轉基因植物中大豆黃素的制備的制作方法

專利名稱：轉基因植物中大豆黃素的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及提高植物中的營養含量的研究領域。更具體地說，本發明涉及修飾選擇的植物，來提高它們的雌激素化合物的含量和涉及植物和可以從該植物獲得的植物衍生物。
背景技術：
異黃酮是一組雌激素化合物，屬于類黃酮類植物次級代謝物。這些化合物是在表達異黃酮合酶的一些植物中，特別是豆科植物中天然產生的。已知，異黃酮的存在提供了幾個優點，包括促進抗微生物植物防御和在植物內建立細菌或真菌的共生以及在根瘤中輔助氮的固定。
除了給予植物優點，異黃酮飲食還對人的健康有益。例如，可以確信，飲食異黃酮在減少癌癥和心血管疾病的危險方面是有效的。
目前，在人的飲食中，異黃酮的唯一來源是一些豆類，如大豆或鷹嘴豆。至今，大豆構成了主要的飲食來源，但是，用大豆或大豆提取物補充食物產品可能對味道有不利的影響。所以，需要擴大能夠給人類飲食提供異黃酮的有效來源，特別是不有害地影響產品的味道的來源植物或植物組織范圍。
WO 00/53771涉及在不具有異黃酮類化合物途徑并因而不天然產生異黃酮的轉基因植物中形成異黃酮大豆黃素，并且在其中導入三個新基因是必需的，三個基因是與查耳酮合酶(CHS)共同作用的查耳酮還原酶(CHR)，該酶形成2’，4’，4’-三羥基查耳酮，一個適當的查耳酮異構酶(CHI)，該酶將2’，4’，4’-三羥基查耳酮轉變成甘草素，和異黃酮合酶(IFS)。
申請人現在已經發現了在WO 00/53771中公開的途徑，不允許形成許多植物中的大豆黃素。另外，申請人相信在WO 00/53771的實施例3中作為例子的番茄植物的轉化似乎最不可能產生據稱得到的大豆黃素水平增加的番茄。
Yu等人進行了研究(Production of isoflavones genistein anddaidzein in non-legume dicot and monocot tissues.PlantPhysiol.2000 124781-793)應用轉錄因子C1和R，同時在非分化的黑墨西哥甜(Black Mexico Sweet)(BMS)玉米培養物中共導入CHR和IFS。這一途徑只在單細胞系中產生痕量的大豆黃素。
在本領域中認識到了在得出涉及分化組織中的次級代謝途徑的酶學和調節的任何結論中利用這一單個的細胞系統是不可依賴的(Stafford H.A.(1990)CRCPress，Boca Raton，Florida p.225-239)。
BMS玉米細胞培養物是未分化的，并且在黃酮醇生物合成中是沒有活性的。
所以，本發明待解決的主要技術問題涉及提供大豆黃素和/或大豆衍生物的水平明顯提高的新植物的需要。
現在發現，這一問題的解決在于選擇非異黃酮生產性植物或其部分，其包含活性花色苷和黃酮醇途徑，從而使所述植物查耳酮還原酶和異黃酮合酶的酶活性增強。
在遞交時，并不知道選擇包括活性花色苷和黃酮醇生物合成途徑的非異黃酮生產性植物和這些特定酶活性的提高的組合，可用于提供大豆黃素和/或其衍生物含量提高的植物。
術語定義非異黃酮生產性植物可適當地定義為無異黃酮合酶活性，使植物的組織不能生產異黃酮。如Jung等人公開的，在標準的酶測試中得到了負的結果可以確定沒有異黃酮合酶活性，(Nature Biotech.18卷，2000年2月，208-212頁)，該文獻引入作為參考。
術語“植物或其部分”在本文中用于指整個植物或形成其一部分的細胞的分化的組。用于本發明的目的的植物部分可能涉及葉子，莖，果實，種子，花，根，塊莖。
表達語“增加”用于與相應的未改造的植物或其部分的比較中，該表達語可以是在絕對干重的基礎上的或者是相對術語。除了本發明的方法引入的修飾外，這一相應的植物在遺傳上是相同的。
此處所用的大豆黃素包括7，4’-二羥基異黃酮。大豆黃素衍生物包括大豆黃素的細胞生物化學修飾分子。優選地，大豆黃素衍生物選自異黃酮類化合物，例如紫苜蓿素，大豆抗毒素；異黃酮，例如vestitone；魚藤酮類化合物，例如munduserone；isoflavans，例如，vestitone；α-甲基脫氧安息香，例如，安哥拉紫檀素；2-芳基苯并呋喃，例如，centrolobofuran；異黃酮醇(isoflavonols)，例如，7，2’-二羥基-4’-甲氧基異黃酮醇；isoflav-3-enes，例如，haginin；3-芳基香豆素，例如，glysyrin；coumestans，例如，香豆雌酚；coumaronochromones，例如，lupinalbin；coumaranochromene例如，pachyrrhisomene。
大豆黃素的衍生物也可以來自一種或多種化學過程，這些過程選自甲基化，糖基化，異戊二烯化和醚鍵合。
在花色苷生物合成中有活性的植物或其一部分具有一個有活性的花色苷途徑，并且包含了具有編碼一種或多種酶的mRNA的組織，這一種或多種酶選自黃烷酮醇還原酶，前花色素合酶和UDP-葡萄糖類黃酮-3-O-葡糖基轉移酶。
為了本發明的目的，通過分光光度實驗，在植物組織中可以確定活性花色苷的生物合成，其中在λvis-max 480-560nm處的水解植物提取物的光吸收值是活性花色苷途徑的指標。植物組織在液氮中磨碎，并且用80％(v/v)的乙醇，在100mg/700μl時，在室溫下(~22℃)中提取30分鐘。在提取后，通過0.45μm Millex HV過濾器(Millipore Corp，美國)過濾除去細胞碎片。將乙醇提取物(360μl)與12M HCl(40μl)混合。通過分光光度計測試酸化的乙醇提取物，吸光值確定為減去A657的Aλvis-max 480-560nm。
優選地，在花色苷的生物合成中有活性的一個植物或其部分含有10mg/kg以上鮮重的花色苷，更優選地至少100mg/kg以上，進一步優選地至少1000mg/kg，最優選地1000到10,000mg/kg鮮重。適當地，這是根據公式C＝A*MW*103*DF/(ε*1)，從吸收值計算的，其中C指濃度，A是指吸光值(如上面定義)；MW是分子量；DF是稀釋倍數；ε是摩爾消光系數(對于主要的天然花色苷花色苷3-葡糖苷是29,600)，和1是途徑的長度。
黃酮醇生物合成中有活性的植物或其部分具有一個有活性的黃酮醇途徑，和含有任何包括編碼一種或多種酶的mRNA的組織，這些酶選自查耳酮合酶，查耳酮異構酶，黃烷酮3-羥化酶，黃酮醇合酶的組。
為了本發明的目的，通過制備水解的組織的提取物和通過HPLC分析的探測可以確定黃酮醇生物合成中一種植物是否有活性。
為了進行提取，收集組織，在-80℃儲存之前，在液氮中迅速冷凍。然后，將組織研磨成細的粉末，保證勻漿化混合。然后，將來自這一混合物的等分試樣在室溫下(~22℃)在80％(v/v)乙醇中以100mg/700μl提取30分鐘。在提取后，通過0.45μm Millex-HV過濾器(Millipore Corp，美國)過濾以除去細胞碎片。將過濾物在HPLC分析之前儲存在-20℃。
對于已水解的提取物，在360μl的各個組織提取物中加入40μl的12M HCl，然后，在90℃中溫育40分鐘。
在水解后，通過0.2μm的PTFE一次性濾器(Whatman)過濾來自各個提取物的等分試樣。在HPLC系統(HP1100，Agilent)中，通過維持在4℃的自動進樣器注射過濾物(20μl)。將分析柱(ProdigyPhenyl-3，4.6X150mm，顆粒大小5μm，(Phenomenex))保持在30℃下。通過二極管陣列檢測，在262，280和370nm檢測。從210-550nm掃描觀察到的峰，得到光譜。利用Chemstation軟件(Rev.A.8.03)控制系統，收集和分析數據。
將峰的吸收光譜(對基線光譜校準)和停留時間與商業可得黃酮醇標準比較來確定植物組織在黃酮醇生物合成中是否是有活性的。
優選地，在黃酮醇生物合成中有活性的植物或其部分至少含有10mg/kg鮮重的黃酮醇，優選地至少100mg/kg，更優選地至少1000mg/kg，最優選地1000到10000mg/kg。
‘功能等同物’核苷酸序列是編碼發揮相同的生物學功能的蛋白質的任何序列。
根據另一個實施方案，功能等同的核苷酸序列與各自的DNA序列至少顯示了50％的同一性。更具體地說，功能相當的DNA序列與各自的DNA序列至少顯示了60％，更優選地至少755，甚至更優選地至少80％，甚至更優選地至少90％，最優選地95-10％的同一性(DNAStar MegAlign軟件版本4.05和設置為缺省參數的Clustalalgorithm)。
根據進一步優選的實施方案，功能等同的序列與各自的DNA序列顯示了不超過5個堿基對的差別，更優選地不超過3個堿基對，例如只有1個或2個堿基對的差異。
根據另一個實施方案，功能等同的序列能夠在低嚴格(2XSSC，0.1％SDS，在25℃下20分鐘)的條件下與各自序列雜交，更優選地，功能等同序列能夠在中度的嚴格條件下雜交(1XSSC，0.1％SDS，25℃，20分鐘)，進一步優選的功能相當序列能夠在高度嚴格的條件下雜交(0.1XSSC，0.1％SDS，25℃下20分鐘)。
優選地，等同的DNA序列能夠轉錄和隨后翻譯成一個至少與由各自的DNA序列編碼的氨基酸序列有50％的同一性的氨基酸序列。更優選地，從等同的DNA序列翻譯的氨基酸序列與各自的DNA編碼的氨基酸至少有60％，更優選地至少75％，甚至更優選地至少80％，甚至更優選地至少90％，最優選地95-100％的同一性(DNAStarMegAlign Software 4.05版本，和設置為缺省參數的Clustalalgorithm)。
發明簡述現在已經發現，通過具有活性花色苷和黃酮醇途徑的植物和其部分可以提供大豆黃素和/或大豆黃素衍生物的水平明顯升高的新植物，并且已經對該植物進行基因改造以提高其中CHR和IFS的酶活性。
所以，本發明的第一個目的是提供含有大豆黃素和/或其衍生物的基因改造植物或其部分，其中所述的植物或其部分在黃酮醇和花色苷生物合成中是活躍的，并且包括編碼查耳酮還原酶的一種或多種核苷酸序列，和編碼異黃酮合酶的一種或多種核苷酸序列。
發現特別的優勢來自將所述植物進行基因改造以同樣增強CHI活性，其中在有關的組織中大豆黃素的生產相對于單獨增加CHR和IFS活性的修飾顯示了90倍的增加。已經發現這一額外的優點是依賴于CHI同種型的選擇的，該CHI同種型能夠催化4，2’，4’-三羥基查耳酮轉化成7，4’-二羥基黃烷酮(甘草素)。適當的CHI可從豆科植物獲得。在常規大豆中存在的大豆黃素水平的約15倍以上(在干重的基礎上)，該結果代表相對于現有技術的顯著改進。該結果是令人驚訝的，且清楚地證明了當植物中存在花色苷和黃酮醇途徑時，來自這3種酶活性聯合的增加的協同作用。
因此，本發明的第一個實施方案包含如上所述的一種基因改造的植物或其部分，進一步包含一種或多種核苷酸序列，該核苷酸序列編碼能夠催化4，2’，4’-三羥基查耳酮轉化成7，4’-二羥基黃烷酮的查耳酮異構酶。
本發明進一步的實施方案包括如上所述的基因改造的植物或其部分，其中所述的一種或多種核苷酸序列，包括序列鑒定號1和3的序列或其功能等同物。
在優選的例子中，其中追求的是額外的CHI增加的協同優點，本發明涉及一個實施方案，其中所述的一種或多種核苷酸序列包括序列鑒定號1，3和5的序列或其功能等同物。
在進一步的實施方案中，本發明涉及如上所述的遺傳上修飾的植物或其部分，其中所述的植物或其部分選自但不限于煙草、萵苣、椰菜、蘆筍、紅球甘藍、馬鈴薯、菠菜、大黃、紅洋蔥、蔥、茄子、蘿卜、瑞士甜菜、紫羅勒、西瓜和槳果。
根據本發明進行修飾以增加大豆黃素和/或大豆黃素衍生物的含量的植物或其部分對于提供與增加飲食吸收異黃酮相關的健康利益是特別有優勢的。所以，植物或其部分可以在它們的天然狀態中使用或制備成提取物以作為預防劑或通過對抗衰老進程的作用來治療疾病狀態，或誘導健康優勢。
所以，本發明的第二個目的是提供如上所述的植物的提取物，其中所述的提取物含有大豆黃素或其衍生物。
本發明的第三個目的是提供如上所述的提取物，其用作藥物。在優選的實施方案中，本發明的提取物可用于治療和/或預防一種或多種疾病，該疾病選自骨質疏松癥；癌癥；絕經期和絕經后癥狀，包括熱潮紅、焦慮、抑郁、情緒波動、夜汗、頭痛、小便失禁；經前期綜合征，包括體液潴留、乳腺痛、痛經；心臟病；動脈粥樣硬化；高血壓；冠狀動脈痙攣；高膽固醇；阿耳茨海默氏病；認知功能損傷；炎癥，包括炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏(Crohn’s)病；和類風濕性關節炎。
也可以在治療和/或預防一種或多種狀況的如上所述的提取物的使用中獲得化妝品的優點，這些病癥選自陽光導致的皮膚損傷、皮膚皺紋、皮膚喪失敏感性、皮膚喪失彈性、痤瘡、發質不好和脫發。
