專利名稱：用于治療腫瘤的作為編碼細胞抗原的核苷酸序列的載體的微生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及攜帶外源核苷酸序列的微生物，涉及其作為藥物特別是作為疫苗的用途，涉及攜帶外源核苷酸序列的質粒和用于生產這樣的微生物的方法。
背景技術：
和現有技術對于大多數病例，惡性腫瘤疾病引起致命的后果的主要原因是身體防御系統不能檢測和毀壞惡性腫瘤癌細胞。在工業高度發展的國家，癌癥疾病屬于具有致命病程的最普遍的疾病。僅僅在德國，每年超過210000的人死于新形成的惡性疾病(來源WHO，1997年的數據)，相當于每100,000居民超過255人的年死亡速度。
本發明基于產生惡性畸變的分子機理的近來的新發現。在癌癥已經形成的早期階段，產生了控制細胞生長和/或細胞分化的特征性變化(Pronten，癌癥存活性325-35，1998)。主要參與這些變化的是信號轉導和細胞周期控制的蛋白質，這些蛋白質在近年得到鑒定，它們也是腫瘤抗原。
腫瘤抗原大致可以分為三組(Pardoll，Nat.Med.4525-531，1998)i)腫瘤特異性新抗原，它以突變的和/或過度表達的形式存在于腫瘤細胞中例如EGF-R，HER-2，ii)腫瘤特異性胚胎抗原，例如MAGE蛋白質家族的成員或CEA，iii)腫瘤組織特異性分化抗原，例如酪氨酸酶，Mart-1/Melan-A和gp100。
對于腫瘤疫苗的效果，CD8+T細胞的有效誘導是決定性的，因為在大多數病例中腫瘤細胞不表達MHC類型II分子，在大多數病例中胞內存在的腫瘤抗原是重新組裝(restringiert)的MHC類型I。對于腫瘤病人，天然存在的CD8+，胞毒性T細胞(CTL)群體，明顯不足以檢測和去除腫瘤細胞(Jaffee，Ann.N.Y.Acad.sci.88667-72，1999)。此外，由于機理(無反應性，耐受力，中和力)不同腫瘤特異性T細胞不能有效地攻擊腫瘤組織(Smyth等人，Nat.Immunol 2293-299，2001)。因此成功的疫苗必須打破這種無反應性或耐受力并且誘導足夠量的激活的，特異性CTL以及特異性抗體。通過使用抗組(a)的腫瘤抗原的單克隆抗體(mAbs)，例如已經商品化的一種抗HER-2的mAb單克隆抗體(herceptin)，可以看到特異性抗體的作用(Colomer等人，Cancer Invest 1949-56，2001)。
已知減毒的胞內細菌適合作為抗某些細菌感染的疫苗載體，特別是那些受所謂的Th1免疫應答的控制的(Hess and Kaufmann，FEMSImmunology & Medical Microbiology 23165-173，1999)。這種應答的特征是CTL以及呈現特異的分泌IFN-g的CD4+T細胞(也是T輔助細胞，Th)(Abbas等人，Nature 383787-793，1996)。其他組已經顯示重組細菌可以針對異源腫瘤提供保護(Medina等人，Eur.J.Immunol.29693-699，1999；Pan等人，Cancer Res 595264-5269，1999；Woodlock等人，J.Immunother.22251-259，1999；Paglia等人，Blood，923172-3176，1998；Paglia等人，Eur.J.Immunol.271570-1575，1997；Pan等人，Nat.Med.1471-477，1995；Pan等人，Cancer Res.554776-4779，1995)。但是在這些情況下，給動物免疫接種以抵抗替代抗原，然后應用表達該抗原的腫瘤細胞。
但是這些腫瘤系統不能與臨床腫瘤相比，因為這些模型對腫瘤抗原沒有耐受力。
相當數量的不同腫瘤疫苗已經在臨床上進行研究。但是至今為止，沒有任何腫瘤疫苗或免疫接種方法在腫瘤疾病的治療中取得突破。基于這樣的背景，對新的腫瘤治療方法仍然存在迫切的需求。
