專利名稱：用于節育和激素替代療法的具有孕酮受體調節活性的5－{2－羥基－3－[′1－(3－三氟 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種通式(I)所表示的非甾體孕激素，以及所述化合物選擇性地調節孕酮受體對不同靶組織的調節作用的應用，即本發明涉及對不同的靶組織有分離活性功能(dissociated activity profile)的孕激素，優選為具有子宮/乳房分離作用。本發明還涉及所述化合物相對于乳房組織孕酮受體的介導作用選擇性地增強子宮組織孕酮受體的介導作用的應用和方法。由于本發明孕激素獨特的分離活性和選擇性功能，本發明特別涉及所述化合物在節育上的應用，尤其可以用于口服避孕藥、激素替代療法和婦科病癥的治療。本發明的孕激素特別適合用于不含雌激素的口服避孕藥。
背景技術：
孕酮是一種獨特的生殖激素，它在女性生殖系統中具有決定性的作用。孕酮主要的靶器官是子宮、卵巢、乳房和下丘腦-垂體軸。除主要作為婦女妊娠控制劑(例如，口服避孕藥(OC))應用外，孕激素可以任選地與雌激素相結合，廣泛應用于激素替代療法(HRT)。孕激素也用于治療一些婦科病癥，例如痛經、子宮內膜異位和因激素不足或失衡導致的功能失調性子宮出血病。由于孕激素的某些作用可能在某些應用中不合需要，或與除孕激素受體外的其他受體的交叉反應，所以開發新型的孕激素以改善其活性功能成為極大的挑戰。另外對于腫瘤學等治療應用的探索也要求孕激素有新的活性功能。
最近，在WO 98/54159中披露對孕酮受體有非常強的親和力，但額外具有雄性激素作用的非甾體孕激素。這些孕激素不僅適用于婦女節育(FC)和HRT(任選地和雌激素結合)，而且可用于男性FC、男性HRT和男性綜合癥的治療。
WO 00/32584披露特殊的非甾體糖皮質激素，其抗炎活性和代謝作用間具有明顯的分離。它們對于孕激素受體的親和力高，但它們的孕激素潛力并不顯著。
最后，DE 100 38639.3披露對糖皮質激素受體具有很強的親和力糖皮質激素，其從而具有抗炎作用以及抗過敏作用、免疫抑制和抗增殖作用，可用于治療包括關節炎和過敏癥等的疾病。
然而，特別在女性節育和HRT領域對下述孕激素有很大的需求，該孕激素對其他激素受體的親和力較低，而對不同的PR靶組織或器官如在乳房和生殖道中有很強的分離作用。
特別地，由于許多流行病學研究有關乳腺癌發病率與應用復合口服避孕藥(COC)或HRT特別是長期應用的關系，提供具有抗乳房組織增殖潛力且同時對子宮內膜具有有益作用的作用分離的孕激素似乎是有益的。(見例如K.E.Malone等，Epidemiologic Reviews 1993，15，80-97和Standford等，Epidemiologic Reviews 1993，15，98-107)。盡管該風險是矛盾的和有爭議的，但是有證據顯示在某些環境下多年服用孕激素可能會增強普通乳房上皮細胞的有絲分裂活性。所以，提供乳房中有益的作用諸如抗增殖作用并且對卵巢和/或子宮有傳統的孕激素作用的分離活性功能的孕激素是適宜的。
最近，有試驗對具有組織特異性的孕激素受體配體進行篩選，見WO 02/054064。一種篩選具有分離活性功能的孕酮受體(PR)配體的方法基于孕激素表達為兩種不同的同種型(PR-A和PR-B)的事實，該同種型似乎可被具有PR-A或PR-B選擇性的化合物彼此獨立地激活。
這兩種PR同種型在迄今為止所檢驗的所有孕酮靶器官上均有表達(例如乳房、子宮等)。但是，有明顯證據表明PR-A和PR-B功能以組織特異性方式調節對孕酮的反應。排除同種型特異性的小鼠表明PR-A和PR-B對同一靶器官具有不同的功能。在這些研究的基礎上，PR-B似乎是最重要的負責乳腺增殖和分化的受體，而孕激素對子宮上皮細胞和排卵的抗增殖作用很可能是由PR-A介導的(B.Mulac-Jericevic，Science2000，289，1751-1754；Orla Conneely，Endocrine Society Meeting，Toronto，June 2000)。
因此，在WO 02/054064中披露的發明基于下述新理論，即PR活性的同種型特異性配體可能導致在激素治療和避孕中孕激素活性的調節具有組織選擇性。然而，WO 02/054064提供了用于確定潛在的PR同種型和/或組織特異性PR配體的工具，而本發明提供了特定的非甾體孕激素，其具有顯著的PR同種型選擇性，同時對不同的PR靶器官具有令人驚奇的分離作用，特別是子宮/乳房的分離活性功能。
發明目的如上所述，本發明的一個目的是提供用于FC、HRT和婦科病癥治療的新型孕激素。另一個目的是提供適用于不含雌激素的口服避孕藥的新型孕激素。特別地，希望可以提供對某些PR靶器官如子宮具有有益作用，而不會增強對其他PR靶器官的副作用如乳房上皮細胞的增殖/分化的新型孕激素。因此，本發明希望提供一種對不同的靶組織或器官有分離作用功能的新型孕激素，優選為子宮/乳房特異性孕激素。
本發明的另一目的是提供一種方法，該方法用于相對于優選為乳房組織的次選(second selected)組織選擇性地調節優選為子宮組織的首選(first selected)組織中孕酮介導的作用。提供下述方法特別有益，即在子宮選擇性增強抗增殖作用而在乳房組織阻止諸如增殖和分化的不良作用。
本發明的另一個目的是提供PR同種型選擇性的(優選為PR-A相對于PR-B的選擇性)孕激素。本發明也希望能提供選擇性地調節優選為PR-A的PR同種型介導的作用的方法，以及選擇性地激活優選為PR-A的PR同種型轉錄的方法。
所有這些目的令人驚奇地通過通式(I)的孕激素、所述孕激素的應用以及以下進一步詳述的本發明調節孕酮介導的作用得以實現。
發明內容
第一方面，本發明提供一種如下的通式(I)的化合物。本發明優選的化合物是(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮。
第二方面，本發明提供一種包括單獨(例如在不含雌激素的口服避孕藥中)或任選地與作為附加成分的17α-乙炔基雌二醇或其他的雌激素結合的通式(I)化合物的藥物組合物。
第三方面，本發明提供通式(I)的化合物在治療中的應用。
第四方面，本發明提供包含通式(I)化合物的藥物組合物在治療中的應用。
第五方面，本發明提供通式(I)所示的化合物或包括所述化合物的藥物組合物在制備藥劑中的應用。該藥劑用于相對于優選為乳房組織的次選組織選擇性地調節優選為子宮組織的首選組織的孕酮受體介導的作用，尤其是用于節育、激素替代療法或婦科病癥的治療。
第六方面，本發明提供通式(I)化合物作為避孕藥的應用，優選為不含雌激素的口服避孕藥，例如，“僅含孕酮的藥丸(progesterone-onlypill)”(POP)。
第七方面，本發明提供相對于優選為乳房組織的次選組織選擇性地調節優選為子宮組織的首選組織的孕酮受體介導的作用的方法，尤其是用于節育、激素替代療法或婦科病癥的治療。該方法包括向個體給藥通式(I)化合物的步驟。
此外，第八方面，本發明提供通式(I)化合物在制備藥劑中的應用，該藥劑用于相對于孕酮受體同種型B轉錄選擇性激活孕酮受體同種型A轉錄以及相對于孕酮受體同種型B介導的作用選擇性增強孕酮受體同種型A介導的作用。
第九方面，本發明提供相對于孕酮受體同種型B轉錄選擇性激活孕酮受體同種型A轉錄以及相對于孕酮受體同種型B介導的作用選擇性增強孕酮受體同種型A介導的作用的方法。
圖1證明切除卵巢的未成熟雌性大鼠皮下應用化合物((+)-1)(與0.3mg/kg R5020等效的((+)-1)劑量)與標準的孕激素普美孕酮(R5020)相對比，對末端(terminal)和小泡終蕾(alveolar endbud)生成的刺激作用的差別。
圖2顯示通過MIB-5染色法，應用化合物((+)-1)與標準的孕激素普美孕酮(R5020)相比，對未成熟切除卵巢雌性大鼠的乳房上皮細胞增殖的刺激作用。
圖3涉及未成熟切除卵巢雌性大鼠皮下應用R5020(標準孕激素)和化合物((+)-1)后對末端和小泡終蕾生成的刺激作用(臨界值)。
圖4證明與以雌二醇處理的對照組相比化合物((+)-1)對大鼠子宮生長(子宮濕重和子宮干重；上皮厚度)的抗雌激素作用。
具體實施例方式
第一方面，本發明提供如通式(I)所示的非甾體孕激素化合物或其藥物學可接受的衍生物或類似物 其中R1和R2彼此獨立地是-H或-F，R3是-CH3或-CF3，以及Ar是 或 限制條件為該化合物不是5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮。
為本發明的目的，如上所述通式(I)化合物的“藥物學可接受的衍生物或類似物”為結構衍生自和/或基本相似于上述通式(I)結構的化合物以及在定性和/或定量方面與通式(I)化合物獲得的生物學活性(體外和/或體內)也基本相似的化合物。
如通式(I)的化合物具有立體中心(stereogenic center)，其存在兩種不同的立體異構體(對映體)形式。因此本發明化合物可提供為外消旋體，即對應體的混合物(例如記作(±))。然而，例如通過對映體選擇性合成或通過應用例如在以下實施例1a)中所述的標準分離方法，本發明化合物還可提供為單獨的(+)或(-)、即右旋或左旋對映體。應知道，通過披露(+)或(-)異構體，同樣披露了這些異構體固有的絕對構型。
標準分離方法在熟練技術人員的能力范圍之內。例如，可以通過一種光學活性的載體(例如，CHIRALPAK ADTM)以色譜法將外消旋體分離為純異構體。此外，還可以下述方法分離，即使通式(I)的(外消旋)化合物的游離羥基與光學活性酸(如α-羥基苯基乙酸，樟腦磺酸或酒石酸)進行反應，生成非對映異構體的酯，該酯可通過分步結晶或通過色譜法并隨后皂化生成光學上的純對映體。
本發明優選的化合物是上述的通式(I)化合物，其為(+)對映異構體。
