向脂質體中包封金屬絡合物的方法

專利名稱：向脂質體中包封金屬絡合物的方法
技術領域：
本發明涉及包封了99mTc等短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體的制備方法。更具體地說，本發明涉及包封了99mTc等短半衰期的金屬放射性核素絡合物的脂質體的制備方法，其中所述絡合物使用以N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺為配體的99mTc等短半衰期的金屬放射性核素絡合物、以及由該方法制備的脂質體、在該方法中使用的試劑盒。
背景技術：
使用放射性核素進行癌的圖像診斷可以施行無創性的早期診斷。在圖像診斷中廣泛采用的放射性同位素(RI)中，金屬放射性同位素锝-99m(99mTc)在圖像診斷中具有適宜的半衰期(6小時)和γ射線能量(141keV)，并且，通過以99Mo為母核素的發生器系統，可以容易地以生理鹽水溶液的形式獲得，是最適合臨床應用的核素。為了將99mTc選擇性地送達腫瘤，目前進行了很多在標記母體中使用抗體或肽的研究，脂質體也是圖像診斷應用中得到研究的載體之一。脂質體是由脂質雙分子膜構成的封閉小囊泡，作為化療劑等藥物、蛋白質、核酸等的膠囊型DDS載體受到了人們的重視。核醫學診斷中，其內部可以內包大量的放射能，通過調節粒徑或對膜表面進行化學修飾，可以具有靶向性，因此，除實體癌之外，用99mTc標記的脂質體在前哨淋巴結、炎癥·感染部位的高靈敏度圖像診斷方面的應用也值得期待。
已知腫瘤組織中，血管通透性亢進或經由淋巴系統的回收不足，因此高分子容易由血液中滲漏到腫瘤組織間質中并蓄積。這樣的特性顯示透過組織間質的脂質體在腫瘤組織內未被攝取到細胞內，而是存在于細胞間質中。而隨血流循環的脂質體主要被捕捉到肝臟、脾臟等網狀內皮系統組織中，從血液中消散。目前得到普遍研究的、同樣是以腫瘤的圖像診斷為目的包封有67Ga、以及111In的氨三乙酸(NTA)絡合物的脂質體在實驗動物體內顯示了優異的腫瘤濃集性，但也證實在肝臟和脾臟中有高的放射能聚集，這對實際應用造成了很大的障礙。這是由于被攝入到肝臟和脾臟的脂質體與實質細胞內的溶酶體融合并代謝，但此時被釋放到溶酶體內的包封絡合物67Ga和111In-NTA為水溶性，不能透過膜，并由于其穩定性低，絡合物分解，放射性核素貯留于溶酶體內。結果，這些組織內顯示出長時間的放射性的滯留。
而本發明中，可認為脂質體被攝取到細胞內的溶酶體內，代謝后釋放的RI絡合物具有由溶酶體向血液中轉移，迅速排到尿液中的性質，從而消散了這些非特異性放射性的滯留。經選擇，具有這樣的性質的絡合物有99mTc-亞乙雙半胱氨酸(99mTc-CD)(

圖1)。有報告指出99mTc-CD具有2個分子的游離數酸和穩定的5價中性絡合物結構，與對氨基馬尿酸同樣，經由腎臟的有機陰離子遷移，以穩定的化學形態排到尿液中。本發明人目前的研究結果表明通過將與99mTc同族的長半衰期的金屬放射性核素錸-186(186Re)與CD的絡合物186Re-CD包封在脂質體內，可以使聚集在肝臟、脾臟的放射能以186Re-CD的形式迅速地排到尿液中，可極大地降低這些組織的放射能滯留。這些結果顯示包封99mTc-CD絡合物的脂質體也同樣可以消散肝臟和脾臟內的放射性滯留。
但是，制備186Re-CD脂質體時，如果采用直接向脂質中添加186Re-CD絡合物，使其溶脹的直接包封法，則包封率明顯低，為3.2％，因此需要建立一種向脂質體中包封186Re-CD或99mTc-CD的方法。另外，臨床使用時，直接包封脂質體需要在要使用之前制備脂質體，從實際應用角度考慮，也希望有一種臨床標記預先制備的脂質體的方法。有報告提出了67Ga或111In絡合物的高效且簡便的包封方法(圖2)制備具有高脂溶性和置換活性的絡合物--67Ga和111In-喔星絡合物，通過和內包NTA的脂質體一起進行培養，透過脂質體膜的絡合物在內部發生配體交換反應，使得水溶性螯合劑67Ga和111In-NTA保持在脂質體內。使用被稱為配體交換反應的該包封方法時，67Ga或111In的包封率達到約90％。另外，以高的放射化學收率獲得99mTc標記的脂質體的方法還有通過和內包谷胱甘肽的脂質體一起進行培養，使脂溶性絡合物99mTc-六甲基丙烯胺肟(99mTc-HMPAO)在內部還原性地轉化為水溶性分解產物。包封率大約為60％-90％。最近，核醫學上采用的RI標記脂質體最常見的都是采用該包封方法制備的，但67Ga、111In和99mTc的任意一種標記的脂質體都會產生上述的在肝臟、脾臟中滯留放射能的問題。

