Edg受體結合劑在癌癥中的應用的制作方法

專利名稱：Edg受體結合劑在癌癥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及1-磷酸鞘氨醇(S1P)受體激動劑的新用途，特別是在治療癌癥中的新用途。
S1P受體激動劑是加速淋巴細胞歸巢(LH)的物質，其可引起淋巴細胞減少，原因是淋巴細胞從循環系統向次級淋巴組織進行再分布、優選可逆性再分布，但不引起全身性免疫抑制。稚細胞被隔絕；來自血液的CD4和CD8 T-細胞和B-細胞被刺激遷移至淋巴結(LN)和派爾斑(PP)，并因此例如抑制細胞向移植器官的浸潤。
S1P受體激動劑通常是鞘氨醇類似物，如2-取代的2-氨基-丙烷-1，3-二醇或2-氨基-丙醇衍生物，例如包含式X基團的化合物 其中Z為H；C1-6烷基；C2-6鏈烯基；C2-6炔基；苯基；被OH取代的苯基；被1至3個選自鹵素、C3-8環烷基、苯基以及OH取代的苯基的取代基取代的C1-6烷基；或CH2-R4z，其中R4z為OH、酰氧基或式(a)的殘基 其中Z1為直連鍵或O，優選O；R5z和R6z相互獨立地為H，或任選被1、2或3個鹵素原子取代的C1-4烷基；R1z為OH、酰氧基或式(a)的殘基；且R2z和R3z相互獨立地為H、C1-4烷基或酰基。
式X的基團是作為端基連接于親水或親脂部分的官能團，并包含一個或多個脂族、脂環族、芳族和/或雜環殘基，達到的結果是所形成的其中的Z和R1z至少有一個是或包含式(a)的殘基的分子可在多個1-磷酸鞘氨醇受體之一上作為激動劑進行信號轉導。
S1P受體激動劑是在一種或多種1-磷酸鞘氨醇受體、例如S1P1至S1P8上作為激動劑進行信號轉導的化合物。與1-磷酸鞘氨醇受體結合的激動劑可以例如導致細胞內的雜三聚體G-蛋白解離為Gα-GTP和Gβγ-GTP，和/或被激動劑占領的受體磷酸化作用增加，以及下游信號轉導途徑/激酶活化。S1P受體激動劑的結合親和力可以如以下段落I所述進行測定。
合適的S1P受體激動劑的實例有例如-EP627406A1中所公開的化合物，例如式I的化合物 其中R1為直鏈或支鏈(C12-22)碳鏈-其可在碳鏈中含有選自以下的鍵或雜原子雙鍵、三鍵、O、S、NR6和羰基，其中R6為H、烷基、芳烷基、酰基或烷氧基羰基，和/或-其可含有作為取代基的烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、芳烷基氧基、酰基、烷基氨基、烷硫基、酰氨基、烷氧基羰基、烷氧基羰基氨基、酰氧基、烷基氨基甲酰基、硝基、鹵素、氨基、羥基亞氨基、羥基或羧基；或R1為-苯基烷基，其中烷基為直鏈或支鏈(C6-20)碳鏈；或-苯基烷基，其中烷基為直鏈或支鏈(C1-30)碳鏈，其中所述的苯基烷基被以下基團取代-任選被鹵素取代的直鏈或支鏈(C6-20)碳鏈，-任選被鹵素取代的直鏈或支鏈(C6-20)烷氧基鏈，-直鏈或支鏈(C6-20)鏈烯氧基，
-苯基烷氧基、鹵代苯基烷氧基、苯基烷氧基烷基、苯氧基烷氧基或苯氧基烷基，-被C6-20烷基取代的環烷基烷基，-被C6-20烷基取代的雜芳基烷基，-雜環C6-20烷基或-被C2-20烷基取代的雜環烷基，并且其中烷基部分可以含有-在碳鏈中，含有選自以下的鍵或雜原子雙鍵、三鍵、O、S、亞磺酰基、磺酰基或NR6，其中R6如上所定義，且-作為取代基的烷氧基、鏈烯氧基、炔氧基、芳烷基氧基、酰基、烷基氨基、烷硫基、酰氨基、烷氧基羰基、烷氧基羰基氨基、酰氧基、烷基氨基甲酰基、硝基、鹵素、氨基、羥基或羧基，且R2、R3、R4和R5相互獨立地為H、C1-4烷基或酰基，或其可藥用其鹽；-EP 1002792A1中所公開的化合物，例如式II的化合物 其中m為1至9，且R’2、R’3、R’4和R’5相互獨立地為H、烷基或酰基，或其可藥用其鹽；-EP 0778263A1中所公開的化合物，例如式III的化合物 其中W為H；C1-6烷基、C2-6鏈烯基或C2-6炔基；未取代的或被OH取代的苯基；R”4O(CH2)n；或被1至3個選自鹵素、C3-8環烷基、苯基以及被OH取代的苯基的取代基取代的C1-6烷基；X為H或含有的碳原子數為p的未取代的或取代的直鏈烷基或含有的碳原子數為p-1的未取代或取代的直鏈烷氧基，例如被選自以下的1至3個取代基取代C1-6烷基、OH、C1-6烷氧基、酰氧基、氨基、C1-6烷基氨基、酰氨基、氧代、鹵代C1-6烷基、鹵素、未取代的苯基、被1至3個選自C1-6烷基、OH、C1-6烷氧基、酰基、酰氧基、氨基、C1-6烷基氨基、酰氨基、鹵代C1-6烷基和鹵素的取代基取代的苯基；Y為H、C1-6烷基、OH、C1-6烷氧基、酰基、酰氧基、氨基、C1-6烷基氨基、酰氨基、鹵代C1-6烷基或鹵素，Z2為單鍵或含有的碳原子數為q的直鏈亞烷基，p和q相互獨立地為1至20中的整數之一，條件是6≤p+q≤23，m’為1、2或3，n為2或3，R”1、R”2、R”3和R”4相互獨立地為H、C1-4烷基或酰基，或其可藥用其鹽，-WO02/18395中所公開的化合物，例如式IVa或Ivb的化合物 或 其中Xa為O、S、NR1s或基團-(CH2)na-，該基團是未取代的或被1至4個鹵素取代；na為1或2，R1s為H或(C1-4)烷基，該烷基為未取代的或被鹵素取代；R1a為H、OH、(C1-4)烷基或O(C1-4)烷基，其中烷基是未取代的或被1至3個鹵素取代；R1b為H、OH或(C1-4)烷基，其中烷基是未取代的或被鹵素取代；每個R2a相互獨立地選自H或(C1-4)烷基，該烷基是未取代的或被鹵素取代；R3a為H、OH、鹵素或O(C1-4)烷基，其中烷基是未取代的或被鹵素取代；且R3b為H、OH、鹵素、(C1-4)烷基，其中烷基是未取代的或被羥基取代、或O(C1-4)烷基，其中烷基是未取代的或被鹵素取代；Ya為-CH2-、-C(O)-、-CH(OH)-、-C(＝NOH)-、O或S，且R4a為(C4-14)烷基或(C4-14)鏈烯基；或其可藥用其鹽；-WO 02/076995中所公開的化合物，例如式V的化合物 其中mc為1、2或3；Xc為O或直連鍵；R1c為H；任選被OH、酰基、鹵素、C3-10環烷基、苯基或羥基亞苯基取代的C1-6烷基；C2-6鏈烯基；C2-6炔基；或任選被OH取代的苯基；R2c為 其中R5c為H或任選被1、2或3個鹵素原子取代的C1-4烷基，且R6c為H或任選被鹵素取代的C1-4烷基；R3c和R4c相互獨立地為H、任選被鹵素取代的C1-4烷基或酰基，且Rc為C13-20烷基，其可任選地在鏈中含有氧原子，且其可任選地被硝基、鹵素、氨基、羥基或羧基取代；或為式(a)的殘基 其中R7c為H、C1-4烷基或C1-4烷氧基，且R8c為取代的C1-20烷酰基、苯基C1-14烷基，其中C1-14烷基任選地被鹵素或OH取代、環烷基C1-14烷氧基或苯基C1-14烷氧基，其中環烷基或苯環任選被鹵素、C1-4烷基和/或C1-4烷氧基取代、苯基C1-14烷氧基C1-14烷基、苯氧基C1-14烷氧基或苯氧基C1-14烷基，當R1c為C1-4烷基、C2-6鏈烯基或C2-6炔基時，Rc也可以是式(a)的殘基，其中R8c為C1-14烷氧基，或式VI的化合物 其中nx為2、3或4R1x為H；任選被OH、酰基、鹵素、環烷基、苯基或羥基亞苯基取代的C1-6烷基；C2-6鏈烯基；C2-6炔基；或任選被OH取代的苯基；R2x為H、C1-4烷基或酰基R3x和R4x相互獨立地為H、任選被鹵素或酰基取代的C1-4烷基，R5x為H、C1-4烷基或C1-4烷氧基，且R6x為被環烷基取代的C1-20烷酰基；環烷基C1-14烷氧基，其中環烷基環任選被鹵素、C1-4烷基和/或C1-4烷氧基取代；苯基C1-14烷氧基，其中苯環任選被鹵素、C1-4烷基和/或C1-4烷氧基取代，當R1x為被OH取代的C2-4烷基時，R6x也可以為C4-14烷氧基，或當R1x為C1-4烷基時，R6x為戊氧基或己氧基，條件是當R5x為H或R1x為甲基時，R6x不是苯基-丁烯氧基，或其可藥用鹽；-WO 02/06268A1中所公開的化合物，例如式VII的化合物
其中R1d和R2d相互獨立地為H或氨基保護基；R3d為氫或羥基保護基；R4d為低級烷基；nd為1至6的整數之一；Xd為亞乙基、亞乙烯基、亞乙炔基、式-D-CH2-的基團(其中D為羰基、-CH(OH)-、O、S或N)、芳基或被不超過三個選自下文所定義的基團的取代基取代的芳基；Yd為單鍵、C1-10亞烷基、被不超過三個選自基團a和b的取代基取代的C1-10亞烷基、在碳鏈中間或末端含有O或S的C1-10亞烷基、或在碳鏈中間或末端含有O或S、被不超過三個選自基團a和b的取代基取代的C1-10亞烷基；R5d為氫、環烷基、芳基、雜環、被不超過三個選自基團a和b的取代基取代的環烷基、被不超過三個選自基團a和b的取代基取代的芳基、或者被不超過三個選自基團a和b的取代基取代的雜環；且R6d和R7d相互獨立地為H或選自基團a的取代基；<基團a>為鹵素、低級烷基、鹵代低級烷基、低級烷氧基、低級烷硫基、羧基、低級烷氧基羰基、羥基、低級脂族酰基、氨基、單低級烷基氨基、二低級烷基氨基、低級脂族酰氨基、氰基或硝基；<基團b>為環烷基、酰基、雜環，其分別可任選被不超過三個選自基團a的取代基取代；條件是當R5d為氫時，Yd為單鍵或直鏈C1-10亞烷基，或其可藥用的鹽或酯。