這些藥物和化妝品的優點也是由利用本發明的基因改造植物或其部分來提供的。大豆黃素和/或其衍生物的攝取可以通過口服或局部應用。
為了增加量的異黃酮的方便的飲食吸收，本發明的植物或其部分可以適當地摻入食物或營養添加劑中。所以，本發明進一步的目的是提供基因改造植物或其部分或如上所述的食物或營養添加劑的提取物的用途。
將能注意到的是，與飲食異黃酮的常規大豆衍生來源不同，本發明的植物提供的大豆黃素和其衍生物可以摻入食物中，但不會有害地影響這樣的產品的味道。在這種方法下，通過本發明解決了本領域的其他問題。
所以，本發明進一步的目的是提供包括如上所述的基因改造的植物或其部分的食物。優選地，本發明的食物將可以冷凍，并且允許大豆黃素和/或它的衍生物的量在貯存中保持穩定。
在一個最優選的實施方案中，本發明的食物選自帶包裝的什錦色拉、湯、食物涂抹品、調味汁、水果條和冰淇淋等。
包括如上所述的植物或其部分的提取物的營養添加劑也是本發明提供的。
本發明進一步的目的是提供在植物或其部分中增加大豆黃素和/或起衍生物含量的方法，其中所述的方法包括步驟；(i)選擇不產生異黃酮的植物，所述植物或其部分在花色苷和黃酮醇的生物合成方面活躍；(ii)對所述植物進行基因改造以提高植物或其部分的查耳酮還原酶和異黃酮合酶的活性。
在第一個實施方案中，發明的方法另外還包括基因改造所述的植物或其部分來提高查耳酮異構酶的活性，其中所述的查耳酮異構酶能夠催化4，2’，4’-三羥基查耳酮到7，4’-二羥基黃烷酮的轉化。在這一方法中，達到了大豆黃素和/或其衍生物的含量的協同的提高。
在進一步的實施方案中，其中查耳酮還原酶和異黃酮合酶的活性將增加，該實施方案包括如上所述公開的方法，其中序列鑒定號1和3的一種或多種核苷酸序列或其功能等同物是穩定地整合到所述植物的基因組中的。
為了達到查耳酮異構酶的活性的需要的增加，一個優選的實施方案包括如上所述的方法，其中另外還包括在所述的植物的基因組中穩定地整合進序列鑒定號5的一種或多種核苷酸序列或其功能等同物。
在一個最優選的實施方案中，本發明的方法涉及的植物選自煙草、萵苣、椰菜、蘆筍、紅球甘藍、馬鈴薯、菠菜、大黃、紅洋蔥、蔥、茄子、蘿卜、瑞士甜菜、紫羅勒、西瓜和槳果，但并不局限于這些植物。
發明詳述編碼提高大豆黃素和/或大豆黃素衍生物的組織含量的生物合成酶的序列可能是基因組的或cDNA的克隆，或在適當的讀碼框架中編碼與該基因組或cDNA克隆編碼的生物合成基因的氨基酸序列功能等同的氨基酸序列。功能衍生物可通過DNA序列的一種或多種堿基的插入，缺失或置換進行表征，通過已知的誘變技術如定點誘變制備，或者衍生自不同的物種。
為了實施本發明，任何編碼具有查耳酮還原酶、異黃酮合酶或查耳酮異構酶的生物學功能的酶的核苷酸序列均可用于轉化適當選擇的植物，以增加該植物或其部分的這些酶的活性。
通過標準實驗可以評估編碼查耳酮還原酶的核苷酸序列的生物學功能(Welle等，1988 FEBS Letter236221-225；Welle等，1991 Eur J Biochem196423-430；Welle和Schroder，1992 Arch.Biochem.Biophys 293377-381)。為了得到蛋白質，將核苷酸序列亞克隆進原核生物表達載體，如pTZ19R(Pharmacia)，轉化入大腸桿菌(Escherichia coli)。含有需要的核苷酸序列的選擇的大腸桿菌克隆生長到培養密度A600＝0.6-1，然后用1mM異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導表達2.5個小時。在誘導后，離心收獲細菌和再懸浮于0.1M磷酸鉀，0.6mg/ml的溶菌酶和1.2M EDTA中，放置于冰上45分鐘進行溶解。在16000g離心溶解物20分鐘，在查耳酮還原酶實驗中利用上清液的等分試樣。
在最后120μl的體積中測試查耳酮還原酶活性，其中包括80μl查耳酮還原酶蛋白質提取物，10μmol磷酸鉀，pH5.0，0.12μmol NADPH，1nmol 4-香豆酰CoA，1.5nmol[2-14C]，丙二酸單酰CoA，22.2fkat純大豆CHS(～3μg)。在200μl的乙酸乙酯中提取反應產物之前，將反應物在30℃進行60分鐘。通過離心分離有機相，在真空中濃縮，利用15％的乙酸(存在查耳酮異構酶)或CHCl3/乙酸/水(10∶9∶1)(沒有查耳酮異構酶)，通過薄層層析進行分離。通過用參考樣品的共層析確定6’-脫氧查耳酮的同一性。
在本領域已經知道的適當的CHR編碼序列包括；苜蓿(Medicagosativa)登記號CHR1a-X82366，CHR1b-X82367，CHR2a-X82368，CHR7-U13925，CHR12-U13924；鷹嘴豆小桃(Cicer arietinum)，登記號AB024989；大豆(Glycine max)登記號X55730；甘草(Glycyrrhiza glabra)，登記號CHRa-D86558，CHRb-D86559。
或者，可以從其他物種分離適當的CHR編碼序列。在本領域中已知的CHR的序列排列顯示了兩個保守區域，Met-Pro-Val-Val-Gly-Met-Gly-Ser-Ala(Seq.ID.No.7)和Ala-Ile-Ile-Glu-Ala-Ile-Lys-Gln(Seq.ID.No.8)，這兩個保守區域鑒定為在編碼序列的5’端。分別對這些編碼序列的每一個設計簡并引物327和328(參見圖4)。利用引物327和328結合dT17引物，并利用3’cDNA文庫的靶，通過聚合酶鏈反應分離編碼CHR的序列。將得到的片段克隆進pT7載體，并且測序。用那些在本領域已知的序列的排列將允許臨時的鑒定。為了得到全長編碼序列，利用如實施例1(1.3.3)中公開的標準的5’RACE和3’RACE方法可以得到5’和3’序列。
編碼一個具有異黃酮合酶活性的酶的核苷酸序列也可以通過標準的測試方法來確定，其中根據Pompon等人(Methods Enzymol.272，51-64)的方法，從表達細胞色素P450的cDNA的對照WHT1和菌株來制備酵母微粒體。根據Jung等人進行測試(Nature Biotech 2000，18卷，2000年2月，p208-212)。利用Bradford蛋白質微陣列測試各個微粒體制劑的蛋白質含量(Bio-Rad.Hecules.CA)。在80mM K2HPO4，0.5mM谷光甘肽的室溫下溫育30到150μg的微體蛋白質。在各100μl的最后體積中加入80mM K2HPO4，0.5mM谷胱甘肽，20％(wt/vol)蔗糖，pH8.0中使30到150μg的微粒體蛋白質和100mM的柚皮素或100μM的甘草素底物在室溫下溫育，并在每100μl終反應體積中加入40nmol的NADPH中。在溫育后，用乙酸乙酯提取反應物。利用LiChrospher RP-C18柱(5m 250×3mm)或Phenomenexz Luna C18(2)柱(3u；150×4.6mm)，在Hewlett-Packard 1100系列HPLC系統中測試樣品。
在第一個柱上，在候選的cDNA的測試實驗的乙基乙酸中的樣品，利用65％的甲醇作為流動相等度分離5分鐘。對于第二個柱，蒸發樣品，和在80％的甲醇中再懸浮，然后利用10分鐘的線性梯度以流速1ml/min-1進行分離，該梯度從20％的甲醇/80％10mM乙酸銨，pH8.3到100％甲醇，或利用65％的甲醇作為流動相作等度洗脫。染料木黃酮和大豆黃素是通過260nm的吸光值來檢測的。利用在乙醇中溶解的真柚皮素，甘草素，染料木黃酮和大豆黃素(IndofineChemical，Somerville NI)作為校準峰面積的標準，這些面積將轉化成納克。
為了證實染料木黃酮和大豆黃素的同一性，蒸發樣品并在25％的乙腈的水中再懸浮，通過在Zorbax Eclipse XDB-C8反相柱(3×150mm 3.5μm)上，等度地用溶劑A(水中0.1％的甲酸)中25％的溶劑B(乙腈中0.1％的甲酸)上運行25μl而在Hewlett-Packard/Micromass LC/MS上進行測定。利用-6伏特錐電壓通過200到400m/e的電噴射掃描進行質譜分析。在兩個儀器中的200和400nm之間檢測二極管陣列信號。
本領域已知的適當的IFS序列包括Mung豆，登記號AF195807；紅三葉草，登記號AF195811；和Snow Pea，登記號AF195812。
或者，可以從其他物種分離適當的IFS cDNA。Jung等人(NatureBiotech 2000，第18卷，2000年2月，p208-212)敘述了怎樣從雜貨店得到綠豆芽和Snow Pea芽。苜蓿，紅三葉草，白三葉草，毛苕子(hairy vetch)和小扁豆可以從Pinetree Garden Seeds(NewGloucester，ME)獲得，lupine cv.Russel Mix的種子是從BotanicalInterests(Boulder，CO)得到的，甜菜的種子是從商業來源得到的。
使秧苗生長，并利用TRIzol試劑(Gibco BRL)制備RNA，如上所述制備第一鏈cDNA。將寡聚dT在所有的情況中都用作逆轉錄引物，除了利用白三葉草時，以隨機的六聚體用作逆轉錄引物利用Advantage-GC cDNA聚合酶混合物(Clontech)進行聚合酶鏈反應擴增，利用的引物組1是5’-ATGTTGCTGGAACTTGCACTT-3’(Seq ID.No.9)和5’-TTAGAAAGGAGTTTAGATGCAACG-3’(Seq ID.No.10)或嵌套引物組25’TGTTTCTGCATTGCGTCCCAC-3’(Seq.ID.No.11)和5’-CCGATCCTTGCAAGTGGAACAC-3’(Seq.ID.No.12)，擴增如下將利用引物組1擴增的綠豆和紅三葉草PCR產物直接克隆入pCR2.1。
對于白三葉草，小扁豆，毛苕子，苜蓿，lupine和甜菜，具有引物組1的第一個PCR隨后接著第二個引物組2，并克隆得到的片段。對于Snow Pea，具有引物組1的第一個PCR隨后接著利用引物組1的高退火溫度(60℃)的第二個PCR。將期望大小的產品凝膠純化，并且在高的退火溫度和引物組1的第三個PCR時用作模板。將得到的產物克隆進pCR2.1。將所有在pCR2.1中的PCR片段測序。利用DNAStar MegAlign軟件4.05版，進行所有的排列，且ClustalAlgorithm設置成缺省參數。
擴增登記號AF195807(綠豆)，AF195811(紅三葉草)，和AF195812(Snow Pea)的編碼區，并且利用“缺口修復”克隆進pRS315-gal，產生微粒體，并如上所述測試。
通過標準測試(Bixon等人，1982 Biochem.Biophys Acta71525-33；Mol等人，1985 Phytochemistry 242267-2269，Terai等人，1996 Protein Expression and Purification 8183-190)可以確定能夠催化4，2’，4’-三羥基查耳酮到7，4’-二羥基黃烷酮的轉變的查耳酮異構酶活性酶的編碼核苷酸序列。為了得到蛋白質，將核苷酸序列亞克隆進原核表達載體，如pET載體(Invitrogen)，和轉化入大腸桿菌。將含有需要的核苷酸序列的已選擇的大腸桿菌克隆在用1mM的異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導表達之前在2.5小時內生長到A600＝0.6-1的培養密度。
在誘導后，通過離心收獲細菌，在0.1M磷酸鉀，0.6mg/ml溶菌酶和1.2EDTA中再懸浮，放置于冰上45分鐘進行溶解。在16000g離心溶解物20分鐘，在查耳酮異構酶測試中利用上清液的等分試樣。
在包括18.4μm四羥基查耳酮(柚皮素查耳酮)或12.7μg的三羥基查耳酮(異甘草素)底物，查耳酮異構酶蛋白質提取物，5％(w/v)牛血清清蛋白和0.1M磷酸鉀緩沖液(pH5.8)的最后體積中測試了查耳酮異構酶活性。通過在385nm吸光值的降低檢測了抗三和四羥基查耳酮底物的查耳酮異構酶活性。
適當的CHI序列在本領域中已知包括那些從French菜豆(Phaseolus vulgaris)登記號X16470；葛根(Kudzu vine)(Puerariamontana var.lobata)登記號D63577；大豆(Glycine max)登記號AF276302；苜蓿(Medicago sativa)登記號M910079；豌豆(Pisum sativum)登記號U03433衍生的那些。