發明內容
本發明將消除上述現有技術的問題作為要解決的課題。即，為了使給予的放射能迅速消散，不僅要求高的包封率，同時還要求充分提高內部的99mTc-CD的放射化學純度。因此，本發明的目的在于提供以可實用化的放射化學收率和純度制備包封有99mTc等短半衰期金屬放射性核素與CD的絡合物的脂質體的方法。
本發明人為了解決上述課題，將具有高的膜透過性和置換活性的兩種99mTc絡合物--99mTc-HMPAO和99mTc-N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺(MRP20)(圖3)用于配體交換反應，并將兩者進行了比較研究。還研究了制備的包封有99mTc-CD的脂質體在體內的放射能動態，對本標記法在通過99mTc的圖像診斷和通過186Re的內用放射線治療中的有效性進行了評價。結果發現使用99mTc-N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺(99mTc-MRP20)，通過配體交換反應，將99mTc-CD包封到脂質體中，由此可以制備可消散非特異性放射能在肝臟、脾臟中的滯留的、包封有99mTc的脂質體。本發明基于這些認識而完成。
即，本發明提供包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體的制備方法，該方法包括將短半衰期的金屬放射性核素與N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺的絡合物、以及包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體混合，并進行培養。
優選提供包封有99mTc-亞乙雙半胱氨酸(CD)絡合物的脂質體的制備方法，該方法包括將99mTc-N-[2(1 H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺與包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體混合，并進行培養。
本發明的另一方面在于提供包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體，該脂質體通過將短半衰期的金屬放射性核素與N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺的絡合物、包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體混合、培養來制備。
優選提供包封有99mTc-亞乙雙半胱氨酸(CD)絡合物的脂質體，該脂質體通過將99mTc-N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺與包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體混合、培養來制備。
本發明的又一方面在于提供含有上述脂質體的診斷劑或治療劑。
本發明的另一方面在于提供用于實施本發明的包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體的制備方法的試劑盒，該試劑盒包含至少一種選自下述的物質一種或以上的形成脂質體的物質；亞乙雙半胱氨酸(CD)；包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體；短半衰期的金屬放射性核素；N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺；或短半衰期的金屬放射性核素與N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺的絡合物。
