作為降低眼內壓和治療青光眼性視網膜病變/眼神經病的獨特手段的調控、抑制或調節...的制作方法

專利名稱：作為降低眼內壓和治療青光眼性視網膜病變 /眼神經病的獨特手段的調控、抑制或調節 ...的制作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及的領域是包括神經變性和/或眼內壓升高在內的眼部病癥。更具體而言，本發明提供了降低眼內壓并提供眼部神經保護的組合物。
相關領域描述有許多眼部病癥由視神經乳頭(optic nerve head)損傷、眼組織變性和/或眼內壓升高引起或惡化。例如，“青光眼”是一類衰弱性眼病，其是美國和其它發達國家中導致不可逆性失明的最主要原因。原發性開角型青光眼(“POAG”)是青光眼的最常見形式。該疾病的特征是小梁網變性，導致房水的正常功能受阻而使得眼在虹膜和角膜之間的空間(例如，“夾角”)無法閉合(Vaughan，D.等(1992))。在該疾病中，所述受阻的一個特征是眼內壓(“IOP”)增加，如果治療不當和治療不及時會導致進行性視力損失和失明。據估計，在40歲以上的所有成年人中0.4％至3.3％的人被該疾病侵襲(Leske，M.C.等(1986)；Bengtsson，B.(1989)；Strong，N.P.(1992))。此外，該疾病的患病數隨著年齡增長而上升，在75歲或以上的人中患病數超過6％(Strong，N.P.，(1992))。
青光眼侵襲眼的三個獨立的組織。與POAG相關的IOP升高是由于小梁網(TM)的形態學和生化學改變所致，小梁網是位于角膜和虹膜之間的夾角處的組織。大部分營養房水通過TM存在于眼的前部。在青光眼眼睛的TM中，TM細胞的不斷損失和胞外碎片的集結導致房水外流的阻力增加，從而使IOP升高。IOP升高以及其它因素如局部缺血導致視神經乳頭(ONH)的變性改變，引起ONH的進行性“杯狀陷凹形成”和視網膜神經節細胞及軸突的損失。造成TM、ONH和視網膜神經節細胞的青光眼性損傷的詳細分子機理尚不清楚。
20年前，作為導致青光眼視野缺損發展的主要因素，曾激烈地討論過高眼壓癥、局部缺血和視神經乳頭機械變形的相互作用。此后，在變性疾病過程中還涉及到其它因素，包括興奮毒性、氧化一氮、缺乏重要的神經營養因子、神經膠質/神經元相互作用異常以及基因組學(genomics)。在其可最終確定細胞死亡機理并提供對青光眼的各種形式的區分方面，對基因組學的考慮值得討論。在過去8年中，已經對超過15種的不同青光眼基因進行了繪圖并對7種青光眼基因進行了鑒定。這包括原發性開角型青光眼的6種已繪圖的基因(GLC1A-GLC1F)和2種已鑒定的基因(MYOC和OPTN)、先天性青光眼的2種已繪圖的基因(GLC3A-GLC3B)和1種已鑒定的基因(CYP1B1)、色素分散型(pigmentary dispersion)/色素性青光眼的2種已繪圖的基因，以及發育性或綜合征性(syndromic)青光眼的許多基因(FOXC1、PITX2、LMX1B、PAX6)。
因此，青光眼的每種形式可能具有獨特的病理學，相應地，控制所述疾病可能需要不同的治療方法。例如，作用于降解視神經乳頭胞外基質的酶表達的藥物不可能預防興奮毒性或神經營養因子不足導致的RGC死亡。在青光眼中，一種稱為凋亡(程序性細胞死亡)的過程導致RGC死亡。據推測可導致死亡的不同類型的損傷可通過集中于某些共同途徑而導致死亡。可能拓寬藥物效用和增加其在控制疾病的不同形式中具有效用的可能性的一種策略是以共同途徑下游為靶標。然而，作用于多個代謝途徑的藥物更可能產生不需要的副作用。隨著用于鑒定青光眼的具體形式的基于基因的診斷試劑盒的出現，可以試驗選擇性神經保護劑以期減少所測量的反應的偏差程度。
目前的青光眼治療主要是降低IOP，其是青光眼發展和惡化的主要危險因素。這些治療雖然可降低IOP，但是它們并不直接針對發病機制，并且疾病繼續惡化。因此，所需要的是通過發病途徑降低IOP和/或對視神經乳頭和/或視網膜神經節細胞提供神經保護的治療方法。
