專利名稱：細胞分化的誘導方法
技術領域：
本發明涉及使用肽衍生物作為細胞分化誘導劑誘導細胞分化的方法，特別是它們在抗腫瘤非細胞毒性療法中的應用。
已知在大多數腫瘤細胞中分化能力的缺乏會導致無法控制的腫瘤生長。
尋找特異性與非特異性的細胞分化誘導劑因此是新穎的抗腫瘤非細胞毒性療法之一。
“細胞分化的誘導”一般是不同物質恢復(或驅動)下列因各種原因而喪失或降低的功能的能力經過正常的細胞周期、其中生物活性重要物質的合成等。
作用機理不與一種特定細胞功能有關并且能夠由若干參數導致其分化的物質或化合物可以歸屬于非特異性分化誘導劑。
通過給以類視黃醇或α-2-干擾素誘導腫瘤細胞分化的方法是已知的(Cancer Res.，40，2245-3350，1980)。
細胞分化誘導劑聚反式視黃酸(PTRA)被用作延長急性前髓細胞性白血病的誘導或緩解后療法之后的緩解的成分。受視黃酸衍生物影響的細胞分化引起腫瘤細胞生長的穩定化(Abelev G.I.Differentiationand tumor phenotype in cells of leukoses and lymphomas，TheClinical Oncohematology(ed.M.A.Volkova)，Moscow，theMeditsina publishers，2001，Chapter 11，pages 116-123)。
α-干擾素制備物在治療黑瘤中作為免疫治療劑的應用也與腫瘤細胞分化的誘導有關，其中粘連能力得到增強，抗原屬性發生改變。干擾素療法導致腫瘤生長進展減少，以及防止轉移的形成和比率(AtzpodienJ.，Kirchner H.Cancer，Cytokines and cytotoxic cellsinterleukin-2 in the immunotherapy of human neoplasms. Klin.Wochenschr，1990，v.68，pp.1-7)。
由于細胞毒性化學療法而導致造血細胞分化損傷的制備物最近已被引入到臨床實踐中。這些制備物是從骨髓制備的不同細胞因子，例如血液激素類粒細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和其他。它們在治療不同人腫瘤中的應用導致骨髓細胞的成熟加速，防止化療制備物的血液學細胞毒性(Crawford j.，Ozer H.，Stoller R.etal.Phase II of clinical investigation of GM-CSF by the patientsof SCLC with the dose-intensive the chemotherapy.The New EnglandJournal of Medicine.1991，v.325，No.3，pp.164-170)。
因而，腫瘤細胞分化的誘導是化療制備物的贅生物生長穩定化、增加免疫療法效果和糾正血液學毒性的主導機理之一。
本發明人已經發現，通式(I)肽衍生物
是細胞分化的有力誘導劑，可用作癌癥疾病非細胞毒性療法的成分，特別是黑瘤和造血組織增殖，以及血液糾正劑。
式(I)化合物
在國際申請PCT/RU98/00215中被公開為具備抗氧化、抗氣喘、抗低氧、抗炎、抗病毒、抗菌、脂質調節、抗轉移以及其他治療效果。環狀天冬氨酰-組胺和乙酰-天冬氨酰-組胺結構的化合物公開在下列著作中Kvamme，E.；Reichelt，K.L.；Edminson，P.D.；et al.N-substitutedpeptides in brain.Fed.Eur.Biochem.Society Meet.，[Proc.]，1975，41，127-136。
本發明涉及誘導細胞分化的方法，包含有效量通式(I)化合物
或其藥學上可接受的鹽作為活性成分的給藥， 其中R1是被官能團取代的C1-C3烴原子團，取代基選自氨基、C1-C5酰氨基或羧基，羧基可選地被醚化，氨基可選地被酰基取代基取代；或者同時被氨基和羧基取代的C1-C3烴原子團，氨基可選地被酰基取代基取代，羧基可選地包括在C5-C6元環狀酰亞胺中，該酰亞胺包括N-末端氨基或-CONH-基團的-NH-基團；或者被5-6元不飽和雜環基團取代的C1-C3烴原子團，烴原子團可以同時包含可選被酰基取代基取代的氨基；或者 R1是飽和的雜環基團； R2是氫原子或官能團，選自可以被醚化的羧基； R3是5-6元飽和或不飽和環狀或雜環基團，或者氨基或羧基，羧基可選地被醚化； n＝0-4，m＝1-4，k＝0-1。
在優選的實施方式中，本發明涉及細胞分化的誘導方法，包含有效量4-[N-(2-咪唑-4-基)乙基)氨甲酰基]丁酸(Dicarbamine)作為活性成分的給藥。
優選用在本發明中的通式(I)化合物是下示通式(I)化合物
更優選用在本發明中的通式(I)化合物是這樣的通式(I)化合物，其中R1＝NH2CH2-、HOOC-CH2-、CH3CONH-CH2-、CH3OCO-CH2-、
n＝0-4；k＝0-1 R2＝H，COOH，COOCH3；
最優選用在本發明中的化合物是4-[N-(2-咪唑-4-基)乙基)氨甲酰基]丁酸(Dicarbamine)。
在優選的發明實施方式中，將通式(I)肽衍生物在0.5-5.0mg/kg體重單一劑量下長期給藥。
在另一種優選的發明實施方式中，將通式(I)肽衍生物與化療聯合給藥。
優選的發明實施方式還是細胞分化的誘導方法，其中為了使惡性腫瘤生長穩定，特別是黑瘤或造血組織增殖，當化療的能力已經耗盡時，將通式(I)肽衍生物在0.5-5.0mg/kg體重單一劑量下給藥至少15天。
將通式(I)肽衍生物與免疫治療劑干擾素聯合給藥導致其關于惡性腫瘤細胞的功效增強，特別是黑瘤。
另一種優選的本發明實施方式是細胞分化的誘導方法，其中為了增強黑瘤免疫療法的功效，將通式(I)肽衍生物在0.5-5.0mg/kg體重劑量下給藥不少于15天，并且一起給以干擾素。
優選的本發明實施方式還是誘導細胞分化的方法，其中為了降低血液學毒性，在化療過程開始之前、化療期間和化療過程與下一細胞毒性療法過程之間，將通式(I)肽衍生物在0.5-5.0mg/kg體重單一劑量下每日給藥。
下面提供實施例，闡述優選的本發明實施方式。
實施例1通式(I)肽衍生物對黑瘤M-6細胞分化的活性 研究是針對體重20-22克的10-12周齡無胸腺(裸)雌性Balb/C小鼠進行的(由隸屬于N.N.Blokhin of the Russian Academy ofMedical Sciences(RAMS)的Russian Cancer Research Center(RCRC)繁殖)。預先從原始臨床材料獲得人黑瘤株，從RAMS RCRC的腫瘤株庫取得，移植給無胸腺“裸”鼠。將腫瘤用含有活性臺盼藍染劑的Versen溶液分解，皮下接種給小鼠，每只小鼠1.6百萬個細胞。
每日利用金屬探針將Dicarbamine對小鼠胃內給藥，劑量為1.0mg/kg，開始于腫瘤接種前4天，之后達10-11天(給藥過程多達15天)。在最后一次給藥后12、24和48小時內，將小鼠用乙醚麻醉處死。
在實驗中用到4組小鼠 第1組-對照，沒有Dicarbamine給藥。按照與接受Dicarbamine的組相同的期限處死小鼠。
第2組-將Dicarbamine給藥，在給藥終止后12小時內處死小鼠。
第3組-將Dicarbamine給藥，在給藥終止后24小時內處死小鼠。
第4組-將Dicarbamine給藥，在給藥終止后48小時內處死小鼠。
測定四種形態學參數，即含有色素的細胞數、具有細胞凋亡跡象(分化的能力)的細胞數、有絲分裂(增殖活動)的數量和壞死面積，以監測對照組和Dicarbamine組動物M-6黑瘤的分化和增殖程度。這些參數是動態測定的，利用作為整體跡象的一般腫瘤生長形態圖加以校正。為此，從小鼠中取出腫瘤，置于福爾馬林中，進行組織學加工，用于光學顯微鏡檢查。所得數據如表1所示。
表1 M-6黑瘤的形態學參數(光學顯微鏡檢查)參數(％)Dicarbamine撤除后所經過的時間12小時24小時48小時壞死面積對照1-22-33-5Dicarbamine給藥后6-77-98-10有絲分裂對照3-53-53-5Dicarbamine給藥后3-53-53-5編程性細胞死亡對照0.1-0.20.1-0.20.1-0.2Dicarbamine給藥后0.1-0.20.2-0.30.2-0.3含有色素的細胞對照1-21-22-3Dicarbamine給藥后2-32-43-5 所進行的研究允許發明人確定，接種給裸鼠的人黑瘤在第9天形成由多形核白細胞組成的腫瘤，生長在連續的視野中，具有顯著的基質發育。統計腫瘤中的小壞死部位，與12和24小時的處死期限(分別為1-2％和2-3％)相比，這些部位在48小時后有輕微增加(至多為切片面積的3-5％)。在全部生長階段期間，在腫瘤中觀察到3-5％的有絲分裂。細胞凋亡有輕微表現。很少見到含有色素的細胞，它們的數量在第一天不超過1-2％，僅在生長48小鼠后增加至2-3％。因而，在此期間黑素生成的強度是顯著的。所得特征可以得出結論，黑瘤是一種迅速生長的腫瘤，實際上喪失了在細胞凋亡程度基礎上、更是在黑素生成的基本功能能力基礎上的分化能力。