通式(I)化合物的實例如下外消旋體，(+)和(-)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮(((±)-1)，((+)-1)和((-)-1))，外消選體，(+)和(-)-6-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮(((±)-2)，((+)-2)和((-)-2))，外消選體，(+)和(-)-6-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮(((±)-3)，((+)-3)和((-)-3))，外消選體，(+)和(-)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮(((±)-4)，((+)-4)和((-)-4))，外消選體，(+)和(-)-6-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮(((±)-5)，((+)-5)和((-)-5))，以及外消選體，(+)和(-)-6-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮(((±)-6)，((+)-6)和((-)-6))，本發明特別優選的化合物如下(((±)-1)、((+)-1)、((-)-1))，(((±)-2)、((+)-2)、((-)-2))，(((±)-3)、((+)-3)、((-)-3))，(((±)-4)、((+)-4)和((-)-4))。
本發明最優選的化合物是5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮，下文稱作化合物(1) 如上所述，5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮的(+)-對映異構體為特別優選并指定為((+)-1)。(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((+)-1)的合成路線以及該化合物的物理數據如實施例1所述。此化合物在體內以及體外實驗中的試驗結果如實施例2、3、4和5中所述。
通過這些實施例可以證明本發明優選的孕激素((+)-1)具有理想的體內和體外功能。就化合物((+)-1)的體外功能而言，在以下實施例5中證明化合物((+)-1)是選擇性的PR-A激動劑且顯示出高PR-A相對PR-B的特異性(本發明化合物的PR同種型特異性的詳細情況在下述本發明第八和第九部分中給出)。如所證實，化合物((+)-1)選擇性地激活PR-A轉錄，從而選擇性地增強PR-A介導的作用。
就化合物((+)-1)的體內活性功能而言，其具有高度分離性。具體而言，((+)-1)在子宮對維持妊娠顯示出很高活性，而對乳腺活性相當低，即((+)-1)不激活乳腺的增殖和分化(見實施例3的大鼠實驗)，特別是在妊娠得以維持的劑量范圍內。
化合物((+)-1)是迄今為止所確定的在體內最有效的孕激素之一。在排卵抑制實驗(見實施例2)中，化合物((+)-1)至少與本試驗所用的標準孕激素R5020(普美孕酮)同樣有效。在大鼠的維持妊娠實驗中(見實施例3)，化合物((+)-1)的效力是左炔諾孕酮(LNG)的大約10倍。此外，在Clauberg實驗(兔子宮內膜變性；見實施例4)中，記錄表明((+)-1)皮下和口服應用具有同樣的孕激素效力。這證明((+)-1)口服給藥時具有很強的活性。
此外，盡管顯示對雄激素受體(AR)具有中等的結合力，化合物((+)-1)在體內顯示無雄性激素作用，也沒有抗雄性激素作用。在體內雄性激素和抗雄性激素作用的缺乏在切除睪丸的大鼠實驗中得以證明(前列腺重量和精囊的變化)。在大鼠妊娠維持實驗中，即使給予高于維持妊娠所需100倍的劑量時，仍未發現化合物((+)-1)的雄性激素作用。另外，盡管發現化合物((+)-1)對糖皮質激素(GR)有十分強的親和力，但是它在體內似乎并沒有表現任何糖皮質激素或抗糖皮質激素作用，此結論可由旨在測量胸腺重量改變的試驗得出。最后，因為化合物((+)-1)在體外與鹽皮質激素受體(MR)和雌激素受體α(ERα)以微乎其微的親和力相結合，預期其沒有同這些受體交互反應導致的MR或ERα激素作用。
就上述作用與活性而言，化合物((+)-1)被認為是本發明中通式(I)的所有其他化合物的實例。
由于以上所證實的本發明中的新型孕激素的有益作用，尤其是(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮，即化合物((+)-1)，這些孕激素尤其適用于避孕藥，特別是不含雌激素的口服避孕藥，例如僅含孕激素的藥丸(POP)。
第二方面，本發明提供包含上述通式(I)所定義的、且不是5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮的孕激素的藥物組合物。優選的藥物組合物包含上述優選的化合物。本發明更優選的藥物組合物包含5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮(1)，最優選為(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((+)-1)。
例如就要治療/影響的癥狀或應用的方式而言，根據所需的應用，本發明的藥物組合物——當不作為不含雌激素的口服避孕藥應用時(其為本發明孕激素優選的應用之一)——除優選為((+)-1)的通式(I)化合物外，還含有雌激素成分。例如，在該藥物組合物試圖用作(口服)避孕藥(其應用將在下面做更詳細的解釋)的情況下，通常被用于復合(口服)避孕藥的雌激素是適當的。盡管任何天然雌激素(尤其是雌三醇或雌二醇)或合成雌激素、甾體或非甾體都可應用，在這方面尤其是用于口服給藥的優選的雌激素是17α-乙炔基雌二醇及其酯、醚以及其他17α-乙炔基雌二醇的衍生物。
此外，衍生于雌二醇或乙炔基雌二醇的雌三烯-3-氨基磺酸酯(WO96/05216和WO 96/05217)可用于和通式(I)所示的化合物、優選化合物((+)-1)相結合。衍生于雌烷的14α，15α-亞甲基甾體化合物，尤其是14α，15α-亞甲基-17α-雌二醇和相應的3-氨基磺酸酯衍生物也適用于這個方面。
為應用于激素替代療法(其應用將在下文做更詳細的解釋)，可任選地與本發明通式(I)的孕激素、優選為化合物((+)-1)相結合的雌激素優選為雌二醇、雌二醇戊酸酯或者其他的雌二醇酯以及結合的(天然的，例如馬的)雌激素。
在本發明的藥物組合物中，如上通式(I)所定義的化合物，尤其是化合物((+)-1)，和任選的其他雌激素成分，優選為17α-乙炔基雌二醇必須為(藥物學)有效的量。給藥的劑量(即，“(藥物學)有效的量”)視所需治療的病癥、或者其他任何所需的應用以及給藥方式而在較大的范圍內變化。其可以包括任何對所欲的治療或應用有效的劑量。“藥物學有效的量”的確定在本領域熟練的技術人員能力范圍之內。
更準確地，在用于任何設想的應用(即口服避孕藥(復合口服避孕藥以及不含雌激素的口服避孕藥，例如“僅含孕激素的藥丸”)，HRT和對婦科病癥以及其他疾病病癥的治療)的本發明藥物組合物中，向個體給藥優選為化合物((+)-1)的通式(I)化合物的每日劑量在0.01至2mg范圍內通常被認為是適當的。然而，對于特定的應用尤其適宜的劑量如下當優選為化合物((+)-1)的本發明孕激素與如上定義的雌激素結合用于作為復合口服避孕藥的藥物組合物中時，個體給藥適宜的每日劑量為10μg至100mg。個體給藥適宜的每日劑量優選為10μg至1mg。
當優選為化合物((+)-1)的本發明孕激素用于如“僅含孕激素的藥丸”(POP)的不含雌激素的口服避孕藥的藥物組合物中而不含任何其他雌激素成分時，個體給藥適宜的每日劑量為10μg至1mg，更優選為30μg至300μg或10μg至100μg，而低至1μg至10μg的劑量范圍也可以應用。
當優選為化合物((+)-1)的本發明孕激素用于HRT用藥物組合物中時，個體給藥適宜的每日劑量為10μg至10mg，更優選為10μg至1mg(相當于醋酸甲羥孕酮(MPA)等效劑量的1/100)，最優選為10μg至100μg。
當優選為化合物((+)-1)的本發明孕激素用于除避孕藥或HRT的其他應用的藥物組合物時，如治療婦科病癥如經前期綜合癥(其顯示為頭痛、抑郁癥狀、水潴留等)、痛經、子宮內膜異位、肌瘤或功能失調性子宮出血，其給藥量通常同上述用于COC、POP和HRT的范圍相同，但也可視所欲達到的效果而不同于這些值。
當優選為化合物((+)-1)的本發明孕激素與優選為17α-乙炔基雌二醇的雌激素成分結合用于如上定義的藥物組合物中時，雌激素成分個體給藥適宜的每日劑量為(或等效于)0.01至0.05mg。優選為0.015至0.03mg的17α-乙炔基雌二醇。
本發明中的孕激素，尤其是化合物((+)-1)，與優選為17α-乙炔基雌二醇的雌激素成分結合給藥用于優選為復合口服避孕藥(COC)的避孕藥或HRT中時，孕激素和雌激素可以同時給藥，例如在同一片劑中，或者也可根據特定方案分別甚至通過不同途徑例如口服和非胃腸道給藥。在避孕藥(如不含雌激素的口服避孕藥)和HRT應用中，優選為化合物((+)-1)的如上所定義的本發明孕激素和任選的(為復合口服避孕藥時)如上所定義的雌激素成分的每日劑量可在整個女性月經周期內維持不變，或可在女性月經周期內相互獨立地變化，如公知的兩級或多級制劑，其中孕激素以及雌激素的濃度在月經周期的兩個或多個階段內升高。此外，在序貫應用中設想在周期第一階段內單獨給藥雌激素成分，在周期第二階段內加入孕激素。并且，與傳統的口服避孕藥相同，本發明的孕激素，特別是化合物((+)-1)，以及任選的如上所定義的另外的雌激素成分在28天的周期內服用y＝28-x天后可被打斷x天，其中x可為例如7、6、5、4或更少，且由此y可為例如21、22、23、24或更多。在不含雌激素的口服避孕藥例如為POP的情況下，本發明的孕激素，特別是化合物((+)-1)的每日給藥不應被打斷。
本發明中藥物組合物可以本領域公知的方法制備，下文將進行更為詳細的解釋。視所欲給藥的方式以及所用活性化合物的特定性能如溶解度、生物利用度等而定，公知公用的佐劑以及其他合適的載體、稀釋劑、矯味劑等都可應用。合適的載體和佐劑為下列文獻中所推薦用于藥學、化妝品和相關領域的Ullmann’s Encyclopedia of Technical Chemistry，Vol.4，(1953)，pp.1-39；Journal of Pharmaceutical Sciences，Vol.52(1963)，p.918ff；H.v.Czetsch-Lindenwald，“Hilfsstoffe für Pharmazie und angrenzendeGebiete”Pharm，Ind.2，1961，p.72ff；Dr.H.P.Fiedler，Lexikon derHilfsstoffe für Pharmazie，Kosmetik und angrenzende Gebiete，Cantor KG，Aulendorf in Württemberg，1971.