發明概述本發明通過為有需要的患者提供一種降低眼內壓并提供神經保護的方法克服了現有技術的這些及其它缺點，所述方法通過施用治療有效量的包含至少一種抑制結締組織生長因子(CTGF)表達和/或信號傳導的非核苷酸或非蛋白藥物和可藥用載體的組合物來實現。另一方面，本發明提供了通過向患者施用治療有效量的抑制CTGF表達和/或信號傳導的藥物而降低眼內壓的方法。優選地，用于本發明的方法的組合物可降低由CTGF或CTGF信號傳導產物表達增加引起的眼內壓升高。
在一項優選的實施方案中，本發明的組合物可通過局部應用、眼房內(intracamerally)或通過植入物施用。典型地，本發明的組合物中CTGF抑制劑的總濃度為0.01％至2％。通常，本發明的治療方法對患有青光眼例如正常眼壓性青光眼或高眼壓癥的患者最有用。
本發明還提供了預防與POAG相關的視野缺損的方法，所述方法通過向有需要的患者施用包含調節CTGF表達和/或信號傳導的非核苷酸或非蛋白藥物的組合物以便控制眼內壓并對視網膜神經節細胞或視神經乳頭提供保護來實現。
在另一項實施方案中，本發明提供了一種在有需要的患者中降低眼內壓并提供神經保護的組合物。通常，本發明的組合物包含至少一種抑制結締組織生長因子(CTGF)表達和/或信號傳導的藥物和可藥用載體。本發明的組合物中CTGF的總濃度優選為0.01％至2％。
附圖簡要說明以下附圖形成本說明書的一部分并包括在本說明書中以進一步闡明本發明的某些方面。通過參考這些附圖中的一幅或多幅以及在此給出的具體實施方案的詳細描述可以更好地理解本發明。


圖1.CTGF基因在青光眼TM組織中相對于在正常TM組織中表達升高。為了證實微陣列和cDNA差減的結果，通過正常相對于青光眼TM組織cDNA的QPCR分析測定了CTGF mRNA表達。每個樣品下面的數字表示分配給每個樣品的cDNA標識號。如(Wang等，2001)所述的那樣獲得人供體組織和總RNA。“平均”代表正常或青光眼TM水平的平均值。
圖2.CTGF基因在青光眼TM細胞系中相對于在正常TM細胞系中表達升高。為了證實微陣列和cDNA差減的結果，通過正常相對于青光眼TM細胞系cDNA的QPCR分析測定了CTGF mRNA表達。每個樣品下面的數字表示細胞系標識號。如(Shepard等，2001)所述的那樣獲得人TM細胞系和總RNA。“NTM庫”和“GTM庫”是指從合并的NTM或GTMcDNA得到的擴增水平。
圖3.GSK-3抑制對青光眼TM細胞中CTGF基因表達的影響。為了測定GSK-3抑制對CTGF基因表達的影響，我們使用QPCR分析測定了已知的GSK-3抑制劑SB-216763(Coghlan等，2000)對青光眼TM細胞系(SGTM2697)中基礎和TGFβ2-刺激的CTGF mRNA表達的影響。
圖4.CDK2抑制對青光眼TM細胞中CTGF基因表達的影響。為了測定CDK抑制對CTGF基因表達的影響，我們使用QPCR分析測定了已知的CDK-2抑制劑GW-8510(Davis等，2001)對青光眼TM細胞系(SGTM2697)中基礎和TGFβ2-刺激的CTGF mRNA表達的影響。
優選實施方案詳述青光眼是一類多樣的具有某些共同臨床特征的視神經病。青光眼的視力損失是由于神經視網膜中視網膜神經節細胞的選擇性死亡所致，該選擇性死亡在臨床上通過視野的特征性改變、神經纖維層缺損和ONH的進行性杯狀陷凹形成來診斷。青光眼發展的主要危險因素之一是存在高眼壓癥(眼內壓IOP升高)。在患者具有通常所認為的正常IOP的正常眼壓性青光眼的發病機制中似乎也涉及IOP。與青光眼相關的IOP升高是由于小梁網(TM)中房水外流的阻力升高所致，小梁網是位于眼前房的虹膜-角膜夾角處的一種小的特殊組織。TM的青光眼性改變包括TM細胞損失和包括斑塊樣物質在內的胞外碎片的沉積和積聚。另外，青光眼的視神經乳頭也發生改變。在青光眼眼睛中，ONH神經膠質細胞有形態學和可動性改變。在對IOP升高和/或短暫性局部缺血損傷的反應中，ONH胞外基質的組成有改變并且神經膠質細胞和視網膜神經節細胞軸突的形態也有改變。
