溫和化學處理可釋放自PSA-ACT復合物，以及這種PSA與精漿PSA在所有方面都顯示正常[8]。用于篩選inPSA的活性PSA將挑選識別inPSA特性的抗體，所述特性不同于活性PSA的特性。
討論這些實施例表明，inPSA異型的游離PSA與游離PSA相比擔當獨立的癌癥檢測用標記。這在如今診斷用PSA的整個目的范圍2.5-10ng/ml是真實的。采用inPSA的這些發現延伸了目前對游離PSA形式的理解。本發明人先前于1999年4月30日提交的在審U.S.專利申請No.09/302,965(其是1999年2月17日提交的U.S.申請No.09/251,686的部分繼續申請，后者又是1997年4月30日提交的U.S.申請No.08/846,408的繼續申請)中已經顯示pPSA形式提高了患者群體中的癌癥檢測。本發明人的下列主題已被授予專利權BPSA(U.S.申請No.09/303,208)以及BPSA與pPSA的比例以提高癌癥檢測(U.S.申請No.09/303,339)，內容在此以其全文引作參考。
盡管本發明人最初考慮BPSA和pPSA對提供癌癥檢測具有特異性，但是預料之外的是血清中剩余的游離PSA——inPSA顯示了獨立的診斷特性。利用BPSA，pPSA和inPSA的各種算法提高了癌癥檢測，這一發現只是在本發明人已經用BPSA和pPSA試驗測量了足夠的癌癥和良性樣品并且分析數據后才變成明顯的。因此，在最終的分析中，單個形式的pPSA，BPSA和inPSA，無論是單個還是彼此之間的組合，與總PSA和游離PSA比較都顯示前列腺癌檢測顯著提高。
這些新的發現暗示了血清中pPSA，BPSA和inPSA之間的復雜關系。為了提高癌癥檢測和減少不必要的活檢，在早期診斷范圍為2-10ng/ml PSA時，可應用inPSA的確定。結果中給出的實施例表明inPSA以及inPSA與pPSA和BPSA的組合對前列腺癌檢測的實用性，并且提示除了這些實施例以外的某些相關實施例并不意謂著限制其他潛在的不同范圍的PSA，游離PSA％或者pPSA，BPSA和inPSA的組合的應用。
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權利要求
1.一種幫助區分個體中前列腺癌與良性疾病的方法，包括下列步驟a)確定個體生物樣品中所含的總PSA的量；b)確定同一樣品中游離PSA的量；并且計算游離PSA與總PSA的比例；c)確定同一樣品中inPSA的量；以及d)基于總PSA的水平以及游離PSA與總PSA的比例，通過將inPSA的量與用已知癌癥和良性疾病診斷的對照樣品所建立的預定值進行比較，使樣品中所含的inPSA的量與個體中前列腺癌的存在相關。
2.權利要求1的方法，其中步驟c進一步包括下列步驟(a)向生物樣品中加入足夠量的針對BPSA和pPSA的單克隆抗體以封閉樣品中所含的BPSA和pPSA；以及(b)確定樣品中游離PSA的量，這就是樣品中inPSA的量。
3.權利要求1的方法，其中步驟c進一步包括下列步驟(a)確定pPSA的量；(b)確定BPSA的量；以及(c)游離PSA減pPSA和BPSA的量確定inPSA的量。
4.權利要求3的方法，其中相關步驟為基于總PSA的水平和游離PSA與總PSA的比例，通過比較樣品中所含的inPSA和總PSA，游離PSA，BPSA或pPSA的數學組合與用已知癌癥和良性疾病診斷的對照樣品所確立的預定值，使所述數學組合與個體中前列腺癌的存在相關的步驟。
5.權利要求4的方法，其中數學組合包括在inPSA，BPSA，pPSA，總PSA和游離PSA中的加法，減法和除法。
6.權利要求4的方法，其中數學組合為inPSA與BPSA或pPSA的數學組合。
7.權利要求4的方法，其中數學組合為inPSA與pPSA的比例。
8.權利要求4的方法，其中pPSA選自[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5]pPSA，以及[-7]pPSA。