-JP-14316985(JP2002316985)中所公開的化合物，例如式VIII的化合物 其中R1e、R2e、R3e、R4e、R5e、R6e、R7e、ne、Xe和Ye如JP-14316985中所述；
或其可藥用的鹽或酯。
-WO 03/29184和WO 03/29205中所公開的化合物，例如式IX的化合物 其中Xf為O或S，且R1f、R2f、R3f和nf如WO 03/29184和O3/29205中所述，例如，2-氨基-2-[4-(3-芐氧苯氧基)-2-氯苯基]丙基-1，3-丙二醇或2-氨基-2-[4-(芐氧基苯硫基)-2-氯苯基]丙基-1，3-丙二醇。
當進行專利申請引用時，將與所述化合物相關的主題引入本申請作為參考。
酰基可為Ry-CO-殘基，其中Ry為C1-6烷基、C3-6環烷基、苯基或苯基-C1-4烷基。除非另外說明，否則烷基、烷氧基、鏈烯基或炔基均可以為直鏈或支鏈的。
當式I化合物中的R1的碳鏈被取代時，其優選被鹵素、硝基、氨基、羥基或羧基取代。當碳鏈被任選取代的亞苯基中斷時，碳鏈優選為未取代的。當亞苯基部分被取代時，其優選被鹵素、硝基、氨基、甲氧基、羥基或羧基取代。
式I的優選化合物是那些其中R1為任選被硝基、鹵素、氨基、羥基或羧基取代的C13-20烷基的化合物；并且，更優選那些其中R1為被C6-14烷基鏈(烷基鏈任選被鹵素取代且烷基部分任選被羥基取代)取代的苯基烷基的化合物。更優選地，R1為在苯環上被直鏈或支鏈、優選直鏈的C6-14烷基鏈取代的苯基-C1-6烷基。C6-14烷基鏈可以在鄰位、間位或對位，優選在對位。
優選R2至R5各自為H。
優選的式I化合物為2-氨基-2-十四烷基-1，3-丙二醇。特別優選的式I的S1P受體激動劑為FTY720，即游離形式或可藥用鹽形式的2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1，3-二醇(下文稱為化合物A)，例如如下所示的鹽酸鹽
式II的優選化合物為其中R’2至R’5各自為H且m為4的化合物，即游離形式或可藥用鹽形式的2-氨基-2-{2-[4-(1-氧代-5-苯基戊基)苯基]乙基}丙烷-1，3-二醇(下文稱為化合物B)，例如鹽酸鹽。
式III的優選化合物為其中W為CH3、R”1至R”3各自為H、Z2為亞乙基、X為庚氧基且Y為H的化合物，即游離形式或可藥用鹽形式的2-氨基-4-(4-庚氧基苯基)-2-甲基-丁醇(下文稱為化合物C)，例如鹽酸鹽。特別優選R-對映體。
式IVa的優選化合物為FTY720-磷酸鹽(R2a為H、R3a為OH、Xa為O、R1a和R1b為OH)。式IVb的優選化合物為化合物C-磷酸鹽(R2a為H、R3b為OH、Xa為O、R1a和R1b為OH、Ya為O且R4a為庚基)。式V的優選化合物為化合物B-磷酸鹽。
式V的優選化合物為磷酸單-[(R)-2-氨基-2-甲基-4-(4-戊氧基-苯基)-丁基]酯。
式VIII的優選化合物為(2R)-2-氨基-4-[3-(4-環己基氧基丁基)苯并[b]噻吩-6-基]-2-甲基丁-1-醇。
當式I至IX的化合物在分子中具有一個或多個不對稱中心時，本發明應理解為包括各種旋光異構體以及外消旋物、非對映立體異構體及其混合物。當帶有氨基的碳原子為不對稱碳原子時，式III或IVb的化合物在該碳原子上優選具有R-構型。
式I至IX的化合物的可藥用鹽的例子包括與無機酸的鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽和硫酸鹽、與有機酸的鹽，如醋酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、甲磺酸鹽和苯磺酸鹽，或者適宜時，與金屬如鈉、鉀、鈣和鋁的鹽、與胺如三乙胺的鹽以及與氨基二酸如賴氨酸的鹽。本發明的方法的化合物和鹽包括水合物和溶劑合物形式。
根據所觀察的活性例如EP627406A1或USP 6,004,565所述的淋巴細胞歸巢活性，已發現S1P受體激動劑可例如在治療急性同種異體移植物排異中例如用作免疫抑制劑。現已發現S1P受體激動劑具有令人關注的特性，所述特性使其可用于癌癥化療，特別是實體瘤，尤其是晚期實體瘤。仍需要擴展實體瘤癌癥治療的裝備，尤其是在抗癌化合物治療不能使疾病消退或穩定的情況下。
根據本發明的特別發現，本發明提供了1.1一種在有需要的個體中治療實體瘤的方法，包括給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑或其可藥用鹽，其中所述激動劑含有式X的基團。
1.2一種在有需要的個體中抑制實體瘤生長的方法，包括給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑或其可藥用鹽，其中所述激動劑含有式X的基團。
1.3一種在有需要的個體中誘導腫瘤消退、例如腫瘤質量減輕的方法，包括給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑或其可藥用鹽，其中所述激動劑含有式X的基團。
1.4一種在有需要的個體中治療實體瘤侵入或與此腫瘤生長相關的癥狀的方法，包括給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑或其可藥用鹽，其中所述激動劑含有式X的基團。
1.5一種在有需要的個體中預防腫瘤轉移擴散或預防或抑制微轉移灶生長的方法，包括給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑或其可藥用鹽，其中所述激動劑含有式X的基團。
1.6一種在有需要的個體中抑制或控制失控的血管生成(例如1-磷酸鞘氨醇(S1P)介導的血管生成)的方法，包括給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑或其可藥用鹽，其中所述激動劑含有式X的基團。
1.7一種在有需要的個體中預防或治療新血管生成過程所介導的疾病或與失控的血管生成相關的疾病的方法，包括給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑或其可藥用鹽，其中所述激動劑含有式X的基團。
“實體瘤”指除淋巴癌之外的腫瘤和/或轉移灶(無論在何處)，例如腦或其它中樞神經系統腫瘤(如腦膜瘤、腦瘤、脊髓瘤、顱神經瘤和中樞神經系統其它部分的腫瘤，如惡性膠質瘤或髓胚細胞瘤)；頭和/或頸部癌；乳房腫瘤；循環系統腫瘤(例如心臟、縱隔和胸膜、以及胸廓內其它器官的腫瘤、血管瘤和與血管組織有關的腫瘤)；分泌系統腫瘤(例如腎、腎孟、輸尿管、膀胱、其它和未特別指出的泌尿器官)；胃腸道腫瘤(例如食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、直腸乙狀結腸結合點、直腸、肛門、肛管)，涉及肝及肝內輸膽管、膽囊、膽道的其它和未特別指出部分、胰腺及其它消化器官的腫瘤；頭和頸；口腔(嘴唇、舌頭、牙齦、口腔底部、腭和口腔的其它部分、腮腺和唾液腺其它部分、扁桃體、口咽、鼻咽、梨形竇、咽下部和嘴唇、口腔及咽的其它部位)；生殖系統腫瘤(例如外陰、陰道、子宮頸、子宮體、子宮、卵巢和女性生殖器官的其它部位、胎盤、陰莖、前列腺、睪丸和男性生殖器官的其它部位)；呼吸道腫瘤(例如鼻腔和中耳、副鼻竇、喉、氣管、支氣管和肺，例如小細胞肺癌或非小細胞肺癌)；骨骼系統腫瘤(例如四肢的骨和關節軟骨、骨關節軟骨和其它部位)；皮膚腫瘤(例如皮膚惡性黑色素瘤、非黑色素瘤皮膚癌、皮膚基底細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、間皮瘤、Kaposi’s肉瘤)；和涉及其它組織、包括外周神經和植物神經系統、結締組織和軟組織、腹膜后腔和腹膜、眼及附件、甲狀腺、腎上腺和其它內分泌腺及有關結構的腫瘤、繼發性和未特別指出的惡性淋巴結瘤、呼吸和消化系統的繼發性惡性腫瘤和其它部位的繼發性惡性腫瘤。
在以上和以下提到腫瘤、腫瘤疾病、癌或惡性腫瘤時，還單獨或同時暗指原發器官或組織和/或其它任一部位的轉移瘤，不管腫瘤和/或轉移瘤是在何處。
當S1P受體激動劑為式I化合物(例如化合物A)或式IVa或IVb的化合物時，在一項實施方案中，其被用于除乳腺、前列腺、膀胱、腎臟或肺腫瘤以外的實體瘤治療方法1.1、1.2、1.3或1.4中。
在一系列其它具體的或可供選擇的實施方案中，本發明還提供了1.8一種在有需要的個體中增強化療劑的活性或克服化療劑耐藥性的方法，其包括與所述化療劑一起，同時或依次給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑，例如含有式X的基團的S1P受體激動劑，或其可藥用鹽。