或者，在CHI功能和結構之間的已確定的關系能夠使適當的CHI序列從其他來源分離。本領域已經顯示，許多克隆方案在分離CHIcDNA時是有效的，并且可以由本領域的人員采用來鑒定或選的CHI編碼序列。
Shirley，B.W.等人(Plant Cell.第4卷，333-347，1992，)敘述了基于PCR的得到來自擬南芥(Arabidopsis)的CHI cDNA的途徑，其中公開了用于引物設計的共有序列的鑒定以及PCR反應條件。Sparvoli，F.等人(Plant Mol.Biol.，24743-755，1994)敘述了應用異源Antirrhinum CHI cDNA探針從cDNA的文庫克隆CHI。Grotewold E.等人(Mol.Gen.Genet.(1994)2421-8，)敘述了編碼CHI的玉米基因的分離和鑒定，克隆戰略和適當的引物。
上面清楚地勾劃的文獻證明，來自其他植物的相應的CHI序列；對于其他CHI基因的或選的克隆戰略；用于生成引物的共有序列的知識；適當的PCR條件是本領域已知的。所以，本領域的技術人員能夠鑒定和利用或選的CHI序列用于本發明的轉化。
本發明的基因構建體根據要求提高的量級，包括編碼查耳酮還原酶和異黃酮合酶的一種或多種核苷酸序列，或包括編碼查耳酮還原酶，異黃酮合酶和查耳酮異構酶的一種或多種核苷酸序列。
需要的基因序列將是可操作地(即，定位地，以保證其功能)連接一種或多種適當的允許DNA轉錄的啟動子的。可用于在植物中表達的，且與該基因同源或異源的(即，非天然地可操作地連接編碼異黃酮類生物合成的酶的基因的)適當啟動子是本領域已知的，如在Weising等人(1988)Ann.Rev.Genetics 22421-477)中所述的。用于本發明的啟動子可以是誘導型的，組成型的，或組織特異性的，或具有這樣的特征的各種聯合。
有用的啟動子包括，但不限于組成型啟動子，如香石竹蝕刻環病毒(carnation etched ring virus)(CERV)啟動子，花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)35S啟動子，或更特別地，加強的花椰菜花葉病毒啟動子，包括2個串聯的CaMV 35S啟動子(稱為，“雙35S”啟動子)。這些具有提高一株植物中異黃酮類化合物水平的作用。
因此，在進一步的方面，本發明提供了表達盒形式的基因構建體，包括轉錄的5’-3’方向的可操作的連接的成分，在植物細胞中各含有一個適當的啟動子的一種或多種單位，選自包括編碼CHR和IFS的序列的多個核苷酸序列和適當的轉錄和翻譯終止調節區域。更具體地說，所述的組包括能夠催化4.，2’，4’-三羥基查耳酮到7，4‘-二羥基黃烷酮轉化的CHR，IFS和CHI的序列。
啟動子和終止子調節區域將在宿主植物細胞中起作用，并且對植物細胞和該基因可以是異源或同源的。可以利用的適當啟動子如上所述。
終止調節區域可以是從該基因的3’區域衍生的，該基因中的啟動子是從另一個基因得到或起源的。可以利用的適當的終止區域是本領域已知的，包括根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合酶終止子(Tnos)、根癌農桿菌甘露堿合酶終止子(Tmas)，核酮糖二磷酸-羧化酶-加氧酶小亞單位終止子(TrbcS)和CaMV 35S終止子(T35S)。用于本發明的特別優選的終止區包括Tnos和TrbcS終止子區域。
這樣的基因構建體可以適當地通過根癌農桿菌共轉化進寄主植物和篩選大豆黃素水平來進行活性篩選。
方便地，本發明的表達盒可以通過將個別啟動子/基因/終止子單位克隆進適當的克隆載體來制備。適當的克隆載體是本領域已知的，包括如pUC(Norrander等人，(1983)Gene，26101-106)，pEMBL(Dente等人，(1983)Nucleic Acids Researchll1645-1699)，pBLUESCRIPT(從Stratagene得到)，pGEM(從Promega得到)和pBR322(Bolivar等人，(1977)Gene295-113)的載體。特別有用的克隆載體是根據pUC系列的那些。克隆載體允許對該DNA擴增或操作，例如通過接合序列來進行。克隆位點的優選的形式是多接頭，那是含有多個鄰接限制位點的序列，允許在克隆中靈活應用。
優選地，本發明的DNA構建體是包括在一個載體中的，最優選的表達載體是適用于在適當的宿主(植物)細胞中表達的。令人滿意的是，任何能夠生產包括導入的DNA序列的植物的載體都是夠用的。
適當的載體是本領域中已知的，并且是常見的技術參考文獻中所敘述的，這些文獻如Pouwels等人，Cloning Vector.A LaboratoryManual，Elsevier，Amsterdam(1986)。特別適當的載體包括Ti質粒載體。
在宿主細胞中導入本發明的DNA構建體的轉化技術是本領域已知的，包括如微量注射、利用聚乙二醇，電穿孔，或高速彈滲透的方法。利用本發明的優選的方法依賴于根癌農桿菌介導的共轉化。
在植物細胞或植物的轉化后，已經摻入的需要的DNA的植物細胞或植物可以通過如抗生素抗性，除草劑抗性，對氨基酸類似物的耐受性或利用表型標記的方法來選擇。
在本領域的技術人員的知識內的各種測試方法可以用于確定植物細胞是否顯示了基因表達的增加，例如，Northern印跡或定量的逆轉錄PCR(RT-PCR)。整個轉基因植物可以從轉化細胞通過常規的方法來產生。這樣的大豆黃素水平提高的轉基因植物是可以繁殖的，并且可以交配產生純合系的。這樣的植物產生含有編碼導入的性狀的，并且可以生長產生將生產選擇的表型的植物。
已經根據本發明修飾的植物或其部分可以以富積的提取物或基本純化的形式用作大豆黃素和/或一種或多種它的衍生物的來源。
含有本發明的植物，植物部分或其提取物的食物的產品能夠使消費者完全利用與異黃酮的吸收增大相關的健康益處，同時避免了與現有技術中的大豆衍生的異黃酮相關的不利的味道。
沙拉葉子特別適用于通過本發明的方法進行遺傳轉化，所以根據本發明轉化的萵苣(萵苣屬)的物種如萵苣(Lactuca sativa)，例如‘紅燕麥葉子(Red Oak Leaf)’，‘Red Leprechaun’；萵苣類群Butterhead萵苣，如Mira、Redcross；萵苣類群Cos萵苣，如“Romaine Red Cos”、“Four Season Red”、Seville；萵苣類群Crisp萵苣，如“Red Salad Bowl”、“Red Grenoble”；萵苣類群Cutting萵苣，如“Lollo Rosso”、Revolution提供了補充飲食需要的理想的方法，可以提供消費者洗滌和預包裝的飲食。
含有快餐條或早餐谷類的水果提供了用異黃酮補充人飲食的方便的方法。從本發明的植物派生的水果片是適用于干燥到10到90％的，優選地干燥到20到60％，最優選地40％的鮮重，達到貨架穩定性，并且摻入條或谷類產品。
本發明的大豆黃素和/或大豆黃素衍生物水平高的水果也可以理想地摻入酸乳酪和冰淇淋或味道好的水果飲料。
這些食物產品的適當的水果將包括懸鉤子，草莓，黑葡萄干，紅葡萄干，藍莓和黑莓。
已經在本發明中基因改造的植物或其部分也可以提供富含大豆黃素和/或它的衍生物或其純化的形式的提取物來源，這些提取物包含在作為營養補充的產品，控制卡路里的飲料和低脂肪涂抹食品中。
大量的證據證明了化妝品和藥品的健康優勢可以歸因于人的異黃酮，特別是大豆黃素的飲食消耗。這些包括作為雌激素和抗雌激素試劑的活性(Coward等人，1993；Martin，等人，1996)；與植物雌激素活性相關的抗癌作用(Lee等人，1991；Adlercreutz等人，1991)；與幾個酶的抑制相關的抗癌作用，包括DNA拓撲異構酶和酪氨酸蛋白激酶(Akiyama等人，1987；Uckun等人，1995)；乙醇消耗的抑制(Keung和Vallee，1993；Keung等人，1995)；抗氧化劑活性(Arora等人，1998；Tikkanen等人，1998)；提高骨再礦化(Tomonaga等人.，1992；Draper等人，1997)；和有利的心血管效果(Wagner等人，1997)。
參考附圖可以更完全地理解本發明，其中

圖1顯示了豌豆的查耳酮還原酶DNA序列(SEQ ID NO1)和它的對應的蛋白質序列(SEQ ID NO2)。
圖2顯示了大豆異黃酮合酶DNA序列(SEQ ID NO3)和它的對應的蛋白質序列(SEQ ID NO4)圖3百脈根(Lotus corniculatus)查耳酮異構酶DNA序列(SEQID NO5)和它的對應的蛋白質序列(SEQ ID NO6)圖4提供了用于本發明的引物序列。
圖5說明了pPV5LN，pPE2，pPE5，pPE9，pPE11，pPE15，pPE51，pPE120，和pPE125的質粒圖譜。
圖6說明了來自用真正大豆黃素標準形成峰的代表性的煙草轉化體，pPE120/24，pPE120/26和pPE51的煙草花瓣提取物的GC-MS分析。A.停留時間對應于真正的大豆黃素(RT＝19.60)的峰代表IpPE120/24和pPE120/26的轉化體。B.檢測用真正的大豆黃素標準形成峰的pPE120/24和pPE51/9的選擇離子顯示了在pPE120/24的特征峰。
圖7說明了在含有編碼查耳酮還原酶和異黃酮合酶(pPE120)活性和對照(pPE51)的構建體的煙草轉化體的花瓣組織中的大豆黃素的累積。通過HPLC水解和分析來自花瓣的乙醇提取物。
圖8說明了來自編碼查耳酮還原酶，查耳酮異構酶和異黃酮合酶(pPE125)活性和對照(pPE51)的構建體的煙草轉化體的花瓣組織中的大豆黃素的累積。通過HPLC水解和分析花瓣中的乙醇提取物。
實施例1查耳酮還原酶，查耳酮異構酶和異黃酮合酶的cDNA克隆，和轉基因煙草(N.tabacum)的分析1.1 植物材料利用正常得到的煙草(N.tabacum)基因型作為起始材料可以進行所有的實驗。煙草培養物SR1就是這樣一個基因型。煙草培養物SR1的植株生長在溫度得到控制的生長室中，光期16小時，溫度25℃。
1.2 細菌菌株大腸桿菌菌株XL1-Bluerec A1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，supE44，rel A1 lac[F’proAB laclqZΔM15Tn10(Tetr)](Stratagene Europe，新西蘭)。利用Hanahan(1983)的方法進行大腸桿菌XL1-Blue的轉化。根癌農桿菌LBA4404(Hoekema，1985)。根據Shen和Forde(1989)進行根癌農桿菌LBA4404的轉化。
1.3 基因克隆1.3.1 總RNA分離從百脈根(百脈根屬(Lotus))，Glycine max(大豆)，Pisumsativum(豌豆)和紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)葉子組織，利用Purescript RNA分離試劑盒(Pharmacia)根據制造商的說明分離RNA。
1.3.2 cDNA合成
5’cDNA文庫構建將從百脈根，大豆，豌豆或苜蓿組織分離的2μg RNA，加熱到65℃，10分鐘，然后在冰上快速冷卻。在20μl的反應液中逆轉錄RNA，42℃，90分鐘，其中利用了10個單位的Stratascript(Gibco-BRL)，所在的溶液中有1x RT的緩沖液(GibcoBRL)，30mM dNTPs(dATP，dCTP，dTTP，dGTP)(Pharmacia)，0.1MDTT，10U/μl RNasin(Roche)和50pmol隨機的六聚體。然后，利用Gibco-BRL PCR純化試劑盒(根據制造商的說明)純化隨機引導的cDNA。然后，在50μl的1X加尾緩沖液(Roche)，1mM dATP(Roche)，1單位的末端轉移酶(Roche)，37℃下向純化的cDMA添加聚腺苷酸化末尾，然后，在80℃變性15分鐘。
3’cDNA文庫構建將從百脈根，大豆，豌豆，苜蓿組織中分離的2μg RNA，加熱到65℃，10分鐘，然后在冰上快速冷卻。利用10單位的Stratascript在1XRT緩沖液中，30mM的dNTP，0.1M DTT，1單位/μl RNasin和5pmoll寡聚dT17在20μl的反應液中逆轉錄RNA，42℃，90分鐘。
1.3.3 PCR擴增文庫PCR擴增在50μl的1XPCR緩沖液(Roche)，20mM dNTPs25pmol 5’引物，25pmol 3’引物，2.5個單位的Taq DNA聚合酶(Roche)，0.25單位的pfu turbo DNA聚合酶(Stratagene)中進行50ng的3’cDNA的PCR擴增。循環條件是30個循環的94℃30秒，55℃ 30秒，72℃ 2分鐘，其中利用了Perkin Elmer PCR機器。將最初的變性步驟(94℃)擴展到了2分鐘。