優選短半衰期的金屬放射性核素為99mTc或其鹽。
附圖簡述圖1表示99mTc-CD的推測結構。CD的配位原子上具有氮和硫，與5價的99mTc形成穩定的氧絡合物。
圖2表示86Re-CD的直接包封法(A)和111In-NTA的配體交換反應(B)。
■CD或NTA▲86Re或111In○喔星圖3表示99mTc-HMPAO(左)和99mTc-MRP20(右)的結構。是具有高脂溶性和置換活性的99mTc絡合物，可認為比較容易發生水解和配體交換反應。
圖4表示99mTc-HMPAO和99mTc-MRP20在其水溶液中的穩定性。以形成絡合物0小時后為100％，表示各99mTc絡合物的放射化學純度隨時間的變化。
(A)未經RP-HPLC提純的99mTc-HMPAO；(B)經RP-HPLC提純的99mTc-HMPAO；(C)未經RP-HPLC提純的99mTc-MRP20；(D)經RP-HPLC提純的99mTc-MRP20；○25℃，□37℃圖5表示pH對99mTc-HMPAO(A)和99mTc-MRP20(B)與CD的配體交換反應性的影響。將因交換反應而產生的99mTc-CD的放射化學吸收率表示在縱軸。
○與未經RP-HPLC提純的99mTc絡合物的交換；□與經RP-HPLC提純的99mTc絡合物的交換；圖6表示使用99mTc-HMPAO制備的99mTc-CD脂質體(99mTc(HMPAO)-CD脂質體)的內包物質的EP分析結果。
圖7表示使用99mTc-MRP20制備的99mTc-CD脂質體(99mTc(MRP20)-CD脂質體)的內包物質的EP分析結果(A)與RP-HPLC分析結果(B)。
圖8表示將99mTc標記的脂質體靜脈給予小鼠時的體內放射能動態。
△99mTc/GSH脂質體■99mTc(HMPAO)-CD脂質體；●99mTc(MRP20)-CD脂質體；圖9表示將包封有99mTc-CD的脂質體給予小鼠后，向外排放的放射能占所給予的放射能的比例。
■99mTc(HMPAO)-CD脂質體給予組；□(斜線)99mTc(MRP20)-CD脂質體給予組；圖10表示將99mTc(MRP20)-CD脂質體給予小鼠后，通過EP(A)和RP-HPLC(B)對排到尿液中的放射能的分析結果。
實施發明的最佳方式以下對本發明的實施方式進行說明。
本發明提供的包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體的制備方法，其特征在于將短半衰期的金屬放射性核素與N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺的絡合物、包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體混合，并進行培養。
可用于本發明的短半衰期的金屬放射性核素的種類并沒有特別限定，優選99mTc(锝99m)或186/188Re，特別優選99mTc。
關于本發明中使用的短半衰期的金屬放射性核素與N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺(MRP20)的絡合物，例如短半衰期的金屬放射性核素為99mTc時，可通過將MRP20的乙醇溶液與氯化亞錫的鹽酸溶液混合，向其中加入99mTcO4-溶液，在室溫下放置來制備。使用除99mTc以外的短半衰期的金屬放射性核素時，可以使用相應的含有短半衰期的金屬放射性核素的溶液來代替99mTcO4-溶液。
本發明中使用的包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體可以使用形成脂質體的物質，按照常規方法制備。
形成脂質體的物質只要是本領域中通常使用的物質即可，并沒有特別限定，從在生物體內提供穩定的脂質體的角度考慮，優選使用磷脂或其衍生物、除磷脂以外的脂質或其衍生物。
上述磷脂的例子有二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿(卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、心磷脂、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂等天然或合成的磷脂，或按照常規方法向上述磷脂加氫的產物。