在本領域內已知，導入細菌中的核酸序列的表達產物在這些細菌的細胞膜上表達，或者將它們從這些細菌中分泌。該技術的基礎是代表格蘭氏陰性細菌的I型分泌系統的原型的大腸桿菌溶血素系統HlyAs。借助于HlyAs，研制了分泌型載體，允許有效地去除腸炎沙門氏菌(Salmonella enterica)，小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)中的蛋白質抗原。這樣的分泌型載體含有結合到編碼下述產物的核苷酸序列上任意蛋白質抗原的cDNA，所述產物指用于溶血素分泌器的HlyA信號肽，hlyB和hlyD和hly特異性啟動子，借助于該分泌載體，可以在該細菌的表面表達蛋白質。這樣的遺傳工程修飾的細菌作為疫苗誘導一種比細菌具有更高的免疫保護作用，其中由導入的核酸表達的蛋白質保留在細胞內(Donner等人，EP1015023A；gentschev等人，Gene，179133-140，1996；疫苗192621-2618，2001；Hess等人PNAS 931458-1463，1996)。但是該系統的缺點是通過使用hly-特異性啟動子，在該細菌的外表面表達的蛋白質的量是非常小的。
研制了借助于載體細菌，例如沙門氏菌和單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)將質粒DNA插入到哺乳動物細胞中的技術。當它們處于真核啟動子控制下時，包含于這些質粒中的基因也在哺乳動物細胞中表達。將質粒導入到單核細胞增生李斯特氏菌中，所述的質粒包含任意真核啟動子控制下的任意抗原的核苷酸序列。通過將該核苷酸序列導入特異性裂解基因，獲得了單核細胞增生李斯特氏菌溶解于抗原呈遞細胞的胞質溶液中并且釋放它們的質粒，這導致隨后質粒編碼的蛋白質的表達、加工和呈遞，并且明顯增加這些蛋白質的免疫原性(Dietrich等人，Nat.Biothechnol.16181-185，1998；Vaccine 192506-2512，2001)。
研制了減毒的，定居于胞內的細菌。例如單核細胞增生李斯特氏菌變種，腸炎沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌和傷寒沙門氏菌種(Salmonellaenterica.sv.Typhimurium和Typhi)，和牛分枝桿菌已用作為耐受力極好的抗斑疹傷寒和肺結核的活疫苗。這些細菌，包括它們的減毒突變體通常是免疫刺激的，并且可以引發良好的細胞免疫應答。例如，單核細胞增生李斯特氏菌刺激至特定程度的TH1細胞活化，胞毒性T-淋巴細胞增殖。這些細菌提供分泌的抗原直接進入抗原呈遞細胞的胞質溶液(APC，巨噬細胞和樹枝狀的細胞)，依次表達共刺激分子并且引起T細胞的有效刺激。李斯特氏菌在吞噬區室中被部分降解，從而由這些細菌產生的抗原一方面由MHC II類分子呈遞，因此導致T輔助細胞誘導。另一方面，在從吞噬區室中釋放后，李斯特氏菌在APCs的胞質溶液中復制；由這些細菌產生和分泌的抗原優選的是由MHCI類途徑呈遞，因此誘導抗這些抗原的CTL應答。此外，可以證明通過李斯特氏菌和巨噬細胞，天然殺死細胞(NK)和中性粒細胞相互作用，誘導這些細胞因子的表達(TNF-α，IFN-γ，IL-2，IL-12；Unanue，Curr.Opin.Immunol.，935-43，1997；Mata & Paterson，J.Immunol.1631449-14456，1999)，對此已檢測到抗腫瘤效果。通過施用經轉導以表達腫瘤抗原的單核細胞增生李斯特菌，抗原可以特異性地抑制試驗腫瘤的生長(Pan等人，Nat Med 1471-477，1995；Cancer Res.595264-5269，1999；Voest等，Natl.Cancer Inst.87581-586，1995；Beatty and Paterson，J. Immunol.1655502-5508，2000)。
將引入了編碼腫瘤抗原的核苷酸序列的減毒的腸炎沙門氏菌菌株作為表達病毒抗原的細菌載體，通過口服施用后會提供針對不同試驗腫瘤的特異保護(Medina等人，Eur.J.Immunol.30768-777，2000；Zoller和Christ，J.Immunol.1663440-34450，2001；Xiang等人，PNAS 975492-5497，2000)。