1.9根據1.8所述的方法，其中化療劑為信號傳導路徑抑制劑，該信號傳導路徑針對宿主細胞或腫瘤形成和/或轉移灶形成所涉及的過程，或可被腫瘤細胞利用以進行增殖、存活、分化或產生耐藥性。
1.10如上所述的方法，其中S1P受體激動劑間斷給藥。
在一系列其它具體的或可供選擇的實施方案中，本發明還提供了2.1用于上述1.1至1.4所定義的任何方法的包含式X的基團的S1P受體激動劑或其可藥用鹽，當S1P受體激動劑為式I的化合物(如化合物A)或式IVa或IVb的化合物時，其優選用于乳腺、前列腺、膀胱、腎臟或肺以外的實體瘤。
2.2用于以上1.5至1.10或下文7中所定義的任何方法中的S1P受體激動劑，例如含有式X的基團的S1P受體激動劑，或其可藥用鹽。
3.1用于制備用在上述1.1至1.4所定義的任何方法中的藥物組合物的包含式X的基團的S1P受體激動劑或其可藥用鹽，當S1P受體激動劑為式I的化合物(如化合物A)或式IVa或IVb的化合物時，其優選用于乳腺、前列腺、膀胱、腎臟或肺以外的實體瘤。
3.2用于制備用在以上1.5至1.10或下文7中所定義的任何方法中的S1P受體激動劑，例如含有式X的基團的S1P受體激動劑，或其可藥用鹽。
4.1用于上述1.1至1.4所定義的任何方法的藥物組合物，其含有包含式X的基團的S1P受體激動劑或其可藥用鹽，以及一種或多種可藥用的稀釋劑或載體，當S1P受體激動劑為式I的化合物(如化合物A)或式IVa或IVb的化合物時，其優選用于乳腺、前列腺、膀胱、腎臟或肺以外的實體瘤。
4.2用于以上1.5至1.10或下文7中所定義的任何方法的藥物組合物，其含有S1P受體激動劑，例如含有式X的基團的S1P受體激動劑，或其可藥用鹽，以及一種或多種可藥用的稀釋劑或載體。
5.1一種藥物組合，其含有a)為S1P受體激動劑的第一藥物，例如含有式X的基團的S1P受體激動劑或其可藥用鹽，以及b)為化療劑的輔藥，例如下文所詳細說明的化療劑。
5.2一種藥物組合，其含有一定量的a)為S1P受體激動劑的第一藥物，例如含有式X的基團的S1P受體激動劑或其可藥用鹽，以及b)為化療劑的輔藥，其選自下文xi)部分所定義的化合物，以產生協同治療效果。
6.一種如上所定義的方法，包括將治療有效量的S1P受體激動劑，例如包含式X的基團的S1P受體激動劑或其可藥用鹽和第二種藥物共同給藥，例如同時或相繼給藥，所述的第二種藥物為下文所述的化療劑。
7.一種在有需要的個體中治療淋巴增殖或骨髓增殖異常，例如治療腫瘤侵入或與此腫瘤生長相關的癥狀的方法，其包括向所述個體共同給藥，例如同時或相繼給藥S1P受體激動劑，例如包含式X的基團的S1P受體激動劑或其可藥用鹽和第二種藥物，所述的第二種藥物為例如下文所述的化療劑。
“淋巴癌”是指例如血液和淋巴系統腫瘤(例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、與AIDS有關的淋巴瘤、惡性免疫增生病、多發性骨髓瘤和惡性漿細胞瘤、淋巴白血病、骨髓白血病、急性或慢性淋巴細胞白血病、單核細胞白血病、其它指定細胞類型的白血病、未特別指出細胞類型的白血病、其它和未特別指出的淋巴、造血及有關組織的惡性腫瘤例如彌散性大細胞淋巴瘤、T-細胞淋巴瘤或皮膚T-細胞淋巴瘤)。骨髓癌包括如急性或慢性髓性白血病。
名詞“化療劑”尤其所指的是除S1P受體激動劑外的任何化療劑。其包括但不只限于i.芳香酶抑制藥，
ii.抗雌激素藥、抗雄激素藥(特別是患前列腺癌時)或戈那瑞林激動劑，iii.拓撲異構酶I抑制劑或拓撲異構酶II抑制劑，iv.微管活化劑、烷化劑、抗腫瘤抗代謝藥物或鉑配合物，v.靶向/降低蛋白或脂類激酶活性或者蛋白或脂類磷酸酶活性的化合物，其它抗血管生成化合物或可誘導細胞分化過程的化合物，vi.緩激肽1受體或血管緊張素II拮抗劑，vii.環加氧酶抑制劑、二膦酸類化合物、組蛋白脫酰酶抑制劑、肝素酶(heparinase)抑制劑(防止硫酸乙酰肝素降解)如PI-88、生物學應答修飾劑，優選淋巴因子或干擾素，例如干擾素γ、遍在蛋白化抑制劑或能阻斷抗細胞凋亡途徑的抑制劑。
Viii.Ras致癌同種型抑制劑，例如H-Ras、K-Ras或N-Ras，或法尼基轉移酶抑制劑，例如L-744,832或DK8G557，ix.端粒末端轉移酶抑制劑，例如telomestatin，x.蛋白酶抑制劑、基質金屬蛋白酶抑制劑、蛋氨酸氨基肽酶抑制劑，例如bengamide或其衍生物，或蛋白體抑制劑，例如PS-341。
xi.mTOR抑制劑。
這里使用的術語“芳香酶抑制劑”涉及能抑制雌激素生成，即將雄甾烯二酮和睪酮底物分別轉化為雌酮和雌二醇的化合物。該術語包括但不局限于甾類，尤其是阿他美坦、依西美坦和福美坦，和特別是非甾類，尤其是氨魯米特、羅谷亞胺、吡啶基苯乙哌啶酮、曲洛司坦、睪內酯、酮康唑、伏氯唑、法倔唑、阿那曲唑和來曲唑。依西美坦可以如市售形式如商標為AROMASINTM的形式給藥。福美坦可以如市售形式如商標為LENTARONTM的形式給藥。法倔唑可以如市售形式如商標為AFEMATM的形式給藥。阿那曲唑可以如市售形式如商標為ARIMIDEXTM的形式給藥。來曲唑可以如市售形式如商標為FEMARATM或FEMARTM的形式給藥。氨魯米特可以如市售形式如商標為ORIMETENTM的形式給藥。本發明中含芳香酶抑制藥化療劑的聯合給藥對治療激素受體陽性腫瘤如乳瘤特別有效。
這里使用的術語“抗雌激素藥”涉及能在雌激素受體水平拮抗雌激素效應的化合物。該術語包括但不局限于他莫昔芬、氟維司群、雷洛昔芬和鹽酸雷洛昔芬。他莫昔芬可以如市售形式如商標NOLVADEXTM的形式給藥。鹽酸雷洛昔芬可以如市售形式如商標為EVISTATM的形式給藥。氟維司群可按US 4,659,516中公開的內容制得或以如市售形式如商標為FASLODEXTM的形式給藥。本發明中含有抗雌激素藥化療劑的聯合給藥對治療雌激素受體陽性腫瘤如乳瘤特別有效。
這里使用的術語“抗雄激素藥”涉及能抑制雄性激素生物學效應的任一物質，包括但不局限于比卡魯胺(CASODEXTM)，其可按照US 4,636,505中公開的內容配制。
這里使用的術語“戈那瑞林激動劑”包括但不局限于阿巴瑞克、戈舍瑞林和醋酸戈舍瑞林。戈舍瑞林在US 4,100,274中公開，可以如市售形式如商標為ZOLADEXTM的形式給藥。阿巴瑞克可按照US 5,843,901中公開的內容配制。
這里使用的術語“拓撲異構酶I抑制劑”包括但不局限于托泊替康、伊立替康、9-硝基喜樹堿和大分子喜樹堿軛合物PNU-166148(WO99/17804中的化合物A1)。伊立替康可以例如市售形式如商標為CAMPTOSARTM的形式給藥。托泊替康可以如市售形式如商標為HYCAMTINTM的形式給藥。
這里使用的術語“拓撲異構酶II抑制劑”包括但不局限于蒽環霉素類如阿霉素(包括脂質體劑型，例如CAELYXTM)、柔紅霉素、表柔比星、伊達比星和奈莫柔比星(nemorubicin)、蒽醌米托蒽醌和洛索蒽醌，和鬼臼脂素(podophyllotoxines)依托泊苷和替尼泊苷。依托泊苷可以例如市售形式如商標為ETOPOPHOSTM的形式給藥。替尼泊苷以如市售形式如商標為VM26-BRISTOLTM的形式給藥。阿霉素以如市售形式如商標為ADRIBLASTINTM的形式給藥。表柔比星以如市售形式如商標為FARMORUBICINTM的形式給藥。伊達比星以如市售形式如商標為ZAVEDOSTM的形式給藥。米托蒽醌以如市售形式如商標為NOVANTRONTM的形式給藥。
這里使用的術語“微管活化藥”涉及微管穩定藥和微管去穩定藥，包括但不局限于紫杉烷類如紫杉醇和多西他賽，長春生物堿如長春花堿，特別是硫酸長春花堿、長春新堿，特別是硫酸長春新堿、和長春瑞濱、海綿內酯(discodermolide)和埃博霉素及其衍生物，如埃博霉素B或其衍生物。紫杉醇以如市售形式如商標為TAXOLTM的形式給藥。多西他賽以如市售形式如商標為TAXOTERETM的形式給藥。硫酸長春花堿以例如市售形式如商標為VINBLASTIN R.P.TM的形式給藥。硫酸長春新堿以例如市售形式如商標為FARMISTINTM的形式給藥。海綿內酯可如US 5,010,099公開的內容中得到。
這里使用的術語“烷化劑”包括但不局限于環磷酰胺、異環磷酰胺、苯丙氨酸氮芥或亞硝基脲(BCNU或GliadelTM)。環磷酰胺以例如市售形式如商標為CYCLOSTINTM的形式給藥。異環磷酰胺以例如市售形式如商標為HOLOXANTM的形式給藥。
術語“抗腫瘤抗代謝藥物”包括但不局限于5-氟尿嘧啶、卡培他濱、吉西他濱、甲氨蝶呤和依達曲沙。卡培他濱以例如市售形式如商標為XELODATM的形式給藥。吉西他濱以例如市售形式如商標為GEMZARTM的形式給藥。
這里使用的術語“鉑配合物”包括但不局限于卡鉑、順鉑和奧沙利鉑。卡鉑以例如市售形式如商標為CARBOPLATM的形式給藥。奧沙利鉑以例如市售形式如商標為ELOXATINTM的形式給藥。