如上所述，通式(I)的孕激素尤其是化合物((+)-1)或者含有所述化合物的不含(如在不含雌激素的口服避孕藥中)或包括其他的雌激素成分例如17α-乙炔基雌二醇的藥物組合物的適宜的服用方式是口服，例如通過片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、顆粒劑、溶液劑、乳劑或者混懸劑等。如上所述適于本發明目的的化合物可與公知公用的佐劑和載體混合用于口服給藥藥物組合物的制備，例如阿拉伯樹膠、滑石、淀粉、糖(例如甘露糖、甲基纖維素、乳糖等)、明膠、表面活性劑、硬脂酸鎂、含水或不含水的賦形劑、石蠟衍生物、交聯劑、分散劑、乳化劑、滑潤劑、防腐劑、調味劑(例如精油等)、或者增溶劑(例如苯甲酸芐酯或苯甲醇)。在藥物組合物中，活性成分還可分散于微粒如納米顆粒組合物中。
然而，還設想其他的應用方式，如非胃腸道給藥，例如腹膜內、肌肉(如通過含水、油性或其他溶液注射劑，例如通過儲庫型注射劑，其中激素由儲庫緩慢釋放進入血液，并從而傳送至靶器官例如下丘腦、垂體和子宮)、皮下或透皮應用。對于非胃腸道給藥，可將活性試劑溶解或懸浮于生理可接受的稀釋劑中，例如含有或不含有增溶劑、表面活性劑、分散劑或乳化劑的油。作為油，例如可使用且不限于橄欖油、花生油、棉籽油、大豆油、蓖麻油和芝麻油。如本領域中所公知，可通過用于透皮傳遞活性試劑的特定設計、任選地含有特定滲透促進劑的合適貼劑實現透皮應用。此外，乳劑、軟膏、霜劑或凝膠也可用于透皮傳遞。
應用的另一種方式是通過埋植含有惰性載體材料的儲庫型植入劑。該儲庫型材料可為例如生物可降解聚合物或如硅酮橡膠的合成聚硅氧烷。該植入劑設計用于在較長的時期內(例如3至5年)以被控制的方式釋放活性藥劑。再一種適宜的給藥方式是通過陰道內裝置(例如陰道環)或子宮內系統(IUS)，其含有在延長的時期內控釋如本發明的孕激素和/或雌激素的活性藥劑的儲庫。這種IUS(例如MIRENATM)在植入子宮腔后可在長達5年(或直到系統被移除)時間內以確定量持續釋放激素。孕激素和/或雌激素的每日釋放量對應于上述的每日劑量。
第三方面，本發明提供通式(I)所示的化合物或其藥物學可接受的衍生物或類似物在治療中的應用 其中R1和R2分別獨立是-H或-F，R3是-CH3或-CF3，以及Ar是 或 但限制條件是該化合物不是5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮。
第四方面，本發明提供藥物組合物在治療中的應用，該藥物組合物包括如上所定義的通式(I)所示的化合物，但限制條件為該化合物不是5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮。
在本發明的第三和第四方面中，用于治療的優選的化合物和組合物和本發明的第一和第二方面中所述的優選的化合物和組合物是一樣的。優選地，本發明的化合物和組合物，尤其是化合物((+)-1)或包含化合物((+)-1)的藥物組合物，可例如作為(復合)口服避孕藥(COC)、不含雌激素的口服避孕藥例如僅含孕激素的“微丸”(minipills)(POP)、避孕貼劑、注射劑、植入劑或子宮內系統(IUS)用于節育，或任選與孕激素特別是17α-乙炔基雌二醇結合應用于激素替代療法或婦科病癥的治療，如痛經、子宮內膜異位、肌瘤、經前期綜合癥、功能失調性子宮出血病等。對其他可治療的疾病或例如在避孕領域的其他應用的解釋將在下文本發明第五和第六方面進行討論。
第五方面，本發明提供通式(I)所示的化合物或其藥物學上可接受的衍生物或類似物在制備相對于次選組織選擇性地調節首選組織的孕酮受體介導的作用的藥劑中的應用 其中R1和R2分別獨立地是-H或-F，
R3是-CH3或-CF3，以及Ar是 或 但是包括了化合物5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮，而此化合物被本發明的第一、二、三和第四方面從通式(I)的范圍內排除。
如前文所公開的本發明的各個方面，特別是第一方面，如上所述的相同的通式(I)化合物是優選的用于本發明目的的化合物。因此，化合物(I)，尤其是化合物((+)-1)即(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮，或其藥物學可接受的衍生物和類似物，對于本發明的第五方面來說，同樣是最優選的化合物。
在本發明的這個方面的目的中，“選擇性地調節”PR介導的作用是指如上所述的通式(I)所示的化合物對首選的靶組織可以達到一種或幾種作用，與次選的靶組織中的所述配體導致的作用相比這些作用的種類不同(例如，抑制、刺激或不產生作用)和/或強度不同(例如，弱、強和/或持續長或短)。
應當明白，本發明的益處當然不止限于首選和次選組織本身，而是同樣旨在首選和次選器官，因此本發明的第五方面還涉及通式(1)的如上所定義的化合物(且包括被本發明的第一、二、三和第四方面從通式(I)的范圍內排除的化合物5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮)在制備相對于次選組織選擇性地調節首選組織的PR介導的作用的藥劑中的應用。
為了本發明的目的，首選的靶器官優選為生殖道，即主要為子宮，次選靶器官為乳房，特別是乳腺。相應地，首選的靶組織優選為子宮組織，次選的靶組織優選為乳房組織。這樣，本發明第五部分的化合物相對優選為子宮組織的首選靶組織和優選為乳房組織的次(即不同的)選靶組織顯示出分離活性功能。
優選地，“相對于次選組織選擇性地調節首選組織的PR介導的作用”在本發明特定的上下文中是指選相對于所述優選為乳房組織的次選組織在所述優選為子宮組織的首選組織中選擇性地提高PR介導的作用。換句話說，通過本發明的方法和應用，相對(即對比)于次選組織(優選為乳房組織)中的PR介導的作用，首選組織(優選為子宮組織)中的PR介導的作用被選擇性地增強，即在所述首選和次選靶組織觀察到對PR介導的作用分離。
術語“相對于次選組織選擇性地調節首選組織的PR介導的作用”并未因此意圖限于首選和次選組織中PR介導的作用的某些絕對的值，而是包括下述情況，其中，例如次選組織(優選為乳房組織)中誘導的PR介導的作用低或根本檢測不到，而在首選組織(優選為子宮組織)中誘導的PR介導的作用非常顯著或僅中等，但無論如何相對次選組織中誘導的PR介導的作用有所提高。
最優選地，上述本發明第五部分所定義的本發明化合物相對乳房中不良的PR介導的作用如乳房上皮細胞的增殖/分化，發揮對生殖道中的PR介導的有益的和/或保護的作用如維持妊娠，并且還維持傳統的孕激素作用如抑制排卵等。
因此，本發明提供具有明顯分離的孕激素活性功能的孕激素化合物，其能夠在一個孕酮靶器官如子宮引發所需的有益的效果，而在另一個孕酮靶器官例如乳房不引發不良作用如乳房組織的增殖/分化(其表現為乳腺末端終蕾的加速生成)。然而，本發明的益處并不僅限于分離的子宮/乳房組織功能，其同樣可用于有關孕酮受體調節的其他靶組織的結合。
用于本發明這方面的如上所定義的通式(I)的優選為化合物((+)-1)的化合物實際上顯示出分離的活性(子宮對乳腺)在下文例如實施例3中得以證實，其中據證實本發明的化合物，特別是化合物((+)-1)，相對于維持妊娠和就乳腺末端終蕾的增殖而論的在乳房組織顯著降低的孕激素活性來說，在子宮顯示出體內強促孕活性。實施例中還包括生物測試的詳細描述，該生物測試用于測定某一化合物是否實際上相對于優選為乳房組織的次選組織選擇性地調節優選為子宮組織的首選組織的PR介導的作用。
然而，可以這樣籠統地說，為測定某一化合物是否實際上相對于另一靶組織選擇性地調節確定的靶組織的PR介導的作用，優選相對于由已知的標準孕激素配體如標準孕激素R5020(普美孕酮)所產生的作用測定所述化合物引發的作用的種類(即是否該化合物抑制、不影響、增強或維持所述靶組織中的PR介導的作用)以及所引發作用的強度。然后優選在考慮到預期的醫療適應癥或預期的應用(例如節育或HRT等)的情況下，將所測化合物在第一和第二靶組織中所產生的效果加以比較和評價。在一方面體內實驗和另一方面體外實驗或者聯合體內/體外應驗的基礎上，對組織特定性孕激素受體配體的篩選實驗詳敘于WO02/054064，其所公開的內容并入本文作為參考。例如，測定某一化合物是否相對于乳房選擇性地誘發子宮或卵巢的PR介導的作用的試驗為對嚙齒動物乳房上皮細胞增殖/分化的生物測定、嚙齒動物妊娠維持試驗或子宮內膜增殖/分化試驗、以及嚙齒動物的排卵抑制試驗或排卵過度試驗。然而，如前所述，本發明并不僅限于子宮/乳房選擇性孕激素，而是同樣適用于涉及PR介導的作用的其他組織或器官。在并非如上所述的優選組織的所需的靶組織中選擇并進行如上所述的適宜的體內試驗，以及相對于適宜的標準孕激素測定某種所測孕激素所誘發的作用無疑在熟悉本領域人員的知識范圍內。
由于上文所述的通式(I)的孕激素，尤其是化合物((+)-1)對不同孕酮靶器官特別是乳房和生殖道中PR介導的作用具有顯著的分離活性功能，由本發明化合物(及任選的其他雌激素成分)制備的藥劑適用于治療某些婦科病癥以及用于HRT。本發明化合物作為避孕藥的應用并不總是醫療適應癥，而是屬于本發明的第六個方面，為此將在下文加以討論。應知道婦科病癥包括并不限于例如子宮內膜異位、肌瘤、痛經、經前期綜合癥(PMS，其為許多癥狀的集合名詞，如下腹疼痛、頭痛、腫脹、抑郁、易怒等，在月經之前六到八天許多婦女都體驗過這些癥狀)、功能失調性子宮出血癥(由于激素缺乏或不平衡導致)。本發明的化合物也可控制月經周期不規則。HRT主要用于減輕更年期癥狀如更年期綜合癥(例如潮熱，盜汗)、骨質疏松癥、粘膜干燥以及心理癥狀(例如抑郁)。甚至有有力證據表明，HRT預防心血管疾病、阿爾茲海默氏病、結腸癌或其他疾病的發展。
至于設想的以及優選的應用方式、設想的以及優選的劑量、設想的以及優選的其他藥劑成分和任選的其他雌激素成分可參考本發明的第二方面。彼處所有有關合適的、優選的、更優選的以及最優選的實施方案的敘述都同樣適用于本發明的第五方面，即包括被本發明的第一、二、三和第四方面從通式(I)的范圍內排除的化合物5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮的通式(I)化合物在制備相對于次選組織調節首選組織PR介導的作用的藥劑中的應用。本發明該方面(以及本發明的其他方面)的優選實施方案也包含于本發明各個方面相應的從屬權利要求中。
鑒于本發明第五方面涉及通式(I)所表示的化合物或其藥物學可接受的衍生物或類似物的單純醫療目的的應用，本發明第六方面涉及通式(I)化合物或其藥物學可接受的衍生物或類似物作為避孕藥的應用。