重組沙門氏菌菌株也可以有效地作為預防性疫苗抗病毒感染(HPV)；(Benyacoub等人，Infect Immun 673674-3679，1999)以及用于治療腫瘤病毒導致的無限增殖的的小鼠腫瘤(HPV)(Revaz等人，Virology 279354-360，2001)。
發明的技術目的本發明的目的是提供一種藥物，尤其是作為在腫瘤預防和腫瘤治療中的一種改進疫苗，它打破對腫瘤的免疫耐受力。
發明概述為了達到該技術目的，本發明教導具有編碼細胞抗原的核苷酸序列的微生物，其基因組中插入了下列成分，并且是可表達性的I)編碼至少腫瘤細胞的一種或幾種抗原的表位的核苷酸序列，和/或編碼特異于產生了腫瘤的組織細胞的一種或幾種抗原的至少一個表位的核苷酸序列；II)編碼刺激免疫系統的細胞的蛋白質的可選擇的核苷酸序列；IIIA)編碼轉運系統的核苷酸序列，它使得成分I)任意選擇性地，II)的表達產物在細菌的外表面表達，和/或使得成分I)任意選擇性地，成分II)的表達產物分泌成為可能；和/或IIIB)編碼用于在哺乳動物細胞的胞質溶液中裂解微生物和用于胞內釋放質粒的蛋白質的核苷酸序列，所述的質粒包含于裂解的微生物內；和IV)用于表達I)到IIIB)的一種或幾種成分的一種活化序列，所述的活化序列選自“能夠在微生物中活化的，組織細胞特異性的，但是不是細胞特異性的活化序列”，I)到IV)各個成分可能以一個或多個拷貝存在，并且利用這樣的微生物生產藥物。
因此本發明的主體是微生物，這些微生物代表了編碼細胞抗原的核苷酸序列的載體，這些核苷酸可以在微生物的外膜表達或分泌，本發明還包括這些微生物用于打破針對腫瘤的免疫耐受力，本發明還包括含作為編碼正常細胞和/或腫瘤細胞的細胞抗原的核苷酸的載體的所述微生物的新腫瘤疫苗。借助本發明，最終引起直接抗腫瘤的免疫反應。
詳細地說，本發明的微生物含有下列成分I)至少一種編碼腫瘤細胞的至少一種細胞蛋白質的至少一種抗原的至少一個表位的核苷酸序列和/或任意選擇性地編碼至少一種特異于衍生腫瘤的組織細胞的至少一種抗原的至少一個表位的核苷酸序列；II)任意選擇性地編碼至少一種刺激免疫系統細胞的至少一種蛋白質的核苷酸序列；IIIA)編碼用于由成分I)編碼的細胞抗原在膜上表達或分泌和用于分泌由成分編碼的免疫刺激蛋白質的轉運系統的至少一種核苷酸序列；IIIB)任意選擇性地用于在胞質溶液中裂解微生物以使包含在所述微生物中的質粒釋放到胞質溶液中的核苷酸；IV)編碼至少一種能夠在微生物中活化的或非細胞特異性，但是腫瘤細胞特異性，組織細胞特異性或功能特異性活化以表達成分I)和II)的活化序列的核苷酸序列。
優選的
具體實施例方式
下文中，將詳細地描述本發明的微生物成分。
成分I)成分I)代表編碼腫瘤細胞的至少一種細胞蛋白質或至少一種致瘤突變的細胞蛋白質的至少一個抗原的至少一個表位的至少一個核苷酸序列。該細胞蛋白質的致瘤突變可能已經導致其原始細胞功能的失去或獲得。此外，該細胞蛋白質可以選自于下列組“受體分子或其部分，即該受體的胞外，跨膜或胞內部分；粘附分子或其部分，即粘附分子的胞外，跨膜或胞內部分；信號轉導蛋白質；控制細胞周期的蛋白質；分化蛋白質；胚胎蛋白質；和病毒誘導蛋白質”。這樣的細胞抗原在細胞中起著控制細胞生長和細胞分裂的作用并且呈遞到正常細胞中的細胞膜上，例如由MHC I類分子呈遞。在腫瘤細胞中，這些抗原經常過量表達或特異性地突變。這樣的突變可能具有致癌基因抑制劑限制功能，或結果是將原-致癌基因激活為致癌基因，可以單獨或共同參與腫瘤生長中的過量表達。這樣的細胞抗原呈遞到腫瘤細胞的膜上，因此代表了腫瘤細胞上的抗原，但是沒有導致產生影響患者腫瘤疾病的免疫反應。Rapp(US5156841)已經描述了將致癌蛋白即致癌基因的表達產物用作為腫瘤疫苗的免疫原。該文獻的詳述作為本文參考。