通過計數腫瘤切片中含有黑素的細胞數，在黑素生成強度的基礎上評估Dicarbamine對黑瘤細胞分化的效果。為此，切除小鼠中的腫瘤，置于戊二醛中，進行組織學加工，用于電子顯微鏡檢查。按照下列方程，計算所制備的切片中反映細胞分化程度的黑素生成強度指數(MGII) MGII＝NCM×NM 其中NCM是含有黑素體的細胞數； NM是每細胞中黑素體的平均數。
利用這種指數進行黑素生成分析，如表2所示。
表2 Dicarbamine給藥后黑瘤細胞中的黑素生成強度對比(電子顯微鏡檢查)參數(絕對值)Dicarbamine撤除后所經過的時間12小時24小時48小時含有黑素體的細胞數(每500個細胞)對照135.0144.0159.0Dicarbamine給藥后175.0210.0227.0每細胞中黑素體的平均數對照19.021.026.0Dicarbamine給藥后28.035.042.0MGII對照5.16.08.2Dicarbamine給藥后9.814.719.0 *從腫瘤接種后第9天開始 電子顯微鏡檢查試驗顯示，與對照相比，包含黑素體的腫瘤細胞數和每一細胞中的黑素體數由于Dicarbamine的效果而增加。不同觀察期的MGII指數如下增加12小時-1.9倍，24小時-2.4倍，48小時-2.3倍。
因而，在Dicarbamine的15天給藥過程后，M-6黑瘤腫瘤細胞分化程度平均增加2.2倍，這得到黑素生成強度(MGII指數)、包含黑素體的細胞數增加(1.3倍)和黑素體數增加(1.3倍)的支持。
實施例2Dicarbamine對所接種的人黑瘤細胞的黑素合成功能的效果 按照較高的單一劑量4.5mg/kg向如實施例1所述皮下接種人黑瘤的小鼠每日p.o.給以Dicarbamine達3周，從腫瘤移植術之時開始。
在腫瘤抑制術后3周內處死動物。處死時的腫瘤體積平均為150mm3。處死后，切除小鼠腫瘤，用Versen溶液分解，分離細胞部分，在光學顯微鏡檢查期間計算Goryaev腔中含有色素的細胞數。
所進行的研究顯示，含有黑素的細胞的對照平均數為39.14±8.72，試驗組為108.42±11.91，也就是說合成黑素的細胞數顯著(p＜0.01)增加3倍。
因而，在使用不同劑量Dicarbamine所進行的系列試驗中，在黑素生成強度的基礎上，獲得統計學上顯著的增強人黑瘤細胞分化誘導作用的效果。
數據列在表3中。
表3 由Dicarbamine誘導的人黑瘤細胞黑素生成強度腫瘤編號對照腫瘤編號試驗 含有黑素的細胞數 含有黑素的細胞數13219523521113293954424110546513063661067547111平均39.14平均108.42*標準偏差8.72標準偏差11.91 *p＜0.01 實施例3Dicarbamine對所接種的人黑瘤Me1-6生長動力學的效果 研究是針對體重20-22克的10-12周齡無胸腺(裸)雌性Balb/C小鼠進行的(由隸屬于RAMS的RCRC繁殖)。預先從原始臨床材料獲得人黑瘤株Me1-6，從RAMS RCRC的腫瘤株庫取得，移植給無胸腺“裸”鼠。
向兩組小鼠每日p.o.給以單一劑量1.5mg/kg和4.5mg/kg的Dicarbamine達3周，從腫瘤發育之時開始從腫瘤移植術后第15天至36天)。
在移植術后第18、25、33、39、46和53天進行腫瘤的測量。在腫瘤生長動力學的基礎上評估8周Dicarbamine的效果，按照下式計算腫瘤體積“V” V＝π*L*s*h(mm3) 其中L是長度的mm數，s是寬度的mm數，h是高度的mm數。
然后計算腫瘤體積之間的比例Vt/Vt-1，以百分比表示，按照Student法進行統計學處理，以計算統計學上的顯著性差異。所得數據如表4所示。
所得數據顯示，與對照相比，最大腫瘤質量增益延遲了7天。與對照組相比，接受單一劑量4.5mg/kg Dicarbamine的小鼠組移植術后第25天相當于45mg/kg Dicarbamine給藥10天，此時見到腫瘤生長速率有統計學上的顯著性差異。這組的平均腫瘤體積增加了166.0±93.0％，而對照組中該參數為329.0±88.9％(p＜0.015)。
實施例4Dicarbamine與化療的組合對接種移植給無胸腺小鼠的人M-6黑瘤生長的效果 按照實施例3所述技術進行研究。將Dicarbamine按照單一劑量4.5mg/kg每日p.o.給藥3周，從腫瘤出現之時開始(從第15天至第36天)。在聯合治療組中，也將Dicarbamine按照單一劑量4.5mg/kg每日給藥3周(第15天至第36天)，聯合由抗腫瘤細胞抑制劑順鉑6mg/kgi.v.(第25天)和Aranoza 40mg/kgi.p.(第27天)的單一給藥。細胞抑制療法開始于平均腫瘤體積為200±62mm3之時。在移植術后第18、25、33、39、46和53天，測量腫瘤體積，計算Vt/Vt-1值，以百分比表示。所得數據如表5所示。
表5 抗腫瘤細胞抑制劑與Dicarbamine的化療組合對人M-6黑瘤生長動力學的效果小鼠組別治療方案腫瘤接種后不同天數的M±m(％)劑量(mg/kg)單次/療程給藥天數25天33天39天46天53天對照生理鹽水p.o.15-36329.0±88.9132.9±57.321.9±2.610.5±8.13.8±10.3順鉑Aranoza6mg/kg i.v.25413.0±276.0177.0±46.062.04±30.121.2±18.718.2±12.740mg/kg i.p.27Dicarbamine4.5/94.5mg/kgp.o.15-36166.0±93.0**276.0±104.039.8±27.319.6±17.54.2±22.5Dicarbamine順鉑Aranoza4.5/94.5mg/kgp.o.*15-36182.0±60.0**191.0±71.024.5±17.428.7±9.88.0±30.66mg/kg i.v.2540mg/kg i.p.27 *-每日；**-p＜0.05 從所列數據可以看出，Dicarbamine在所用給藥途徑中在最初階段延緩腫瘤生長，第25天的腫瘤質量增益為166.0±93.0％，比對照組的增益329.0±88.9％減少了。因而，再現了Dicarbamine對黑瘤生長的效果結果(見實施例3)。Aranoza與順鉑的聯合化療在所示制度中似乎是無效的，也就是說腫瘤增益在此期限高于對照值(413.0±276.0％)。這證實了所用Me1-6人黑瘤株對給定化療方案不存在敏感性。向該無效的化療方案引入Dicarbamine導致腫瘤質量增益在第25天有統計學上的顯著性(p＜0.05)減少，為182.0±60.0％，這證實了它在沒有化療效果存在下的情況下的功效。
實施例5當干擾素給藥時通式(I)肽衍生物對黑瘤細胞增殖能力的效果 研究了Dicarbamine以及α-干擾素(Introne，IN)對黑瘤細胞增殖能力的效果。應當注意，Dicarbamine本身能夠延緩黑瘤細胞的增殖活動，而不改變它們的存活。
研究是針對在組織培養物中以單層方式生長的兩種連續細胞培養物進行的，即鼠B-16黑瘤細胞和人M-5黑瘤細胞。IN的給藥濃度為70-700IU/ml。將Dicarbamine(D)轉移至儲備溶液中(1.000μM)，通過0.22μM孔徑濾器除菌，然后稀釋至0.01和1.0μM濃度。
在初始細胞增殖速率(IRCP)的基礎上評估制備物對細胞的效果。該指數(IRCP)通常被稱為集落速率生長，是這樣測定的，計數“試驗”皿(含有制備物)和“對照”皿(沒有制備物)中感染后前幾天期間微集落中的細胞數，分析其中的50個集落。每一“點”包括不少于三個含有生長中的細胞集落的Petri皿，其中加入特定濃度的研究用制備物。按照下式計算集落的生長速率(％) (試驗皿中細胞數/集落(平均值)-1)/(對照皿中細胞數/集落-1)×100％ 計算每“點”的微集落中的細胞數。根據“試驗”皿與“對照”皿之間所生長的集落數之比測定細胞存活率，借助細胞存活率判斷制備物在選定濃度范圍內的毒性。試驗結果如表6所示。