載體PCR擴增1ng載體在50μl的1XPCR緩沖液(Stratagene)，20mM dNTPs 25pmol 5’引物，25pmol 3’引物，5個單位的pfu turboDNA聚合酶中進行PCR擴增。循環條件30循環的94℃30秒，55℃30秒，72℃2分鐘。最初的變性步驟(94℃)擴展2分鐘。
cDNA末端的5’快速擴增(5’race)50ng的5’cDNA補充是在50μl的1XPCR緩沖液，20mM dNTPs，5pmol寡聚dT17，1.25單位的Taq DNA聚合酶，0.125單位pfu turbo DNA聚合醇中。條件是94℃2分鐘，42℃2分鐘，72℃45分鐘。通過加入下面的成分擴增cDNA；即將25pmol 5’R.引物，25pmol引物R.，1.25單位Taq DNA聚合酶，0.125單位pfu turbo DNA聚合酶加入到逆轉錄反應中。循環條件30個循環的94℃30秒，55℃30秒，72℃2分鐘。最初的變性步驟擴展到2分鐘。在50μl的1XPCR緩沖液，20mM的dNTPs，25pmol 5’R.引物，25pmol R.引物，2.5單位的Taq DNA聚合酶，0.25單位pfuturbo DNA聚合酶中再擴增1μl的這一PCR反應物。最初的變性步驟延長到2分鐘。
cDNA末端的3’快速擴增(3’race)50ng的3’cDNA擴增是在50μl的1XPCR緩沖液，20mM dNTPs，25pmol 5’R.引物，25pmol引物R.，2.5單位的Taq DNA聚合酶，0.25單位pfu turbo DNA聚合酶中。循環條件30個循環的94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 2分鐘。最初的變性步驟擴展到2分鐘。如前文所述應用5’Rr引物和R1再擴增1μl的這一PCR反應物，循環條件30個循環的94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分鐘。最初的變性步驟延長到2分鐘。
1.3.4 分離和克隆擴增的產物在ETBr-1.2％瓊脂糖TBE(45mM Tris-硼酸，1mM EDTA)凝膠上分析PCR產生的片段。利用Gibco-BRL凝膠提取試劑盒根據制造商說明書從凝膠中分離DNA片段，并且克隆進pT7 TA克隆載體(Novagen)。
1.3.5 用限制酶消化用10個單位的各個適當的限制酶(Roche)，在推薦的緩沖液中，在37℃下消化PCR擴增物或2μg的質粒DNA 2小時。在EtBr-1.2％瓊脂糖TBE凝膠上分離消化物根據制造商的說明，利用Gibco BRL凝膠提取試劑盒切出和純化需要的片段。
1.3.6 合成的接頭的構建通過在1X連接緩沖液中加熱到94℃ 5分鐘一起退火1μg的有義的和反義的寡聚核苷酸，然后在30分鐘內冷卻到室溫。
1.3.7 DNA片段的脫磷酸化在50μl的1Xsip(Roche)緩沖液中，0.5個單位的蝦腸磷酸酶(Roche)，在37℃下15分鐘溫育載體DNA片段，然后在80℃變性5分鐘。
1.3.8 亞克隆進載體以比例5∶1將需要的DNA片段連接在適當的載體中，最后體積為20μl，其中含有1X連接緩沖液(Roche)，2單位的T4 DNA連接酶(Roche)，4-8℃下16小時。
1.3.9 制備和轉化感受態大腸桿菌為了制備感受態細胞，在37℃，225r.p.m，在10ml含有12.5μg/ml的四環素的Lennox培養液中使XL1-Blue(來自單個菌落)的培養物生長過夜。將來自這一過夜培養物的1ml轉移到100ml的新鮮的，預熱的，Lennox培養液中，并且再培養2小時直到OD600的范圍是0.3到0.6。然后，通過在4℃，4500g離心10分鐘回收細胞。在50ml 100mM CaCl2中洗滌細胞，再懸浮在最后體積5ml的100mMCaCl2中。然后，將細胞放置于冰上1小時。
如下進行轉化在200μl的感受態細胞中加入五分之一(4μl)的連接反應物。在冰上溫育混合物30分鐘，然后于42℃熱休克40秒。然后，在混合物中，在37℃，225r.p.m溫育30分鐘之前加入300μl的2YT。然后，在含有100μg/ml的羧芐青霉素或50μg/ml卡那霉素的Lennox瓊脂上鋪轉化體，并且在37℃溫育過夜。
1.3.10 大腸桿菌重組體的鑒定和篩選通過從單個菌落，在50μl的含有下面的混合物，1Xpcr緩沖液，0.2mM dNTPs，25pmol 5’引物，25pmol 3’引物，1.25單位的Taq DNA聚合酶的反應物中擴增DNA來鑒定陽性轉化體。循環條件是30個循環的94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分鐘。將最初的變性步驟延長到2分鐘。然后，在EtBr-1.2％的瓊脂糖TBE凝膠上分析pcr擴增。
1.3.11 質粒DNA的提取和純化將選擇的菌落在50ml的含有100μg/ml羧芐青霉素或50μg/ml的卡那霉素(如果適當)的2TY培養液中，在225r.p.m，在37℃生長過夜。通過在4500g，4℃離心10分鐘回收細胞。在4ml的溶液1(25mMTris Cl，pH8.0，10mM EDTA)中再懸浮細菌沉淀，然后，加入8ml的溶液2(0.2N NaOH，1％SDS)，留在室溫下5分鐘溶解細胞。加入6ml的冰冷溶液3(3M鉀，5M乙酸)，在冰上溫育混合物15分鐘。然后，在15000g，4℃離心細菌溶解物20分鐘，通過4層miracloth(Calbiochem)來過濾上清液。加入10ml的異丙醇沉淀DNA，在室溫，15000g旋轉15分鐘進行沉淀。在1ml的含有10μg/ml的RNase A的TE(10mM Tris.Cl pH7.6，1mM EDTA)中再懸浮沉淀，在50℃溫育30分鐘除去污染的RNA。將溶液用等體積的酚/氯仿(1∶1)提取兩次，再次用等體積的氯仿提取一次。用0.1體積的3M NaACpH5.2和0.7體積的異丙醇，再沉淀DNA，然后在室溫，在10000g旋轉5分鐘。在70％的ETOH中洗滌沉淀，然后空氣干燥，再懸浮于TE，最后濃度為1μg/μl。
1.4 載體構建產生了表達載體，其中含有來自豌豆、百脈根和大豆的查耳酮還原酶(CHR)，查耳酮異構酶(CHI)和異黃酮合酶(IFS)cDNA。在雙35s啟動子的控制下放置CHR，CHI和IFS轉基因得到煙草組織中高水平的表達。
1.4.1 構建質粒pPV5LN為了構建pPV5LN，將pUC19修飾如下。首先，通過從pUC19除去HindIII/EcoRI多克隆位點，和用合成的DNA片段替代它，破壞原來的EcoRI和HindIII位點和導入SgfI，HindIII，KpnI，EcoRI和XbaI限制位點可以構建質粒pPV3。這一合成片段是通過退火寡聚核苷酸624和625(圖4)來構建的。這樣得到了質粒pPV3。
將來自含有～1.9kb編碼序列上游的2X35S啟動子序列的pSJ30的KpnI/EcoRI插入物和隨后的Nos終止子序列與用KpnI/EcoRI限制酶切的pPV3連接。得到了質粒pPV5。
然后，從pPV5除去了作為SalI/SacI片段的～1.9kb的編碼序列，用導入NcoI，NheI和MunI限制位點的合成的DNA片段替代，同時使原來的SalI/SacI位點保持完整。這一合成片段是通過退火寡聚核苷酸626和627(圖4)來構建的。這產生了質粒pPV5L。
利用PCR用植物Kozak序列TAAACC替代pPV5L中的起始密碼ATG的5’端緊接的序列(CCACC)。寡聚的核苷酸640和641(圖4)用于擴增來自載體pCP031(van Engelen等人，1994)的2X35S啟動子的189bp的3’片段，通過寡聚核苷酸641來修飾Kozak序列。然后在與用HindIII-NcoI限制酶切的pPV5L連接以替代啟動子之前，分別用HindIII/EcoRV和EcoRV/NcoI限制酶切pCP031和擴增的片段。這樣得到了質粒pPV5LN(圖5)。
1.4.2 構建質粒pPE-2為了構建質粒pPE-2，通過插入3個寡聚核苷酸連接物可以修飾pPV5LN的多克隆位點。首先，將寡聚核苷酸331和332(圖4)一起退火，并且與用EcoRI-XbaI限制酶切的質粒pPV5LN連接。這樣得到質粒p5LNa。其次，利用寡聚核苷酸248和191(圖4)來擴增來自pPV5LN的多克隆位點，并且用XbaI和EcoRI限制酶切擴增產物。然后，使這一產物與寡聚核苷酸333和334(圖4)和NcoI-EcoRI限制酶切p5LNa的退火產物連接。這產生了質粒p5LNb。為了構建質粒pPE-2，將寡聚核苷酸329和330一起退火，連接進用SfiI-HindIII限制酶切的質粒p5LNb。這樣得到了質粒pPE-2(圖5)。
1.4.3 構建質粒pPE-5為了構建質粒pPE-5，通過插入寡聚核苷酸連接物可以修飾pSJ34的多克隆位點。首先，將寡聚核苷酸337和338(圖4)一起退火，并且用HindIII-EcoRI限制酶切的質粒pSJ34連接。這樣得到質粒pPE-5(圖5)。
pSJ34是二元載體pGPTV-Kan(Becker等人，1992 Plant Mol.Biol.，201195-1197)的衍生物，其中通過用Klenow聚合酶‘填充’破壞了nptII選擇性標記和基因7聚腺苷酸化信號之間的BamHI位點。
1.4.4構建質粒pPE-9(2X35S+Kozak-Lotus CHI-Tnos)從百脈根3’和5’cDNA文庫，利用引物160/323和160/321各自擴增百脈根的CHI cDNA(圖4)；然后利用引物198/324和198/322各自再擴增擴增產物(圖4)。電泳分離擴增片段，將產物5a.3.19和2.11各自克隆進載體pT7和用引物152和191來測序(圖4)。
為了證實擴增的片段的DNA序列，將引物386和387用于從百脈根3’cDNA文庫擴增CHI基因(三份)的完全的編碼區域。將得到的片段LCHI-A，LCHI-B和LCHI-C克隆進載體pT7，和用引物152和191來測序。克隆LCHI-A再用引物386/403和402/387來擴增，用NcoI-PstI和PstI-NheI各自消化得到的片段，并且連接進NcoI-XbaI切開的PE-2以產生載體PE-9(在PE-2中2x35S+kozak-LotusCHI-tNOS)(圖5)。
1.4.5構建質粒pPE-11(2x35S+kozak-Pea CHR-Tnos)從豌豆葉子組織3’cDNA文庫，利用引物384和385擴增查耳酮還原酶cDNA。將得到的0.98kb產物連接進PCR克隆載體pT7Blue(Novagen)，在進一步亞克隆之前證實序列。
然后，利用寡聚核苷酸384/362，363/398，399/400和401/385(表1)從pT7Blue載體擴增查耳酮還原酶序列。在與NcoI-XbaI限制酶切的pPE-2連接之前，分別用NcoI-NarI，NarI-BamHI，BamHI-MunI，和Mun I-NheI限制酶切得到的擴增產物。這樣得到了質粒pPE-11(圖5)。
1.4.6構建質粒pPE-15(2x35S+kozak-Soy IFS-Tnos)從大豆葉子組織cDNA文庫，利用引物339/340，341/342，和343/344(表1)擴增異黃酮合酶cDNA。在與用NcoI-XbaI限制酶切的pPE-2連接之前，分別用NcoI-ApaI，ApaI-SalI，和SalI-NheI限制酶切得到的擴增產品。這樣得到了質粒pPE-15(圖5)。
1.4.7構建植物轉化載體pPE-120(CHR-IFS)將如上所述的單個基因構建體用于如下構建質粒pPE120。用SalI-EcoRI和HindIII-SalI各自消化質粒pPE-11和pPE-15。然后，使2x35S+kozak-Pea CHR-Tnos和2x35S+kozak-Soy IFS-Tnos片段與用HindIII-EcoRI限制酶切的pPE-5連接(圖5)。
1.4.8構建植物轉化載體pPE-125(CHR-CHI-IFS)為了構建植物轉化載體pPE125，用SalI限制酶切質粒pPE9和pPE-120。然后，使得到的2x35S+kozak-Lotus CHI-Tnos片段(來自pPE-9)與用SalI線性化的pPE-120連接。這樣得到了質粒pPE-125(圖5)。
1.4.10GPTV對照質粒基于GPTV的二元質粒，pPE51(圖5)，其中含有雙CaMV35s啟動子和nos聚腺苷酸化信號(Pd35s-Tnos)，用作對照質粒。這允許了在轉化的對照植物和通過組織培養方法產生的含有CHR，CHI和IFS構建體的植物之間的直接比較。