還可以加入親水性高分子的脂質衍生物，以修飾脂質體的表面。可以使用的親水性高分子脂質衍生物只要無損脂質體結構的穩定即可，并沒有特別限定，例如有聚乙二醇、葡聚糖、普魯蘭、菲可(聚糖體)、聚乙烯醇、合成多聚氨基酸、直鏈淀粉、支鏈淀粉、甘露聚糖、環糊精、果膠、角叉藻聚糖以及它們的衍生物等，可特別優選使用聚乙二醇和聚乙二醇衍生物。
本發明中使用的脂質體可以根據需要使用穩定劑、抗氧化劑等。穩定劑的例子有降低膜流動性的膽固醇等固醇；甘油；蔗糖等糖類。抗氧化劑的例子有生育酚同系物、例如維生素E等。
為了制備脂質體，可以在燒瓶中，將溶解于溶劑中的形成脂質體的物質(可以是2種或以上的混合物)減壓餾去溶劑，在燒瓶的內壁上形成脂質薄膜。
作為溶劑，只要可溶解要使用的脂質，可以是任何溶劑，例如氯仿、三氯乙烷、二氯甲烷等鹵化烴類；己烷、庚烷等烴類；苯、甲苯、二甲苯等芳烴類；二乙醚、二異丙醚、乙二醇二甲醚、四氫呋喃等醚類等。
接著，移入減壓干燥器，減壓下完全餾去溶劑，然后加入CD水溶液，使脂質溶脹，可獲得多室脂質體(MLV)混懸液。再使用0.2μm、0.05μm等的膜濾器依次加壓過濾，可獲得單室脂質體。
按照凝膠過濾、離心等公知的方法，純化所得脂質體分散液，可以將脂質體與未包入脂質體的物質分離。
接著，向上述得到的包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體中加入短半衰期的金屬放射性核素與N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺的絡合物(特別優選99mTc-N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺等)，進行培養，由此可制備包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體。培養溫度和時間并沒有特別限定，可以適當設定。例如通過在室溫下培養30分鐘至數小時左右，可以制備包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體。
上述由本發明的方法得到的、包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體，其特征在于短半衰期的金屬放射性核素(例如99mTc)-CD絡合物的純度高。這樣，脂質體內部的短半衰期的金屬放射性核素(例如99mTc)-CD絡合物的放射化學純度越高，則越有望使放射性從肝臟和脾臟中迅速消散，因此按照本發明的方法制備的、包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體具有與現有的包封有99mTc的脂質體或99mTc-HMPAO-CD脂質體相比，使肝臟和脾臟中的放射性滯留大幅降低的特征。具有這樣特征的脂質體本身也在本發明的范圍之內。
由本發明的方法得到的包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體，例如可用作包括癌或腫瘤等的各種疾病的診斷劑或治療劑。
本發明的脂質體可以經口或腸道外給予生物體。給予方法優選通過注射給予，根據癌或腫瘤的存在部位，可以采用靜脈注射、肌內注射、皮下注射、動脈注射等任意的形式，優選靜脈注射。
將本發明的脂質體作為診斷劑或治療劑給予時，可以直接給予脂質體，但優選以含有脂質體的藥物組合物的形式給予。上述藥物組合物含有本發明的脂質體和藥學上可接受的賦形劑，還可根據需要含有其它藥學制劑、載體、輔藥。
通過注射，將本發明的脂質體給予受試者時，優選制備成液體藥物組合物。
液體藥物組合物例如可將本發明的脂質體溶解或分散于如水、生理鹽水、水性葡萄糖、甘油、乙二醇、乙醇等的載體中，還可根據需要添加佐劑，以此來制備溶液或混懸液。
根據需要，本發明的藥物組合物中可以含有少量濕潤劑、乳化劑或助溶劑、pH緩沖劑等，例如乙酸、枸櫞酸鈉、環糊精衍生物、單月桂酸山梨糖醇酐、乙酸三乙醇胺鈉、油酸三乙醇胺等的助劑。這樣的藥物組合物的制備方法是本領域人員已知的。
本發明的脂質體的給予量根據給予目的、包封的短半衰期的金屬放射性核素的種類和載藥量等而不同，通常成人給予0.1mg-1mg左右。