9.權利要求4的方法，其中數學組合為inPSA與總PSA的比例。
10.權利要求4的方法，其中數學組合為inPSA與游離PSA的比例。
11.權利要求4的方法，其中數學組合為inPSA減pPSA。
12.權利要求4的方法，其中數學組合為inPSA減pPSA后與總PSA的比例。
13.權利要求4的方法，其中數學組合為inPSA減pPSA后與游離PSA的比例。
14.權利要求4的方法，其中數學組合為inPSA加pPSA。
15.權利要求4的方法，其中數學組合為inPSA加pPSA后與總PSA的比例。
16.權利要求4的方法，其中數學組合為inPSA加pPSA后與游離PSA的比例。
17.權利要求4的方法，其中數學組合為inPSA減BPSA。
18.權利要求4的方法，其中數學組合為inPSA加BPSA。
19.權利要求1的方法，其中數學組合為inPSA加或減BPSA后與總PSA或游離PSA的比例。
20.權利要求1的方法，其中總PSA為2.5-10ng/ml，游離PSA與總PSA的比例大于20％，以及inPSA的量高于預定值指示前列腺癌的存在。
21.權利要求20的方法，其中總PSA為4-10ng/ml。
22.權利要求20的方法，其中游離PSA與總PSA的比例大于25％。
23.權利要求1的方法，其中總PSA為2.5-10ng/ml，游離PSA與總PSA的比例選自5％-25％，以及inPSA的量高于或低于預定值指示前列腺癌的存在。
24.權利要求23的方法，其中總PSA為4-10ng/ml。
25.權利要求23的方法，其中總血清PSA為2.5-4ng/ml。
26.權利要求23的方法，其中游離PSA與總PSA的比例選自5％-25％。
27.權利要求1的方法，其中總PSA選自增量從1.0到10.0ng/ml的任何組合。
28.權利要求1的方法，其中總PSA低于約20ng/ml。
29.權利要求1的方法，其中總PSA低于10ng/ml。
30.權利要求1的方法，其中總PSA為約2.5-10ng/ml。
31.權利要求1的方法，其中游離PSA與總PSA的比例為1-50％。
32.權利要求1的方法，其中游離PSA與總PSA的比例為大于20％。
33.權利要求1的方法，其中游離PSA與總PAS的比例為大于25％。
34.權利要求1的方法，其中個體為人。
35.權利要求1的方法，其中樣品為生理流體。
36.權利要求13的方法，其中生理流體為血清，血液或血漿。
37.權利要求2的方法，其中pPSA選自[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5，-7]pPSA，其截短的形式，及其任何組合。
38.權利要求5的方法，其中數學組合為BPSA減pPSA。
全文摘要
本發明提供了用于檢測和確定前列腺癌存在的試驗方法。試驗能夠在游離PSA與總PSA的比例顯著高的男人群體中檢測前列腺癌。試驗還能夠在少量總PSA，即范圍為2－4ng/ml的男人群體中檢測前列腺癌。根據本發明的一個實施方案，試驗包括下列步驟(a)確定來自患者的生物樣品中所含的總PSA的量，(b)確定同一樣品中游離PSA的量，并且計算游離PSA與總PSA的比例，(c)確定同一樣品中的pPSA的量，(d)確定同一樣品中BPSA的量，(e)確定同一樣品中inPSA的量，以及(f)基于總PSA的水平和游離PSA，通過將inPSA的量與用已知癌癥和良性疾病診斷的對照樣品所建立的預定值進行比較，使樣品中所含的inPSA的量與患者中前列腺癌的存在相關。
文檔編號A61K48/00GK1656231SQ03811904
公開日2005年8月17日 申請日期2003年5月22日 優先權日2002年5月24日
發明者史蒂芬·D·米科瓦伊奇克, 哈里·G·里滕豪斯 申請人:海布里特克有限公司