TM的青光眼性改變與纖維變性不同，纖維變性與傷口愈合反應有關并且通常涉及炎癥以及隨后的肌成纖維細胞增殖。組織損傷可被炎癥系統識別，該系統通過刺激成纖維細胞和血管生成啟動傷口修復過程。死亡或將死的組織/細胞被最初由纖維蛋白組成的瘢痕組織代替，之后被過量的胞外基質物質、尤其是膠原蛋白所代替。
CTGF是分泌的細胞因子，已知其主要通過增加I型膠原蛋白和纖連蛋白的沉積來增加胞外基質(ECM)的產生。以前認為CTGF的過量表達是如硬皮病、纖維增生性疾病、瘢痕形成等其中存在ECM成分過量積累的病癥的主要成因。小梁網(TM)區域中胞外基質物質的過量積累也是許多形式的青光眼的標志；認為這種增加導致房水外流的阻力增加，從而導致眼內壓升高。本發明人已發現在分離的組織和由人TM建立的細胞系中存在CTGF基因產物。因此，認為CTGF在TM的ECM產生中發揮作用。下調CTGF基因表達、蛋白產生或CTGF活化的下游作用的藥物代表降低IOP的新手段。
CTGF表達可被多種因素誘導，包括TGF-β、VEGF、凝血酶、高級糖基化終產物(AGE)、機械應激和溶血磷脂酸(LPA)等。CTGF的具體誘導物和信號途徑可因所刺激的具體細胞類型而異。有報導稱在一些細胞類型中TGF-β對CTGF的誘導涉及Smads、PLC、PKC和酪氨酸激酶，而在其它細胞類型中似乎涉及RhoA、PKA和細胞骨架。成纖維細胞的機械應激通過蛋白激酶和酪氨酸磷酸酶的參與誘導CTGF表達。
CTGF的作用機理尚不十分清楚。CTGF似乎與PDGF受體、整聯蛋白以及LDL受體相關的蛋白(LRP)結合，它們中的每一種均可以作為CTGF的信號細胞表面受體發揮作用。在一些細胞類型中，通過PDGF受體的CTGF信號傳導似乎涉及MAPK和PI3K。軟骨細胞中的CTGF信號傳導涉及引起細胞增殖的ERK信號傳導和引起細胞分化的p38MAPK信號傳導。CTGF所用的具體的細胞表面受體和信號途徑似乎取決于所研究的具體細胞類型。
美國專利No.5,585,270描述了編碼CTGF的多核苷酸。據說CTGF具有促有絲分裂活性，即刺激靶細胞增殖的功能。據說CTGF還具有趨化活性，即通過與特定分子相互作用導致化學誘導細胞運動。該蛋白被認為在人組織的正常發育、生長和修復中發揮作用。該專利還描述了通過對傷口應用有效量的含有純化CTGF的組合物加速患者傷口愈合的方法。據說該多肽可用于皮膚傷口愈合不良的情況或者需要增強正常愈合機制的情況，例如燒傷。該專利沒有對青光眼或眼部病癥進行討論。
美國專利No.6,069,006的說明書是上述美國專利No.5,585,270的部分延續，其描述了CTGF調節性核酸序列。該專利還描述了治療纖維變性疾病的方法和鑒別用于治療纖維變性疾病的藥物的方法。除了CTGF核酸序列或多肽外，沒有描述其它具體的藥物。沒有描述眼組織的神經保護。
美國專利No.6,358,741描述了衍生自CTGF的許多核酸序列，據說這些核酸序列可用于抑制細胞中的CTGF表達。該專利沒有討論青光眼、眼組織的神經保護或抑制CTGF表達的非核酸或非多肽序列。
CTGF似乎在中樞神經系統的星形反應性星形膠質細胞的胞質中以高濃度產生。CTGF被認為是造成與反應性星形膠質細胞增生如神經膠質增生(神經膠質過度生長)以及神經膠質瘢痕形成相關的機制、即已知阻礙神經修復和生長的過程的成因(Schwab等，2000；Schwab等，2001)。據信，所述過程還參與與青光眼相關的視網膜神經元損失和/或視神經軸突修復不能。本發明人已發現下調CTGF提供了保護視網膜和視神經/神經乳頭的方法。
因此，一方面，本發明提供了通過施用包含非核苷酸或非肽CTGF抑制劑的組合物降低IOP并對視網膜神經節細胞提供神經保護的方法。進一步的構思是該組合物可包含抑制上調CTGF的藥物的化合物。例如，已證明過氧化氫(H2O2)是CTGF基因表達的誘導物。還發現TGF-β、地塞米松和5-羥色胺也誘導CTGF表達(Park等，2001)。