其中R1和R2分別獨立是-H或-F，R3是-CH3或-CF3，以及Ar是 或 但限制條件是該化合物不是5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮。
盡管一般的節育以及特別是避孕可在特定環境下由于單純的醫療原因(并因此使這方面與上述本發明的第五方面有關)應用，避孕(即預防懷孕)通常被認為并非意欲預防或治療特定疾病。不過，或者單獨使用孕激素(如不含雌激素的口服避孕藥，例如POP)還是與雌激素聯合使用(如COC)的避孕都具有除抑制妊娠之外的有益(醫療上的)作用。已知避孕藥能夠治療某些病癥，如月經周期中的不定期出血或者具有上文本發明第五部分所列舉癥狀的經前期綜合癥。通常避孕藥還對皮膚的外觀有積極的影響。此外，服用避孕藥的婦女更少患有盆腔炎(PID)，并可以減少患卵巢、子宮內膜和結腸直腸癌癥的危險。
如上文所提到的，本發明的新型孕激素尤其是化合物((+)-1)適用于不含雌激素的口服避孕藥，例如僅含孕激素的“微型藥丸”(POP)。這些不含雌激素的口服避孕藥對那些因為某些雌激素作用而不耐聯合使用雌激素—孕激素但仍想要享受片劑形式激素避孕藥的好處的婦女來說是一種合適的選擇。此外，不含雌激素的口服避孕藥對那些正在哺乳的婦女來說也是一種不錯的選擇，由于在哺乳期由于雌激素抑制乳汁的生成，因此服用復合雌激素—孕激素避孕藥是不妥的。
本發明的新型孕激素尤其是化合物((+)-1)可不僅用于完全不含任何雌激素成分的口服避孕藥，還可用于基本不含雌激素的口服避孕藥。“基本不含雌激素”應理解為是指雌激素的量比在雌激素—孕激素復合型口服避孕藥中通常所含有的量低。
然而，除了上述僅含孕激素(即，不含雌激素的口服避孕藥)或結合雌激素的避孕藥的優點之外，包括上述本發明孕激素尤其是化合物((+)-1)的避孕藥實際上也避免了已知避孕藥潛在的缺點，本發明的孕激素僅激活特定靶組織或器官(尤其是子宮)的孕激素受體，而對任何其他的預期之外的組織或器官(尤其是乳腺)僅有很小程度的(或完全沒有)作用，從而使得這些治療具有良好的耐受度并且出現嚴重的副作用以至引發潛在的健康問題的危險更小。此外，由于它們具有定制地調節PR介導的病癥和作用的潛力，本發明的孕激素尤其是化合物((+)-1)由于具有靶組織特異性因此可以較低劑量給藥，該劑量比已知孕激素用于避孕藥(以及本發明第五方面所討論的其他適應癥)的劑量要小得多。孕激素作為避孕藥的其他方面的應用可以從下書中得到，“Kontrazeption mit Hormonen”(“含激素的避孕藥”)，H.-D.Taubert和H.kuhl、Georg Thieme Verlag Stuttgart-紐約，1995年。
關于本發明第六方面的優選實施方案，一方面可參考權利要求，另一方面可參考本發明第二部分所給出的解釋和敘述，即包含通式(I)尤其是化合物((+)-1)孕激素的藥物組合物。其所述給藥方式、劑量、成分的結合(尤其是有關任選的其他雌激素成分)，以及任何其他優選的實施方案同樣全部適用于本發明的第六方面，即通式(I)所示的化合物用于避孕藥的應用。
本發明的第七方面涉及相對于次選組織或器官選擇性地調節首選組織或器官的孕酮受體介導的作用的方法。
該方法包括以下步驟，即向需要選擇性地調節孕酮受體介導的作用的個體給藥有效量的通式(I)化合物或其藥物學上可接受的衍生物或類似物或者是包含通式(I)的該化合物的藥物組合物。
其中R1和R2分別獨立地是-H或-F，R3是-CH3或-CF3，以及Ar是 或 但是包括化合物5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮，而此化合物被本發明的第一、二、三、四和第六方面從通式(I)的范圍內排除。
關于本發明的第七方面，相對于次選組織對首選組織選擇性地調節孕酮介導的作用例如包括——如上文所述的本發明的其他方面——相對于次選的優選為乳房組織的靶組織或優選為乳腺的靶器官的不良的PR介導的作用(如增殖/分化)，在首選的優選為子宮組織的靶組織或優選為子宮的靶器官選擇性地增強期望出現的和/或保護作用。然而，應當理解為本發明并非限于本發明孕激素對子宮/乳房的分離活性，而是本發明還包括對受孕激素受體介導影響的任何其他首選和次選靶組織的分離的活性。關于“相對于次選組織調節首選組織中的PR介導的作用”的優選實施方案以及詳細解釋，參考本發明其他方面所述，特別是第五方面。
如在本發明的第五方面以及本發明的第六方面所解釋，需要選擇性地調節孕酮受體介導的作用的優選為哺乳動物、最優選為人的個體可以是例如需要(由于醫療原因)或希望避免懷孕的女性個體。因此，如上文已經敘述的，本發明第七方面的方法可用于避孕藥。在這方面，上文所述所有有關本發明孕激素作為避孕藥的應用的內容同樣適用于本發明的第七方面的應用，包括關于給藥劑量、劑量方案、給藥方式以及任選雌激素與本發明孕激素的結合的優選實施方案。
除了避孕之外，相對次選組織對首選組織PR介導的作用的調節有益和必需的醫療適應癥為例如激素替代療法或婦科病癥的治療。所有這些適應癥已經在例如本發明的第五方面作了詳細的敘述，且同樣適用于本發明的第七方面。
本發明的第八方面和第九方面涉及通式(I)所示化合物或其藥物學上可接受的衍生物或類似物在制備相對于PR-B轉錄選擇性地激活PR-A轉錄和相對于PR-B介導的作用選擇性地提高PR-A介導的作用的藥劑中的應用， 其中R1和R2分別是-H或-F，R3是-CH3或-CF3，Ar是 或 但是包括了化合物5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮，而此化合物被本發明的第一、二、三、四和第六方面從通式(I)的范圍內排除。
本發明的第八方面和第九方面還涉及相對于PR-B轉錄選擇性地激活PR-A轉錄的方法以及相對于PR-B介導的作用選擇性地提高PR-A介導的作用的方法。這些方法包括向需要選擇性地調節PR-A轉錄和PR-A介導的作用的個體分別給藥通式(I)的化合物或其藥物學可接受的衍生物或類似物的步驟
其中R1和R2分別是-H或-F，R3是-CH3或-CF3，Ar是 或 但是包括化合物5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮，而此化合物被本發明的第一、二、三、四和第六方面從通式(I)的范圍內排除。
如下文實施例5所證明，本發明的孕激素，尤其是化合物(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮，((+)-1)，已被發現可以選擇性地激活PR-A的轉錄，并從而選擇性的誘導PR-A介導的作用，而優選地不影響PR-B的轉錄和PR-B介導的作用。
如上文“發明背景”部分所述，在B.Mulac-Jericevic以及O.Conneely研究的基礎上，PR同種型B看上去是乳腺增殖和分化的最主要原因，而孕激素對子宮上皮細胞和對排卵的抗增殖作用很可能是由PR同種型A所介導的(B.Mulac-Jericevic，Science 2000，289，1751-1754；Orla Conneely，Endocrine Society Meeting，Toronto，June 2000)。因此，如上文所述，孕激素對孕酮受體同種型A顯示選擇性，即激活PR-A轉錄且同時優選地不影響PR-B轉錄的孕激素，也可能選擇性地增強在子宮內PR介導的作用，而同時優選地不影響乳腺內PR介導的作用。證明該PR同種型特異性和PR配體的組織選擇性之間的聯系是在先申請WO 02/054064的主題。本發明通過實施例3和實施例5再次證實了這一原則，其中本發明優選的化合物，化合物((+)-1)被證明是一種選擇性的和高效的PR-A激動劑，因此，其在體外對PR同種型A相對于B以及在體內對不同的靶組織顯示出強烈的分離活性功能，包括在子宮組織誘發期望的和有益的效果而在乳房組織不誘發如乳腺增殖/分化的不良效果。
然而，本發明的應用并不限于子宮對乳房系統，而是可延伸到其他的孕酮靶器官系統。基本上PR同種型介導的作用涉及其中的任何病癥都可以通過本發明孕激素的應用、或通過本發明第八方面的藥劑的制備、或通過本發明第九方面的包括給藥所述孕激素的方法加以治療。應當明白，有關本發明的其他方面所述的本發明的優選孕激素、給藥方式、劑量和劑量方案、與其他成分如雌激素的結合等等，都同樣適用于這里所述的第八方面和第九方面。
須注意，為了本發明的目的，本發明孕激素相對于PR同種型B對PR同種型A的選擇性(或者是特異性，該術語在本文用作選擇性的同義詞)被定義為此孕激素在PR-A和PR-B轉染的細胞中誘發的轉錄功效的差異。優選地，該差異達到或者超過10％，更優選為達到或超過15％，最優選為達到或超過20％。“轉錄功效”被定義為確定濃度的被測孕激素相對于標準的孕激素(例如，R5020)在PR-A或者PR-B轉染的細胞中所達到的響應。
除了“轉錄功效”以外，另一個潛在的評價被測孕激素對PR-A或PR-B的選擇性的參數是“能力”，即EC50值(或與其技術等效的ED50)，其通過在體外在PR-A或PR-B轉染的細胞中加以測定。優選地，特定的被測孕激素對PR-A對PR-B轉染的細胞所達到的能力的差異應在因子為10的范圍之內或因子大于10。關于轉錄功效和能力的測定的更詳細的敘述見下文的實施例5，以及在先申請WO 02/054064，其因此目的并入本文作為參考。如下文實施例5所證明，本發明的化合物尤其是化合物((+)-1)是具有PR-A選擇性的強激動劑。
除了上文所描述的本發明的孕激素的體內的應用之外，由于其對PR同種型A的特異性，這種顯著的選擇性地激活PR-A轉錄的能力也可為了診斷或科學研究的目的被開發用于例如涉及兩種PR同種型的體外測定。因此，本發明的第八方面和第九方面也提供單純屬于受體水平的體外應用和方法。例如，優選為化合物((+)-1)的本發明化合物可用作評價其他PR配體潛在的PR同種型特異性的標準。因此，本發明化合物可以并入診斷或科學試劑盒，用以確定其他化合物選擇性地激活PR同種型轉錄的能力。本發明的化合物也用來鑒別某些診斷或科學應用所需的PR同種型特異的細胞。
有關下文實施例5中所用具有PR同種型特異性的孕激素的體外測定的細節，參見WO 02/054064，在此并入作為參考。WO 02/054064特別揭示了如何得到由表達PR-A或PR-B的質粒轉染的細胞，如何檢測PR-A和PR-B轉錄以及如何鑒定那些顯示PR同種型特異性的PR配體。此外，如上文提到的，WO 02/054064也揭示了組織選擇性PR配體的篩選實驗。
關于制備通式(I)所示的化合物或其藥物學可接受的衍生物或類似物的方法 其中R1和R2分別是-H或-F，R3是-CH3或-CF3，