本發明所屬的細胞抗原和其致癌突變的例子有I)受體，例如Her-2/neu，雄激素受體，雌激素受體，midkine受體，EGF受體，ERBB2，ERBB4，TRAIL受體，FAS，TNFα受體；ii)信號轉導蛋白質和其致癌突變，例如c-Raf(Raf-1)，A-Raf，B-Raf，Ras，Bc1-2，Bc1-x，Bc1-w，Bf1-1，Brag-1，Mc1-1，A1，Bax，BAD，Bak，Bc1-Xs，Bid，Bik，Hrk，Bcr/abl，Myb，C-Met，IAP1，IAO2，XIAP，ML-IAP LIVIN，survivin，APAF-1；iii)控制細胞周期的蛋白質和其致瘤突變，例如細胞周期蛋白D(1-3)，E，A，B，H，Cdk-1，-2，-4，-6，-7，cdc25c，P16，p15，p21，p27，p18，pRb，p107，p130，E2F(1-5)，GAAD45，MDM2，PCNA，ARF，PTEN，APC，BRCA，p53和同系物；iv)轉錄因子和其至瘤突變，例如C-Myc，NFkB，c-Jun，ATF-2，Sp1；v)胚胎蛋白質，例如癌胚胎抗原，α-胎兒蛋白質，MAGE，PSCA；vi)分化抗原，例如MART，Gp100，酪氨酸酶，GRP，TCF-4；vii)病毒抗原，例如下面的病毒HPV，HCV，HPV，EBV，CMV，HSV。
可選擇地或另外地，成分I)可以表示編碼至少特異于正常組織細胞的一種抗原的至少一種核苷酸序列，所述的細胞衍生了腫瘤。這種特定的抗原例如是I)受體，例如雄激素受體，雌激素受體，乳鐵蛋白受體；ii)分化抗原，例如堿性髓磷脂，α-乳白蛋白，GFAP，PSA，纖維性酸蛋白質，酪氨酸酶，EGR-1，MUC1。
成分II)成分II)表示編碼至少一種蛋白質的至少一種核苷酸序列，該蛋白質刺激細胞的免疫系統。通過選擇該蛋白質，可以加強與成分I)的表達產物的免疫反應和/或以更有利于激活Th1細胞(對于細胞的免疫反應)進行定位或以更有利于激活Th2細胞(用于體液的免疫反應)進行定位。免疫刺激蛋白質例如是I)細胞因子，例如M-CSF，GM-CSF，G-CSF；ii)干擾素，例如IFN-α，β，γ；iii)白細胞介素，例如IL-1，-2，-3，-4，-5，-6，-7，-9，-10，-11，-12，-13，-14，-15，-16，人白血病抑制因子(LIF)，iV)化學因子，例如RANTES，單細胞趨化性和活化因子(MCAF)，巨噬細胞炎癥因子蛋白質-1(MIP-1-α，β)，嗜中性活化蛋白質-2(NAP-2)，IL-8。
成分IIIA)成分IIIA)是編碼至少一種轉運系統的至少一種核苷酸序列，該轉運系統可以使成分I)和任意選擇性地II)的表達產物在微生物的外表面進行表達。相應的成分可選擇性地在微生物細胞膜上進行分泌或表達，即是膜結合的。這樣的轉運系統例如是I)大腸桿菌溶血素轉運信號(含有處于hly特異性啟動子控制下的HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)；下面的轉運信號可用于在HlyB和HlyD蛋白質存在下分泌-C-末端HlyA轉運信號；在HlyB蛋白質的存在下膜結合表達-C-末端HlyA轉運信號，ii)大腸桿菌的溶血素轉運信號(含有處于非hly特異性細菌啟動子控制下的HlyA，HlyB和HlyD的核苷酸序列)，iii)新月柄桿菌(caulobacter crescentus)的S-層蛋白質(RasA)的轉運信號；可以將下面的轉運蛋白用于分泌和膜結合表達-C-末端RsaA轉運信號，iv)大腸桿菌的To1C蛋白質的轉運信號；可以將下面的轉運蛋白用于膜結合表達-大腸桿菌的To1C的N-末端轉運信號，大腸桿菌的整合膜蛋白To1C是大腸桿菌的外膜的多功能孔-形成蛋白質，除了具有例如大腸菌素E1的受體(Morona等人，J.Bacteriol.153693-699，1983)和大腸菌素V的分泌(Fath等人，J.Bacteriol.1737549-7556，1991)的功能以外，還具有U3噬菌體的受體的功能(Austin等人，J.Bacteriol.1725312-5325，1990)；該蛋白質不僅存在于大腸桿菌中，而且還存在于許多的格蘭氏陰性細菌中(Wiener等人，Structure Fold Des 8R171-175，2000)；其外膜定位和廣泛的存在使得To1C是提供異源抗原的理想的候選者，以便例如引起免疫反應。