治療青光眼的治療劑優選為藥物樣小分子，其影響CTGF途徑的一個或多個方面。優選的治療劑為以下的這些(1)CTGF的抑制劑；(2)在CTGF作用的下游發揮作用的物質的抑制劑(即CTGF信號傳導的抑制劑)和/或(3)上調CTGF基因或蛋白表達的物質的抑制劑。
本發明人已經用CTGF QPCR分析試驗了數種不同化合物種類對培養的人正常或青光眼TM細胞中基礎和TGFβ2誘導的CTGF基因表達的抑制作用。小分子抑制劑的靶標是抑制GSK-3、CDK、NAALADase、蛋白激酶C、MEK、p38MAPK、ROCK、VEGF、牻牛兒基牻牛兒基轉移酶和AGE。還試驗了PPAR、5-HT和P2X7的小分子激動劑的活性。以胞外信號調節激酶1或2(ERK1或ERK2)為靶標的化合物也可以在基礎或TGFβ2-誘導的CTGF基因表達中發揮作用。許多GSK-3和CDK抑制劑之間存在明顯的交叉反應性，因此抑制其它靶標如ERK、蛋白激酶C或STAT家族的化合物可能會被證明在抑制TM細胞中基礎或TGFβ2-刺激的CTGF表達中有價值。
已發現兩大類化合物可抑制人TM細胞中基礎和TGFβ2誘導的CTGF表達GSK-3和CDK抑制劑。糖原合酶激酶(GSK-3)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其以衍生自兩種基因的兩種細胞形式存在，即GSK-3α和GSK-3β。GSK-3α和GSK-3β95％相同，并且不能容易地區分小分子拮抗劑對它們的差別抑制。GSK-3是糖原合成中的限速酶，但具有許多磷酸化細胞靶標，包括糖原合酶、β-連環蛋白、eIF2B和tau(在(Cohen和Frame2001)和(Woodgett 2001)中有評述)。在該文獻中沒有給出GSK-3直接參與CTGF表達和信號傳導的實例。
依賴細胞周期蛋白的激酶(CDK)具有多種細胞功能，包括調節細胞分裂周期、凋亡、轉錄、神經元功能和分化。已經鑒定了數種已知的CDK的ATP-競爭性抑制劑(Knockaert，Greengard等，2002)。人們一直在致力于將CDK抑制用于治療癌癥、阿爾茨海默病、ALS、中風、心血管疾病等。已證明CTGF是成纖維細胞增殖中TGFβ的下游介導物，其上調細胞周期蛋白A-cdk2(Kothapalli和Grotendorst，2000)。
在GSK-3類化合物中，發現一種化合物即SB-216763(Coghlan，Culbert等，2000)抑制正常和青光眼(圖3)人TM細胞中基礎和TGFβ2誘導的CTGF水平。SB-216763是一種馬來酰亞胺衍生物，其在0.01mM ATP存在下對GSK-3α和GSK-3β的IC50為34nM，Ki為9nM(Coghlan，Culbert等，2000)。受試并發現可抑制TM細胞中基礎和某些情況下的TGFβ2誘導的CTGF基因表達的GSK-3類抑制劑中的其它化合物包括帕羅酮類(paullones)，如阿司特帕羅酮(alsterpaullone)、9-氰基帕羅酮和坎帕羅酮(kenpaullone)(Zaharevitz，Gussio等，1999；Leost，Schultz等，2000；Bain，McLauchlan等，2003)。
在CDK類化合物中，發現一種具有相對選擇性的CDK2抑制劑即GW-8510(Davis，Benson等，2001)抑制正常和青光眼(圖4)人TM細胞中基礎和TGFβ2-誘導的CTGF水平。GW-8510是強效且具有相對選擇性的CDK2抑制劑，其IC50為10nM。GW-8510還抑制CDK1和CDK4，但IC50值較低(110和130nM)(Davis，Benson等，2001)。受試并證明具有抑制活性的其它CDK類抑制劑包括purvalanol A和roscovitine(Hardcastle，Golding等，2002)。
在CTGF QPCR分析中受試并發現可抑制TM細胞中基礎和一些情況下的TGFβ2誘導的CTGF基因表達的其它類化合物包括PPAR激動劑如曲格列酮、環格列酮(Willson，Brown等，2000)和15(S)HETE。