本發明中還使用下式 所示的99mTc-N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺(99mTc-MRP20)。
99mTc-MRP20可如下制備將N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺(MRP20)的乙醇溶液與氯化亞錫的鹽酸溶液混合，向其中加入99mTcO4-溶液，在室溫下放置。
本發明提供用于實施本發明的包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體的制備方法的試劑盒，該試劑盒包含至少一種選自下述的物質一種或以上的形成脂質體的物質；亞乙雙半胱氨酸(CD)；包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體；短半衰期的金屬放射性核素；N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺；或短半衰期的金屬放射性核素與N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺的絡合物。
上述中，一種或以上的形成脂質體的物質和亞乙雙半胱氨酸(CD)是用于制備包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體的試劑，可以將它們單獨或兩者包含在試劑盒中，或將制備好的包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體本身包含在試劑盒中。
同樣，短半衰期的金屬放射性核素和N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺是用于制備短半衰期的金屬放射性核素與N-[2(1H-吡略基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺的絡合物的試劑，可以將它們單獨或兩者包含在試劑盒中，或將制備好的短半衰期的金屬放射性核素與N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺的絡合物包含在試劑盒中。
通過以下的實施例進一步具體說明本發明，但本發明并不受實施例的限定。
實施例(實驗材料和方法)1.一般方法99mTcO4-溶液采用99Mo/99mTc發生器(Ultra Techne Kow，第一同位素)的生理鹽水洗脫液。絡合物合成中的產物的確認采用薄層色譜(TLC)、紙色譜(PC)、醋酸纖維素膜電泳法(EP)和反相高效液相色譜(RP-HPLC)。TLC使用Merck公司制造的硅膠(Silica gel 60F254)，用氯仿和甲醇的混合溶劑(4∶1)展開。PC使用Whatman公司制造的濾紙(No.1)，用50％乙腈展開。EP的電泳膜采用醋酸纖維素膜(SELECA-V，東洋濾紙株式會社)，緩沖液采用巴比妥緩沖液(pH＝8.6，I＝0.06，Nacalai Tesque)，以一定的電流(1mA/cm)電泳25分鐘。RP-HPLC的柱使用COSMOSIL C18-AR-300(4.6mm×150mm，Nacalai Tesque)，與流分收集器(Pharmacia)連接，用γ計數器(ARC-380M，Aloka)測定收集的所有流分。標記化合物的分析以流速0.5ml/分鐘、移動相在(A)使用0.01M磷酸緩沖液(pH＝7.0)和乙腈，其中乙腈的比例為10分鐘內由0增至100％的測定條件下；(B)使用0.0125M磷酸緩沖液(pH＝2.5)和乙腈，其中乙腈的比例為12分鐘內由0增至9％、20分鐘到40分鐘內由9％增至100％的測定條件下進行。
2.CD和MRP20的合成N，N’-亞乙雙半胱氨酸(CD)的合成按照Brondeau等人的方法進行(Brondeau等人，Canadian J Chem 4549-52，1967)。向L-硫代脯氨酸(噻唑烷-4-甲酸，東京化成)的氨溶液中加入金屬鈉，攪拌，然后加入NH4Cl，在室溫下攪拌過夜，將生成的晶體溶于水，用鹽酸析出而得(收率23％，熔點251-254℃)。