表6 Dicarbamine和α-干擾素對鼠B-16黑瘤和人M-5黑瘤細胞增殖活動的效果制備物IN濃度IU/ml與制備物接觸下列期限時的初始細胞增殖速率(相對于對照而言的％細胞/集落)48小時72小時96小時無D0.01μM D1.0μM D無D0.01μM D1.0μM D無D0.01μM D1.0μM DM-5的對照100.084.269.0100.073.650.0100.070.249.1IN7.0111.379.154.794.849.136.973.046.933.370.053.740.530.751.934.924.548.831.723.9B-16的對照100.052.944.6100.061.043.6---IN70.0---50.2-26.1---700.038.024.921.529.822.016.0 從上表可以看到，在M-5黑瘤的對照中，IRCP指數保持在100％的水平達96小時。
在加入7.0IU/mlα-干擾素的M-5細胞樣本中，IRCP指數在48小時增加至111.3％，在76和96小時僅分別減慢至94.8和73.0％。當加入70IU/mlα-干擾素時，IRCP指數在48小時減慢至53.7％，在72小時減慢至51.9％，在96小時減慢至48.8％。也就是說，70IU/mlα-干擾素的最大抑制效果達到50％IRCP。
當加入0.01μM Dicarbamine時，IRCP指數在48小時減慢至82.4％，在72小時減慢至73.6％，在96小時減慢至70.2％，當加入1μMDicarbamine時，IRCP指數在48小時減慢至69.0％，在72小時減慢至50.0％。
因而，Dicarbamine的最大抑制效果也達到IRCP的50％，這是在1.0μM制備物濃度下獲得的。
在B-16黑瘤試驗中，當加入70IU/mlα-干擾素時，IRCP指數在72小時減慢至50.0％，當加入兩種所示濃度的Dicarbamine時，IRCP指數在48小時分別減慢至52.9和44.6％，在72小時分別減慢至61.0和44.6％。僅當加入700IU/mlα-干擾素時，IRCP指數才顯著減少至38.0和29.8％。。
因而，所進行的試驗顯示，α-干擾素和Dicarbamine抑制M-5黑瘤和B-16黑瘤細胞生長的水平為40.0-50.0％，這是分化誘導劑所特有的。僅在α-干擾素濃度增加100倍的情況下才獲得更強的對IRCP指數的效果。
向M-5細胞聯合加入70.0IU/mlα-干擾素和Dicarbamine顯示，在所有情況下IRCP指數在所記錄的期限分別降低至30.7-24.0-31.0％。當聯合使用700IU/mlα-干擾素和兩種濃度Dicarbamine時，獲得最強的對B-16黑瘤的效果IRCP指數在48小時分別降低至24.9和29.8％，在72小時分別降低至22.0和16.0％。
因而，Dicarbamine類似于α-干擾素減緩鼠B-16黑瘤和人M-5黑瘤細胞增殖，不顯示毒性(根據存活指數)。正如所給出的實施例所示，Dicarbamine的效果是分化誘導劑所特有的，與已知分化誘導劑α-干擾素的組合對黑瘤細胞具有加和特征。這種效果導致腫瘤生長抑制作用的強化，是提高黑瘤免疫療法功效的象征。
5.2肽衍生物對黑瘤細胞增殖能力的效果 研究是針對在組織培養物中以單層方式生長的鼠B-16黑瘤的連續細胞培養物進行的。選擇α-干擾素作為對比制備物，給藥濃度為70IU/ml。
將供試化合物轉移至儲備溶液中(1,000μM)，通過0.22μm孔徑濾器除菌，然后稀釋至100μM濃度。
在初始細胞增殖速率(IRCP)的基礎上評估化合物對細胞的效果。該指數是這樣測定的，計數“試驗”皿(含有制備物)和“對照”皿(沒有制備物)中感染后前幾天期間微集落中的細胞數，分析其中的50個集落。
按照下式計算集落的生長速率(％) (試驗皿中細胞數/集落(平均值)-1)/(對照皿中細胞數/集落-1)×100％ 計算每“點”的微集落中的細胞數。根據“試驗”皿與“對照”皿之間所生長的集落數之比測定B-16細胞存活率，借助細胞存活率判斷毒性。試驗結果如表7所示。
表7 100μM肽衍生物和70IU/ml α-干擾素對鼠B-16黑瘤細胞增殖活動的效果化合物與制備物接觸下列期限時的初始細胞增殖速率(相對于對照而言的％細胞/集落)48小時72小時對照2.52＝100％3.49＝100％干擾素29.6+2.327.4±2.1Dicarbamine30.8±2.828.2±2.2126.6±2.726.6±2.8225.5±1.925.5±1.7335.6+2.935.6±2.9438.3±3.538.3+3.5532.4±2.632.4±2.3629.3±2.729.3+2.2738.8+2.738.8±2.8821.4±1.516.9±0.9927.1±1.717.2±1.31035.9±3.623.1±1.61121.5±1.920.7±1.81228.7+2.120.3±1.91344.9±4.018.9±1.41433.8±3.519.9±1.81539.7+2.529.8+2.31641.3±4.028.9+2.51739.7+2.126.6±2.11842±339±31921±141±52044+342+42142±428±2 與對照的差異是顯著的(p＜0.01)。
表7所列數據顯示，肽衍生物抑制B-16黑瘤細胞集落生長的水平為50.0-70.0％，這是分化誘導劑所特有的。
實施例6在Dicarbamine給藥后不同期限腫瘤細胞的細胞周期分布 試驗是針對所接種的B-16黑瘤進行的。在制備物給藥后不同期限DNA含量的基礎上研究Dicarbamine對腫瘤細胞分布的效果。從腫瘤接種后第6天開始歷時10天，每日向小鼠胃內給以0.5mg/kgDicarbamine。在接種后第10、12、16和18天，也就是分別在Dicarbamine給藥后第5和7天以及在Dicarbamine 10-天給藥終止后第2和4天，處死動物，用于隨后的腫瘤材料研究。
試驗結果顯示，Dicarbamine導致分裂間期腫瘤細胞比例(IIG1)的顯著增加(≈25％)。在恒定的增殖中細胞比例(≈30％)中，注意到IIG2細胞比例有所增加(12-14％)。因此，正常基質細胞(IG1)在樣本中的比例代償性降低。所述變化在5-10次Dicarbamine給藥后最突出。
Dicarbamine的過程給藥導致腫瘤細胞群的動態重排。注意到合成周期(S-相)細胞的抑制作用伴有準備增殖的細胞或增殖中細胞(G2相)的比例的代償性降低。同時發生腫瘤細胞在固定相G1中的蓄積。
通過降低增殖活動水平，Dicarbamine促進細胞在固定(非增殖)細胞周期中的蓄積。它能夠延緩腫瘤生長，促進細胞向更加分化狀態的轉變。
實施例7Dicarbamine關于環磷酰胺及其與順鉑和卡鉑組合的血液學毒性的功效 針對第一代雄性小鼠雜交體F1(CBA×C57BI)研究Dicarbamine的血液矯正效果。
7.1使用4組動物研究Dicarbamine對環磷酰胺(CPH)血液學毒性的效果 第1組-每日0.5mg/kg Dicarbamine，開始于CPH給藥前5天直至200mg/kg CPH單一給藥后5天； 第2組-200mg/kg CPH單一給藥； 第3組-完整的對照； 第4組-每日0.5mg/kg Dicarbamine，歷時10天。所得數據如表8所示。
表8 在環磷酰胺和環磷酰胺與Dicarbamine作用下小鼠外周血中的總白細胞數組 環磷酰胺給藥后不同天數的總白細胞數(以千個/mm3計)3 571013172112.80±0.22 7,96±1.1013.38±1.5411.88±1.9213.30+1.4812.40±1.7612.90±2.6021.06±0.44 4.38±0.7710.50±3.026.44±0.6012.20±3.0212.20±1.8011.86±1.32316.50±8.20 16.10±3.2014.80±3.3015.80±1.9014.90±2.7016.90±4.7014.70±2.80415.70±4.30 15.30±7.8017.30±5.1015.70±3.8012.50±3.5217.80±4.7016.30±3.90 所得數據顯示，Dicarbamine與CPH的聯合使用減少后者的血液毒性效果，加速恢復血液參數。
7.2在研究Dicarbamine對CPH與鉑衍生物組合的血液毒性作用的效果時，每日將Dicarbamine向小鼠胃內給藥20天，單一劑量為0.5mg/kg。在從開始Dicarbamine給藥過程第5天，將細胞抑制性制備物腹膜內給藥一次。細胞抑制性制備物的劑量如表10和11所示。