成分IIIB)成分IIIB)是編碼至少一種裂解蛋白質的核苷酸序列，它在哺乳動物細胞的胞質溶液表達并且裂解微生物以釋放宿主細胞的胞質溶液中的質粒。這樣的裂解蛋白質(內溶素)例如是處于李斯特啟動子控制下的李斯特特異性裂解蛋白質，例如PLY551(Loessner等人，MolMicrobiol 161231-41，1995)和/或李斯特特異性的穴蛋白。
本發明的優選的具體實施方式
是不同成分IIIB)的結合，例如裂解蛋白質和穴蛋白的結合。
成分IIIA和/或IIIB可以是組成型活化的。
成分IV)成分IV)代表編碼至少一種用于成分I)表達，任意選擇性地II)的表達的活化序列的至少一種核苷酸序列。
如果表達是在微生物的外表面的膜結合的，活化序列優選的是選擇那些能夠在微生物中活化的。這樣的活化序列例如是I)組成型活化的啟動子區域，例如大腸桿菌的β-內酰胺酶基因或tetA基因的具有“核糖體結合位點”(RBS)的啟動子區域(Busby and Ebright，Cell79743-746，1994)；ii)能夠被誘導的啟動子，優選的是在細胞中被接受后活化的啟動子。單核細胞增生李斯特氏菌的啟動子actA(Dietrich等人，Nat.Biotechnol.16181-185，1998)或鼠傷寒沙門氏菌的pagC啟動子(Bumann，Infect Immun 697493-7500，2001)屬于這種類型。
如果裂解后質粒從微生物釋放到細胞的胞質溶液，活化序列不是細胞特異的，但是組織特異的，細胞周期特異或功能特異的。優選的是選擇這樣的活化序列，特異地在巨噬細胞，樹狀細胞，淋巴細胞中活化。
本發明意義上的微生物是病毒，細菌或單細胞的寄生蟲，它們通常被用于轉移對微生物而言的外源的核苷酸序列。
在本發明的特定的具體實施方式
中，微生物代表格蘭氏陽性或格蘭氏陰性細菌，優選的細菌，例如大腸桿菌，沙門氏菌，小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)，霍亂弧菌(Vibriocholerae)，單核細胞增生李斯特氏菌，志賀氏菌(Shigella)。
優選的是，使用可以減毒的這樣的細菌。
采用本領域技術人員已知的方法將本發明的成分導入微生物。如果該微生物代表細菌，將該成分插入到質粒，將質粒轉移到細菌。本領域技術人員非常熟悉適用于該細菌和質粒的技術。
本發明的主體是含有本發明微生物或該微生物的膜包膜的藥物制劑。該方法中涉及的這些膜包膜的制劑參見例如EP-A-0540525。這樣的藥物制劑例如是本發明的微生物溶于適用于注射的為藥師所熟悉的溶液中的懸浮液。
本發明的另一方面涉及含有本發明的微生物的藥物制劑的給藥。局部或全身給藥，例如表皮，皮下組織，肌肉系統，體腔，器官，腫瘤或血液循環。
本發明的特定方面是以本發明的藥物進行經口或直腸給藥以預防和/或治療增殖疾病。給藥可以一次或幾次進行。在每次給藥中，使用10-109本發明的微生物進行給藥。如果以該數量的本發明的微生物進行給藥時沒有引起足夠的免疫反應，則必須提高注射的量。
在以本發明的微生物給藥后，破壞了對細胞呈遞成分I)，例如對腫瘤細胞，或對衍生腫瘤的組織細胞的耐受力，并且激發了抗腫瘤和/或其組織細胞的胞毒性免疫反應。
基于選擇的成分I)，該胞毒性免疫反應或只針對腫瘤或針對腫瘤細胞，包括衍生了腫瘤的組織細胞。
因此本發明的一個方面是將本發明的藥物制劑給藥以預防或治療增殖疾病。增殖疾病是腫瘤疾病，白血病，病毒引起的疾病，慢性炎癥，移植器官的排斥和自體免疫病。
在本發明的具體的實施方式中，其中成分I)代表了至少一個由腫瘤細胞和衍生腫瘤的組織細胞表達的細胞抗原，將本發明的藥物給藥以預防或治療甲狀腺，乳房，胃，腎，卵巢，痣，前列腺，子宮頸或膀胱、泌尿器腫瘤。
下面，將詳細解釋本發明，基于僅僅代表實施例的具體方式。實施例1通過表達c-raf的沙門氏桿菌免疫接種，在BxB小鼠中誘導免疫應答