靶向、減小或抑制VEGFR活性的化合物尤其是能抑制VEGF酪氨酸激酶受體、抑制VEGF受體或與VEGF結合的化合物、蛋白質或抗體，和特別是那些WO 98/35958中、或如WO 00/09495、WO 00/27820、WO00/59509、WO 98/11223、WO 00/27819和EP 0 769947中一般和具體公開的化合物、蛋白質或單克隆抗體，例如1-(4-氯苯氨基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪或可藥用鹽，如琥珀酸鹽；那些如M.Prewett等人在Cancer Research59(1999)5209-5218中、F.Yuan等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.93，pp.14765-14770，Dec.1996中、Z.Zhu等人在Cancer Res.58，1998，3209-3214中和J.Mordenti等人在Toxicologic Pathology，Vol.27，no.1，pp 14-21，1999中描述的化合物；WO 00/37502和WO 94/10202中的化合物；M.S.O’Reilly等人在Cell 79，1994，315-328中描述的AngiostatinTM； M.S.O’Reilly等人在Cell 88，1997，277-285中描述的EndostatinTM；鄰氨基苯甲酸酰胺；ZD4190；ZD6474；SU5416；SU6668；或抗VEGF抗體或抗-VEGF受體抗體，例如RhuMab。
抗體指完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多種類抗體、和抗體碎片，只要該抗體碎片能表現出希望的生物學活性。
靶向、減小或抑制表皮生長因子受體家族活性的化合物尤其是能抑制EGF酪氨酸激酶受體家族成員如EGF受體、ErbB2、ErbB3和ErbB4或結合EGF或EGF有關配體的化合物、蛋白質或抗體，和特別是那些WO97/02266中一般和具體公開的化合物、蛋白質或單克隆抗體，如實施例39的化合物，或者在EP 0 564 409、WO 99/03854、EP 0520722、EP 0 566 226、EP 0 787 722、EP 0 837 063、US 5,747,498、WO 98/10767、WO 97/30034、WO 97/49688、WO 97/38983中和尤其在WO 96/30347(如已知化合物CP358774)、WO 96/33980(如已知化合物ZD 1839)和WO 95/03283(如化合物ZM105180)中公開的化合物、蛋白質或單克隆抗體；例如曲妥單抗(HerpetinR)、西妥昔單抗、Iressa、OSI-774、CI-1033、EKB-569、GW-2016、E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3或E7.6.3。
靶向、減小或抑制PDGFR活性的化合物尤其是能抑制PDGF受體的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，如伊馬替尼。
靶向、減小或抑制c-AbI家族成員及其基因融合產物活性的化合物例如是N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，如伊馬替尼；PD180970；AG957或NSC680410。
靶向、減小或抑制蛋白激酶C、Raf、MEK、SRC、JAK、FAK和PDK家族成員或PI(3)激酶或與PI(3)激酶有關家族成員和/或細胞周期蛋白依賴性激酶家族(CDK)成員活性的化合物，尤其是那些EP 0 296 110中公開的星孢素衍生物如米哚妥林；其它化合物的實施例包括例如UCN-01、沙芬戈、BAY 43-9006、苔蘚抑素1、哌立福辛；伊莫福新；RO 318220和RO 320432；GO 6976；Isis 3521；或LY333531/LY379196。
其它抗血管生成化合物例如是薩力多胺(THALOMID)和TNP-470。
靶向、減小或抑制蛋白或脂質磷酸酶活性的化合物例如是磷酸酶1、磷酸酶2A、PTEN或CDC25如岡田酸或其衍生物的抑制劑。
能誘導細胞變異過程的化合物例如是視黃酸、α-、γ-或δ-生育酚或α-、γ-或δ-生育三烯酚。
這里使用的術語環加氧酶抑制劑包括但不局限于例如塞來考昔(CelebrexR)、羅非考昔(VioxxR)、etoricoxib、伐地考昔或5-烷基-2-氨基氨基苯基乙酸如5-甲基-2-(2’-氯-6’-氟苯氨基)苯基乙酸。
這里使用的術語“組蛋白脫酰酶抑制劑”包括但不局限于MS-27-275、SAHA、pyroxamide、FR-901228或丙戊酸。
這里使用的術語“二膦酸類化合物”包括但不局限于依替膦酸、氯膦酸、替魯膦酸、帕米膦酸、阿侖膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸和唑來膦酸。“依替膦酸”以例如市售形式如商標為DIDRONELTM的形式給藥。“氯膦酸”以例如市售形式如商標為BONEFOSTM的形式給藥。“替魯膦酸”以例如市售形式如商標為SKELIDTM的形式給藥。“帕米膦酸”以例如市售形式如商標為AREDIATM的形式給藥。“阿侖膦酸”以例如市售形式如商標為FOSAMAXTM的形式給藥。“伊班膦酸”以例如市售形式如商標為BONDRANATM的形式給藥。“利塞膦酸”以例如市售形式如商標為ACTONELTM的形式給藥。“唑來膦酸”以例如市售形式如商標為ZOMETATM的形式給藥。
這里使用的術語“基質金屬蛋白酶抑制劑”包括但不局限于膠原模擬肽和非模擬肽抑制劑、四環素衍生物例如異羥肟酸模擬肽抑制劑巴馬司他及其口服生物可接受類似物馬立馬司他、普啉司他、BMS-279251、BAY12-9566、TAA211或AAJ996。
這里使用的術語“mTOR抑制劑”包括但不僅限于雷帕霉素或其衍生物。雷帕霉素是由吸水鏈霉菌產生的已知的大環內酯類抗菌素。適宜的雷帕霉素衍生物包括例如式A的化合物
其中R1aa為CH3或C3-6炔基，R2aa為H或-CH2-CH2-OH、3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基-丙酰基或四唑基，并且Xaa為＝O、(H，H)或(H，OH)其條件是，當Xaa為＝O且R1aa為CH3時，R2aa不為H，或者當R2aa為-CH2-CH2-OH時，其前體藥物，例如其生理學可水解的酯。
式I化合物在例如WO 94/09010、WO 95/16691、WO 96/41807、USP5,362,718或WO 99/15530中已經公開，這些文獻在此引入作為參考。可按照這些文獻中公開的或與之相似的方法制備這些化合物。
優選的雷帕霉素衍生物是32-脫氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32-脫氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S)-二氫-雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S)-二氫-40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素，和更優選的40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素。雷帕霉素衍生物的其他例子包括如USP 5,362,718中公開的CCI779或40-[3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素或其可藥用鹽、如WO99/15530中所公開的ABT578或40-(四唑基)-雷帕霉素，特別是40-表-(四唑基)-雷帕霉素，或者如WO 98/02441和WO 01/14387中所公開的雷帕霉素類似物，例如AP23573。
在給出了專利申請或科學刊物引文的情況中，與化合物有關的內容引入本申請作為參考。這些化合物也可以是其可藥用鹽、相應的消旋物、非對映異構體、對映體、互變異構體以及，如果存在的話，上述化合物的相應的結晶變體，例如溶劑化物、水合物和多晶型。在本發明的組合中用作活性成份的化合物可如所引用文獻中所述進行制備和給藥。同時，本發明的范圍還包括多于兩種的上述各種活性成份的組合，即本發明范圍內的藥學組合可包括三種或三種以上活性成份。此外，第一藥物和輔藥均不為同種成份。
在治療如上所詳細說明的實體瘤中，S1P激動劑(如包含式X的基團的S1P激動劑)的效用可在動物試驗或臨床試驗方法中進行證實，例如依照下文所述的試驗方法證實。