研究Dicarbamine當聯合CPH和順鉑或卡鉑給藥對小鼠外周血白細胞數的效果的結果分別如表9和10所示。
表9 Dicarbamine對環磷酰胺與順鉑組合的血液毒性的效果細胞抑制性制備物Cdtistaticpreparation劑量(mg/kg)細胞抑制性制備物給藥后不同天數的總白細胞數(以千個/mm3計)死亡期限(天)035721DicarbamineCPH順鉑200811.30±2.302.32±0.496.60±0.9010.40±1.5412.30±1.568；16CPH順鉑200811.30±2.301.20±0.334.32±0.776.24±1.1510.80±1.023；4；7DicarbamineCPH順鉑100411.30±2.304.14±0.6011.40±1.1014.90±1.3211.80±1.32noCPH順鉑100411.3±2.32.65±0.664.74±0.668.05±0.8812.0±1.4DicarbamineCPH順鉑50211.30±2.306,70±1.1517.00±5.1714.50±2.0012.40±0.99noCPH順鉑5021.30±2.304.04±0.777.62±0.998.72±1.1513.10±1.54no 所列數據顯示，在第5天，在接受最大劑量細胞抑制性制備物以及Dicarbamine的小鼠組中，白細胞數已經達到比生理學標準的下限，在第7天，實際上恢復至原始水平。僅就試驗的21天而言，沒有觀察到Dicarbamine恢復。在接受最大劑量細胞抑制性制備物而無Dicarbamine的小鼠中，注意到在試驗的第3、4和7天有動物死亡。在接受最大劑量細胞抑制性制備物以及Dicarbamine的動物中，注意到僅在第8和16天有被延遲了的死亡。
表10 Dicarbamine對環磷酰胺與卡鉑組合的血液毒性的效果細胞抑制性制備物Cytostaticpreparation劑量(mg/kg)細胞抑制性制備物給藥后不同天數的總白細胞數(以千個/mm3計)死亡期限(天)035721DicarbamineCPH順鉑2003011.50±2.803.10±0.7012.80±1.3715.30±1.2612.30±0.8910CPH順鉑2003011.30±2.301.18±0.494.60±0.607.54±0.7712.60±1.283DicarbamineCPH順鉑1001511.50±2.804.04±0.4410.40±1.5914.80±1.7611.80±1.34noCPH順鉑1001511.30±2.302.74±0.496.48±0.6010.50±1.3813.20±1.50noDicarbamineCPH順鉑507.511.30±2.306.60±0.7710.90±1.2111.20±1.2010.90±1.28noCPH順鉑50211.50±2.803.94±1.048.72±1.9810.80±2.4011.20+0.99no 所列數據(表10)顯示，在使用Dicarbamine以及致死劑量卡鉑和環磷烷的情況下，外周血中的白細胞數和動物死亡的期限與表9所列數據相似。
因而，當使用致死劑量的細胞抑制性制備物時，Dicarbamine在全部所研究的過程中抑制白細胞減少癥的形成，它加速恢復總白細胞數，延遲小鼠死亡的期限。
7.3在研究通式(I)肽衍生物對CPH與卡鉑組合的血液學毒性作用的效果時，將化合物每日向小鼠胃內給藥10天，劑量為0.5mg/kg。在供試化合物給藥開始后第5天，向小鼠腹膜內注射200mg/kg CPH和單一劑量15mg/kg卡鉑。然后，繼續5天供試化合物的給藥。
在供試化合物開始給藥之前，從小鼠尾巴抽取血液，計算總白細胞數。在環磷酰胺與卡鉑給藥后第3、5和7天，也樅小鼠尾巴抽取血液，計算總白細胞數。每組包括15只動物。
作為對照組，小鼠僅接受細胞抑制性制備物。
表11所列數據顯示通式(I)肽衍生物抑制白細胞減少癥的形成，加速恢復總白細胞數。
表11 通式(I)肽衍生物對環磷酰胺與卡鉑組合的血液學毒性作用的效果化合物編號在細胞抑制性制備物給藥后不同天數的外周血中總白細胞數(以千個/mm3計)0 357113,3±3,5 3.3±1.0*10.0±1.3*11.6±2.5*213.8±3.5 3.18±0.82*9.1±0.5*11.9±2.5*315.5±3.2 4.18±2.019.2±1.917.5±1.7*415.3±2.7 3.02±0.839.62±3.8416.1±0.15512.1±1.4 2.1±1.0410.5±2.0815.26±1.23614.2+1.1 3.04+1.6114.56+2.6525.68+3.1*713.7±1.1 3.14±0.6213.7±0.5716.58+2.9812.9+2.5 3.98±0.7810.8±0.5716.16±0.85913.2±3.0 5.04+0.20*8.64±1.9719.38+1.81012.9±1.9 5.18±1.97*19.76±3.22*21.82±3.74*1114.8±2.3 3.32±1.310.28±1.3517.56+2.61212.8±0.8 3.56±0.1220.66±3.7*17.4+2.81314,9±0,6 2.66±0.2125.7±4.1*32.1±4.87*1413.8±0.5 2.66±0.2316.24+2.328.9±3.65*1512.7±0.7 3.76±0.1426.4±5.8*27.6±4.12*1612.6±0.6 3.9±0.2315.44±1.324.9±4.31*1713.4±0.8 3.36±0.2717.6±3.126.1±3.97*CPH+C16.1±3.5 1.14±0.554.31±1.38.3±0.58 *顯著性p≤0.05 7.4Dicarbamine對細胞分化的效果得到在環磷酰胺與Dicarbamine組合的影響下與單獨給以Dicarbamine相比小鼠外周血微分數研究的支持。
使用兩組小鼠。第一組給以Dicarbamine，在CPH給藥之前5天的劑量為0.5mg/kg，在CPH給藥之后5天的劑量為200mg/kg。第二組小鼠給以單獨的CPH，劑量為200mg/kg。研究結果如表12和13所示。
表12和13所列數據顯示，由于成熟形式的爆發而發生回收外周血，這確認了Dicarbamine的分化效果。尤其在第3和5天根據外周血數和骨髓細胞構成見到這一點(表12和13)。在Dicarbamine組中，外周血缺乏髓細胞和嗜中性白細胞，在沒有Dicarbamine的組中，存在這些構成要素(表12)。
實施例8受肽衍生物影響，皮下接種的小鼠Friend成紅細胞增多(FEB)的速率和尺寸的減少 研究是針對雄性小鼠雜交體100BDF1進行的，將動物分組，每組10只小鼠。使用直系DBA2小鼠用于體內繼代移植FEB。
從隸屬于RAMS N.N.Blokhin的GU RCRC腫瘤株庫獲得Friend成紅細胞增多株，使用3-8代皮下接種物腹膜內繼代移植兩次。使用1×106個細胞的0.3ml 1999培養基懸液進行Thr接種。
利用探針，將供試化合物的溶液每日向小鼠胃內給藥，從腫瘤接種后第3天至第7天。
在腫瘤生長抑制率(TGI，％)和平均壽命(ALS)的基礎上評估治療功效。借助普遍接受的標準T/C(％)測定壽命的增加，它是試驗組與對照組ALS之比。在平均腫瘤體積變化動力學的基礎上計算腫瘤生長速率Vt/V1。
關于肽衍生物對腫瘤大小和腫瘤生長速率的效果的研究數據分別如表14和15所示。
所得結果顯示，肽衍生物導致皮下接種的FEB的生長抑制，直至療法終止后19天。所述效果開始于在單一劑量1.5mg/kg化合物給藥終止后不久，直至第13天仍保持顯著水平(p＜0.05)。腫瘤生長速率在撤除化合物后一周期間變得穩定。
從所進行的研究可以確定，通式(I)化合物對FEB皮下結節的形成具備抑制效果。從所得數據可以認為供試化合物可用于人造血組織增殖的治療。
實施例9Dicarbamine和2α-干擾素(Reaferon)對Friend成紅細胞增多腫瘤細胞的效果 經由脾細胞皮下接種給DBA2雌性小鼠，研究Friend成紅細胞增多。
進行4組試驗。
第1組-沒有治療的對照動物，給以生理鹽水； 第2組-每日s.c.給以100千IU/kg Reaferon，從接種后第3天至第7天； 第3組-p.o.給以單一劑量4.5mg/kg Dicarbamine，從接種后第3天至第7天； 第4組-按照相似的方案同時給以Dicarbamine和Reaferon。