N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺(MRP20)的合成按照Morgan等人的方法進行(Morgan等人.Inorg.Chim.Acta 190257-264，1991)。將吡咯-2-醛和乙二胺在乙腈中攪拌過夜，然后在甲醇溶劑下用NaBH4還原，在堿性條件下萃取到氯仿中，得到中間體。接著將中間體和乙酰丙酮在乙腈中攪拌，然后用氯仿萃取，通過硅膠柱(溶劑為乙酸乙酯∶甲醇＝5∶1)和苯進行重結晶，提純。收率15.9％，熔點74-75℃(文獻值75℃)。
3.99mTc-HMPAO和99mTc-MRP20的合成99mTc-HMPAO(99mTc-六甲基丙烯胺肟)通過由日本Medi-Physics公司供應的試劑盒(Cerebrotec(注冊商標)，Nycomed AmershamInternational)制備。向試劑盒中加入99mTcO4-生理鹽水溶液，溶解后立即使用。
99Tc-MRP20如下制備將190μl MRP20的乙醇溶液(17mM)和10μl0.01N氯化亞錫的HCl溶液(1.35M)混合，向其中加入200μl99mTcO4-溶液，在室溫下放置15分鐘后使用。
通過TLC、PC、EP、RP-HPLC求出所得99mTc絡合物(99Tc-HMPAO、99mTc-MRP20和99mTc-CD)的放射化學收率。放射化學收率的計算如下進行將干燥的TLC板、濾紙和醋酸纖維素膜裁成5mm寬度，用γ計數器測定各裁片，以各板上的全部的放射能為100％，求出不同Rf值下的放射能比例。
4.HMPAO和MRP20的分配系數的測定向500μl辛醇和500μl pH7.0的HEPES緩沖液或pH12.0的Na2HPO4-NaOH緩沖液中加入20μl用生理鹽水制備成8mM的HMPAO或MRP20溶液，攪拌、靜置后測定辛醇層、水層的吸光度，比較兩種絡合物的脂溶性。
5.99mTc絡合物在其水溶液中的穩定性為了比較99mTc-HMPAO和99mTc-MRP20在其水溶液中的穩定性，將99mTc-HMPAO水溶液用50mM氨緩沖液(pH9.4)稀釋為最終配體濃度1mM，在25℃或37℃的水浴中培養，一定時間(0.5、2、4、8、24小時)后，通過上述的分析方法分別求出放射化學純度。99mTc-MRP20水溶液用50mM磷酸緩沖液(pH8.3)稀釋，進行同樣的操作。
為了研究游離配體對穩定性的影響，用RP-HPLC提純99mTc絡合物溶液，將洗脫到100％乙腈中的純化99mTc絡合物溶液用緩沖液按照1∶1的比例混合、稀釋，與提純前同樣，研究絡合物的放射化學純度隨時間的變化。
6.99mTc絡合物與CD的配體交換反應性將CD用1N NaOH溶解，濃度為66.7mM，然后用緩沖液稀釋至10倍，用2N HCl調節pH，以此作為CD水溶液。將該CD水溶液與99mTc-HMPAO和99mTc-MRP20溶液按照3∶1的比例混合，在37℃培養30分鐘，然后通過EP求出Tc-CD的放射化學收率。稀釋CD的緩沖液使用pH7.0或8.3的HEPES緩沖液、pH9.4或10.5的氨緩沖液、pH11.2的磷酸鈉緩沖液(均為50mM)。CD溶液與99mTc-HMPAO和99mTc-MRP20溶液進行溶液混合后的CD濃度為5mM，HMPAO和MRP20濃度為2mM。
7.脂質體的制備在茄型燒瓶中，將用2ml氯仿溶解的硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC，日本油脂)和膽固醇(CH，Sigma)以2∶1摩爾比(15μ摩爾∶7.5μ摩爾)混合，然后在65℃減壓下餾去溶劑，在燒瓶內壁形成脂質的薄膜。移入減壓干燥器，花4小時或以上減壓完全餾去溶劑，然后加入大致等滲的包封物質的水溶液，在65℃使脂質溶脹，得到多室脂質體(MLV)的混懸液。使用0.2μm、0.05μm的聚碳酸酯膜濾器(Nuclepore(注冊商標)，野村Micro Science)依次加壓過濾，得到單室脂質體(SUV)。將生成的脂質體進行凝膠過濾(凝膠過濾柱，1×30cm，Bio-Rad)，其中以用5％甘露糖醇水溶液溶脹的Bio-Gel A-1.5m(Bio-Rad)為載體，用5％甘露糖醇水溶液洗脫提純。接著將脂質體以400,000g離心20分鐘，用生理鹽水使沉淀再混懸，制備脂質體溶液。