pPE51通過用EcoRI-HindIII限制酶切pPE2來構建。然后使2x35S-kozak-Tnos片段與用HindIII-EcoRI限制酶切的pPE5連接。這樣得到了質粒pPE51(圖5)。
1.5 根癌農桿菌的轉化如Shen和Forde(1989)所述，通過高電壓電穿孔在根癌農桿菌菌株LBA4404中導入二元質粒pPE120，pPE125，pPE130，和pPE51。簡要地說，通過接種50ml的2xYT培養基(Sambrook等人，1989)和于100rpm在28℃下振搖培養，直到培養達到OD6000.5-0.7制備根癌農桿菌的電感受態細胞.在冰上冷卻細胞，通過離心收獲，然后丟棄上清液。然后，在0.5ml 10％的甘油中重懸之前，連續在50，25，1和1ml的冷10％(v/v)甘油中洗滌細胞。
對于轉化，將40μl的細胞轉移到預冷的0.2cm的電穿孔杯中(Bio-Rad Laboratories)。將1μl的pPE120或pCJ102質粒DNA與細胞懸浮液在冰上混合，立即利用具有脈沖控制單元的基因脈沖儀(Bio-Rad)施加電脈沖。對于轉化，電場強度是12.5kv/cm，電容為25μF，和并聯的400-600ohms的電阻器，得到時間常數8-12msec。將細胞立即轉移到1ml的2xTY，并且在29℃振搖2小時。然后，將等分試樣鋪在用卡那霉素補充的LB瓊脂，并且在29℃，溫育2-3天。
在卡那霉素抗性克隆中質粒的存在和其完整性是通過PCR分析確定的，該PCR分析分別利用pPE120(GPTV2和30035s；340-GPTV1)，pPE51(30035S和GPTV2)，pPE125(GPTV2和30035S；340-GPTV1；248-403；402-398)，pPE130(GPTV2-30035S)特異引物(圖4)。
1.6 煙草cv SR1的穩定轉化PCR陽性克隆的A.tumefaciens細胞接種到10ml含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的Lennox培養基中，29℃，120轉/分培養過夜。過夜培養物3000g離心，細胞沉淀用等體積的MS培養液重懸(含3％蔗糖)。從組織培養的煙草L.cv.SR1上割下小塊的葉片，直接加入A.tumefaciens細胞懸液中，共同孵育10分鐘。
然后將葉片移出，軸面向下，加入培養皿中(10片/培養皿)，在22℃和較低的光照條件下放置2天。再將葉片移出，軸面向下，加入含激素、500μg/ml頭孢氨噻、50μg/ml卡那霉素的煙草培養液中，放置在24℃、光周期為16小時的生長室中。3周后，愈合的葉片轉移到含新鮮煙草培養液的vitro-vent(Melford LaboratoriesLtd)組織培養裝置中。
從愈合的葉片上分離的新芽放在不含激素、含500μg/ml頭孢氨噻、50μg/ml卡那霉素的煙草培養液中。從生根的新芽中分離基因組DNA，通過分別特異性地擴增CHR、CHI、IFS基因來篩選含目的基因的轉基因植物。
然后將轉基因成功的植物進行盆載，使用50％的珍珠巖和50％的混合肥料，放入種子箱中，在25℃、光周期為16小時(3000lux)的生長室中培養。1周后，將植物從種子箱中移出，植入5英寸的花盆里。
從每株獨立的植物轉化體上分別收集花瓣組織，保存好用于后面的分析。花期結束后，每株植物被割倒后重新培養，從新長成的花中收集種子用于繁殖和分析。
1.7 從煙草組織中提取黃酮類和異黃酮類化合物黃酮類和異黃酮類化合物是通過分別制備水解或非水解提取物，分析它們的糖苷基來進行測定的。
提取的方法是先從煙草的完全開放的成熟花朵上收集花瓣。為保證分析的代表性，從每種pPE120、pPE125和相應的pPE51(對照)轉基因植物中收集的花朵(每株植物大于10支)均應處于相似的發育階段。從花朵上去除雄蕊、心皮、冠筒組織，剩余的花瓣組織在液氮中速凍后貯存于-80℃。將每株植物的花瓣組織(＞10份)研磨成均一的粉末，取1小份放入80％(v/v)的乙醇中(100mg/700μl)，在室溫(約22℃)抽提30分鐘。
抽提后，用0.45μm的Millex-HV濾器(Mlilipore Corp，USA)過濾去除細胞碎片。濾液保存于-20℃以備HPLC分析。
水解時將40μl 12M HCl加入360μl花瓣抽提液中，90℃孵育40分鐘。將黃豆苷/金雀異黃苷標準品用與花瓣抽提液同樣的條件水解，作為水解過程的對照。
1.8 黃酮類和異黃酮類化合物分析1.8.1 黃酮類和異黃酮類化合物HPLC分析的條件水解后，每種抽提液取小份用0.2μm的PTFE一次性濾器(Whatman)過濾。20μl濾液用自動上樣器加入HPLC系統(HP1100，Agilent)中，溫度控制在4℃。分析柱(Prodigy Phenyl-3，4.6×150mm，顆粒徑5μm，Phenomenex)溫度為30℃。二極管陣列分別在262、280、和370nm檢測。觀測到的峰從210-550nm掃描獲得光譜。用Chemstation軟件(Rev.A.8.03)控制系統并收集和分析數據。
采用梯度乙腈(1％醋酸中)從抽提液中分離黃酮類和異黃酮類化合物，流速0.8ml/min。乙腈梯度為15-37％線性22分鐘，37-80％線性2分鐘，80％維持2分鐘。然后乙腈在2分鐘內從80％下降到15％，15％維持2分鐘，進行下次上樣。
將樣品的吸收光譜(用基線光譜校正)和峰值滯留時間與購買的黃酮類和異黃酮類標準品的結果比較。
建立櫟皮酮、堪非醇、染料木黃酮、大豆黃酮、異甘草素和甘草素的標準曲線，用于水解煙草抽提液的定量測定。結果用鮮重計算(μg/g鮮重)。使用的HPLC系統和分析軟件對煙草抽提液的檢測極限為0.1μg/ml，相當于1.5μg/g鮮重。重復上樣的結果差異小于5％。
1.8.2 黃酮類和異黃酮類化合物GC-MS分析的條件水解后，每種抽提液取小份加入5ml 10％Na2SO4中，再用2ml乙酸乙酯抽提。然后1600g離心1分鐘。將乙酸乙酯層移入一個新試管，在N2下(＜45℃)蒸發干燥。
樣品用30μl吡啶溶解，與20μl雙-三氟乙酰胺(BSTFA)一起45℃加熱15分鐘，1μl樣品用無分流注射器于280℃上樣于CP-Sil 8CB/MS(25m×0.25mm×0.25μM薄膜)氣相毛細管柱(Chrompack)(Hewlett Packard 5890氣相色譜)。烤箱溫度設為線形升高，從100℃到320℃，10℃/分鐘，氦氣流速為1ml/min。質譜檢測采用HewlettPackard 5972A四通道質譜選擇檢測儀，設定在300℃(EI)，質譜范圍分別為大豆黃酮175、184、383、398道爾頓(選擇性離子模式)；染料木黃酮228、399、371、486道爾頓(選擇性離子模式)；異甘草素219、307、371、457和472道爾頓(選擇性離子模式)；甘草素151、179、192、235、385和400道爾頓(選擇性離子模式)。另外，以下質譜范圍用于全掃描模式大豆黃酮170-400道爾頓；異甘草素130-480道爾頓；甘草素130-410道爾頓；染料木黃酮180-490道爾頓。
1.9 異常表達查耳酮還原酶和異黃酮合成酶的轉基因煙草中大豆黃酮的積聚為確定非豆科植物煙草中查耳酮還原酶和異黃酮合成酶的異常表達是否能夠增加大豆黃酮和/或染料木黃酮的合成，測定了花瓣組織中的黃酮類和異黃酮類化合物成分。采用HPLC分析了花瓣組織的水解抽提液，分別取自19株pPE120和6株pPE51轉基因植物。
對取自轉入pPE120或pPE51的煙草花朵的花瓣水解抽提液的HPLC分析結果的比較顯示在幾株pPE120轉基因植物中檢測到一個小峰具有與大豆黃酮標準品同樣的滯留時間。相反，這種HPLC峰在對照(pPE51)轉基因植物中未檢測到。為證實我們的初步結果，從HPLC上收集了這個峰用GC-MS方法分析。另外，還收集了一株典型的pPE51轉基因植物和一個大豆黃酮標準品在相應滯留時間的組分作為對照。
GC-MS分析結果顯示pPE120組分的滯留時間和測定離子(175、184、383和398[M+])的相對豐度與大豆黃酮標準品的結果相似(圖6)。而且，pPE51組分未顯示有相似滯留時間或相似測定離子相對豐度的GC峰，表明對照轉基因植物中未檢測到大豆黃酮(圖6)。
通過與大豆黃酮標準品的比較進行定量檢測顯示pPE120花瓣組織的大豆黃酮積聚達到約2.75μg/g鮮重(圖7)。
1.10 表達查耳酮還原酶、異黃酮合成酶和查耳酮異構酶的轉基因煙草中大豆黃酮的積聚為確定非豆科植物煙草中查耳酮還原酶和異黃酮合成酶伴隨查耳酮異構酶的共同表達是否能夠增加大豆黃酮的積聚，測定了花瓣組織中的黃酮類和異黃酮類化合物成分。采用HPLC分析了花瓣組織的水解抽提液，分別取自12株pPE125和6株pPE51轉基因植物。
對取自轉入pPE125或pPE51的煙草花朵的花瓣水解抽提液的HPLC分析結果的比較顯示在幾株pPE125轉基因植物中檢測到一個峰具有與大豆黃酮標準品同樣的滯留時間。相反，這種HPLC峰在對照(pPE51)轉基因植物中未檢測到。為證實我們的初步結果，從HPLC上收集了這個對應大豆黃酮的峰，用GC-MS方法分析。另外，還收集了一株典型的pPE51轉基因植物和一個大豆黃酮標準品在相應滯留時間的組分作為對照。
GC-MS分析結果顯示pPE125組分的滯留時間和測定離子(175、184、383和398[M+])的相對豐度與大豆黃酮標準品的結果相似。而且，pPE51組分未顯示有相似滯留時間或相似測定離子相對豐度的GC峰，表明對照轉基因植物中未檢測到大豆黃酮。
通過與大豆黃酮標準品的比較進行定量檢測顯示pPE125花瓣組織的大豆黃酮積聚達到約246.7μg/g鮮重(約493μg/g干重)(圖8)。
實施例2萵苣的轉化Lactuca Sativa L.Cv Lollo Rossa，Bijou，Muscara &Revolution的穩定轉化PCR陽性克隆的A.tumefaciens細胞接種到10ml含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的Lennox培養基中，29℃，120轉/分培養過夜。過夜培養物3000g離心，細胞沉淀用等體積的UM培養液重懸，1∶10(v/v)的稀釋液用于轉化。
從組織培養7天的萵苣Lactuca Sativa L.的秧苗上割下子葉，用解剖刀片在子葉背軸面劃痕后直接加入A.tumefaciens細胞懸液中，共同孵育10分鐘。
然后將子葉移出，背軸面向下，轉移到含3％蔗糖的固體UM培養基上(8片/培養皿)，蓋上一層濾紙，在25℃放置2天。然后再將子葉移出，軸面向上，轉移到含3％蔗糖、0.04mg 1-1NAA、0.5mg 1-1BAP、100μg/ml頭孢氨噻、500μg/ml羧芐青霉素、50μg/ml卡那霉素的固體MS培養基上，放置在25℃、光周期為16小時的生長室中。每14天將外植體轉移到新鮮培養基。8周后，將新生的外植體轉移到含0.11％(w/v)MES、100pg/ml頭孢氨噻和50pg/ml卡那霉素的固體MS培養基中。
從生根的新芽中分離基因組DNA，通過分別特異性地擴增CHR、CHI、IFS基因來篩選含目的基因的轉基因植物。
然后將轉基因陽性的植物轉入9cm直徑的花盆中進行盆載，使用Levington M3混合肥料、John Innes No.3和珍珠巖的混合物(3∶3∶2)，放入種子箱中，在25℃、光周期為16小時的生長室中培養。1周后，將植物從種子箱中移出，在25℃、光周期為16小時的條件下維持。
從每株獨立的植物轉化體上分別收集葉片組織，保存于-80℃，用前面描述的方法進行黃酮類和異黃酮類化合物的分析。
實施例3馬鈴著的轉化Solanumtuberosum L.cv.的穩定轉化轉基因陽性(PCR)克隆的A.tumefaciens細胞接種到20ml含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的Lennox培養基中，29℃，120轉/分培養3天。培養完成后將培養物3000g離心，細胞沉淀用25ml含3％蔗糖(w/v)的MS培養液(pH5.8)重懸。
從組織培養4周的馬鈴薯Solanum tuberosum L.上割下葉子，軸面向上放在添加了0.02mg/l NAA、20mg/l GA3、2mg/l玉米素核苷的固體L3培養基上(在MS基礎鹽里添加1.6％葡萄糖、0.8％瓊脂，pH5.8)，在23℃放置2天。