Raf是常規的胞質絲氨酸/蘇氨酸激酶(PSK)，它與其他蛋白自的信號級聯系統結合控制細胞生長和存活(Kerkhoff and Rapp，Oncogene 171457-1462，1998；Troppmair and Rapp，RecentResults Cancer Res.143245-249，1997)。生長因子與相應的受體結合通常借助于Ras的活化，以及隨后的基于PSK和酪氨酸激酶MEK和PSK ERK的幾個磷酸化步驟將Raf活化以激活細胞核中的復制機理(Kerkhoff and Rapp，Oncogene 171457-1462，1998)。該鏈中的第一個連接，修飾形式的小G蛋白質Ras存在于30％的人腫瘤中(Zachos和Spandidos，Crit.Rev.Oncol.Hematol.2665-75，1997)。Raf是Ras的一種效應因子，并且以過度表達形式在許多人腫瘤中存在(Naumann等人，Recent Results Cancer Res.143237-244，1997)。
對于在小鼠模型中的測試，使用過度表達整個分子或組成型激活激酶區域(BxB)的轉基因小鼠(Kerkhoff等人，Cell Growth Differ11185-190，2000)。其中約半年后小鼠皮下產生肺腫瘤。
對于疫苗的生產，利用PCR將人的c-Raf cDNA克隆到質粒pMOhly1HlyA讀框處(附
圖1)。隨后，將質粒pMO-Raf轉移到減毒的沙門氏菌(鼠傷寒沙門氏菌SL7207)，其帶有芳香代謝缺陷(Hoiseth和Stocker，Nature 291238-239，1981)。在借助于抗c-Raf抗體的免疫印跡中，可以在PMOhy-Raf感染的SL7207細菌的細菌裂解液和培養物上清液中檢測到c-Raf HlyAs融合蛋白。
以沙門氏菌(5×109)口服免疫接種7-10周齡的BxB轉基因小鼠，以5天的間隔重復免疫接種2次，最后一次免疫的45天之后以5×105沙門氏菌靜脈免疫接種復新免疫接種。為了控制目的，以裸露的c-Raf編碼DNA肌內給藥小鼠。
在最后接種之后5-7天，獲取血清樣品，借助于免疫印跡分析抗體應答。為此，將1∶200稀釋血清與膜上的分離的蛋白質和c-Raf轉染的或未轉染的細菌的印跡的蛋白質雜交。借助于特異于小鼠IgG的抗體進行結合到血清抗體的檢測。與對照小鼠相反，用pMOhly1-Raf轉染的SL7207免疫接種，可以誘導同種型IgG的c-Raf特異性抗體。因此已經證明用上面描述的沙門氏菌進行免疫接種可以破壞自身的耐受力以及誘導CD4+T細胞，這對于抗體同種型變化為IgG是必要的。
為了分析CD8+T細胞應答，用相同的方法給C57BL-6小鼠免疫接種。在最后一次免疫接種7天之后，分離脾臟細胞，并且用Raf過表達的EL-4細胞刺激經分離的脾細胞。在刺激開始后1小時，由布雷菲德菌素A阻止泡囊的運輸，在另一個4小時之后，用CD8和IFN-g-特異性抗體染色細胞，并且用流式細胞計數器分析(Mittrucker等人，Infect Immun 70199-203，2002)。僅僅在一個小鼠pMO-Raf-免疫接種的小鼠中，可以檢測到Raf特異的抗體免疫應答。
對于殺腫瘤活性的檢測，殺死10，12和14月齡的免疫接種和未免疫接種的BxB小鼠，稱量肺質量。肺質量是對腫瘤大小的直接測量。與對照組包括已經用編碼c-Raf的裸DNA(SL-pCMV-raf)免疫接種的組相比用SL-pMO-Raf免疫接種的一組中，在14個月之后清楚地看到肺質量減少的小鼠出現的頻率更高。通常，在未處理的動物中腫瘤生長是不可逆的(Kerkhoff等人，Cell Growth Differ.11185-190，2000)。這些數據顯示該實驗中用SL-pMO-Raf免疫接種動物可以抵抗腫瘤的生長，本文描述的發明適用于作為腫瘤疫苗。
這些實驗進一步顯示作為本發明代表的載體系統主要破壞自身耐受力并且在c-Raf-耐受動物中誘導c-Raf特異性抗體應答以及T細胞應答。