A.體外試驗A.1抗腫瘤活性試驗使用了最初分離自乳腺癌的小鼠乳腺癌細胞系，例如JygMC(A)。在試驗操作開始前，將細胞數目調整至5×105以在新鮮培養液中鋪板。將細胞與含有2.5mM胸腺嘧啶脫氧核苷的不含FCS的新鮮培養液一起孵育12小時，然后用PBS清洗兩次，隨后再加入含10％FCS的新鮮培養液，并再次孵育12小時。然后再與含有2.5mM胸腺嘧啶脫氧核苷的不含FCS的新鮮培養液一起孵育12小時。為將細胞從所粘連成的細胞團塊中釋放，可將細胞以PBS清洗兩次，并重新鋪于含有10％FCS的新鮮培養液中。在同步化后，將細胞與不同濃度的式I化合物一起或者單獨孵育3、6、9、12、18或24小時。在以0.2％EDTA處理后，收獲細胞，并以冰冷的70％酒精溶液固定，然后于37℃以250μg/ml的RnaseA(1-A型Sigma Chem.Co.)水解30分鐘，并以10mg/ml的碘化丙啶染色20分鐘。在孵育期后，同時通過Coulter計數器計數細胞以及SRB比色測定來測定細胞數目。在這些試驗條件下，S1P激動劑(例如鹽酸鹽形式的化合物B)可在10-12-10-6M濃度范圍內抑制腫瘤細胞的增殖。
A.2 S1P介導的HUVEC管柱形成試驗使用傳代2-8代的HUVEC用于管柱形成試驗，同時在收獲前細胞融合度切勿超過70％。使用Herpes平衡鹽溶液(HBSS來自Clonetics)清洗細胞然后以胰蛋白酶/EDTA(0.25mg/ml，來自Clonetics)對之進行酶解消化來預處理細胞以進行實驗。在約90％的細胞脫離平板后，加入等體積的胰蛋白酶中和液(TNS來自Clonetics)并將細胞收集至至少含有10ml EBM-2(Clonetics)+0.1％BSA(Sigma)培養液的圓錐管中。于1000rpm離心細胞5分鐘，移除上清液并補充以5ml的新鮮EBM-2+0.1％BSA。使用血球計數器計數細胞并將細胞混懸液調整達到500,000細胞/ml的濃度。使用100nM的檢測化合物以及每只管中10ng/ml的百日咳菌外毒素(PTx)對圓錐管進行預處理，然后向每只管中加入1ml的細胞混懸液。然后于37℃、5％CO2中孵育圓錐管半小時。使用涂以纖連蛋白的Fluoro-Blok 24-Mulitwell嵌入板(8μm管徑大小，Falcon#351147)代替在24孔板中的單個嵌入板進行細胞移行試驗。如上所述準備細胞和檢測化合物并進行預孵育，然后向嵌入板每一合適的孔中加入100μl。將300μl EBM-2+2％經活性炭吸附的不含S1P的培養液加入標記為無刺激物(-)孔的底部，同時將300μl含有S1P(500nM)的培養液加入標記為刺激物(+)孔的底部。然后將平板置于37℃、5％CO2中孵育4小時。
先向小瓶中加入20μl DMSO來準備鈣黃綠素AM，50μg/小瓶(Molecular Probes #C3100)。然后加熱12.5ml的HBSS(每平板)至37℃，同時每小瓶中加入150μl。然后將小瓶內容物轉移回剩余的HBSS中以使鈣黃綠素AM最終濃度為4μg/ml。
將Fluoro-Blok平板移出保溫箱，分開頂部嵌入板并“輕彈”除去粘在嵌入板上多余的培養液。然后將嵌入板轉移至含有500μl/孔的4μg/ml的鈣黃綠素AM的新的24孔板上。再將板于37℃、5％CO2中孵育1.5小時。
孵育后，將板置于Cytofluor II上以485nm的激發波長和530nm的發射波長進行讀數。嵌入板中的Fluoro-Blok涂層只允許移行至底部的細胞被計數。數據傳輸至Excel進行計算，并使用SigmaPlot生成圖表，同時使用SigmaStat進行顯著性檢驗(t-檢驗)。(圖7)。
在4倍放大倍率下，通過計數3個獨立視野中分支點(兩獨立帶的連接點)的數目來定量管柱形成。結果報道如下
這些結果證實了FTY720-磷酸鹽或化合物C-磷酸鹽本身作為血管生成激動劑的獨特能力，但又令人驚奇的可作為S1P所介導血管生成的拮抗劑。化合物C磷酸鹽優選為消旋物或R-對映體。PTx被用作抑制Giα(EDG-1)所介導活性的對照。
B.體內試驗B.1抗腫瘤活性抗腫瘤活性以T/C％表示(經處理動物平均腫瘤體積的增加除以對照動物平均腫瘤體積的增加再乘以100)。
將等分試樣的癌癥細胞(1×107)(例如人類A375黑色素瘤細胞)移植至BALB/c-nu/nu小鼠。在腫瘤長至10×10mm大小時，將動物隨機分配至四個亞組，并用式I化合物處理。經過2周處理后，處死動物，同時收獲腫瘤和組織并進行形態學和分子分析處理。使用卡尺測定腫瘤大小。在本試驗中，在以0.5至5mg/kg的劑量給藥時，與對照鹽水相比，S1P激動劑(例如化合物B或C(以鹽酸鹽形式))可減慢腫瘤生長；例如，化合物C鹽酸鹽在以2.5mg/kg 5次/周的劑量給藥時，可產生最終T/C值為30％的結果。
B.2與VEGF-R蛋白酪氨酸激酶抑制劑聯合將移植人類MDA-MB-435乳腺腫瘤的裸鼠以100mg/kg 5次/周口服劑量的VEGF-R蛋白酪氨酸激酶抑制劑(例如1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪琥珀酸鹽)、2.5mg/kg 5次/周靜脈劑量的S1P受體激動劑(例如化合物C(鹽酸鹽))或兩者聯合用藥處理兩周。如上所述，以T/C％表示抗腫瘤活性。與單獨使用任何一種藥劑相比，化合物C鹽酸鹽和1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪琥珀酸鹽的聯合用藥可產生更顯著的抗腫瘤效果(T/C％27)(化合物C鹽酸鹽T/C66％；1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪琥珀酸鹽T/C91％)。在移植人類A375黑色素瘤細胞并以相似方法進行處理的裸鼠中，相同的聯合用藥也同樣獲得了良好的抗腫瘤反應聯合用藥所產生的T/C％為15，而單獨使用每一種藥劑所產生的T/C％分別為35和44。
B.3抗血管生成活性將在0.5ml 0.8％w/v瓊脂(含有肝素，20U/ml)中含有(i)1-磷酸鞘氨醇(5μM/腔)或(ii)人體VEGF(1μg/腔)的多孔腔植入裸鼠脅腹皮下。S1P或VEGF可誘導腔周圍的血管化組織的生長。此反應為劑量依賴性的并可通過測定組織重量和血容量來定量。從移植前4-6小時開始，以化合物A(0.3、3、30或50mg/kg)口服(i)或化合物C的R-對映體(2.5mg/kg)靜脈(ii)或化合物C的S對映體(2.5mg/kg)靜脈(iii)或載體(5％葡萄糖，10ml/kg)口服或靜脈(iv)處理裸鼠，每天一次，持續4天。在給予最后一次劑量24小時后，處死動物以進行血管化組織的測定。測定腔周圍血管化組織的重量和血容量。
與僅用載體處理的動物相比，經化合物A或化合物C的R或S對映體處理過的動物顯示其血管化組織的重量和/或血容量減低。
C.臨床試驗C.1 S1P受體激動劑(例如式I、II或III的化合物，如化合物A、B或C)的臨床獲益調查
20名對標準治療方法耐藥或難控的進展期晚期腫瘤患者，以通過劑量遞增試驗所確定的劑量接受了所述的化合物治療。每周對患者進行體檢和實驗室檢查以調查其全身臨床狀況。每兩個月通過放射檢查評定其腫瘤變化和所負荷的轉移。患者最初接受2個月的治療。此后，只要其疾病沒有進展并且藥物耐受滿意，患者可以持續本治療。
評估的主要變量安全性(不良事件)、標準血清生物化學和血液學、計算機斷層掃描(CT)或核磁共振成像(MRI)所確定的腫瘤大小。
C.2聯合治療合適的臨床試驗為，例如晚期實體瘤患者的開放標記非隨機化劑量遞增試驗。這樣的試驗特別證明了本發明的組合的活性成份的協同作用。通過這些試驗結果或通過為所屬技術領域中的技術人員所已知的試驗設計中的變化，可直接確定其對增殖性疾病的有益效果。這樣的試驗特別適合對比使用活性成份單藥療法和本發明之聯合療法的療效。優選第一藥物(a)的劑量逐漸遞增直至達到最大耐受劑量，同時輔藥(b)以固定劑量給藥。或者也可選擇，第一藥物(a)以固定劑量給藥，同時輔藥(b)劑量遞增。每一患者均每天或間斷接受藥劑(a)治療。在這些試驗中可確定治療療效，例如12、18或24周后每6周進行放射學評估。
或者也可選擇，使用安慰劑對照的雙盲試驗來證實此處所述發明的聯合治療益處。
在單獨使用S1P受體激動劑時，本發明方法實施中所需的每日劑量將依據如下因素而變化，例如所使用的化合物、宿主、給藥方式以及所治療病情的嚴重程度。優選的每日劑量范圍為約從0.1至100mg，單次給藥或分次給藥。患者合適的每日劑量為例如0.1至50mg口服。S1P受體激動劑可通過任何常規途徑給藥，特別是腸道(例如口服，如以片劑、膠囊、口服液的形式)、鼻腔、肺(通過吸入)或胃腸外給藥(例如以注射液或注射混懸液的形式)。合適的口服給藥單位劑量形式包含約0.1至30mg(通常0.25至30mg)的S1P受體激動劑以及一種或多種可藥用的稀釋劑或其載體。為抑制血管生成，選擇一足夠高劑量的S1P受體激動劑很重要，因為低濃度的S1P受體激動劑可促進血管生成。在給予患者S1P激動劑時，可通過如上A、B和C所述的濃度和劑量遞增試驗來選擇提供抗血管生成作用的合適劑量。
本發明的組合也可與手術治療、輕微長時間升高整個體溫和/或照射治療聯合。