在治療終止或生理鹽水給藥終止后第3、7和14天處死動物，獲取光學顯微鏡檢查用材料，在第7和14天獲取電子顯微鏡檢查用材料。
就組織學檢查而言，將腫瘤塊固定在10％中性福爾馬林中，包埋到石蠟中；將所得切片用蘇木精-曙紅染色，利用高碘酸Schiff反應檢查糖原(多糖)含量，根據Brachet檢查RNA含量，還檢查脂質和鐵。在Polivar光學顯微鏡(Austria)中進行切片的觀察和照相。
就電子顯微鏡檢查而言，將腫瘤塊固定在2.5％戊二醛溶液和1％四氧化鋨中，包埋到EPON-812中。在LKB-III ultratome(Sweden)上制備semi-thick和ultra-sick切片。將所得semi-sick切片用甲苯胺藍染色，在光學顯微鏡中進行觀察。將ultra-sick切片另外用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色；在JEOL 1200 EX-II電子顯微鏡(Japan)中進行切片的觀察和照相。
在電子顯微鏡檢查期間計算不同類型細胞(胚細胞、淋巴細胞和粒性白細胞)的分化百分比，用于定量評估。
在組織學檢查期間評估細胞有絲分裂和細胞凋亡百分比以及壞死面積。
組織學檢查 第1組沒有治療的對照動物 組織學檢查發現，腫瘤細胞是大的、多形的，它們的核是明亮的，細胞質是適度發育的。細胞大小偶爾有波動，統計個別較小的細胞，但是大細胞代表了細胞的主體。
腫瘤細胞連續向外生長。在個別腫瘤中，統計包圍腫瘤細胞保留區域的壞死部位。壞死面積沒有超過切片表面的10-15％。
在大多數腫瘤細胞中，RNA的Brachet反應明顯突出，很少微弱或不存在(在個別小細胞中)。
高碘酸Schiff反應具有擴散特性，與鐵的反應僅在個別細胞中呈陽性。
在大細胞中的腫瘤中，統計有絲分裂(多達1-1.5％)和具有細胞凋亡跡象的細胞(多達0.5％)。
隨著腫瘤生長，壞死面積增加至切片表面的20-30％，有絲分裂的數量增加(多達1.5-2％)，細胞凋亡活動沒有變化。大型多形細胞的數量在所有期限下都顯著占優勢。
第2組Reaferon給藥 腫瘤具有通常的組織結構。正如對照組，在大型多形細胞中見到較小的具有深染色核的細胞。
第14天，壞死面積為切片表面的40-50％，有絲分裂活動為0.5-1％，第7天，細胞凋亡增加至1-2％，但是第14天降低至1-1.5％。
第3組Dicarbamine給藥 注意到具有深染色核的小腫瘤細胞數量有所增加。大型多形細胞數量顯著占優勢。與第1組圖形相比，壞死面積沒有顯著變化。有絲分裂活動也停留在對照圖形的限度內。在第3和7天，細胞凋亡的比率顯著降低(第7天降至0.1＝0.5％)。
第4組Dicarbamine與Reaferon的同時給藥 與第2組的變化相比，壞死面積和有絲分裂活動沒有顯示顯著的變化。第3天，細胞凋亡降低至0.2-0.5％，在第7和14天為0.5％(同對照)。
胚型大型多形細胞在腫瘤中顯著占優勢。
電子顯微鏡檢查 第1組沒有治療的對照動物 在電子顯微鏡檢查期間，在腫瘤中主要見到胚型大型多形低分化細胞。這些細胞中的核為圓形或者略微不規則的形狀，偶爾有不平坦的表面。在其中通常見到染色質的擴散分布，注意到僅有一些生成位于邊緣的異染色質。核通常占據細胞質的大部分，其中核糖體、單線粒體、偶爾還有略微粗糙的內質網結構占優勢。胚細胞占全部腫瘤群的90-95％。
除了胚細胞以外，還統計不同成熟程度的淋巴細胞，即成淋巴細胞、淋巴細胞(大、中、小)。這些細胞中的核是圓形的、卵形的，經常具有不平坦的表面，它們包含大量蓄積方式的異染色質，統計核仁。細胞質是適度發育的，它包含大量核糖體；幾乎沒有其他細胞器，偶爾統計有密集的顆粒。
粒性白細胞具有嗜中性白細胞的小顆粒特征，嗜曙紅細胞在細胞質中不太常見。細胞中的核是有節段的或者具有深的凹陷。偶爾能夠見到在細胞質中具有顆粒的細胞、不規則的核和伸出的胞質膜(單核細胞)。在腫瘤中統計到自由移動的紅細胞。
腫瘤中主要是大型胚細胞占優勢(多達90-95％)。據統計淋巴樣細胞在4-8％范圍內，粒細胞占1-2％。
在移入后隨著腫瘤生長，注意到不同細胞類型之間的比例沒有顯著變化。
第2組Reaferon給藥 不同類型腫瘤細胞的一般超微結構得以保留。
大型胚細胞的數量沒有降低，淋巴樣細胞占到4-8％，粒性白細胞占到1-2％。在腫瘤中存在個別的紅細胞。
第3組Dicarbamine給藥 不同類型腫瘤細胞的超微結構仍然跟以前一樣。它們的數量比例變化和分化水平多少有所升高。大型胚型細胞的數量降低至70-80％，淋巴細胞和粒細胞的數量分別增加至18-25％和2-5％。在腫瘤中存在個別的紅細胞。
在處置終止后第7天統計最常見的變化。
第4組Reaferon和Dicarbamine給藥 不同類型腫瘤細胞的超微結構實際上相當于上述(見第1組)。
大型胚型細胞的數量在70-80％范圍內波動。淋巴細胞的數量達到18-25％，白細胞的數量停留在2-5％的水平。在其他細胞中統計有紅細胞。
如同前面幾組，所見到的變化在第7天最突出。
因而，每日向Friend成紅細胞增多小鼠口服給以4.5mg/kgDicarbamine 5天確實導致不成熟腫瘤細胞主要向形成粒細胞以及紅細胞樣譜系細胞方向分化。
與對照動物的腫瘤相比，當使用Dicarbamine時，不成熟腫瘤細胞的數量從90-95％降低至70-80％，也就是降低了15-20％，淋巴細胞的數量從4-8增加至18-25％，也就是增加了4倍。
粒細胞譜系細胞的數量也有不太顯著的增加(從1-2％至約2-5％)。
應當注意到，在處置終止后第7天見到最常見的變化。在處置終止后第14天，這些變化變得穩定。
100千IU/kg Reaferon皮下給藥5天導致腫瘤壞死面積增加在處置終止后第7天從對照組的15-20％至試驗組的40-50％，在第14天從20-30％至40-50％)。有絲分裂的比率多少有所減少(從1.5-2％至0.5-1％)，具有細胞凋亡跡象的細胞的數量有所增加(在處置終止后第7天從0.5％至1-2％)。腫瘤細胞的分化實際上沒有變化。
在Dicarbamine和Reaferon在相同劑量和相同期限下同時給藥中，見到每種制備物效果的總和。觀察到單獨Dicarbamine所特有的增強不成熟胚細胞分化的效果，以及在給以單獨Reaferon所見到的壞死面積增加和有絲分裂數量減少。
因而，已經確認，Dicarbamine能夠增強Friend成紅細胞增多的不成熟腫瘤造血細胞向不同方向的分化，特別是形成淋巴樣和髓樣譜系腫瘤細胞。
Dicarbamine對細胞分化的效果代表了它的一般性質，正如前面在黑瘤研究實施例中所觀察到的。
實施例10Dicarbamine在化療期間關于卵巢癌患者骨髓與外周血造血細胞的保護效果的電子顯微鏡檢查 在以前涉及Dicarbamine對骨髓作用機理的研究中，發現所給定的制備物在試驗條件下通過減少正常造血細胞的細胞凋亡，保護動物骨髓免于環磷酰胺的不利細胞毒性效果。
針對10名III-IV期卵巢癌患者的骨髓穿刺活組織檢查樣本和外周血也獲得相似的數據。
將患者分為相等的兩組第I組-患者接受單獨的化療，第II組-患者接受化療以及Dicarbamine給藥。
第I和II組患者在療法第一天接受600mg/m2環磷酰胺和400mg/m2卡鉑；重復該療程，間隔3-4周。一名患者的化療過程平均包括6個沒有Dicarbamine的療程和5.7個伴有Dicarbamine的療程。
第II組患者接受化療以及Dicarbamine，按照單一劑量100mg給藥，開始于第一療程前5天，然后直至相同劑量下一療程的開始。在兩個療程之間使用Dicarbamine的持續時間平均為24.5天。平均總劑量為2.5克。
在化療開始之前和伴有或沒有Dicarbamine的療程結束時采集患者的穿刺活組織檢查用骨髓和電子顯微鏡檢查用外周血。
將新鮮的骨髓穿刺活組織檢查樣本放置在載物板上，用攪拌桿攪拌多次，直至獲得小的密集的片段。將后者固定在2.5％戊二醛溶液中，另外固定在1％四氧化鋨溶液中；用pH7.4磷酸鹽緩沖液洗滌后，在遞增濃度的醇中脫水，包埋到環氧樹脂EPON-812的混合物中。在LKB-IIIultratome(Sweden)上制備semi-thick和ultra-sick切片。將semi-sick切片用亞甲基或甲苯胺藍染色，使ultra-sick切片與乙酸雙氧鈾與檸檬酸鉛的水溶液對比。
將包含肝素的外周血在3,000rpm下離心1小時。然后在表面上倒上2.5％戊二醛溶液，成膜10-15分鐘，除去膜，然后如上所述進行處理。