借助于相同的試驗系統，可以將沙門氏菌作為疫苗生產，它表達異型的C-Raf(例如B-Raf和A-Raf)突變的C-Raf，B-Raf或A-Raf，正常的或突變的C-Raf，B-Raf或A-Raf的表位，或正常和/或突變的C-Raf，B-Raf或A-Raf的表位的重組體。由于Raf活性的損失伴隨的突變的例子是Ras結合的區域，激酶區域和/或預防位點的突變。
實施例2用表達PSA的沙門氏菌免疫接種BALB/C小鼠誘導免疫應答除了這些標記的診斷用途以外，組織特異性抗原特別是由腫瘤細胞合成和高程度表達的那些組織特異性抗原的存在也是治療途徑的可能的起始點。對于前列腺癌，至今為止，已經鑒定了三種有價值的抗原PSA(前列腺-特異性抗原)，PSMA(前列腺特異性膜抗原)和PSCA(前列腺干細胞抗原)。PSA以過量表達方式已經存在于早期腫瘤形式(Watt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 833166-3170，1986；Wang等人，Prostate 289-96，1981)和因此可用于腫瘤診斷(Labrie等人，J. Urol.147846-851，discussion 851-842，1992)；在大多數情況下PSCA表達僅僅在局部發展的，去分化和轉移腫瘤階段獲得增加(Gu等人，Oncogene 191288-1296，2000；Reiter，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 951735-1740，1998)。器官特異性使得PSA以及PSCA成為潛在的靶抗原用于研制抗前列腺癌的免疫治療(Reiter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 951735-1740，1998；Hodge等人，Int.J.Cancer 63231-237，1995；Armbruster，Clin.Chem.39181-195，1993)。
在該起始的試驗中，計劃證明基于載體pMOHLY1分泌PSA的沙門氏菌是否在BALA/c小鼠中誘導免疫應答。為此，采用聚合酶鏈反應(PCR)將開頭的兩個NsiI接頭導入到PSA的c-DNA序列中，以便使得經過擴增的片段盡可能以框內形式插入到靶載體。為了擴增，選擇645堿基對(bp)的片段。以5’-GTGGATTGGTGATGCATCCCTCATC-3’和5’-CAGGGCACATGCATCACTGCCCCA-3’作為引物。首先將PCR產物末端平齊化克隆到pUC18載體并且后來借助于NsiI接頭連接到靶載體pMOhly1。借助于限制性酶消化確證插入正確并且通過序列分析進行證實(附圖2)。
借助于該沙門氏菌株，現在以3周的間隔用1×107的劑量給BALB/c小鼠鼻下免疫接種3次。用Western印跡分析方法和胞內細胞因子染色方法檢測免疫應答。
權利要求
1.具有編碼細胞抗原的核苷酸序列的微生物，其基因組中插入了下列成分并且這些成分是可表達的I)編碼腫瘤細胞的一種或幾種抗原的至少一個表位的核苷酸序列和/或編碼特異于衍生腫瘤的組織細胞的一種或幾種抗原的至少一個表位的核苷酸序列；II)編碼刺激免疫系統的細胞的蛋白質的任意選擇性核苷酸序列；IIIA)轉運系統的核苷酸序列，使得成分I)和任意選擇性地成分II)的表達產物在細菌的外表面表達和/或分泌成分I)和任意選擇性地成分II)的表達產物成為可能，和/或IIIB)編碼用于在哺乳動物細胞胞質溶液中裂解微生物和用于胞內釋放質粒的蛋白質的核苷酸序列，所述質粒包含于裂解的微生物內；和IV)用于表達I)到IIIB)的一個或幾個成分的活化序列，所述的活化序列選自“能夠在微生物中活化的，組織特異性的，但不是細胞特異性的活化序列”。其中從I)到IV)的各個成分可以是相同或不同，各個成分以一個或多個拷貝存在。
2.根據權利要求1所述的微生物，其中該微生物是病毒，細菌，特別是格蘭氏陽性或格蘭氏陰性細菌，優選的是選自“大腸桿菌，沙門氏菌，小腸結腸炎耶爾森氏菌，霍亂弧菌，單核細胞增生李斯特氏菌，志賀氏菌”，或是單細胞的寄生蟲，優選的是該微生物的毒性被降低。
3.根據權利要求1所述的微生物，其中該微生物是細菌的胞膜。