Ar是 或 具有或不具有該化合物不是5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮的限制條件，該方法類似于WO98/54159中所揭示的用于得到其所述的更大類的化合物的方法。然而，因為本發明的化合物相對于WO 98/54159中所揭示化合物是新穎的，所以下文敘述了得到本發明孕激素的幾條不同的合成路線。化合物(1)、(2)、(3)和(4)的制備將在實施例1a)、1b)、1c)和1d)中分別詳加描述。
得到如上文所述的通式(I)所示的化合物的首選方法始于通式(II)所示的化合物 其中取代基R1、R2和Ar的定義與上文所述的通式(I)的解釋相同。通式(II)化合物在催化劑的存在下與通式CF3-SiMe3或CF3-Si(Rx)3所示的化合物反應，其中Rx是C1到C4的烷基，或與甲基金屬化合物例如格氏試劑或烷基鋰反應，生成通式(I)的化合物。氟鹽或堿性碳酸鹽等堿性鹽可以作為催化劑應用(參考J.Am.Chem.Soc.111，1989，393)。
此外，本發明通式(I)所示的化合物也可由通式(III)所示的化合物合成 其中R1和R2的定義與上文所述的通式(I)相同，LG是離去基團，如-Cl、-Br或甲苯磺酸鹽取代基。通式(III)的化合物與化合物Ar-NH-R’反應，其中Ar與上文所述的通式(I)的定義相同，R’是氫原子或C1到C5的酰基。在特定的環境下，取代基R’須在隨后去掉。通式(III)所示的化合物也作為中間產物生成，例如，它可作為從相應的碳酸直接生成的酰基氯。
本發明通式(I)所示化合物的苯環上的取代型包含取代基R1、R2和-CF3可以按照本領域公知的芳香環選擇性取代的方法得到。
通過以下的實施例對本發明進行更進一步的描述，但是，這些實施例并沒有限制本發明的范圍。
實施例實施例1通式(I)孕激素的制備a)制備(±)-、(+)-和(-)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((±)-1、(+)-1和(-)-1)1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基-腈在-70℃惰性氣體氣氛下，在10分鐘內將8.15ml N，N′-二甲基咪唑烷二酮(N，N’-dimethylimidazolidinone)加入78ml 2M的二異丙基胺鋰溶液(四氫呋喃/庚烷/苯乙烷)中。15分鐘后，加入10.6g(2-氟-5-三氟甲基苯基)-乙腈。10分鐘后，在-20℃，加入20.3ml 1，2-二氯乙烷(注意也可將(2-氟-5-三氟甲基苯基)-乙腈與1，2-二溴乙烷和Cs2CO3反應)并將混合液在-20℃攪拌2個小時，在環境溫度下攪拌16個小時。然后，用冰使混合液冷卻并加入氯化銨飽和溶液和乙酸乙酯。然后將乙酸乙酯相用氯化銨飽和溶液洗滌兩次，再用水洗滌兩次，用硫酸鈉干燥，通過Kugelrohr裝置濃縮蒸餾。
產量8.7g 1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基-腈，b.p.140℃/0.04hPa1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基-醛(carbaldehyde)將8.5g 1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基-腈溶解在60ml甲苯中。在-70℃，在45分鐘內加入56ml 1M溶解于甲苯的氫化二異丁基鋁。4小時后，在-78℃，逐滴加入120ml的乙酸乙酯。混合物放置以達到環境溫度，并用2N的硫酸洗滌三次，用水洗滌一次。乙酸乙酯相用硫酸鈉干燥，用硅膠(己烷/乙酸乙酯5+1)色譜分離。
產量4.5g 1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基-醛3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]2-氧代-丙酸在20分鐘內冰冷卻下向5.0g 2-二乙基膦酰基-2-乙氧基乙酸乙酯在40ml四氫呋喃中的溶液中加入10ml 2M的二異丙基胺鋰溶液在四氫呋喃/庚烷/甲苯中的溶液。混合物在0℃攪拌30分鐘。在30分鐘內，在0℃下加入30ml 4g 1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基-醛的四氫呋喃溶液。在環境溫度下放置20小時后，向混合物中加入2N硫酸，用乙酸乙酯萃取，然后用硫酸鈉干燥并濃縮。然后將粗產物溶解在50ml的乙醇中，用33ml2M的氫氧化鈉溶液使之皂化。
產量5.2g此酸，在充分攪拌的同時，與180ml 2N硫酸加熱回流數小時。用乙酸乙酯萃取后用水清洗，得到4.6g黃色油狀3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酸。
5-{3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]2-氧代-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮在-10℃，向15ml的2.9g 3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酸的二甲基乙酰胺溶液中加入0.84ml亞硫酰氯。混合液在-10℃攪拌30分鐘，在0℃攪拌1小時，然后加到1.95g 5-氨基2苯并呋喃酮中(反之亦然，或將5-氨基2苯并呋喃酮加入混合液中)。在環境溫度下放置16小時，加入2M的鹽酸和乙酸乙酯，把有機相用水洗至中性，用硫酸鈉干燥并濃縮。用硅膠(己烷/乙酸乙酯1+1)色譜分離，在二異丙基醚中重結晶，得到2.4g 5-{3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮(m.p.168℃)。
(±)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((±)-1)將2.7g 5-{3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮溶解在15ml二甲基甲酰胺中；在冰冷卻下，加入4.25ml三氟甲基-三甲基硅烷和972g碳酸銫。在環境溫度下攪拌18小時，然后在冰冷卻的條件下，加入6.5ml 1M的氟化四丁銨的四氫呋喃溶液，混合液攪拌1小時。添加全部的水后，產物用乙酸乙酯萃取。有機相用硫酸鈉干燥并濃縮。用硅膠(己烷/乙酸乙酯3+2)色譜分離，得到餾分1為760mg的初始原料，以及餾分2為880mg的(±)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((±)-1)(m.p.158℃)。
化合物((±)-1)的對映異構體的分離
化合物((±)-1)的對映異構體的混合物可以用手性載體(CHIRALPAKAD，從DAICEL得到)色譜分離進行分離，用己烷/乙醇97+3作為流動相，得到2.4g的外消旋體餾分1為(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((±)-1)867mg；m.p.162-163℃，αD＝+114.5°(在氯仿中c＝0.5)；餾分2為(-)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((±)-1)860mg；m.p.163-164℃，αD＝-113.7°(在氯仿中c＝0.5)。
b)制備(±)-、(-)-和(+)-6-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮((±)-、(+)-、(-)-2)1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基-腈從(2-氟-3-三氟甲基苯基)-乙腈的制備與1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基-腈的制備類似(見實施例1a))。B.p.120℃/0.04hPa。
1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基-醛從1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基-腈的制備與1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基-醛的制備類似(見實施例1a))。
3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酸從1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基-醛的制備與3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酸的制備類似(見實施例1a))。M.p.177℃(降解)。
6-{3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮從3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酸的制備與6-{3-[1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮的制備類似(見實施例1c))。M.p.117-118℃。
(±)-6-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮((±)-2)與實施例1a)中化合物(±)-1)類似，(±)-6-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮((±)-2)可以由6-{3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮得到。M.p.200-201℃。
化合物((±)-2)的對映異構體的分離如實施例1a)所述將(+)和(-)對映異構體進行分離。分離產量餾分1為(-)-6-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮((-)-2)m.p.171-173℃，αD＝-115.2°(在氯仿中c＝0.5)，餾分2為(+)-6-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮((+)-2)m.p.168-173℃。