然后將離體的葉子直接加入A.tumefaciens細胞懸液中，共同孵育10分鐘。孵育完成后，將葉子吸干，軸面向上，轉移到培養皿中(固體L3培養基上覆蓋了2ml煙草細胞懸液，再蓋上一層濾紙)，在23℃黑暗中放置2天。再將葉子外植體移出，軸面向上，轉移到添加了0.02mg/l NAA、20mg/l GA3和500μg/ml頭孢氨噻的固體L3培養基上，放置在23℃、光周期為16小時的生長室中培養4天。然后每14天將葉子外植體移到新鮮的添加了0.02mg/l NAA、20mg/l GA3和500μg/ml頭孢氨噻的固體L3培養基上。8周后，從新生的外植體上切下新芽(約1.5cm)轉移到含1％(w/v)蔗糖、0.8％瓊脂、500μg/ml頭孢氨噻和100μg/ml卡那霉素的固體MS培養基上。
從生根的新芽中分離基因組DNA，通過分別特異性地擴增CHR、CHI、IFS基因來篩選含目的基因的轉基因植物。
每株轉基因陽性植物的約3cm長的葉莖被轉移到含8％(w/v)蔗糖、0.8％瓊脂的MS培養基上，放置在25℃黑暗中來生成小塊莖。從每株獨立的植物轉化體上分別收集小塊莖，保存于-80℃，進行黃酮類和異黃酮類化合物的分析。
實施例4食品皮膚外觀因攝入異黃酮而改善調查設計采用雙盲安慰劑對照試驗，在33位絕經后的女性志愿者中進行。受試者用平行設計的方式隨機分到2組中，分別在12周時間內接受含或不含功能成分的食物。在試驗期間，受試者要求避免食用含大豆的食物，停止攝入維生素、礦物質或其他食物添加劑。
試驗分兩個階段。首先是參加(″run-in″)或淘汰(″washout″)階段，受試者食用安慰食品2周。第二階段為介入階段，受試者隨機分成2組，分別食用含功能成分的食品(每日2次低卡路里食品)或安慰食品10周。
試驗食品以低卡路里的食物塊的形式提供，食物塊很小(29g大小)，平均含108卡路里和3.1g脂肪。
每塊功能性食物塊含有
安慰食品含PABA(對氨基苯甲酸)，但不含任何功能性成分。加入PABA的食物塊與其他食物塊外型完全一致。
試驗顯示食物塊中所含微量營養素中的異黃酮非常有效，對皮膚的健康和外觀帶來一系列益處1，改善皮膚外觀，通過減輕皺紋的深度使皮膚看起來年輕；2，改善皮膚的彈性和膚色；3，使皮膚更加柔軟和光滑；4，降低皮膚的敏感性，使人對自己的皮膚感覺更好；5，提高機體和皮膚的整體抗氧化劑水平。
在10周的介入階段后，每位受試者皮膚受益或血清學變化的統計顯著性見下表
序列表<110>Unilever Plc<120>營養增強的植物<130>T3087(C)<160>53<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>946<212>DNA<213>豌豆<220>
<221>各種特征<223>豌豆查耳酮還原酶DNA序列<400>1atgggtagtg ttgaaatccc aacaaaggtg cttaccaaca catctgctca aattaagatg 60cctgttgttg gaatgggatc agcacctgac ttcacatgca agaaagacac taaagaagca120atcatcgaag ccatcaaaca aggttacaga cactttgata ctgctgctgc ttatggatcc180gaacaagctc ttggtgaggc tttgaatgag gctattcaac ttggtcttgt cactagagaa240cagctttttg ttacttctaa actttgggtt actgaaaatc atcctcacct tgttcttcct300gctctacaaa aatctctcaa gactcttcag ttggattact tggatttgta tttgattcat360tggccactta gttctcagcc cggaaagttt tcatttccaa ttgatgtggc tgatctattg420ccatttgatg taaaaggtgt gtgggaatcc atggaagagg ctttgagact tggactcacg480aaagctattg gtgtcagtaa cttctctgtc aagaaacttc aaaagctact atctgttgcc540ctgttcttc ctgctgttaa tcaagtagag atgaaccttg catggcaaca aaagaagcta600agagaatttt gcaatgaaaa tggaatagtg ttgactgcat tttcaccgtt gaggaaaggc660gccagccgag gagcaaatga ggttatggag aatgatatgc ttaaacagat tgcagatgct720catggaaagt ctattgcaca aatttctctg agatggttat atgaacaagg aatcactttt780gttccaaaga gctatgataa ggagagaatg agtcaaaatt tgagaatctt tgattggaca840ctgacaaagg aggatcatga gaaaattgat caaattaagc agaatcgttt gatccctgga900ccaaccaagc caagtctcaa tgatctttgg gatgatgaaa tataag 946<210>2<211>314<212>蛋白質<213>豌豆
<220>
<221>各種特征<223>豌豆查耳酮還原酶蛋白質序列<400>2Met Gly Ser Val Glu Ile Pro Thr Lys Val Leu Thr Asn Thr Ser Ala1 5 10 15Gln Ile Lys Met Pro Val Val Gly Met Gly Ser Ala Pro Asp Phe Thr20 25 30Cys Lys Lys Asp Thr Lys Glu Ala Ile Ile Glu Ala Ile Lys Gln Gly35 40 45Tyr Arg His Phe Asp Thr Ala Ala Ala Tyr Gly Ser Glu Gln Ala Leu50 55 60Gly Glu Ala Leu Asn Glu Ala Ile Gln Leu Gly Leu Val Thr Arg Glu65 70 75 80Gln Leu Phe Val Thr Ser Lys Leu Trp Val Thr Glu Asn His Pro His85 90 95Leu Val Leu Pro Ala Leu Gln Lys Ser Lau Lys Thr Leu Gln Leu Asp100 105 110Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro Leu Ser Ser Gln Pro Gly115 120 125Lys Phe Ser Phe Pro Ile Asp Val Ala Asp Leu Leu Pro Phe Asp Val130 135 140Lys Gly Val Trp Glu Ser Met Glu Glu Ala Leu Arg Leu Gly Leu Thr145 150 155 160Lys Ala Ile Gly Val Ser Asn Phe Ser Val Lys Lys Leu Gln Lys Leu165 170 175Leu Ser Val Ala Thr Val Leu Pro Ala Val Asn Gln Val Glu Met Asn180 185 190Leu Ala Trp Gln Gln Lys Lys Leu Arg Glu Phe Cys Asn Glu Asn Gly195 200 205Ile Val Leu Thr Ala Phe Ser Pro Leu Arg Lys Gly Ala Ser Arg Gly210 215 220
Ala Asn Glu Val Met Glu Asn Asp Met Leu Lys Gln Ile Ala Asp Ala225 230 235 240His Gly Lys Ser Ile Ala Gln Ile Ser Leu Arg Trp Leu Tyr Glu Gln245 250 255Gly Ile Thr Phe Val Pro Lys Ser Tyr Asp Lys Glu Arg Met Ser Gln260 265 270Asn Leu Arg Ile Phe Asp Trp Thr Leu Thr Lys Glu Asp His Glu Lys275 280 285Ile Asp Gln Ile Lys Gln Asn Arg Leu Ile Pro Gly Pro Thr Lys Pro290 295 300Ser Leu Asn Asp Leu Trp Asp Asp Glu Ile305 310<210>3<211>1567<212>DNA<213>大豆<220>
<221>各種特征<223>大豆異黃酮合酶DNA序列<400>3atggtgcttg aacttgcact tggtttattg gttttggctc tgtttctgca cttgcgtccc 60acacccactg caaaatcaaa agcacttcgc catctcccaa acccaccaag cccaaagcct120cgtcttccct tcataggaca ccttcatctc ttaaaagaca aacttctcca ctacgcactc180atcgacctct ccaaaaaaca tggtccctta ttctctctct actttggctc catgccaacc240gttgttgcct ccacaccaga attgttcaag ctcttcctcc aaacgcacga ggcaacttcc300ttcaacacaa ggttccaaac ctcagccata agacgcctca cctatgatag ctcagtggca360atggttccct tcgggcccta ctggaagttc gtgaggaagc tcatcatgaa cgaccttctc420aacgccacca ctgtaaacaa gttgaggcct ttgaggaccc aacagacgcg taagttcctt480agggttatgg cccaaggcgc agaggcacag aagccccttg acttgaccga ggagcttctg540aaatggacca acagcaccat ctccatgatg atgctcggcg aggctgagga gatcagagac600atcgctcgcg aggttcttaa gatctttggc gaatacagcc tcactgactt catctggcca660ttgaagcatc tcaaggttgg aaagtatgag aagaggatcg acgacatctt gaacaagttc720
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<221>各種特征<223>大豆異黃酮合酶蛋白質序列<400>4Met Val Leu Glu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Val Leu Ala Leu Phe Leu1 5 10 15His Leu Arg Pro Thr Pro Thr Ala Lys Ser Lys Ala Leu Arg His Leu20 25 30Pro Aen Pro Pro Ser Pro Lys Pro Arg Leu Pro Phe Ile Gly His Leu35 40 45His Leu Leu Lys Asp Lys Leu Leu His Tyr Ala Leu Ile Asp Leu Ser50 55 60Lys Lya His Gly Pro Leu Phe Ser Leu Tyr Phe Gly Ser Met Pro Thr65 70 75 80