可將本發明的藥物摻入用于(例如局部、眼房內或通過植入物)遞送至眼的各種類型的眼用制劑中。優選將所述藥物摻入用于遞送至眼的局部眼用制劑中。所述藥物可以與眼科可接受的防腐劑、表面活性劑、粘度增強劑、滲透促進劑、緩沖劑、氯化鈉以及水混合以形成水性、無菌的眼用混懸液或溶液。眼用溶液制劑可以通過將藥物溶解在生理學可接受的等張水性緩沖液中來制備。此外，眼用溶液還可以包含眼科可接受的表面活性劑以幫助溶解藥物。另外，眼用溶液還可以含有增加粘度的物質，如羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，以增強制劑在結膜囊中的保持力。也可以使用膠凝劑，包括但不限于結冷膠(gellan)和黃原膠。為了制備無菌眼用軟膏制劑，將活性成分與防腐劑在適合的賦形劑如礦物油、液體羊毛脂或白凡士林中混合。根據公開的類似眼用制劑的配方，可以通過將藥物混懸于由例如卡波普-974等的組合物制備的親水性基質中制備無菌眼用凝膠制劑；可以摻入防腐劑和張力劑。
優選將藥物配制成pH約4至8的局部眼用混懸劑或溶液劑。為每個個體建立特定的劑量方案由臨床醫生決定。通常這些制劑中包含的藥物量為以重量計0.01％至5％，但優選為以重量計0.05％至2％，最優選為以重量計0.1至1.0％。劑型可以是溶液劑、混懸微乳劑。因此，對于局部給藥，根據熟練臨床醫生的判斷，可將這些制劑的1至2滴遞送至眼表面，每天1至4次。
所述藥物也可以與用于治療青光眼的其它藥物組合使用，所述的其它藥物例如但不限于β-阻斷劑、前列腺素類似物、碳酸酐酶抑制劑、α2激動劑、縮瞳藥和神經保護藥。
可以使用本領域技術人員公知的技術將藥物直接遞送至眼(例如局部用滴眼劑或軟膏劑；處于陷凹(cul-de-sac)中或鄰近鞏膜或在眼中的緩釋裝置；眼周、結膜或眼球筋膜下、眼房內或玻璃體內注射)或經胃腸外遞送至眼(例如經口；靜脈內、皮下或肌內注射；經皮遞送；等)。以下是本發明具體的可能的制劑實例(a)局部眼用制劑重量百分比CTGF抑制劑 0.005-5.0四丁酚醛 0.01-0.05HPMC 0.5苯扎氯銨 0.01氯化鈉 0.8乙二胺四乙酸二鈉 0.01NaOH/HCl 適量至pH7.4純化水 適量至100mL進一步的構思是可將本發明的化合物配制在眼內植入裝置中。
以下實施例用于闡明本發明的優選實施方案。本領域技術人員應當理解在以下實施例中所公開的技術代表發明人所發現的在本發明的實施中可良好發揮作用的技術，因此可以認為其構成了實施本發明的優選方式。然而，根據本發明所公開的內容，本領域技術人員應當理解在不背離本發明的精神和范圍的情況下，可對所公開的具體實施方案進行很多改變并且仍能獲得類似或相似的結果。
實施例1青光眼TM相對于非青光眼TM中的CTGF表達微陣列篩選通過GeneFilter(Research Genetics)篩選鑒定青光眼TM細胞中相對于正常TM細胞中CTGF的mRNA轉錄物升高。
如(Shepard等，IOVS 2001，423173)所述的那樣，由合并的(每種6個)正常或青光眼TM細胞系中分離出500ηg總RNA(TRIzol Reagent；Invitrogen)，并于300單位Superscript II核糖核酸酶H-反轉錄酶(Invitrogen)、100μCi[α-33P]dCTP(10mCi/ml，3,000Ci/mmol；Amersham)、0.33mM dATP、dGTP、dCTP(Promega)、3.3mM DTT、1X第一鏈緩沖液(Invitrogen)和2μg oligo-dT存在下、在37℃下分別反轉錄90分鐘。然后按照生產商的使用說明用Chroma-Spin 100柱(Clontech)純化放射性標記的cDNA。按照生產商的使用說明用點有≈4,000種已知基因的單個Genefilter(GF211；Research Genetics)與放射性標記的探針雜交。通過在0.5％SDS中煮沸5分鐘將膜首先進行預處理。