施用本發明的藥物組合物不僅產生了例如協同治療效果(例如就減慢、停止或逆轉腫瘤的形成或延長腫瘤的響應期或抑制血管生成而言)這樣的有益效果，而且還產生了其它令人驚訝的有益效果，例如與僅使用本發明的組合中所使用的藥物活性成分之一的單獨治療相比，特別是在治療用其它用作抗癌藥的化療劑無效的腫瘤時，副作用減少、生活質量提高或者死亡率和發病率降低。
另一方面的有益效果是可使用較低劑量的本發明的組合中的活性成分，例如劑量不僅可以更小而且使用頻率可以更低，或者當控制腫瘤形成的生長時可用于減小副作用的發生率。這與被治療患者的希望和需要是一致的。
根據本發明的一個實施方案，一種優選的藥物組合含有a)式I、II、III、IVa、IVb、V或VI的化合物，例如化合物A、B或C，以及b)作為輔藥的一種或多種上述段落(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vii)或(xi)中所述的化合物，例如卡鉑，順鉑，紫杉醇，多西他賽，吉西他濱，阿霉素，靶向、降低或抑制血管內皮生長因子受體(VEGFR)家族酪氨酸激酶或血小板衍生生長因子受體(PDGFR)的活性的化合物，二膦酸類或mTOR抑制劑。
本發明的另一實施方案涉及S1P受體激動劑(a)與化療劑(b)聯合在治療淋巴或骨髓癌中(例如如上所示)的用途。該組合還可包含一種其他的輔藥(b)，例如白消安、阿糖胞苷、6-硫基鳥嘌呤、氟達拉濱、羥基脲、丙卡巴肼、博來霉素或氨甲蝶呤。拓撲異構酶II抑制劑(例如柔紅霉素)，或者特別是靶向、降低或抑制PDGFR或c-Abl家族成員及其基因融合產物的活性的化合物(例如伊馬替尼)作為輔藥(b)更佳，例如用于治療淋巴癌。
這里使用的術語“共同給藥”或“聯合給藥”或相似術語包括將選擇的治療劑向單個患者給藥，包括其中的藥物不一定以同樣的給藥途徑給藥或同時給藥的治療方案。
本發明的目的之一是提供一種含有聯合治療增殖性惡性疾病有效量的本發明的組合的藥物組合物。在該組合物中，第一藥物a)和輔藥b)可以以一個聯合的單位劑量形式或兩個單獨的單位劑量形式同時給藥、依次給藥或分別給藥。單位劑量形式也可以是固定的組合物。
本發明的藥物組合物可以以本身已知的方式制備，并且是那些適合于腸內(如口服或直腸)和胃腸外對哺乳動物(溫血動物)、包括人給藥的組合物，其含有治療有效量的至少一種如上所指出的藥理學活性的聯用組分本身，或同時含有一種或多種可藥用的載體或稀釋劑，特別是適合于腸內或胃腸外使用的載體或稀釋劑。
適合的藥物組合物含有，例如約0.1％至約99.9％、優選約1％至60％的活性成分。用于通過腸內或胃腸外給藥進行聯合治療的藥物制劑是例如單位劑量形式的制劑，如糖包衣片、片劑、膠囊或栓劑，或安瓿。如果沒有另外說明，這些劑型以本身已知的方式制備，例如常規混合、制粒、糖包衣、溶解或冷凍干燥法。應當理解的是，既然可以通過給藥多個劑量單位來達到所需的有效量，每個劑型的單個劑量中所含的聯用組分的單位含量本身并不需要構成有效量。
具體地講，本發明組合物的每個聯用組分的治療有效量可同時或以任何順序依次給藥，并且各組分可以分別或以固定的組合給藥。例如，根據本發明，延遲增殖性惡性疾病的發展或對其進行治療的方法包括以聯合治療有效量、優選協同有效量(例如與文中描述的量一致的每日劑量或間斷劑量)，同時或以任何順序依次施用(i)游離或可藥用鹽形式的第一藥物a)和(ii)游離或可藥用鹽形式的輔藥b)。本發明的組合的各個聯用組分可在治療過程中的不同時間分別給藥，或者以分開或單一組合物的形式同時給藥。此外，術語給藥也包括使用在體內可轉化為這些聯用組分的前藥。因此，本發明應理解為包括所有這些同時或交替治療的方案，術語“給藥”也應作相應的解釋。
本發明的組合中使用的各個聯用組分的有效量隨使用的特定化合物或藥物組合物、給藥方式、所治療的病情、治療病情的嚴重程度而變化。因此，根據多種因素、包括給藥途徑和患者的腎肝功能來選擇本發明的組合的劑量方案。具有普通技能的主治醫師、臨床醫師或獸醫能迅速地決定和指定預防、阻止或控制病情發展所需要的單個活性成分的有效量。使活性成分的濃度最精確地達到可產生效果而沒有毒性的范圍內需要以活性成分在靶點的利用度動力學為基礎的給藥方案。
當然，第一藥物a)的每日劑量隨多種因素，例如選擇的化合物、治療的特定病情和所需的效果而變化。然而，以約0.1至100mg作為單次劑量或分次劑量處方的每日劑量給以S1P受體激動劑，例如化合物A、B或C，通常即可獲得滿意效果。S1P受體激動劑可通過任何常規途徑給藥，特別是腸內給藥，例如以片劑、膠囊、口服液的形式口服給藥，或以例如注射液或注射混懸液的形式胃腸外給藥。適于口服給藥的單位劑量形式包含約0.1至30mg的成份(a)(例如0.1至25mg)和一種或多種可藥用的稀釋劑或載體。
法倔唑對于人的口服劑量范圍為約0.5至10mg/天，優選約1至約2.5mg/天。依西美坦對于人的口服劑量范圍為約5至200mg/天，優選約10至約25mg/天，或者胃腸外給藥的劑量范圍為約50至500mg/天，優選約100至約250mg/天。如果藥物以單獨的藥物組合物給藥，可按照GB2,177,700中公開的方式給藥。福美坦對于人的胃腸外給藥劑量范圍為約100至500mg/天，優選約250至約300mg/天。阿那曲唑對于人的口服劑量范圍為約0.25至20mg/天，優選約0.5至約2.5mg/天。氨魯米特對人給藥的劑量范圍為約200至500mg/天。
檸檬酸他莫昔芬對人給藥的劑量范圍為約10至40mg/天。
長春花堿對人給藥的劑量范圍為約1.5至10mg/m2天。硫酸長春新堿對人胃腸外給藥的劑量范圍為約0.025至0.05mg/kg體重*每星期。長春瑞濱對人給藥的劑量范圍為約10至50mg/m2天。
磷酸依托泊苷對人給藥的劑量范圍為約25至115mg/m2天，如56.8或113.6mg/m2天。
替尼泊苷對人給藥的劑量范圍為每兩個星期約75至150mg。阿霉素對人給藥的劑量范圍為約10至100mg/m2天，如25或50mg/m2天。表柔比星對人給藥的劑量范圍為約10至200mg/m2天。伊達比星對人給藥的劑量范圍為約0.5至50mg/m2天。米托蒽醌對人給藥的劑量范圍為約2.5至25mg/m2天。
紫杉醇對人給藥的劑量范圍為約50至300mg/m2天。多西他賽對人給藥的劑量范圍為約25至100mg/m2天。
環磷酰胺對人給藥的劑量范圍為約20至1500mg/m2天。苯丙氨酸氮芥對人給藥的劑量范圍為約0.5至10mg/m2天。
5-氟尿嘧啶對人給藥的劑量范圍為約50至1000mg/m2天，如500mg/m2天。卡培他濱對人給藥的劑量范圍為約10至1000mg/m2天。鹽酸吉西他濱對人給藥的劑量范圍為約1000mg/m2/星期。
甲氨蝶呤對人給藥的劑量范圍為約5至500mg/m2天。
托泊替康對人給藥的劑量范圍為約1至5mg/m2天。伊立替康對人給藥的劑量范圍為約50至350mg/m2天。
卡鉑對人給藥的劑量范圍為每四個星期約200至400mg/m2。順鉑對人給藥的劑量范圍為每三個星期約25至75mg/m2。奧沙利鉑對人給藥的劑量范圍為每兩個星期約50至85mg/m2。
伊馬替尼對人給藥的劑量范圍為約2.5至850mg/天，更優選5至600mg/天，最優選20至300mg/天。
阿侖膦酸對人給藥的劑量范圍為約5至10mg/m2天。氯膦酸對人給藥的劑量范圍為約750至1500mg/天。依替膦酸對人給藥的劑量范圍為約200至400mg/天。伊班膦酸對人給藥的劑量范圍為每三至四星期1-4mg。利塞膦酸對人給藥的劑量范圍為約20至30mg/天。帕米膦酸對人給藥的劑量范圍為每三至四個星期約15至90mg。替魯膦酸對人給藥的劑量范圍為約200至400mg/天。
曲妥單抗對人給藥的劑量范圍為約1至4mg/m2/星期。
比卡魯胺對人給藥的劑量范圍為約25至50mg/m2/天。
1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪或其鹽如琥珀酸鹽對人給藥的劑量范圍為約50至1500mg/天、優選100至750mg/天、最優選250至500mg/天。
雷帕霉素或其衍生物(例如40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素)可以約0.1至25mg的劑量范圍給藥。
配方舉例軟膠囊式I化合物例如化合物A鹽酸鹽 30mg聚乙二醇300 300mg聚山梨酯80 20mg----總量350mgS1P受體激動劑(例如包含式X的基團的S1P受體激動劑)在本發明的應用所需的劑量下耐受性良好。例如，在大鼠和猴子中，化合物A的急性口服LD50為＞10mg/kg。
另一方面，本發明涉及S1P激動劑作為促血管生成藥物的用途。近來，誘導新生血管生成已被認可為治療許多疾病(例如心肌血管生成、傷口愈合或糖尿病性血管功能障礙/血管病變)的極佳的靶位。
如上所述，高濃度的S1P受體激動劑(2μM或更高，例如2-5μM或約5μM)顯示抗血管生成作用，同時S1P受體激動劑可抑制VEGF-誘導的血管生成。相反，低濃度(0.1-1μM，例如0.1-0.5μM或0.5-1μM)的S1P受體激動劑具有增進血管生成的效果，同時能夠增強VEGF-誘導的血管生成。因此，S1P激動劑在血管生成中可有雙相作用。