Val Val Ala Ser Thr Pro Glu Leu Phe Lys Leu Phe Leu Gln Thr His85 90 95Glu Ala Thr Ser Phe Asn Thr Arg Phe Gln Thr Ser Ala Ile Arg Arg100 105 110Leu Thr Tyr Asp Ser Ser Val Ala Met Val Pro Phe Gly Pro Tyr Trp115 120 125Lys Phe Val Arg Lys Leu Ile Met Asn Asp Leu Leu Asn Ala Thr Thr130 135 140Val Asn Lys Leu Arg Pro Leu Arg Thr Gln Gln Thr Arg Lys Phe Leu145 150 155 160Arg Val Met Ala Gln Gly Ala Glu Ala Gln Lys Pro Leu Asp Leu Thr165 170 175Glu Glu Leu Leu Lys Trp Thr Asn Ser Thr Ile Ser Met Met Met Leu180 185 190Gly Glu Ala Glu Glu Ile Arg Asp Ile Ala Arg Glu Val Leu Lys Ile195 200 205Phe Gly Glu Tyr Ser Leu Thr Asp Phe Ile Trp Pro Leu Lys His Leu210 215 220Lys Val Gly Lys Tyr Glu Lys Arg Ile Asp Asp Ile Leu Asn Lys Phe225 230 235 240Asp Pro Val Val Glu Arg Val Ile Lys Lys Arg Arg Glu Ile Val Arg245 250 255Arg Arg Lys Asn Gly Glu Val Val Glu Gly Glu Val Ser Gly Val Phe260 265 270Leu Asp Thr Leu Leu Glu Phe Ala Glu Asp Glu Thr Met Glu Ile Lys275 280 285Ile Thr Lys Asp His Ile Lys Gly Leu Val Val Asp Phe Phe Ser Ala290 295 300Gly Thr Asp Ser Thr Ala Val Ala Thr Glu Trp Ala Leu Ala Glu Leu305 310 315 320
Ile Asn Asn Pro Lys Val Leu Glu Lys Ala Arg Glu Glu Val Tyr Ser325 330 335Val Val Gly Lys Asp Arg Leu Val Asp Glu Val Asp Thr Gln Asn Leu340 345 350Pro Tyr Ile Arg Ala Ile Val Lys Glu Thr Phe Arg Met His Pro Pro355 360 365Leu Pro Val Val Lys Arg Lys Cys Thr Glu Glu Cys Glu Ile Asn Gly370 375 380Tyr Val Ile Pro Glu Gly Ala Leu Ile Leu Phe Asn Val Trp Gln Val385 390 395 400Gly Arg Asp Pro Lys Tyr Trp Asp Arg Pro Ser Glu Phe Arg Pro Glu405 410 415Arg Phe Leu Glu Thr Gly Ala Glu Gly Glu Ala Gly Pro Leu Asp Leu420 425 430Arg Gly Gln His Phe Gln Leu Leu Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Met435 440 445Cys Pro Gly Val Asn Leu Ala Thr Ser Gly Met Ala Thr Leu Leu Ala450 455 460Ser Leu Ile Gln Cys Phe Asp Leu Gln Val Leu Gly Pro Gln Gly Gln465 470 475 480Ile Leu Lys Gly Gly Asp Ala Lys Val Ser Met Glu Glu Arg Ala Gly485 490 495Leu Thr Val Pro Arg Ala His Ser Leu Val Cys Val Pro Leu Ala Arg500 505 510Ile Gly Val Ala Ser Lys Leu Leu Ser515 520<210>5<211>670<212>DNA<213>百脈根<220>
<221>各種特征<223>百脈根查耳酮異物酶DNA序列
<400>5atggctgcat ccctcacccc aatccaggtc gagaaccttc aatttcctgc gtctgtcacc 60tctccagcca ccgccaagtc ttatttcctc ggtggtgcag gggagagagg gttgacgatt120gaggggaagt tcataaaatt cactggcata ggagtgtatt tggaagatac agcagtggat180tcactcgcca ccaagtggaa gggtaagagt tcacaagagc tgcaggactc ccttgacttc240ttcagagaca tcatttcaag tccctctgag aagttaattc gagggtccaa gctgaggcca300ttgagtggcg tggagtattc aagaaaggtg atggagaatt gtgtggcaca catgaagtct360gctggaactt atggtgaagc agaggccaca gccattgaaa aatttgcaga agccttcagg420aaggtggatt ttccaccagg ttcctctgtt ttctaccgac aatcaacaga tggaaaatta480gggcttagtt tctctttgga tgacacgata ccagaagaag aggctgtagt tatagagaac540aaggcactct cagaggcagt gttagagacc atgattggcg agcatgctgt ttcccctgat600ttgaagcgtt gtttggctga aaggttgcct attgtgatga accagggtct tctcctcact660ggaaactgat 670<210>6<211>222<212>蛋白質<213>百脈根<220>
<221>各種特征<223>百脈根查耳酮異物酶蛋白質<400>6Met Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ile Gln Val Glu Asn Leu Gln Phe Pro1 5 10 15Ala Ser Val Thr Ser Pro Ala Thr Ala Lys Ser Tyr Phe Leu Gly Gly20 25 30Ala Gly Glu Arg Gly Leu Thr Ile Glu Gly Lys Phe Ile Lys Phe Thr35 40 45Gly Ile Gly Val Tyr Leu Glu Asp Thr Ala Val Asp Ser Leu Ala Thr50 55 60Lys Trp Lys Gly Lys Ser Ser Gln Glu Leu Gln Asp Ser Leu Asp Phe65 70 75 80Phe Arg Asp Ile Ile Ser Ser Pro Ser Glu Lys Leu Ile Arg Gly Ser
85 90 95Lys Leu Arg Pro Leu Ser Gly Val Glu Tyr Ser Arg Lys Val Met Glu100 105 110Asn Cys Val Ala His Met Lys Ser Ala Gly Thr Tyr Gly Glu Ala Glu115 120 125Ala Thr Ala Ile Glu Lys Phe Ala Glu Ala Phe Arg Lys Val Asp Phe130 135 140Pro Pro Gly Ser Ser Val Phe Tyr Arg Gln Ser Thr Asp Gly Lys Leu145 150155 160Gly Leu Ser Phe Ser Leu Asp Asp Thr Ile Pro Glu Glu Glu Ala Val165 170 175Val Ile Glu Asn Lys Ala Leu Ser Glu Ala Val Leu Glu Thr Met Ile180 185 190Gly Glu His Ala Val Ser Pro Asp Leu Lys Arg Cys Leu Ala Glu Arg195 200 205Leu Pro Ile Val Met Asn Gln Gly Leu Leu Leu Thr Gly Asn210 215 220<210>7<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列GPTV1<400>7ttgtccagat agcccagtag ctg 23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列GPTV2<400>8cgacaatctg atcatgagcg gag 23<210>9<211>24
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列300 35S<400>9cgcaagaccc ttcctctata taag 24<210>10<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列Gus2<400>10gcatcacgca gttcaacgct g21<210>11<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列152<400>11ggaaacagct atgaccatga ttac 24<210>12<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列160<400>12aaggatcgt cgacatc 17<210>13<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列167<400>13agtcccccat ggtacgtcct gtagaaacc 29<210>14<211>25<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>引物序列168<400>14cgttttcgtc ggtaatcacc attcc 25<210>15<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列191<400>15tttcccagtc acgacgttgt 20<210>16<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列198<400>16gacatcgata atacgac 17<210>17<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列248<400>17tgctacctct agagaatttc cccg 24<210>18<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列321<400>18ctaagcccct aagtattcca tcaggtgatt 30<210>19<211>34<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物序列322<400>19ccaggtggaa aattacacat gtgcttgaaa gagc 34<210>20<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列323<400>20tttgaaaagt ctaataacga gggtcagaag 30<210>21<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列324<400>21tactcaagga aggttgatgg agaactgtcg tgg 33<210>22<211>64<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列329<400>22cgcgagctca tgtaccccgg gatttccact agtttaaggg ttaactacat ggtcgacgta60cata 64<210>23<211>70<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列330<400>23agcttatgta cgtcgaccat gtagttaacc cttaaactag tggaaatccc ggggtacatg60agctcgcgat 70<210>24