c)制備(±)-、(+)-和(-)-6-{2-羥基-3-[1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮((±)-、(+)-和(-)-3)6-{3-[1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基]2-氧代-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮
在-10℃將1.8ml亞硫酰氯加入到60ml的6.0g 3-[1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酸(如WO 98/54159所述制備)的二甲基乙酰胺溶液中。混合物在-10℃攪拌30分鐘，在0℃攪拌1小時，然后與5g 6-氨基-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮混合。在環境溫度下放置16小時，混合液分為水相和乙酸乙酯相。有機相用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥并濃縮。用己烷和乙酸乙酯(10-20％)作為液相的硅膠色譜分離，得到6.78g 6-{3-[1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮(m.p.136-139℃)。
(±)-6-{2-羥基-3-[1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮((±)-3)將215mg 6-{3-[1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮溶解在7.5干燥的四氫呋喃中。在冰冷卻的條件下，加入0.32ml 3M甲基溴化鎂的醚溶液。30分鐘后，在0℃，將此反應液倒入飽和氯化銨溶液中，用乙酸乙酯萃取。有機相用鹽水清洗，用硫酸鈉干燥并蒸發。用己烷和乙酸乙酯(0-20％)作為液相的硅膠色譜分離，餾分1為80mg的初始原料，餾分2為95mg的6-{2-羥基-3-[1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮((±)-3，m.p.75-76℃)。
化合物((±)-3)的對映異構體的分離如實施例1a)所述的((±)-1)，將(+)和(-)對映異構體進行分離。分離產量餾分1為(-)-6-{2-羥基-3-[1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮((-)-3)m.p.129-130℃，αD＝-54.8°(在氯仿中c＝0.5)，
餾分2為(+)-6-{2-羥基-3-[1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-甲基-丙酰氨基}-4-甲基-2，3-苯并惡嗪-1-酮((+)-3)m.p.132-135℃，αD＝+55.2°(在氯仿中c＝0.5)。
d)制備(±)-、(+)-和(-)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((±)-、(+)-和(-)-4)1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基-腈從(2-氟-3-三氟甲基苯基)-乙腈的制備與1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基-腈的制備相類似(見實施例1a))。B.p.120℃/0.04hPa。
1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基-醛從1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基-醛的制備與1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基-醛的制備相類似(見實施例1a))。
3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酸從1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基-醛的制備與3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酸的制備相類似(見實施例1a))。M.p.177℃(降解)。
5-{3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮從3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酸和5-氨基2苯并呋喃酮的制備與5-{3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮的制備相類似(見實施例1a))。M.p.157-158℃。
(±)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((±)-4)與實施例1a)中化合物((±)-1)的制備類似，(±)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((±)-4)可以由5-{3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-氧代-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮得到。M.p.212-214℃。
化合物((±)-4)的對映異構體的分離如實施例1a)所述的((±)-1)，將(+)和(-)對映異構體進行分離。分離產量餾分1為(-)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((-)-4)m.p.165-166℃，αD＝-115.5°(在氯仿中c＝0.5)，餾分2為(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-3-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((+)-4)m.p.164-166℃。
實施例2(體內孕激素活性測定——排卵抑制)在治療開始之前，監控雌性大鼠(體重190到210g)的兩個月經周期。只有具有規律的4天周期的動物才能用于隨后的實驗。從動情后期開始向動物給藥被測化合物4天(第1到第4天)，其后，控制該周期。
對于皮下應用，被測化合物溶解在苯甲酸芐酯/蓖麻油(1+9 v/v)中，每日劑量為以1ml/kg體重的體積給藥。
口服應用中，被測化合物混懸于載體液體(85mg MyrjR溶解于100ml0.9％w/v的氯化鈉溶液)中，每日劑量為以2ml/kg體重的體積給藥。
評價
在應用被測化合物的第4天，用乙醚麻醉那些處于發情期或發情后期的動物，切除其一側的卵巢。準備好管道，通過顯微鏡觀察其中的卵子。第5天，用二氧化碳處死所有動物(完整的以及切除部分卵巢的)，用同樣的方法保存并分析管道。然后，測定并用百分數的形式表示有多少動物的排卵作用被抑制。
下文中的表1-a和表1-b清楚的說明化合物((+)-1)通過抑制LH分泌，有效抑制了成年雌性大鼠的排卵作用。表1-a證明((+)-1)的EC50是45μg/kg。因此，此化合物被認為具有很強的促孕活性。與標準孕激素R5020(普美孕酮)的比較顯示化合物((+)-1)在體內是目前所確定的效力最強的孕激素之一。其因子為1至2(或更多)，效力相當于或超過了R5020(參考表1-b)。
表1-a
表1-b
實施例3(乳房/子宮選擇性的體內測定)
a)對大鼠乳房上皮細胞增殖/分化作用的生物鑒定實驗這個實驗的目的是評價孕激素對乳腺發育的作用，特別是對雌激素引發的大鼠的乳房末端終蕾的生成。孕激素與其他激素(促乳激素、雌激素、糖皮質激素、生長激素等)一起誘導乳腺上皮細胞的增殖和分化。尤其是，它們涉及小泡和末端終蕾的形態形成，乳汁在這些部位生成并分泌到管腔中。
為了測定本發明中的被測孕激素，尤其是化合物((+)-1)對乳腺分化和增殖的作用，將21天齡的未成熟雌性大鼠(Wistar Han，SPF)在治療開始之前的4到6天切除卵巢。連續6天給予動物標準雌激素(雌酮(E1)，70μg/kg)和被測孕激素((+)-1)(用量0.1ml/50g體重；賦形劑苯甲酸芐酯/蓖麻油(1+4 v/v)；皮下給藥)。對照組給予例如賦形劑、不含孕激素的雌酮、雌二醇與已知的孕激素例如R5020(普美孕酮)。在治療6天后，用二氧化碳處死動物。
為了整體染色(whole mount staining)，刮去動物左腹部腹股溝處乳房區域的毛，并連同皮膚一起切下。為了組織學/免疫組織化學分析，將動物右腹部腹股溝處乳腺連同與其連接的結締組織一起切下，然后固定在3.7％的福爾馬林PBS(磷酸鹽緩沖液；不含Ca2+/Mg2+)中。
整體染色依照Tellyesniczky方法(見下)，將標本固定在乙醇—福爾馬林溶液中過夜。然后將乳腺組織和連接在其上的皮下組織從真皮剝離，然后再將標本固定整夜。之后步驟如下70％乙醇1.5小時；丙酮3×1.5小時；丙酮整夜；異丙醇1.5小時；96％乙醇2小時；蘇木精-鐵3小時；VE水先沖洗標準然后2×0.5小時；70％乙醇整夜；80％乙醇1.5小時；96％乙醇1.5小時；異丙醇1.5小時。然后將標本轉移到陪氏培養皿中，加入甲苯中放置約1小時，即直到組織不再上浮。然后用雪松木油(Merck，no.1.06965)處理組織。上述溫育時間為最少時間且可延長。尤其是，在固定后用70％乙醇溫育的時間可延長至至少2.5周。整體染色所需溶液的制備a)Tellyesniczky乙醇-福爾馬林甲醛37％81.8ml，乙醇70％1636ml，冰醋酸(在使用之前不久加入)81.8ml(共1800ml)。
b)蘇木精母液蘇木精(Merck，no.1.15938)10g，乙醇96％100ml。此溶液在使用前必須在37℃放置48小時。在暗處放置可保存幾乎無限長時間。
c)所用蘇木精-鐵溶液蘇木精母液(經過濾后)15.2ml，乙醇96％1374ml，FeCl3×6H2O(s.4)91.1ml，1mol/l HCl220ml(共1700ml)；用2mol/l NaOH調節pH至1.25。
d)FeCl3×6H2O溶液FeCl3×6H2O(Merck，no.1.03943)1.07g，VE水90.2ml，HCl37％0.92ml(共91.1ml)。