8.包封有99mTc-CD的脂質體的制備包封有99mTc-CD的脂質體通過配體交換反應制備。將CD溶于生理鹽水，將1.5ml由2N NaOH調節為pH11.8的5mM CD溶液添加到由上述方法制備的磷脂的薄膜中，制備脂質體，然后通過凝膠過濾除去未封入的CD。將500μl所得純化脂質體用等量生理鹽水稀釋，然后將140μl99mTc-HMPAO溶液和99mTc-MRP20溶液加入其中，在37℃培養60分鐘，得到包封有99mTc-CD的脂質體。將反應溶液離心分離，沉淀的級分為包封有99mTc-CD的脂質體。
9.99mTc/GSH脂質體的制備按照現有方法制備99mTc/GSH脂質體。將GSH溶于135mM NaCl/10mMHEPES緩沖液(pH7.4)中，用2N NaOH調節pH＝6.7，制備50mM GSH溶液。將1.5ml GSH溶液添加到磷脂的薄膜中，制備脂質體，然后通過凝膠過濾除去未封入的GSH。接著將250μl99mTc-HMPAO加入到500μl純化脂質體中，在25℃培養40分鐘，得到99mTc/GSH脂質體。離心反應溶液，沉淀的級分為99mTc/GSH脂質體。
10.包封有99mTc-CD的脂質體的內包物質的分析向使用99mTc-HMPAO制備的99mTc-CD脂質體(99mTc-HMPAO-CD脂質體)和使用99mTc-MRP20制備的99mTc-CD脂質體(99mTc-MRP20-CD脂質體)的各沉淀級分中加入大約250kBq/ml量的乙醇，充分攪拌，靜置20分鐘，溶解脂質膜。通過EP對溶出的脂質體內包物質進行分析。
11.正常小鼠的體內動態將包封有99mTc-CD的脂質體級分或99mTc/GSH脂質體級分用生理鹽水稀釋，使磷脂濃度為1.4-1.8μ摩爾/ml。將0.1ml各脂質體溶液由尾靜脈給予一組5只5周齡的ddY系雄性小鼠。給予10分鐘、1、3、6、24小時后斷頭處死，然后摘取各組織，由γ射線檢測裝置測定組織重量和放射能。以所給予的量為100％，分布于各組織的放射性以1g各組織的放射性(％ID/g組織)來表示。
給予24小時后，對尿液中的放射性進行分析。將300μl采集的尿液裝入用于離心過濾的濾器中(Microcon(注冊商標)，Millipore)，在4℃以8800rpm離心15分鐘，除去蛋白質，然后用0.45μm的針頭濾器過濾，將過濾物通過EP、RP-HPLC進行分析。
(結果)1.99mTc化合物的化學性質99mTcO4-在EP中泳動至陽極一側8.0cm處；在由氯仿和甲醇的混合溶劑展開的TLC中，Rf值為0.8-0.9；在由50％乙腈展開的PC中，Rf值為0.9-1.0。可以認為在EP、TLC和PC中，由99mTcO4-水解而產生的99mTcO2殘留在原點。99mTc-CD在EP中泳動到陽極一側6.0cm處；在RP-HPLC(B)中是在22.0分鐘后被洗脫。99mTc-HMPAO在EP中在原點不泳動，在TLC中的Rf值為0.9，因此TLC的Rf值為0.9附近的放射能比例減去由EP求出的99mTcO4-的比例，以所得值作為放射化學收率。RP-HPLC(A)中的保留時間為16.9分鐘。按照如下所示的方法合成的99mTc-MRP20在EP中在原點不泳動，在PC中的Rf值為0.8-1.0，因此通過求出EP中殘存于原點的放射能的比例和PC中殘存于原點的放射能的比例，可計算放射化學收率。RP-HPLC(A)中的保留時間為18.1分鐘。這些結果的匯總(99mTc化合物的分析值)如表1所示。
表1表199mTc化合物的分析值99mTc-99mTc-99mTcO4-99mTcO299mTc-CDHMPAO MRP20TLC/CH3Cl+MeOH Rf值0.8-0.9 0 -- --0.9PC/50％CH3CN Rf值 0.9-1.0 0 -- 0.8-1.0 --EP電泳距離(cm) 8.0 0 6.0-8.00 0RP-HPLc(A)保留時間(分鐘)4-5 ---- 18.1 16.9RP-HPLC(B)保留時間(分鐘)4-5 --22.0 ----2.HMPAO和MRP20的分配系數轉移到辛醇層的HMPAO的吸光度在檢測下限或以下。當緩沖液的pH為7.0時，辛醇層中的MRP20的吸光度和水層中MRP20的吸光度之比為2.1±0.7；當pH為12.0時，為5.0±1.6。