據此，本發明進一步提供8.S1P激動劑，例如含有式X的基團的S1P激動劑，如化合物A或化合物A磷酸鹽，在誘導新血管生成過程中的用途，例如作為促血管生成劑，例如在需要促進血管生成的適應癥中；9.用于治療或預防由抑制新血管生成過程所介導的(例如經抗血管生成因子所介導的)疾病、例如需要促進血管生成的適應癥、例如傷口愈合或治療心肌梗塞或糖尿病性血管功能障礙/血管病變的藥物的制備方法，其包括使用S1P受體激動劑，例如含有式X的基團的S1P激動劑，如化合物A或化合物A磷酸鹽作為性成份。
10.治療或預防由抑制新血管生成過程所介導的(例如經抗血管生成因子所介導的)疾病、例如需要促進血管生成的適應癥、例如傷口愈合或治療心肌梗塞或糖尿病性血管功能障礙/血管病變的方法，其包括給以需要這種治療的個體有效量的S1P受體激動劑，例如含有式X的基團的S1P激動劑，如化合物A或化合物A磷酸鹽。
適合促進血管生成的S1P激動劑包括如上關于癌癥治療所定義的那些化合物，例如含有式X的基團的S1P激動劑或式I至IX的化合物，或其可藥用鹽或酯。優選的S1P激動劑為化合物A磷酸鹽。S1P激動劑可單獨使用，或者與一種或多種促進血管生成的其他藥劑例如VEGF聯合使用。
為促進血管生成，選擇足夠低劑量的S1P受體激動劑很重要，因為高濃度的S1P受體激動劑可抑制血管生成。在將S1P激動劑給藥于患者時，用于提供促血管生成作用的合適的S1P激動劑劑量可通過如上A、B以及C所述的濃度和劑量遞增試驗進行選擇。


圖1顯示，化合物A磷酸鹽可以以鐘形劑量依賴形式強烈地促進毛細血管樣網狀結構形成，同時顯示最大活性在0.5μM左右。
圖2顯示，在0.5-1μM時，化合物A磷酸鹽和化合物A均不削弱VEGF所介導的重建，而是與多肽生長因子協同起作用。
圖3顯示，化合物A磷酸鹽以及S1P所刺激的管柱形成實際上可被百日咳菌外毒素(PTX，50ng/ml)(一種αi/o型雜三聚體G蛋白的抑制劑)完全抑制。這可解釋為，在化合物A磷酸鹽所刺激的生物反應中，可能涉及到EDG-1(S1P1)受體所介導的信號傳導活動。
圖4顯示，在1μM時，本身看起來比S1P低效的鞘氨醇可削弱S1P和化合物A磷酸鹽誘導毛細血管樣結構的能力，同時對VEGF所誘導的管柱形成沒有抑制作用。在這一方面，鞘氨醇的作用表現異于化合物A。數據表明，鞘氨醇與S1P之間的平衡看起來對于最可能經由EDG受體家族的內皮細胞激活/血管生成極其重要。同樣重要的是，高濃度的鞘氨醇和化合物A(2-5μM)可抑制VEGF觸發的管柱形成。
圖5顯示，用0.5μM的化合物A磷酸鹽處理HUVEC可導致ERK1/2的短暫激活，并在第10分鐘時出現磷酸化/激活峰，20分鐘后回復至基線水平。
圖6檢測了是否化合物A、化合物A磷酸鹽、鞘氨醇或S1P也可在HUVEC上誘導組織因子。所發現的數據表明，在這些化合物中，無一可單獨或與其他化合物聯合提高組織因子活性，具體如圖6所示。化合物A與化合物A磷酸鹽可輕微增強VEGF而非TNFα所誘導的組織因子活性。
圖7顯示了化合物C在S1P所介導的HUVEC管柱形成試驗中的作用。所用縮寫如下BSA牛血清白蛋白ECGS內皮細胞生長因子組 ECL增強化學發光S鞘氨醇PBS磷酸鹽緩沖鹽水JNK1/2c-jun-N-末端激酶1/2 RT室溫TF當量組織因子當量EGR-1/NFAT早期生長反應蛋白1/活化T細胞核因子F1P化合物A磷酸鹽(FTY720-磷酸鹽)
S1P激動劑(如含有式X的基團的S1P激動劑)在促進血管生成中的效用可在例如依照下文所述的試驗方法中進行證實。
D.細胞培養和材料在37℃、5％CO2，于補充20％SCS(HyClone，Logan，UT)、1U/ml肝素、50μg/ml ECGS、2mM谷酰胺、100U/ml青霉素以及0.1mg/ml鏈霉素的M199培養液中培養人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。在傳代最多5代后將細胞用于試驗。用含有1％SCS的M199餓細胞5小時以獲得短暫受餓的HUVEC細胞。重組人體VEGF165獲自PromoCell(Heideberg，德國)。磷酸特異性ERK1/2、p38激酶多克隆抗體、無磷酸ERK1/2抗體以及LumiGLO化學發光劑來自New England BioLabs(Beverly，MA)，多克隆IκB抗體來自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，Calif)。過氧化物酶-標記的驢抗兔免疫球蛋白G(Ig G)和綿羊抗小鼠IgG購自AmershamLIFE SCIENCE(Amersham Place，英國)。Immobilon-P轉移膜為Millipore的產品(Bedford，MA)。S獲自Sigma Chemical Co.；S1P來自Biomol。化合物A磷酸鹽儲備液通過如下方案制備。先將化合物A磷酸鹽溶于含有痕量濃HCl的甲醇中(0.5mg化合物A磷酸鹽于500μl加入2μl HCl的甲醇中)。于真空中蒸發所形成溶液中的溶劑，并于0.1％的脫脂BSA在無菌去離子水(500μl)中的溶液(變體1)或于0.5％Triton X-100在去離子水中的溶液(變體2)中重新溶解所得到的殘余物。將所產生的儲備液(2.5mM)超聲處理并于4℃保存。
凝集試驗在80-90％融合度時將細胞種于6孔板中并生長過夜。依照Clauss，M.，J.Biol.Chem.271，17629-17634(1996)，Mechtcheriakova，D.，Blood 93，3811-3823(1999)中所述的方法將細胞自平板剝脫，并分析組織因子活性。簡要的說，在與VEGF(1.5nM)、TNF-α(100U/ml)、S(0.5-2μM)、S1P(0.5-2μM)、化合物A(0.5-2μM)以及化合物A磷酸鹽(0.5-2μM)一起孵育4小時后，將細胞清洗兩次，并然后剝脫移至1ml凝集緩沖液中(12mM醋酸鈉、7mM巴比妥酸二乙酯以及130mM氯化鈉；pH7.4)。將50μl重新混懸的細胞與50μl檸檬酸化的血漿混和，并在用50μl 20mM CaCl2溶液于37℃重新鈣化后，測定其凝集時間。使用獲白兔腦促凝血酶原激酶的標準曲線測定TF當量。
E.蛋白質印跡分析在各種處理后，將細胞用冷的PBS清洗兩次，然后于100μl Laemmli緩沖液中裂解消化，最后剝脫并于95℃加熱5分鐘。使用SDS-PAGE分離總的細胞裂解液并轉移至Immobilon-P膜上。將膜用含0.1％Tween-20和3％脫脂奶的PBS封閉30分鐘，并于RT下，與稀釋于封閉緩沖液中的一抗一起孵育1小時。所得到的膜再用含有0.1％Tween-20的PBS清洗三次，每次5分鐘，然后再于室溫下與過氧化物酶標記的二抗一起孵育1小時。在清洗后，再將膜與ECL試劑一起孵育1分鐘，并如所要求的暴露至膠片。如欲使用其他的抗體重新探測，需再將膜以PBS清洗兩次，然后于55℃使用剝脫緩沖液(62.5mM Tris-HCl，pH6.8，2％SDS，100mM 2-巰基乙醇)剝脫30分鐘，并再于室溫下使用PBS清洗3次，每次5分鐘。在每次免疫檢測后，將膜于4℃、SaranWrap中濕覆蓋保存。
體外Matrigel上的血管生成試驗依照制造工序，在減低了生長因子的Matrigel基質(BD Bioscience)上進行內皮細胞至毛細血管樣結構的形態發生試驗。簡要的說，先將HUVEC進行胰蛋白酶酶解，然后于含大豆胰蛋白酶抑制劑(1mg/ml，Sigma)的無血清的M199中重新混懸。離心后，再將細胞于無血清的培養液中以0.5×105細胞/ml的密度重新混懸，并再將細胞混懸液種于96孔培養板中(Costar，Corning Incorporated)，培養板事先涂以含有或不含有如下各種刺激物的50μl Matrigel1.5nM的VEGF、0.1-2μM的S1P、0.1-2μM的S、0.1-2μM的化合物A、以及0.1-2μM的化合物A磷酸鹽。8小時后，以含3％甲醛的PBS固定Matrigel上的細胞，并于4℃保存。最后使用帶有冷CCD相機(Kappa GmbH，Gleichen，德國)的Nikon Diaphot顯微鏡拍攝影像，并通過直接計數每一試驗重復孔中兩顯微鏡視野中分支點的數目來于影像定量結果。