在光學顯微鏡Polivar(Austria)中觀察薄切片，在電子顯微鏡JEOL-1200-CX-11(Japan)中觀察半薄切片。
1、在化療和Dicarbamine給藥開始之前的對照研究-第I和II組患者 在骨髓穿刺活組織檢查中見到不同成熟程度和分化方向的造血細胞，一部分細胞具有空泡形成和營養不良的跡象。
存在大型的未分化胚細胞，具有狹窄的細胞質邊緣，主要包含核糖體。在這些細胞中，具有擴散性染色質和個別核仁的圓形-卵形核占據細胞質的主要部分。
一部分細胞以不同的類型和分化程度向白細胞的粒細胞譜系分化。
見到具有圓形-卵形核的前髓細胞與髓細胞，細胞質中的擴散性染色質包含不同量的特殊顆粒。紅細胞和更成熟的粒細胞經常位于這些細胞周圍。
經常見到更加分化的粒細胞，即帶狀嗜中性白細胞和節段性嗜中性白細胞。在它們的細胞質中存在嗜中性白細胞、嗜曙紅細胞和嗜堿細胞所特有的不同類型特殊顆粒。
不同分化程度(小、中、大-成淋巴細胞的)淋巴樣細胞排列在粒細胞中。
統計有多種成熟紅細胞，經常具有不同的形狀，以及正成紅細胞，包含核和血小板。
2、環磷烷和卡鉑化療后的骨髓-第I組 在不同類型的保守性造血細胞(粒細胞、淋巴細胞、正常紅細胞、紅細胞、血小板)中，在化療過程之后采集的骨髓穿刺活組織檢查樣本中統計有營養不良和低度成熟的跡象。
在胚細胞的細胞質中含有核糖體，它經常形成空泡。核是大的，具有擴散的染色質或異染色質的蓄積，偶爾有不規則的形狀，具有向內突出的部位。
前髓細胞和髓細胞中特殊顆粒的數量是不顯著的，細胞質經常具有突出的營養不良性改變。
在帶型和節段型的保守性粒細胞中，也觀察到營養不良性改變和不顯著量的特殊顆粒。這些顆粒也經常發生營養不良性改變和形成空泡。
保守性正成紅細胞經常是不規則形狀的，具有細胞質的過程和設計。
應當注意到，在穿刺骨髓活組織檢查樣本中，尤其在粒細胞中，統計有具有細胞凋亡跡象的細胞。在這類細胞中，注意到異染色質的著邊、核與細胞質片段化的跡象核細胞凋亡體的生成。
3、環磷烷和卡鉑化療以及Dicarbamine給藥之后的骨髓-第II組 在經歷化療以及Dicarbamine給藥的患者的穿刺骨髓活組織檢查中，統計不同分化程度與類型的造血細胞(粒細胞、淋巴細胞、血小板、正成紅細胞)。
胚型細胞是大的，它們含有圓形的核，具有擴散性染色質和個別的核仁，它們的細胞質是狹窄的，在其中見到核糖體、個別的線粒體和偶爾的單一原始密集顆粒。
存在很多前髓細胞和髓細胞，包含圓形或卵形的核，具有擴散性或凝聚性染色質；它們的細胞質包含相當大量的特殊顆粒，既有原始的(黑暗者)，也有不太成熟的(更加成熟者)。
還經常統計有帶狀和節段狀白細胞。它們具有凹陷的(豌豆樣)或有節段的核，在它們的細胞質中有豐富的主要為嗜中性白細胞類型的特殊顆粒，不太常見具有結晶樣結構的嗜曙紅細胞類型。
細胞質中，不同分化程度的淋巴細胞包含線粒體、粗內質網結構、偶爾有單一顆粒形式的單一包涵物。
粒細胞類型的細胞、淋巴細胞經常構成致密的蓄積。
與紅細胞一起，統計有不同分化程度和相對普通形狀的正成紅細胞。
極少統計有具有細胞凋亡跡象的細胞。
在研究外周血造血細胞時，見到與以前關于骨髓要素所述相同的組成規律。
在聯合化療(環磷酰胺+卡鉑)之前與之后和化療以及Dicarbamine給藥期間對卵巢癌患者所進行的骨髓與外周血造血細胞的對比電子顯微鏡檢查確立了免于所用制備物細胞毒性影響的保護效果機理。
研究顯示，用在本項工作中的化療制備物對粒細胞、淋巴樣細胞和紅細胞樣譜系的不同造血細胞類型發揮突出的細胞毒性效果。
這種細胞毒性效果以細胞質營養不良性改變和在骨髓細胞(和分別外周血)中發育的特殊顆粒死亡的形式表示。
所述障礙尤其涉及早期分化節段的粒細胞，在更低程度上還涉及淋巴樣細胞，也就是胚細胞、前髓細胞、髓細胞、成淋巴細胞的生成，它們牽涉紅細胞樣譜系，以及導致造血細胞的功能性分化形式的不充分蓄積。
進而發現，在粒細胞譜系要素中，遺傳性編程性細胞死亡、即細胞凋亡增強了。
營養不良變化和細胞凋亡一般導致白細胞減少、中性白細胞減少、血小板減少和其他造血狀態障礙的形成和有限的化療能力。
基于所進行的研究，確認Dicarbamine保護骨髓(分別和外周血)造血細胞免于所用化療制備物的細胞毒性效果，促進年輕形式向成熟細胞要素的分化，和減少細胞凋亡事件。
作為所發現的Dicarbamine效果的結果，在化療期間的患者的骨髓中，發生年輕(胚)型造血細胞的蓄積，尤其重要的是，它們向功能性形式的分化增強了。
因而，在化療條件下，刺激骨髓造血細胞、尤其是粒細胞譜系細胞的分化，和防止細胞凋亡的生長，是Dicarbamine的保護效果機理。
實施例11Dicarbamine關于減少卵巢癌化療血液學毒性的功效 在13名III-IV期卵巢癌患者中研究Dicarbamine的效果，他們按照下列方案經歷77個化療過程400mg/m2卡鉑i.v.逐滴一次+600mg/m2環磷烷i.v.逐滴一次；在28天中重復這些過程。每日飯后口服給以100mg Dicarbamine，開始于第一過程之前5天，然后持續三周。給藥的持續時間為26天，療程劑量為2600mg。在第二化療過程之前5天再次給以Dicarbamine，給藥持續21天。在兩個化療過程期間Dicarbamine攝取的總持續時間為52天。
在接受77個Dicarbamine化療過程的13名患者中評估血液學毒性(白細胞減少、中性白細胞減少、血小板減少)，與一組7名接受25-27個沒有Dicarbamine的化療過程的患者(對照)進行對比。
在進行化療(對照)之前和之后多次動態評估造血參數，以及在試驗組中在Dicarbamine給藥之前和之后動態評估這些參數。下面列出按照所示方案接受有或沒有Dicarbamine的化療的個別患者的造血參數。
8.1患者接受沒有Dicarbamine的化療 51歲女性，診斷III期卵巢癌；按照治療方案她接受第一化療過程600mg/m2環磷烷和400mg/m2卡鉑一次。
完整的血液分析，化療過程1參數，測量單位化療過程1開始之前化療過程1之后5天化療過程1之后2周化療過程1之后3周白細胞109/l4.53.82.22.0嗜中性白細胞109/l2.92.40.90.8血小板168160154150 由于中性白細胞減少，第二治療過程推遲7天。
按照如下治療方案，第二化療過程600mg/m2環磷烷+400mg/m2卡鉑一次，沒有Dicarbamine。
完整的血液分析，化療過程2參數，測量單位化療過程2開始之前化療過程2之后5天化療過程2之后2周化療過程2之后3周白細胞109/l3.53.32.02.1嗜中性白細胞109/l2.22.00.80.9血小板178170154150 由于中性白細胞減少，第三過程推遲。
63歲女性，診斷IV期卵巢癌，轉移至右腹股溝淋巴結，腹水；按照如下治療方案她接受第一化療過程600mg/m2環磷烷+400mg/m2卡鉑一次，沒有Dicarbamine。
完整的血液分析，化療過程1參數，測量單位CT過程1開始之前CT過程1之后5天CT過程1之后2周CT過程1之后3周白細胞109/l5.03.92.12.0嗜中性白細胞109/l3.21.70.91.0血小板160150151152 由于白細胞減少和中性白細胞減少，第二治療過程推遲4天。
按照如下治療方案，進行第二化療過程600mg/m2環磷烷+400mg/m2卡鉑一次，沒有Dicarbamine。
完整的血液分析，化療過程2參數，測量單位CT過程2開始之前CT過程2之后5天CT過程2之后2周CT過程2之后3周白細胞109/l3.7 2.9 2.0 2.2嗜中性白細胞109/l2.2 1.8 0.9 0.9血小板166 160 140 155 由于中性白細胞減少，第三過程推遲。
8.2患者接受化療以及Dicarbamine 51歲女性，診斷III期卵巢癌；按照如下治療方案她接受第一化療過程600mg/m2環磷烷和400mg/m2卡鉑，在治療第1天。每日給以100mg Dicarbamine，開始于化療過程1之前5天，然后持續21天。過程2之前的Dicarbamine療法周期為26天。
完整的血液分析，化療與Dicarbamine過程1參數，測量單位開始 Dicarbamine給藥之前開始CT過程1之前Dicarbamine攝取終止之后CT過程2之后第0天第5天第21天第33天白細胞109/l5.95.54.74.0嗜中性白細胞109/l4.24.03.32.9血小板170164160158 按照如下治療方案，如期進行化療過程2600mg/m2環磷烷和400mg/m2卡鉑一次，在進行第一化療過程之后28天+Dicarbamine。在過程2之前5天給以100mg Dicarbamine，然后每日給藥持續21天。Dicarbamine攝取的總持續時間(2個化療過程)為52天。