膜的預雜交在42℃下、于含有5ml MicroHyb(Research Genetics)的轉瓶中用5μg poly-dA(ResearchGenetics)和5μg煮沸的Cot1 DNA(Invitrogen)作為封閉試劑進行30分鐘。將全部放射性標記的探針煮沸并在42℃下加至預雜交混合物中達16h。雜交后，將膜在2XSSC/1％SDS中洗滌2次達20分鐘，然后在0.5XSSC/1％SDS中洗滌1次達15分鐘。將膜放置于濕Whatmann 3MM紙上并用SaranWrap包裹。在Storm磷光顯像儀(Molecular Dynamics)上用最大分辨率獲得圖像。一旦獲得圖像，就將印跡立即在沸騰的0.5％SDS中除去探針并用相反的探針(例如正常TM之后是青光眼TM)進行另一次雜交。使用Pathways(Research Genetics)和MS Excel(Microsoft)軟件分析得自一式兩份探測的圖像。在GF211 GeneFilter上的4300種基因中，CTGF(GenBank登錄號#AA598794)是顯示出GTM∶NTM比＞2倍的7種基因之一。
cDNA差減篩選在定制的PCR-SelectTMcDNA差減篩選(Clontech)中獨立地鑒定CTGF，所述的差減篩選用于篩選在青光眼TM細胞中相對于在正常TM細胞中差異表達的mRNA轉錄物。
如(Shepard等，2001)所述的那樣，由合并的(每種7個)正常或青光眼TM細胞系中分離出700μg總RNA(TRIzol Reagent；Invitrogen)。使用Nucleotrap mRNA Midi試劑盒(Clontech)通過在oligo-dT膠乳珠上的兩輪poly A+選擇分離出受試者(青光眼)和驅動者(正常)poly A+RNA。按照Clontech試劑盒(目錄號#K1804-1)的方法進行所有隨后的PCR-SelectTMcDNA差減步驟。
基本按照PCR-SelectTM差異篩選試劑盒(Clontech目錄號#K1808-1)中的使用說明進行得到的cDNA差減文庫的差異篩選。選擇的數個差異表達的cDNA克隆也通過Northern分析證實。用差減TM細胞cDNA文庫探針鑒定的所有候選差異表達克隆的列表由Clontech產生。CTGF的轉錄物(GenBank登錄號#XM_037055.1)在該表中并且于青光眼cDNA文庫中被富集。
實施例2RNA分離和第一鏈cDNA制備按照生產商的使用說明(Life Technologies)使用Trizol試劑由TM細胞中分離出總RNA。按照生產商的使用說明(PE Biosystems，Foster City，CA)使用隨機六聚體和TaqMan反轉錄試劑由1μg總RNA產生第一鏈cDNA。然后，將100ul反應物稀釋20倍以達到0.5ng/μl的有效cDNA濃度。
定量PCR基本如(Shepard等，IOVS 2001，423173)所述的那樣使用ABI Prism7700序列檢測系統(Applied Biosystems)通過定量實時RT-PCR(QPCR)證實CTGF的差異表達。使用Primer Express軟件(Applied Biosystems)設計用于CTGF擴增的引物，并將該引物退火至Genbank登錄號為#NM_001901.1的鄰接外顯子(CAGCTCTGACATTCTGATTCGAA，nts1667-1689和TGCCACAAGCTGTCCAGTCT，nts 1723-1742)上，產生76-bp擴增子。CTGF的擴增使用設計用于產生69-bp擴增子的針對18SrRNA基因(GenBank登錄號#X03205 GTCCCTGCCCTTTGTACACAC，nts 1680-1700和CGATCCGAGGGCCTCACTA，nts 1730-1749)的引物相對于18S核糖體RNA表達進行標化。使用SYBRGreen I雙鏈DNA結合染料化學(Applied Biosystems)擴增CTGF或18S cDNA。