F.體外Matrigel管柱形成試驗中化合物A磷酸鹽所誘導的內皮細胞形態發生以及可能涉及的Gi-介導的信號傳導路徑使用體外Matrigel血管生成試驗來測定化合物A和化合物A磷酸鹽對內皮細胞形態學分化的影響。內皮細胞形態發生是一復雜的過程，其要求細胞-細胞外基質的相互作用、以及隨之而來的基質重建、刺激移行、細胞-細胞相互作用以及血管周圍蛋白水解。如圖1中所示，化合物A磷酸鹽可以以鐘形劑量依賴形式強烈地促進毛細血管樣網狀結構的形成，并顯示其最大活性位于0.5μM左右。可反應刺激物誘導效力的每個顯微鏡視野中分支點的數目對于化合物A磷酸鹽和S1P也是相當的，并顯著超過VEGF所觸發的效果。與化合物A磷酸鹽相比，0.5-1μM的化合物A本身具有微弱的、但持續增強的作用。0.5-1μM的化合物A磷酸鹽以及化合物A均不削弱VEGF所誘導的重建，而是與多肽生長因子協同起作用(參見圖2)。此外，化合物A磷酸鹽以及S1P所刺激的管柱形成可被百日咳菌外毒素(PTX，50ng/ml)(一種αi/o型雜三聚體G蛋白的抑制劑)完全抑制。這可解釋為，在化合物A磷酸鹽所刺激的生物反應中，可能涉及到EDG-1(S1P1)受體所介導的信號傳導活動(參見如圖3)。在1μM時，本身看起來比S1P低效的鞘氨醇可削弱S1P和化合物A磷酸鹽誘導毛細血管樣結構的能力，同時對VEGF所誘導的管柱形成沒有抑制作用(參見圖4)。在這一方面，鞘氨醇的作用表現異于化合物A。數據表明，鞘氨醇與S1P之間的平衡看起來對于最可能經由EDG受體家族的內皮細胞激活/血管生成極其重要。同樣重要的是，高濃度的S和化合物A(2-5μM)可抑制VEGF觸發的管柱形成。該數據提示，化合物A和化合物A磷酸鹽在體外對血管生成可有雙相的劑量依賴性作用。
G.化合物A磷酸鹽對ERK1/2 MAP激酶的激活經由MAP激酶的信號傳導在多種細胞功能中發揮著重要作用。用0.5μM的化合物A磷酸鹽處理HUVEC可導致ERK1/2的短暫激活，并在第10分鐘時出現磷酸化/激活峰，20分鐘后回復至基線水平(參見圖5)。在HUVEC中沒有檢測到p38激酶和JNK1/2被化合物A磷酸鹽激活。此外，化合物A磷酸鹽可以劑量依賴的方式觸發ERK1/2的激活，并在2μM顯示較強活性。這與管柱形成試驗的結果形成對比，在管柱形成試驗中，化合物A磷酸鹽在2μM時的效力比0.5μM時低。在處理5分鐘至60分鐘的動力學范圍內，化合物A和S均不能在內皮細胞中誘導MAP激酶激活。欲評估炎癥性/NFκB-依賴性程序在內皮細胞的化合物A磷酸鹽所刺激的生物反應中的可能作用，可將膜以抗IκB抗體重新進行檢測。IκB水平不受化合物A磷酸鹽處理的影響。此外，以化合物A磷酸鹽處理內皮細胞可能無法如NFκB依賴性次反應基因那樣，誘導E-選擇素表達。因此，數據有力表明，化合物A磷酸鹽信號傳輸不涉及NFκB的激活(這是內皮細胞急性炎癥反應中的主要級聯反應)。
H.化合物A和化合物A磷酸鹽不誘導內皮細胞組織因子表達。
經典的炎癥激發物TNF-α和主要的血管源性生長因子VEGF兩者對內皮細胞的一個重要的特征性屬性為其上調組織因子的潛能。化合物A、化合物A磷酸鹽、S或S1P均檢測了其是否也可在HUVEC上誘導組織因子。所發現的數據表明，在這些化合物中，無一可單獨或與其他化合物聯合提高組織因子活性(參見圖6)。化合物A與化合物A磷酸鹽可輕微增強VEGF而非TNFα所誘導的組織因子活性。所獲得的數據同時還表明，化合物A、化合物A磷酸鹽、S或S1P與血管源性的VEGF和炎性TNF-α以不同的機理起作用。
I.可通過如下試驗測定S1P受體激動劑與人體S1P受體的結合親和力。人體S1P受體至HEK293細胞中的瞬時轉染克隆EDG受體和Gi蛋白，然后混和相等量的EDG受體Gi-α、Gi-β和Gi-γ的cDNA并使用磷酸鈣沉淀法(M.Wigler等人，Cell.1977；11；223和DS.Im等人，Mol.Pharmacol.2000；57；753)將之用于轉染單層HEK293細胞。簡要的說，將含有25μg DNA和0.25M CaCl2的DNA混合物加至HEPES緩沖的2mM Na2HPO4中。使用25mM氯喹毒化亞融合的單層HEK293細胞，然后將DNA沉淀物加至細胞。4小時后，以PBS和refed培養液(90％1∶1 Dulbecco’s改進的基礎培養液(DMEM)F-12+10％胎牛血清)清洗單層細胞。在加入DNA 48-72小時后，在冰上于含有10％蔗糖的HME緩沖液(單位mM20 HEPES，5 MgCl2，1 EDTA，pH 7.4)中剝脫并收獲細胞，并使用Dounce勻漿器裂解細胞。在以800xg離心后，使用不含蔗糖的HME稀釋上清液，并再以100,000xg離心1小時。將所得到沉淀物重新勻漿，并再次以100,000xg離心1小時。將此粗制的膜狀沉淀物再于含蔗糖的HME中重新混懸、等分標本，并浸入液氮中速凍。將膜于-70℃儲存。通過Bradford蛋白檢測光譜測定蛋白濃度。
使用S1P受體/HEK293膜制備物的GTPγS結合檢測如DS.Im等人Mol.Pharmacol.2000；57；753所述進行GTPγS結合實驗。使用25μg來自瞬時轉染的HEK293細胞的膜制備物在GTP結合緩沖液(單位mM50 HEPES，100 NaCl，10 MgCl2，pH7.5)中測定配體介導的GTPγS至G-蛋白的結合。在10μM GDP和0.1nM [35S]GTPγS(1200Ci/mmol)的存在下將配體加至膜中并于30℃孵育30分鐘。使用Brandel采集機(Gaithersburg，MD)將已結合的GTPγS與未結合的分離，并使用液體閃爍計數器計數。
權利要求
1.一種在有需要的個體中治療實體瘤或抑制實體瘤生長的方法，包括給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑，條件是，當S1P受體激動劑為FTY720或FTY720-磷酸鹽時，所述腫瘤不是乳腺、前列腺、膀胱、腎臟或肺的腫瘤。
2.一種在有需要的個體中治療實體瘤侵入或與此腫瘤生長相關的癥狀、預防腫瘤轉移擴散或預防或抑制微轉移灶生長的方法，其包括給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑。
3.一種在有需要的個體中抑制或控制失控的血管生成，例如1-磷酸鞘氨醇(S1P)介導的血管生成的方法，其包括給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑。
4.一種在有需要的個體中預防或治療由新血管生成過程所介導的疾病或與失控的血管生成相關的疾病的方法，其包括給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑。
5.一種在有需要的個體中增強化療劑的活性或克服化療劑的耐藥性的方法，其包括與所述化療劑一起，同時或依次給予所述個體治療有效量的S1P受體激動劑。
6.根據任何上述權利要求的方法，其中將S1P受體激動劑間斷給藥。
7.根據任何上述權利要求的方法，其包括將治療有效量的S1P受體激動劑和第二種藥物同時或依次共同給藥，所述第二種藥物為化療劑。
8.一種治療淋巴增殖或骨髓增殖異常的方法，其包括向所述個體同時或依次共同給藥S1P受體激動劑和第二種藥物，所述第二種藥物為化療劑。
9.根據任何上述權利要求的方法，其中S1P受體激動劑含有式X的基團 其中Z為H；C1-6烷基；C2-6鏈烯基；C2-6炔基；苯基；被OH取代的苯基；被1至3個選自鹵素、C3-8環烷基、苯基以及OH取代的苯基的取代基取代的C1-6烷基；或CH2-R4z，其中R4z為OH、酰氧基或式(a)的殘基 其中Z1為直連鍵或O，優選O；R5z和R6z相互獨立地為H，或任選被1、2或3個鹵素原子取代的C1-4烷基；R1z為OH、酰氧基或式(a)的殘基；且R2z和R3z相互獨立地為H、C1-4烷基或酰基。
10.一種藥物組合，其包含a)為S1P受體激動劑的第一藥物，以及b)為化療劑的輔藥。
11.根據權利要求10所述的組合，其中的輔藥選自i.芳香酶抑制藥，ii.抗雌激素藥、抗雄激素藥或戈那瑞林激動劑，iii.拓撲異構酶I抑制劑或拓撲異構酶II抑制劑，iv.微管活化劑、烷化劑、抗腫瘤抗代謝藥物或鉑配合物，v.靶向/降低蛋白或脂類激酶活性或者蛋白或脂類磷酸酶活性的化合物，其它抗血管生成化合物或可誘導細胞分化過程的化合物，vi.緩激肽1受體或血管緊張素II拮抗劑，vii.環加氧酶抑制劑、二膦酸類化合物、組蛋白脫酰酶抑制劑、肝素酶抑制劑、生物學應答修飾劑、遍在蛋白化抑制劑或能阻斷抗細胞凋亡途徑的抑制劑，viii.Ras致癌同種型抑制劑，ix.端粒末端轉移酶抑制劑，x.蛋白酶抑制劑、基質金屬蛋白酶抑制劑、蛋氨酸氨基肽酶抑制劑或蛋白體抑制劑，和/或xi.mTOR抑制劑。
12.一種治療或預防由抑制新血管生成過程所介導疾病的方法，其包括向需要所述治療的個體給予有效量的S1P受體激動劑。
13.根據權利要求12所述的方法，其中S1P受體激動劑含有如權利要求9中所定義的式X的基團。
全文摘要
本發明提供了使用1－磷酸鞘氨醇受體激動劑，并可任選地聯合應用化療劑來治療實體瘤，例如腫瘤侵入、特別是抑制或控制失控的血管生成的方法。本發明還包括1－磷酸鞘氨醇受體激動劑和化療劑的組合。
文檔編號A61P9/00GK1652757SQ03811194
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月15日 優先權日2002年5月16日
發明者T·鮑姆魯克爾, V·布林克曼, K·R·拉蒙塔涅, P·T·拉索塔, D·梅希特謝里安科娃, J·M·伍德 申請人:諾瓦提斯公司