用40-倍的放大率，計數在尾部方向乳頭附近的末端終蕾數目。被測區域應為大約1.8mm2。對于充分分化的標本，該面積可以減少，其應至少具有250個可測得的蕾。計數完畢后，計算每1mm2終蕾的數目。
評價末端和小泡終蕾的數目用每mm2+/-標準差表示(SD)。被測孕激素的孕激素作用可以測定為末端和小泡終蕾的臨界值(見圖3)(即在首次測得顯著孕激素作用的濃度)，或者測定為達到與0.3mg/kg對照化合物普美孕酮(R5020)(見圖1)相同的分化作用所需的等效劑量。對于圖1顯示的數據，以ANOVA(Dunn’s方法)檢驗各被測組之間的差異。圖3中，與雌酮對照組相比使用t-檢驗檢驗各組之間的差異。圖1和圖3中的星號表示其有顯著的差異。
MIB-5免疫組織化學法(依照C.Gerlach等，Lab.Invest.1997，77(6)，697-698，有修改)為了更詳細的評價乳房上皮細胞的增殖，用增殖標記試劑MIB-5對細胞進行染色如下(參考圖2)乳腺固定于4％甲醛/PBS中24小時，并嵌入石蠟中。在載玻片上展開4μm的切片，脫去石蠟，在pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液中用微波處理10分鐘，用PBS清洗。載玻片用3％H2O/甲醇封閉15分鐘，用Blockingkit(Vektor，no.SP-2001)封閉10分鐘，以及用在PBS中1∶2稀釋的大鼠血清(Sigma，no.S-7648)封閉30分鐘以減少非特異性染色并在PBS中清洗。用單克隆抗體MIB-5(Dianova，no.Dia-5055)溫育載玻片1小時，此抗體對大鼠Ki-67抗原(用PBS/0.2％BSA稀釋至1∶200)具有特異性。然后，用PBS/0.2％吐溫20清洗載玻片兩次，在用PBS/0.2％吐溫20以1∶200稀釋的生物素化大鼠抗-小鼠第二抗體(Dianova，no.425-066-100)中溫育1小時，并再次用PBS/0.2％吐溫20清洗兩次，隨后在抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶(Vecstain Elite ABCKit no.PK-6100)絡合物中溫育1小時。用二氨基聯苯胺(Zymed SubstrateKit)進行染色。所有的步驟均在室溫下進行。
評價為了描述被測化合物的特性，測定被MIB-5染色的乳房上皮細胞的百分數。圖2顯示MIB-5陽性的上皮細胞數目的百分比+/-標準差(SD)。用ANOVA(Bonferroni t-檢驗)檢驗各組之間的差異。圖2中的星號表示顯著性差異(p＜0.05)。實驗結果在下文的c)部分作進一步的討論。
b)大鼠維持妊娠實驗對于大鼠，去勢導致妊娠的終止。孕激素(與雌激素結合)能夠維持去勢動物的妊娠。然而，去勢大鼠維持妊娠的程度僅在確定的劑量范圍內最佳。因此，一般來說高劑量或低劑量都可以導致作用減弱。用一定劑量的雌酮(E1)同時進行治療可以增強孕激素的妊娠維持作用。
懷孕的大鼠(Wistar Han，SPF)重190至220g(每劑量5至8只動物)，在其懷孕第八天第一次實質給藥2小時后切除其卵巢。從第八天至第十四天，大鼠每日聯合給藥被測孕激素以及標準劑量的E1。一天后，用二氧化碳處死動物。對于每只動物，依照胎兒的心跳測定動物胎兒存活和死亡的數目。在子宮為空的情況下，利用10％硫化銨溶液染色的方法測定著床位置的數目。
被測孕激素和雌酮的劑型和應用S.c.(皮下)應用被測孕激素溶解于苯甲酸芐酯/蓖麻油(1+4 v/v)中，每日劑量為以1ml/kg體重的體積給藥。
P.o.(口服)應用被測孕激素懸浮于載體液體(85mg MyrjR溶解于100ml 0.9％w/v氯化鈉溶液中)，每日劑量為以2ml/kg體重的體積給藥。
I.p.(腹膜內)應用被測孕激素溶解于丙二醇并置入微型滲透泵(2001型，1.0μl/h，7天)，將其置于大鼠的腹腔。
雌酮的標準劑量為皮下0.005mg/kg體重，且溶解于苯甲酸芐酯/蓖麻油(1.4 v/v)中。
評價測定每只動物妊娠維持率[％]、每劑量的妊娠維持率(單一值的中值)和EC50(50％動物的妊娠得以維持的劑量；100％對應于沒有切除卵巢的對照動物)。實驗結果在下文的c)部分作進一步的討論。
c)(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((+)-1)所得的結果以及對結果的討論下文中的實驗結果(表2)得自對本發明的最優選化合物相對于標準孕激素R5020(普美孕酮)的如上文a)所述的大鼠乳房上皮細胞(整體染色法)的增殖/分化作用生物鑒定實驗以及如上文b)所述的妊娠維持實驗，該最優選化合物為(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((+)-1)。
表2顯示在妊娠維持實驗中，要達到EC50值每kg體重(大鼠)所需的被測孕激素(R5020或((+)-1))的劑量，以及在乳房上皮細胞(大鼠；整體染色法)增殖/分化作用的生物鑒定中所需的劑量。中間一欄“等效劑量”指要達到與0.3mg/kg R5020同樣的作用所需的((+)-1)的劑量。最右邊一列表示被測孕激素((+)-1)區別于標準孕激素R5020在兩個實驗中所顯示活性的因子。引用源于分別進行的三個不同實驗中不同的成對的值用于乳房上皮細胞的分化/增殖實驗。從單一值的中值得到ca.1的因子(見最左邊一列)。
表2
本發明優選的孕激素化合物((+)-1)引起末端和小泡終蕾的劑量依賴性增加，與0.3mg/kg/d普美孕酮等效的劑量是0.6mg/kg/d(圖1)。
此外，((+)-1)誘導末端和小泡終蕾的臨界劑量是100μg/kg/d(見圖3)。令人感興趣的是，隨((+)-1)濃度的增加MIB-5陽性細胞呈劑量依賴性減少(圖2)。此外，圖2證明0.3mg/kg/d普美孕酮顯示約42％的MIB-5陽性細胞，而1mg/kg/d((+)-1)顯示約12％的MIB-5陽性細胞。
總而言之，這些結果顯示((+)-1)對乳腺具有與參比化合物普美孕酮大致相同的活性。最值得注意的是，在對妊娠完全維持的藥物劑量(見表2)下未發現對末端和小泡終蕾的形成的任何影響(圖3，表2)。因此，((+)-1)對子宮相對乳腺具有組織選擇性活性。這種有利于向子宮活性的分離至少是6倍。此外，((+)-1)的劑量和對乳腺增殖的誘導呈反比關系。
上述的結果清楚的表示，本發明的優選化合物(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮((+)-1)與標準孕激素R5020相比，其對妊娠維持的效力高，而對乳房上皮細胞的增殖/分化作用卻非常低。與R5020相比，化合物((+)-1)維持妊娠的效力為R5020的8倍，但是對乳腺的作用卻與R5020大致相同。這些實驗結果有力的證明了，本發明的化合物((+)-1)是一種PR介導的作用的選擇性調節劑，相對于本發明次選靶組織乳房的PR介導的作用(乳腺的增殖/分化)，其增強了本發明首選靶組織子宮的PR介導的作用(妊娠維持)。特別地，如上文所述，當服用維持妊娠有效量的化合物((+)-1)時，未發現其對乳腺的影響(見表2和圖3)。因此，如上文“具體實施方式
”部分所述，該化合物尤其適用于避孕、HRT以及婦科病癥的治療。本發明優選的孕激素化合物((+)-1)特別適用于不含雌激素的口服避孕藥。
如上所述化合物((+)-1)所得的對子宮/乳房分離活性功能的實驗結果不僅證明該化合物作為本發明的組織特異性孕激素非常適用于“具體實施方式
”部分所述的適應癥和應用，還證明PR配體的PR同種型特異性與PR配體的組織特異性有關這一概念的生存力，參見WO 02/054064。此外，結果顯示組織特異性孕激素，特別是本發明的子宮/乳房選擇性孕激素可被識別孕激素識別為具有PR同種型，即PR-A對PR-B，選擇性。上述結果明確的證明，如下文實施例5所證明，與PR同種型B相比對PR同種型A有選擇性的孕激素在適合維持妊娠的劑量時，相對于對乳房的PR介導的作用(參見上文表2)選擇性地增強子宮的PR介導的作用。然而，應明白，對PR-A與PR-B的選擇性(如實施例5證明，已測定本發明孕激素對PR-A與PR-B的選擇性)并非僅僅導致子宮/乳房選擇性(如本發明孕激素在上文所確證)，而是可包括任何其他的孕酮靶組織選擇性以及基于孕酮同種型介導的作用的任何其他的PR介導的作用的選擇性調節。
實施例4口服妊娠前活性的體內測定—兔子宮內膜的變性本實驗使用未成年的雌性兔(新澤西大白兔，30至35天齡；來自Schriever，德國)。為了引起子宮內膜的增殖，在實驗的第一至第四天，所有的兔子用5.0g/kg/天的17-α雌二醇(皮下，0.5ml/kg/day)引發。從第七至第十天，以0.001、0.01和0.1mg/kg/day的劑量口服給藥被測化合物(口服，0.5ml/kg/天)。一組動物作為陰性對照組，在雌二醇引發后僅給予賦形劑。另一組作為陽性對照組，在雌二醇引發后僅給予孕酮以引發子宮內膜的分化。為了研究本發明最優選的化合物((+)-1)的孕激素活性，一治療組在雌二醇引發后僅給予化合物((+)-1)。
評價第十一天尸檢。利用光學顯微鏡測定孕激素活性的參數McPhail指數(即，分化程度)(分數1到4；1＝無腺分化，4＝最大程度的分化)。
如下文表3所證明，本發明優選的化合物，化合物((+)-1)，對兔的子宮內膜變性實驗(Clauberg實驗)很有效。經測定，((+)-1)口服應用和皮下給藥具有同樣的效力。因此，當口服給藥時，必須考慮到化合物((+)-1)具有很強的活性。
表3
實施例五PR-A/PR-B同種型特異性體外實驗如本發明的第八和第九方面，通式(I)所示的孕激素，包括不屬于本發明的第一、二、三、四和第六方面的化合物5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮，可用于相對于PR-B的轉錄選擇性地激活PR-A的轉錄，即本發明的孕激素優選為并不激活PR-B的轉錄，至少與激活PR-A轉錄的程度不同。因此，這些孕激素可用于相對于PR-B介導的作用選擇性地激活PR-A介導的作用，即這些化合物優選為不影響PR-B介導的作用。下文敘述測定特定的孕激素是否對PR-A或PR-B具有選擇性的體外實驗。下文還證明本發明通式(I)所示的孕激素是選擇性PR-A激動劑。關于此實驗的更詳細的敘述，尤其是關于PR-A和PR-B轉染的細胞的制備見WO 02/054064，在此并入作為參考。
通過由表達hPR-A(第一細胞)或hPR-B(第二細胞)的質粒穩定轉染而來的第一和第二SK-N-MC細胞，以及與激素反應性MTV啟動子相聯系的LUC報告基因實施本發明篩選PR同種型特異性孕激素的方法。