CTGF和18S引物對的特異性通過組合使用DNA測序、瓊脂糖凝膠分析和使用ABIPrism 770 SDS解離曲線軟件(Applied Biosystems)的解離曲線分析由PCR產物評價。CTGF或18SrRNA反應物由1X SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)、50nM引物和2.5ng cDNA組成，終體積為50μl。熱循環條件由50℃，2分鐘、95℃，10分鐘，然后40個95℃15秒及60℃1分鐘的循環組成。使用PE Biosystems用戶公告#2(http//docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf)中所述的相對標準曲線法進行相對RNA濃度的定量。使用SDS軟件版本1.9.1(AppliedBiosystems)和MS Excel 97(Microsoft)進行數據分析。使用含有CTGF或18S的靶序列的質粒DNA產生標準曲線。QPCR數據以平均值±SD給出。
根據本發明所公開的內容，在此所公開并要求保護的所有組合物和/或方法均無需進行過多實驗即可進行制備和實施。雖然根據優選實施方案對本發明的組合物和方法進行了描述，但對本領域技術人員而言，顯而易見的是在不背離本發明的概念、精神和范圍的情況下，可對在此所述的組合物和/或方法以及所述方法的步驟或步驟的順序進行改變。更具體而言，顯而易見的是可以用化學和結構上相關的某些藥物替換在此所述的藥物以得到相似的結果。對本領域技術人員而言，顯而易見的是所有這些替換和改變均被認為落入所附權利要求所定義的本發明的精神、范圍和概念之內。
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權利要求
1.在有需要的患者中降低眼內壓并提供神經保護的方法，所述方法包括施用治療有效量的包含至少一種抑制結締組織生長因子(CTGF)表達、信號傳導或生物學功能的非核苷酸或非蛋白藥物和可藥用載體的組合物。
2.權利要求1的方法，其中所述的施用是通過局部應用、眼房內或通過植入物施用。
3.權利要求1的方法，其中在所述組合物中所述CTGF抑制劑的總濃度為0.01％至2％。
4.權利要求1的方法，其中所述的患者患有青光眼或高眼壓癥。
5.權利要求4的方法，其中所述的青光眼為正常眼壓性青光眼。
6.在有需要的患者中降低眼內壓的方法，所述方法包括施用治療有效量的包含至少一種抑制結締組織生長因子(CTGF)表達、信號傳導或生物學功能的非核苷酸或非蛋白藥物和可藥用載體的組合物。
7.權利要求6的方法，其中所述的施用是通過局部應用、眼房內或通過植入物施用。
8.權利要求6的方法，其中在所述組合物中所述CTGF抑制劑的總濃度為0.01％至2％。
9.權利要求6的方法，其中所述的患者患有青光眼或高眼壓癥。
10.權利要求9的方法，其中所述的青光眼為正常眼壓性青光眼。
11.預防與原發性開角型青光眼(POAG)相關的視野缺損的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含調節結締組織生長因子(CTGF)表達的非核苷酸或非蛋白藥物的組合物以便控制眼內壓并對視網膜神經節細胞或視神經乳頭提供保護。
12.在有需要的患者中降低眼內壓并提供神經保護的組合物，所述組合物包含至少一種抑制結締組織生長因子(CTGF)表達、信號傳導或生物學功能的藥物和可藥用載體。
13.權利要求12的組合物，其中在所述組合物中所述CTGF抑制劑的總濃度為0.01％至2％。
全文摘要
本發明提供了通過施用治療有效量的至少一種抑制結締組織生長因子(CTGF)表達和/或信號傳導的非核苷酸或非蛋白藥物而在有需要的患者中降低眼內壓并提供神經保護的方法。
文檔編號A61K31/519GK1650001SQ03809604
公開日2005年8月3日 申請日期2003年4月18日 優先權日2002年4月30日
發明者D·L·弗利納, A·謝潑德, N·雅各布森, 彭玉豪, A·F·克拉克 申請人:愛爾康公司