4.根據權利要求1-3任一項所述的微生物，其中成分I)是編碼任意選擇性地突變腫瘤細胞的一種或幾種蛋白質的一種或幾種抗原的一個表位或幾個表位的核苷酸序列，其中該蛋白質優選地選自“受體的胞外，跨膜或胞內部分；粘附分子的胞外，跨膜或胞內部分；信號轉導蛋白質；控制細胞周期的蛋白質；轉錄因子，分化蛋白質；胚胎蛋白質；和病毒蛋白質”，該蛋白質優選地是致癌基因產物或阻遏基因產物，特別是c-Raf，A-Raf或B-Raf或c-Raf，A-Raf或B-Raf的同源蛋白質。
5.根據權利要求1-3任一項所述的微生物，其中成分I)是編碼特異于衍生腫瘤的組織細胞的一種抗原的核苷酸，所述組織細胞特別是選自于下列組“甲狀腺，乳腺，唾液腺，淋巴結，乳腺，胃粘膜，腎，卵巢，前列腺，子宮頸，漿膜，膀胱泌尿器和痣”。
6.根據權利要求1-5任一項所述的微生物，包括權利要求4的成分I)和權利要求5的成分I)。
7.根據權利要求1-6任一項所述的微生物，其中成分II)編碼至少一種細胞因子，白介素，干擾素和/或細胞因子。
8.根據權利要求1-7任一項所述的微生物，其中成分IIIA)編碼大腸桿菌的溶血素轉運信號，編碼新月柄桿菌的S-層(Rsa A)蛋白質，或大腸桿菌的To1C蛋白質。
9.根據權利要求1-8任一項所述的微生物，其中成分IIIB)編碼格蘭氏陽性細菌的裂解蛋白質，編碼單核細胞增生李斯特氏菌的裂解蛋白質，編碼單核細胞增生李斯特氏菌的PLY551和/或編碼單核細胞增生李斯特氏菌的穴蛋白。
10.根據權利要求1-9任一項所述的微生物，其中成分IV)編碼能夠在微生物中被激活的活化序列，特別是編碼腫瘤細胞特異性，組織細胞特異性，巨噬細胞特異性，樹突特異性，淋巴細胞特異性，功能特異性活化序列，或被細胞非特異性激活的活化序列。
11.根據權利要求1-10任一項所述的微生物，其中成分I)編碼至少兩種不同蛋白質。
12.權利要求1-11的微生物在生產藥物中的，特別是用于預防和/或治療疾病中的應用，所述的疾病是由非控制性細胞分裂或感染引起的，優選的是腫瘤疾病，特別是前列腺癌，卵巢癌，乳房癌，胃癌，腎腫瘤，甲狀腺腫瘤，黑素瘤，子宮頸腫瘤，膀胱排尿器腫瘤，唾液腺腫瘤或淋巴結腫瘤，白血病，病毒或細菌感染，慢性炎癥，器官排斥和/或自體免疫疾病。
13.權利要求12所述的應用，用于去除腫瘤以及衍生腫瘤的健康組織。
14.權利要求12或13所述的應用，其中制備用于局部，非腸道的，口服或直腸給藥的藥物。
15.根據權利要求12-15之一生產藥物的方法，其中制備生理有效量的權利要求1-11之一所述的微生物與一種或幾種生理耐受的載體物質，用于口服，肌內的，靜脈內的，腹膜內的，直腸或局部給藥。
16.包括權利要求1的成分I)-IV)的質粒或表達載體。
17.用于生產權利要求1-11之一的微生物的方法，其中生產權利要求16的質粒或表達載體，用該質粒或表達載體轉化微生物。
全文摘要
本發明涉及具有編碼插入了下列成分的細胞抗原的核苷酸序列的微生物，并且這些插入成分是可表達的I)編碼腫瘤細胞抗原的至少一個表位的核苷酸序列，和/或編碼特異于產生了腫瘤的組織細胞抗原的至少一個表位的核苷酸序列；II)編碼刺激免疫系統的細胞的蛋白質的可選擇的核苷酸序列；IIIA)編碼轉運系統的一種核苷酸序列，它使得成分I)任意選擇性地，成分II)的表達產物在細菌的外表面實現表達，和/或使得成分I)任意選擇性地，成分II)的表達產物分泌；和/或IIIB)編碼用于在哺乳動物細胞的胞質溶液中裂解微生物和用于胞內釋放質粒的蛋白質的核苷酸，所述的質粒包含于裂解微生物內；和IV)用于表達I)到IIIB)的一種或幾種成分的活化序列，所述的活化序列選自“能夠在微生物中活化的，組織細胞特異性的，但是不是細胞特異性的活化序列”，從I)到IV)各個成分可以相同或不同，各個成分以一個或多個拷貝存在。還公開了這樣的微生物在生產藥物中的應用。
文檔編號A61K35/76GK1650014SQ03809598
公開日2005年8月3日 申請日期2003年2月13日 優先權日2002年2月28日
發明者烏爾夫·R·拉普, W·格貝爾, I·根特謝夫, J·芬斯特勒 申請人:烏爾夫·R·拉普