細胞培育在37℃和含有5％二氧化碳的氣氛下的含有Earl’s鹽的最低必需培養基(S-MEM，不含L-谷氨酰胺；Gibco BRL，no.21090-022)中，補充10％的胎牛血清(FCS)、青霉素100U/鏈霉素100μg/ml(Biochrom，no.A2213)，L-谷氨酰胺4mmol/l(Gibco BRL，no.25030-024)、丙酮酸鈉1mmol/l(Biochrom，no.L0473)以及1×非必須氨基酸(Biochrom，no.K0293)。
轉錄實驗中，將細胞置入96孔碟(2×104細胞/碟)中，并且在上述培養基中培育，但FCS被3％的經木炭吸濾過(stripped)的FCS代替。48小時后，細胞與預先稀釋的被測化合物接觸。為了測定激動作用，在高濃度(10-6至10-11mol/l)的被測孕激素中培育細胞。作為報告基因誘導陽性對照的細胞用10-6至10-11mol/l的R5020(普美孕酮)處理。作為報告基因誘導的陰性對照組的細胞培育在1％的乙醇中。
與被測孕激素溫育24小時后，移去培養基，將細胞溶解在20μl的細胞溶解緩沖液(熒光素酶分析系統E 153A；Promega)中并攪拌該板10分鐘。在30秒內向每碟中加入30ul熒光素酶試劑(熒光素酶分析系統E 151A+152A；Promega)，在循環模式下，通過Microlite ML 3000微量滴定板光度計(Dynatech)測定細胞溶解產物中的熒光素酶報告基因產物的活性。
評價反應得到有效性[％]，評價EC50值得到效力[nM]。激動活性的計算如下測得數據點的LUC活性[％]計算如下 其中，CI＝100％刺激作用(R5020，10-7mol/l)CO＝0％刺激作用(乙醇，1％)。
因此，有效性[％]按下式計算 效力[nM]，即EC50，用圖表測定。
本發明的不同孕激素所達到的一些有效性結果見下表2。這些結果明確證明本發明孕激素尤其是化合物((+)-1)的PR同種型A選擇性。因此，這些孕激素能夠相對于PR-B的轉錄選擇性地激活PR-A的轉錄。同時，這些孕激素能夠相對于PR-B介導的作用選擇性地增強PR-A介導的作用。因此，盡管現有技術總試圖尋找效力更高的孕激素，而本發明則提供適用于選擇性地靶向某些期望的組織或器官，優選為相對于乳房組織中PR介導的作用選擇性地激活子宮組織PR介導的作用的孕酮受體同種型，特別是孕酮受體A同種型的高度選擇性孕激素。
表4
實施例六大鼠抗向子宮活性實驗具有雌激素活性的化合物誘導子宮的生長，導致子宮重量的增長。它們通過增加上皮厚度，還可誘導子宮內膜上皮細胞的外觀發生特殊性變化。PR調節劑通過抑制子宮重量增加和上皮細胞增殖對抗雌激素活性。該作用有時稱作“機能性抗雌激素”作用。
為測定本發明最優選的孕激素即化合物((+)-1)的抗向子宮活性，將被切除卵巢的大鼠用0.3μg/kg/d雌二醇(E2)及劑量增加的((+)-1)處理3天(見圖4)。如圖4所示，除了一組(見圖4，底部的圖，150μg/kg的((+)-1)，用“#”表示)包括9只大鼠外，每一被測組都包括10只大鼠。
評價子宮重量、內腔上皮細胞厚度以及陰道涂片中細胞分化和角質化的狀態的改變都是雌激素活性的參數。與((+)-1)結合，雌激素—刺激的子宮重量增加和內腔上皮細胞厚度增加的降低都是抗雌激素活性的參數(見圖4)。
與賦形劑對照組相比，參比組(雌二醇(E2)處理的)子宮重量和內腔上皮細胞厚度的刺激作用可以用下式計算 在抗雌激素試驗中，與參比化合物(雌二醇)的作用相比較，子宮重量或內腔上皮細胞厚度的抑制作用可如下計算 統計分析中，利用Schering AG的生物統計部門研發的軟件計算95％的置信區間。星號表示顯著性差異(p＜0.05)。
討論如圖4所示，當與雌二醇結合給藥時，((+)-1)在對子宮重量和上皮細胞厚度增加的劑量依賴性抑制方面有很強的機能性抗雌激素作用。5μg/kg/d劑量的((+)-1)顯示出次最大作用。15μg/kg/d劑量產生最大作用。
總之，((+)-1)是一種具有強機能性抗雌激素活性的PR調節劑。在與妊娠維持活性(EC50值為12μg/kg/d)同樣的劑量范圍內，((+)-1)具有抗向子宮活性。這些結果證明((+)-1)在子宮內的高孕激素效力。
孕激素((+)-1)對乳腺末端和小泡終蕾的形成的臨界值很高(見圖3和表2)，但是，即使((+)-1)的濃度很低，其對子宮依然有作用(見實施例6和圖4)。其證明本發明的化合物在乳房和子宮中具有分離的作用。
權利要求
1.通式所示的化合物或其藥物學可接受的衍生物或類似物， 其中R1和R2分別獨立地是-H或-F，R3是-CH3或-CF3，以及Ar是 或 限制條件為該化合物不是5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮。
2.(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮或其藥物學可接受的衍生物或類似物。
3.一種包括如權利要求1所述化合物的藥物組合物。
4.如權利要求3所述的藥物組合物，其中權利要求1所定義的化合物是(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮或其藥物學可接受的衍生物或類似物。
5.如權利要求3或4所述的藥物組合物，其中權利要求1所定義的化合物的含量使得其每日劑量為0.01到2mg。
6.如權利要求3到5之一所述的藥物組合物，其還包括17α-乙炔基雌二醇或其他的雌激素成分。
7.如權利要求6所述的藥物組合物，其中17α-乙炔基雌二醇或其他的雌激素成分的含量使得其每日劑量是0.01到0.05mg。
8.如權利要求1所述的化合物，其是用于治療中。
9.(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮或其藥物學可接受的衍生物或類似物，其是用于治療中。
10.如權利要求8或9所述的化合物，其是用于節育、激素替代療法或者婦科病癥的治療中。
11.如權利要求3所述的藥物組合物，其是用于治療中。
12.包括(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮或其藥物學可接受的衍生物或類似物的藥物組合物，其是用于治療。
13.如權利要求11或12所述的藥物組合物，其是用于節育、激素替代療法或者婦科病癥的治療。
14.如權利要求1所述，但包括被權利要求1所排除的化合物5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮的化合物在制備藥劑中的應用，該藥劑用于相對于次選組織選擇性地調節首選組織的孕酮受體介導的作用。
15.如權利要求14所述的應用，其中首選組織是子宮組織而次選組織是乳房組織。
16.如權利要求14或15所述的應用，其用于相對于乳房組織中孕酮介導的作用選擇性地增強子宮中孕酮介導的作用。
17.如權利要求14到16之一所述的應用，其中該藥劑用于節育、激素替代療法或者婦科病癥的治療。
18.如權利要求14到17之一所述的應用，其用于相對于乳房組織的增殖和分化作用選擇性地增強子宮的抗增殖作用。
19.如權利要求14到18之一所述的應用，其中如權利要求1所定義的化合物是(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮或其藥物學可接受的衍生物或類似物。
20.如權利要求14到19之一所述的應用，其中該藥劑是口服給藥。
21.如權利要求14到20之一所述的應用，其中如權利要求1所定義的化合物的含量使得其每日劑量為0.01到2mg。
22.如權利要求14到21之一所述的應用，其中該藥劑還包括17α-乙炔基雌二醇或其他的雌激素成分。
23.如權利要求22所述的應用，其中17α-乙炔基雌二醇或其他的雌激素成分的含量使得其每日劑量為0.01到0.05mg。
24.如權利要求22或23所述的應用，其中如權利要求1定義的化合物和17α-乙炔基雌二醇或其他的雌激素成分的每日劑量在婦女月經周期中彼此獨立地改變。
25.如權利要求1所述的化合物或如權利要求3所述的藥物組合物作為避孕藥的應用。
26.如權利要求25所述的應用，其中如權利要求1所定義的化合物是(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮或其藥物學可接受的衍生物或類似物。
27.如權利要求25或26所述的應用，其中該避孕藥是口服給藥。
28.如權利要求25至27之一所述的應用，其中該避孕藥是一種不含雌激素的口服避孕藥。
29.如權利要求25至28之一所述的應用，其中如權利要求1所定義的化合物的含量使得其每日劑量為0.01到2mg。
30.如權利要求25至27以及29之一所述的應用，其中如權利要求1所定義的化合物附加有17α-乙炔基雌二醇或其他雌激素成分。
31.如權利要求30所述的應用，其中17α-乙炔基雌二醇或其他的雌激素成分的含量使得其每日劑量為0.01到0.05mg。
32.如權利要求25至27和29至31之一所述的應用，其中如權利要求1定義的化合物和17α-乙炔基雌二醇或其他的雌激素成分的每日劑量在婦女月經周期中彼此獨立地改變。
33.如權利要求1所述，但包括被權利要求1所排除的化合物5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮的化合物在制備藥劑中的應用，該藥劑用于相對于孕酮受體同種型B的轉錄選擇性地激活孕酮受體同種型A的轉錄。
34.如權利要求33所述的應用，其中如權利要求1所定義的化合物是(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮或其藥物學可接受的衍生物或類似物。
35.如權利要求1所述，但包括被權利要求1所排除的化合物5-[3-{1-(3-三氟甲基苯基)-環丙基}-2-羥基-2-三氟甲基-丙酰氨基]-2-苯并[C]呋喃酮的化合物在制備藥劑中的應用，該藥劑用于相對于孕酮受體同種型B介導的作用選擇性地增強孕酮受體同種型A介導的作用。
36.如權利要求35所述的應用，其中如權利要求1所定義的化合物是(+)-5-{2-羥基-3-[1-(2-氟-5-三氟甲基苯基)-環丙基]-2-三氟甲基-丙酰氨基}-2-苯并[C]呋喃酮或其藥物學可接受的衍生物或類似物。
全文摘要
本發明涉及通式(I)所示的非甾體孕激素或其藥物學可接受的衍生物或類似物，其中，R
文檔編號A61P43/00GK1652768SQ03810659
公開日2005年8月10日 申請日期2003年3月10日 優先權日2002年3月11日
發明者諾貝特·施梅斯, 曼弗雷德·萊曼, 烏爾麗克·富爾曼, 彼得·穆恩, 赫麗斯塔·黑格勒－哈通, 米夏埃多·克洛茨比歇爾 申請人:舍林股份公司