<211>60<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列331<400>24aattcgagct catgtacccc gggatttcca ctagtttaag ggttaactac atggtcgacg60<210>25<211>60<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列332<400>25ctagcgtcga ccatgtagtt aacccttaaa ctagtggaaa tcccggggta catgagctcg 60<210>26<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列333<400>26catggatgcg tagttaagcc t 21<210>27<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列334<400>27ctagaggctt acatacgcat c 21<210>28<211>72<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列337<400>28aattcatgta cgagctcaat tcccccggga taggcactag tgctgctgtt aactacatgg60tcgacttatt aa72
<210>29<211>72<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列338<400>29aggtttaata agtcgaccat gtagttaaca goagcactag tgcctatccc gggggaattg60agctcgtaca tg72<210>30<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列339<400>30gaacaccatg gtgcttgaac ttgc24<210>31<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列340<400>31tccagtaggg cccgaaggga accattgcca c 31<210>32<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列341<400>32ccttcgggcc ctactggaag20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列342<400>33cagcgaactc gagcaaagtg20
<210>34<211>79<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列343<400>34cactttgctc gagttcgctg aggatgagac tatggagatc aaaatcacca aggaccacat60caagggtctt gttgtagac 79<210>35<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列344<400>35atgacgagct agcttattaa gaaaggag 28<210>36<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列362<400>36ggtgtgtggg gatccatggaagaggctttg 30<210>37<211>44<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列363<400>37cctcggctcg cgcctttcct caacggtgaa aatgcagtca acac 44<210>38<211>45<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列384<400>38caacaaccca tgggtagtgt tgaaatccca acaaaggtgc ttacc45
<210>39<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列385<400>39agcaactgct agcttatatt tcatcatccc aaagatc37<210>40<211>42<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列386<400>40tagattgcca tggctgcatc cctcacccca atccaggtcg ag 42<210>41<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列387<400>41aaactttgct agcttatcag tttccagtga ggagaagac 39<210>42<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列398<400>42gcttgttcgg atccataagc agc 23<210>43<211>41<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列399<400>43tgcttatgga tccgaacaag ctcttggtga ggctttgaat g 41
<210>44<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列400<400>44cagccacatc aattggaaat g 21<210>45<211>78<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列401<400>45tcatttccaa ttgatgtggc tgatctattg ccatttgatg taaaaggtgt gtgggaatcc60atggaagagg ctttgaga 78<210>46<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列402<400>46cacaagagct gcaggactcc cttga 25<210>47<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列403<400>47gggagtcctg cagctcttgt gaac 24<210>48<211>38<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列624<400>48agctgcgatc gcaagcttgg taccgggaat tctctaga 38
<210>49<211>42<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列625<400>49aatttctaga gaattcccgg taccaagctt gcttgcgatc gc 42<210>50<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列626<400>50tcgacccatg gcccgctagc caattggagc t 31<210>51<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列627<400>51ccaattggct agcgggccat ggg23<210>52<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列640<400>52ccacccacga gggaacatcg tg 22<210>53<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列641<400>53gaattcccat ggtttacact cgaggtcctc tccaaatga 39
權利要求
1.基因改造植物或其部分，其含有大豆黃酮和/或其衍生物，其中所述植物或其部分在黃酮醇和花色苷的生物合成方面活躍，并且含有編碼查耳酮還原酶的一種或多種核苷酸序列和編碼異黃酮合酶的一種或多種核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的基因改造植物或其部分，其進一步含有編碼查耳酮異構酶的一種或多種核苷酸序列，該酶能夠催化4，2′，4′-三羥查耳酮轉變為7，4′-二羥黃烷酮。
3.如權利要求1所述的基因改造植物或其部分，其中所述一種或多種核苷酸序列包含序列識別號1和3所示的序列或者其功能等同物。
4.如權利要求2所述的基因改造植物或其部分，其中所述一種或多種核苷酸序列包含序列識別號1、3和5所示的序列或者其功能等同物。
5.如上述權利要求中任一項所述的基因改造植物或其部分，其中所述植物或其部分選自包括下列的組煙草、萵苣、椰菜、蘆筍、紅球甘藍、馬鈴薯、菠菜、大黃、紅洋蔥、蔥、茄子、蘿卜、瑞士甜菜、紫羅勒、西瓜和槳果。
6.權利要求1至5中任一項所述植物的提取物，其中所述提取物含有大豆黃酮和/或其衍生物。
7.權利要求6所述的提取物，其用于藥物。
8.權利要求6所述的提取物，其用于治療和/或預防選自包括下列的一種或多種疾病骨質疏松癥；癌癥；絕經期和絕經后癥狀，包括熱潮紅、焦慮、抑郁、情緒波動、夜汗、頭痛、小便失禁；經前期綜合征，包括體液潴留、乳腺痛、痛經；心臟病；動脈粥樣硬化；高血壓；冠狀動脈痙攣；高膽固醇；阿耳茨海默氏病；認知功能損傷；炎癥，包括炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏(Crohn’s)病；和類風濕性關節炎。
9.權利要求6所述的提取物用于化妝品來處理和/或預防選自下列的一種或多種病癥陽光導致的皮膚損傷、皮膚皺紋、皮膚喪失敏感性、皮膚喪失彈性、痤瘡、發質不好和脫發。
10.權利要求6所述的提取物在食品或營養添加劑中的用途。
11.如權利要求1至5中任一項所述的基因改造植物或其部分，其用于治療和/或預防權利要求8所述的一種或多種疾病。
12.權利要求1至5中任一項所述的基因改造植物或其部分用于化妝品來處理和/或預防權利要求9所述的一種或多種病癥。
13.權利要求1至5中任一項所述的基因改造植物或其部分在食品中的用途。
14.含有權利要求1至5中任一項所述的基因改造植物或其部分的食品。
15.如權利要求14所述的食品，其選自帶包裝的什錦色拉、湯、食物涂抹品、調味汁、水果條和冰淇淋。
16.營養添加劑，其含有權利要求6所述的提取物。
17.提高植物或其部分中大豆黃酮和/或其衍生物的含量的方法，該方法包括以下步驟(I)選擇不產生異黃酮的植物，所述植物或其部分在花色苷和黃酮醇的生物合成方面活躍；(ii)對所述植物進行基因改造以提高植物或其部分的查耳酮還原酶和異黃酮合酶的活性。
18.如權利要求17所述的方法，其進一步包括對所述植物或其部分進行基因改造以提高查耳酮異構酶的活性，該酶能夠催化4，2′，4′-三羥查耳酮轉變為7，4′-二羥黃烷酮。
19.如權利要求17所述的方法，對其中所述植物進行基因改造使該植物的基因組中整合入一種或多種核苷酸序列，所述序列如序列識別號1和3所示或者是其功能等同物。
20.如權利要求18所述的方法，對其中所述植物進行基因改造使該植物的基因組中整合入一種或多種核苷酸序列，所述序列如序列識別號1、3和5所示或者是其功能等同物。
21.如權利要求17至20中任一項所述的方法，其中所述植物選自煙草、萵苣、椰菜、蘆筍、紅球甘藍、馬鈴薯、菠菜、大黃、紅洋蔥、蔥、茄子、蘿卜、瑞士甜菜、紫羅勒、西瓜和槳果，但并不局限于這些植物。
全文摘要
本發明涉及提高植物中的營養含量的研究領域，更具體地說涉及植物中的異黃酮含量。本發明還提供了提高所選擇植物中異黃酮大豆黃素含量的方法。
文檔編號A61K36/81GK1650017SQ03809573
公開日2005年8月3日 申請日期2003年2月13日 優先權日2002年2月28日
發明者S·P·科里維, R·T·多比, H·T·W·M·范德希登 申請人:荷蘭聯合利華有限公司