完整的血液分析，化療過程2參數，測量單位開始Dicarbamine給藥之前開始CT過程1之前Dicarbamine攝取終止之后CT過程3之后CT過程1之后第28天第33天第54天第61天白細胞109/l4.95.04.24.2嗜中性白細胞109/l3.23.33.13.0血小板180170160160 如期給以第三CT過程。
75歲女性，診斷III期卵巢癌；按照如下治療方案她接受化療與Dicarbamine600mg/m2環磷烷和400mg/m2卡鉑，在治療第1天。每日給以100mg Dicarbamine，開始于CT過程1之前5天，然后持續21天。過程2之前的Dicarbamine療法周期為26天。
完整的血液分析，化療與Dicarbamine過程1參數，測量單位開始Dicarbamine給藥之前開始CT過程1之前Dicarbamine攝取終止之后CT過程2之后第0天第5天第21天第33天白細胞109/l7.47.26.65.2嗜中性白細胞109/l5.75.05.23.8血小板174165162167 按照如下治療方案，如期進行化療過程2600mg/m2環磷烷和400mg/m2卡鉑一次，在進行第一化療過程之后28天+Dicarbamine。在過程2之前5天給以100mg Dicarbamine，然后每日給藥持續21天。Dicarbamine攝取的總持續時間(2個化療過程)為52天。
完整的血液分析，化療過程2參數，測量單位開始Dicarbamine給藥之前開始CT過程1之前Dicarbamine攝取終止之后CT過程3之后CT過程1之后第28天第33天第54天第61天白細胞109/l7.88.27.67.2嗜中性白細胞109/l5.26.06.25.8血小板165160162157 按期給以第三CT過程。
65歲女性，診斷IV期卵巢癌；按照如下治療方案她接受化療與Dicarbamine600mg/m2環磷烷和400mg/m2卡鉑，在治療第1天。每日給以100mg Dicarbamine，開始于CT過程1之前5天，然后持續21天。過程2之前的Dicarbamine療法周期為26天。
完整的血液分析，化療與Dicarbamine過程1參數，測量單位開始Dicarbamine給藥之前開始CT過程1之前Dicarbamine攝取終止之后CT過程2之后第0天第5天第21天第33天白細胞109/l6.65.95.55.0嗜中性白細胞109/l5.04.24.43.4血小板170172166164 按照如下治療方案，如期進行化療過程2600mg/m2環磷烷和400mg/m2卡鉑一次，在進行第一化療過程之后28天+Dicarbamine。在過程2之前5天給以100mg Dicarbamine，然后每日給藥持續21天。Dicarbamine攝取的總持續時間(2個化療過程)為52天。
完整的血液分析，化療過程2參數，測量單位開始Dicarbamine給藥之前開始CT過程1之前Dicarbamine攝取終止之后CT過程3之后CT過程1之后第28天第33天第54天第61天白細胞109/l5.65.85.75.5嗜中性白細胞109/l3.03.23.43.2血小板170170176165 按期給以第三CT過程。
8.3接受化療和接受或不接受Dicarbamine的患者血液學毒性的對比數據，如表16和17所示 表16 接受化療沒有Dicarbamine的患者具有血液學毒性的人數(％)毒性類型CT過程數根據WHO的血液學毒性程度 0I II III IVIII+IV白細胞減少26 3 11.5％519.2％ 12 46.1％ 5 19.2％ 1 3.8％623.07％中性白細胞減少26 7 26.9％0 8 30.7％ 6 23.07％ 5 19.2％1142.3％血小板減少25 10 40.0％312.0％ 7 28.0％ 4 16.0％ 1 4.0％520.0％ 表17 接受化療與Dicarbamine的患者具有血液學毒性的人數(％)毒性類型CT過程數根據WHO的血液學毒性程度0IIIIIIIVIII+IV白細胞減少77100％67.7％1823.3％4355.8％1012.9％01012.9％中性白細胞減少67100％2131.3％1217.9％2334.3％57.4％68.9％1116.4％血小板減少76100％2735.5％3242.1％1013.1％67.8％11.3％79.1％ 所得數據顯示，沒有使用Dicarbamine達到有限的III-IV階段血液學毒性(表16)，白細胞減少為23.0％，中性白細胞減少為42.3％，血小板減少為20.0％。
在接受Dicarbamine的患者組中，白細胞減少、中性白細胞減少和血小板減少的發生率顯著降低(表17)。血液學毒性中，白細胞減少降低至12.9％，即1.8倍，中性白細胞減少降低2.6倍，血小板減少降低2.2倍。因而，Dicarbamine的使用導致所列種類血液學毒性都有減少。
下列數據支持這樣的事實，Dicarbamine的給藥沒有降低細胞抑制劑療法的功效，而是相反在一定程度上增強所達到的效果。
按照上述方案，在兩個有或沒有Dicarbamine的化療過程之后評估患者的治療功效。功效是按照公認的參數評估的CR-完全消退；PR-部分消退；SB-穩定化；和Progr.-進展。
所得數據列在表18中。
表18 按照方案環磷烷+卡鉑與Dicarbamine治療患者的功效患者組患者人數CRPRSBProgr.化療6100.0％233.3％116.6％233.5％116.6％化療+Dicarbamine15100.0％426.6％746.6％213.5％213.3％ 所列數據顯示，在接受沒有Dicarbamine的化療的患者組中，腫瘤生長控制率(CR+PR)達到49.9％。在接受化療與Dicarbamine的患者組中，治療功效為73.2％。
因而，在治療接受化療的患者時使用Dicarbamine，導致主要種類血液學毒性的減少，而不降低治療功效。
上列試驗與臨床數據明顯證實通式(I)肽衍生物作為非特異性分化誘導劑的功效，當使用肽衍生物以及骨髓抑制劑時，化療減少中性白細胞減少的程度和數量，單獨使用導致鼠造血組織增殖和分化中鼠與人黑瘤的生長穩定化，包括沒有化療功效存在的情況。
通式(I)肽衍生物對腫瘤生長的效果顯示與腫瘤細胞增殖活動延遲和分化程度升高有關，特別是黑瘤細胞的黑素合成能力和Friend成紅細胞增多前體細胞的分化誘導。
臨床研究揭示了通式(I)肽衍生物在采用不同聯合化療方案治療癌癥患者時顯著降低血液學毒性的性質。因而，當利用鉑制備物(環磷烷)以及肽衍生物治療患有卵巢癌的患者時，有限的中性白細胞減少和血小板減少的程度降低了2-3倍。與此同時，治療功效沒有降低。
表4 Dicarbamine對裸鼠M-6人黑瘤生長的效果 表4 Dicarbamine對裸鼠M-6人黑瘤生長的效果接種后天數對照n＝7Dicarbamine 1.5mg/kgn＝10 Dicarbamine 4.5mg/kgn＝10M+m*M+mM+mV％ V％p**V％P18天66.2+2.8100 21.8+12.810091.9+54.410025天266.0+69.4329.0+88.9 77.5+46.4302.0+186.00.82266.0+198.0166.0+93.00.01533天582.0+127.4132.9+57.3 342.0+142.0428.0+313.10.11852.0+495.0276.0+104.00.01139天701.0+123.521.9+12.6 435.0+187.023.2+22.10.921129.0+600.039.8+27.30.16946天778.0+148.410.5+8.1 662.0+417.023.9+31.00.451354.0+735.019.6+17.50.27653天821.0+221.83.8+10.3 783.0+423.018.6+54.00.431550.0+780.04.2+22.50.538 *平均值與標準偏差 **顯著性計算是僅對腫瘤體積變化百分比數據而進行的。
表12 在環磷酰胺與Dicarbamine組合的影響下，小鼠外周血白細胞組成的動力學所生成的要素第1組環磷酰胺給藥后天數35710131721髓細胞000,4/54±O,40000年輕的001,4/188±1480.4/48±3000帶狀3.2/89±164.6/370±134.8/660±2235.7/620±2602.2/293±1461.6/198±1502.7/286±214有節段的10.4/290±21017.6/1400±31.4/4200±96027/3200±45024/3190+44019.6/2430±54518.8/2444±585嗜曙紅細胞1.2/34±151.2/95.5±44001.2/290±732.6/322±931.4/182±72單核細胞6.2/172±627.2/570±175.4/724±745.2/690±1304.6/612±2195.4/60±1504.0/520±143淋巴細胞75.6/2120±31069.4/5520±56.2/7530±125065.4/7780±45067.8/9017±58070.8/8780±54573.8/9594±585第2組髓細胞00.6/26±500000年輕的0.4/4±11.6/70±240.6/63±12O.4/26±5000帶狀1.2/13±34.2/184±483.6/378±413.2/206±712.2/26811341.6/195±671.4/167±67有節段的5.2/55±0.616/700±24035.2/3700±70523.7/1494±39018.2/2220±47020.2/2460±3719.6/2330±714嗜曙紅細胞0.4/4±10.4/17±501.0/64±351.4/170±1341.4/170±791.6/190±130單核細胞4.649±17.56.4/280±484.8/504±1155.4/350±1603.8/464±1344.4/537±1344.6/547±65淋巴細胞88.2/935±2371/3110±21755.8/6860±75065.8/4240±70875.0/9150±40271.6/8740±60471.6/8520±785 表格列舉％/絕對量，以mm3表示 表13 在環磷酰胺和環磷酰胺與Dicarbamine組合的影響下，鼠骨髓的細胞構成組No環磷酰胺給藥后的天數35710131721114.5±3.4321.55±1.9232.35±3.5733.8±3.8532.6±5.2228.25±3.0230.4±2.7528.2±1.6513.05±2.7525.22±2.7527.9±2.7530.15±6.625.0±3.1626.55±4.53 *細胞數，以百萬個表示 表14 肽衍生物對Friend成紅細胞增多小鼠腫瘤大小的效果化合物每日給以單一劑量(mg/kg)達5天在療法終止后不同天數的平均腫瘤體積腫瘤生長抑制率％81319對照342[139÷545]706[457÷961]777[199÷1355]11.5157[73÷241]284[197÷371]318[136÷500]5460*6321.5130[68÷192]367[105÷629]367[105÷629]624857對照**249[150÷348]678[373÷983]645[385÷905]---31.5**77[52÷102]219[104÷334]368[193÷543]69*68*43Dicarbamine1.596[37÷155]150[87÷213]290[103÷477]6178*554.5**129[67÷191]300[130÷470]485[1354÷835]625838 注*與對照的差異是顯著的，p＜0.05 **第二次試驗 表15 肽衍生物對Friend成紅細胞增多小鼠腫瘤生長速率的效果化合物每日給以單一劑量(mg/kg)達5天在腫瘤接種后不同天數的相對腫瘤體積以及每日Dicarbamine攝取Vt/V1腫瘤生長抑制率％81319對照-1,02,02.311.51.01.82.05460**6321.51.02.82.8624857對照***1.51.02.722.59---31.5***1.02.84.7869**68**43Dicarbamine1.51.01.563.06178**5545***1.02.33.76625838 注*p＜0.05 **第二次試驗
權利要求
1、誘導包括人類在內的哺乳動物細胞分化的方法，該方法包含有效量下列通式肽衍生物
或其藥學上可接受的鹽的給藥，
其中R1是被官能團取代的C1-C3烴原子團，取代基選自氨基、C1-C5酰氨基或羧基，羧基可選地被醚化，氨基可選地被酰基取代基取代；或者同時被氨基和羧基取代的C1-C3烴原子團，氨基可選地被酰基取代基取代，羧基可選地包括在C5-C6元環狀酰亞胺中，該酰亞胺包括N-末端氨基或-CONH-基團的-NH-基團；或者被5-6元不飽和雜環基團取代的C1-C3烴原子團，烴原子團可以同時包含可選被酰基取代基取代的氨基；或者
R1是飽和的雜環基團；
R2是氫原子或官能團，選自可以被醚化的羧基；
R3是5-6元飽和或不飽和環狀或雜環基團，或者氨基或羧基，羧基可選地被醚化；
n＝0-4，m＝1-4，k＝0-1。
2、根據權利要求1的方法，其中如權利要求1所要求保護的通式(I)肽衍生物是按照0.5-5.0mg/kg的劑量每日口服給藥的。
3、根據權利要求1和2任意一項的方法，其中如權利要求1所要求保護的通式(I)肽衍生物是與化療過程聯合給藥的。
4、根據權利要求1-3任意一項的方法，其中為了使惡性腫瘤的生長穩定，將如權利要求1所要求保護的通式(I)肽衍生物給藥至少15天。
5、根據權利要求1-4任意一項的方法，其中為了增強惡性腫瘤免疫療法的功效，將如權利要求1所要求保護的通式(I)肽衍生物與干擾素一起給藥。
6、根據權利要求4和5任意一項的方法，其中該惡性腫瘤是黑瘤或造血組織增殖。
7、根據權利要求1-3任意一項的方法，其中為了降低血液學毒性，將如權利要求1所要求保護的通式(I)肽衍生物在開始化療過程之前5天給藥直至其終止。
8、根據權利要求1-7任意一項的方法，其中R1＝NH2CH2-、HOOC-CH2-、CH3CONH-CH2-、CH3OCO-CH2-、
n＝0-4；k＝0-1
R2＝H，COOH，COOCH3；
NH2，COOH，-COOCH3，m＝1-4.。
9、根據權利要求1-8任意一項的方法，其中該肽衍生物是4-[N-(2-咪唑-4-基)乙基)氨甲酰基]丁酸。
10、下列通式肽衍生物或其藥學上可接受的鹽的用途，
其中R1是被官能團取代的C1-C3烴原子團，取代基選自氨基、C1-C5酰氨基或羧基，羧基可選地被醚化，氨基可選地被酰基取代基取代；或者同時被氨基和羧基取代的C1-C3烴原子團，氨基可選地被酰基取代基取代，羧基可選地包括在C5-C6元環狀酰亞胺中，該酰亞胺包括N-末端氨基或-CONH-基團的-NH-基團；或者被5-6元不飽和雜環基團取代的C1-C3烴原子團，烴原子團可以同時包含可選被酰基取代基取代的氨基；或者
R1是飽和的雜環基團；
R2是氫原子或官能團，選自可以被醚化的羧基；
R3是5-6元飽和或不飽和環狀或雜環基團，或者氨基或羧基，羧基可選地被醚化；
n＝0-4，m＝1-4，k＝0-1；
用于制造誘導哺乳動物細胞分化的藥物。
11、如權利要求10所指定的通式(I)肽衍生物的用途，與化療過程聯合用于減少血液學毒性。
12、如權利要求10所指定的通式(I)肽衍生物的用途，用于使惡性腫瘤的生長穩定。
13、如權利要求10所指定的通式(I)肽衍生物的用途，與干擾素聯合用于增強免疫療法的功效。
14、根據權利要求10-13任意一項的用途，其中R1＝NH2CH2-、HOOC-CH2-、CH3CONH-CH2、CH3OCO-CH2-、
n＝0-4；k＝0-1
R2＝H，COOH，COOCH3；
NH2，COOH，-COOCH3，m＝1-4.。
15、根據權利要求10-14任意一項的用途，其中該肽衍生物是4-[N-(2-咪唑-4-基)乙基)氨甲酰基]丁酸。
全文摘要
本發明涉及細胞分化的誘導方法，該方法注射具有下列通式(I)的肽衍生物，用作分化誘導因子。所述肽衍生物用于治療腫瘤學疾病，特別是用于使黑瘤生長穩定，增加黑瘤免疫療法的效率，減少化療的血液學毒性。還公開了所述肽衍生物的應用。
文檔編號A61K31/4045GK1649612SQ0380949
公開日2005年8月3日 申請日期2003年2月28日 優先權日2002年2月28日
發明者弗拉迪米爾·葉夫根尼耶維奇·涅博利辛, 維拉·安德列芙娜·戈爾布諾娃, 伊萬·德米特耶維奇·特里斯查林, 納坦·坦弗列維奇·賴赫林, 奧古斯特·米哈伊洛維奇·加林, 馬克·鮑里索維奇·貝奇科夫, 伊蓮娜·米哈伊洛芙娜·特里斯查林娜, 加利娜·亞歷山德羅芙娜·熱爾圖金娜 申請人:弗拉迪米爾·葉夫根尼耶維奇·涅博利辛