3.99mTc-MRP20的合成在通常的操作下，用99mTc標記MRP20時，生成50％或以上的具有負電荷的水解產物，目標標記物的收率最高為35-40％左右。這里，將溶劑乙醇和鹽酸用氮氣置換6小時或以上，另外將錫的鹽酸溶液少量分次加入到反應溶液中，此時99mTc-MRP20得到了81-92％的放射化學收率。RP-HPLC(A)提純后的99mTc-MRP20的放射化學純度大致為100％。
4.99mTc絡合物在其水溶液中的穩定性對RP-HPLC提純前和提純后的99mTc-HMPAO和99mTc-MRP20兩種絡合物溶液，對于存在于各溶液中的各絡合物的放射化學純度隨時間的變化進行了研究。結果表示在圖4中。
未經提純的99mTc-HMPAO在形成絡合物后的30分鐘內大約分解至40％，之后的分解比較緩慢地進行。而99mTc-MRP20在形成絡合物后的2小時內，放射化學純度約為70％，在25℃下，分解至約40％時已是4小時以后。提純后，在37℃下，兩種絡合物的穩定性未見大的差異，但在25℃，反而99mTc-HMPAO比99mTc-MRP20穩定。24小時后，99mTc-MRP20分解至6％，而99mTc-HMPAO的放射化學純度為59％。
5.99mTc絡合物與CD的配體交換反應性RP-HPLC對99mTc-HMPAO和99mTc-MRP20進行提純前后，pH對于與CD的配體交換反應性的影響結果如圖5所示。
在未經提純的99mTc-HMPAO與CD的交換反應中，隨著混合溶液的pH的上升，99mTc-CD的收率增加，在pH11.9時的收率為57％。另外，提純后的交換反應率在pH11.9時達到74％。
在提純前后，99mTc-MRP20與CD的交換反應性都比99mTc-HMPAO高很多，在測定范圍的pH下，顯示了90％或以上的99mTc-CD收率。特別是提純后的99mTc-MRP20總是顯示95％或以上的99mTc-CD收率，未見pH引起的影響。
6.包封有99mTc的脂質體的制備將包封有99mTc的脂質體進行離心，分取離心后的上清，分別測定沉淀和上清的放射能，求出包封率。包封率是沉淀中的放射性除以沉淀中的放射能和上清中的放射能的和所得的值。使用99mTc-HMPAO進行配體交換反應，得到的99mTc-CD包封率為66.4％，使用99mTc-MRP20得到的99mTc-CD包封率為70.0％。使用99mTc-HMPAO得到的GSH脂質體的包封率為75.1％。
對包封有99mTc-CD的脂質體的內包物質進行分析，結果如圖6、圖7所示。99mTc(HMPAO)-CD脂質體、99mTc(MRP20)-CD脂質體的任意一種的內包物質，其在EP中的主要峰都在陽極一側7.5cm-8.0cm處。但是，99mTc(HMPAO)-CD脂質體的內部存在的放射能中，與99mTc-CD相當的峰最高占54％。而對于99mTc(MRP20)-CD脂質體的內包物質，在EP中，91％的放射能泳動到陽極一側6.5cm處，在RP-HPLC(B)中幾乎全部的放射性在保留時間22.3分鐘時洗脫出來。
7.正常小鼠的體內動態將用99mTc-HMPAO和99mTc-MRP20標記的包封有99mTc-CD的脂質體和作為比較對照的99mTc/GSH脂質體靜脈給予正常小鼠，其體內放射性動態如圖8所示。三者由血液中消散的程度相同，給予早期，放射能在肝臟和脾臟中的聚集未見大的差異。但是隨著時間推移，99mTc/GSH脂質體在這些組織中的放射性聚集增加，6小時后，與99mTc-CD脂質體的差異明顯，24小時后，肝臟中1g組織滯留了所給予的放射性的20％，脾臟中在24小時后也見放射性的蓄積傾向，殘留了所給予的放射性的56％。而對于包封有99mTc-CD的脂質體，肝臟在給予30分鐘時、脾臟在給予3小時時，所給予的放射性達到最高值，之后隨時間的推移而減少。比較兩種99mTc-CD脂質體，則99mTc-MRP20-CD脂質體與99mTc(HMPAO)-CD脂質體相比，特別是在給予6小時和24小時時顯示了更迅速的放射性的消散。
給予24小時后，排到體外的放射能量如圖9所示，對尿液中的放射性的分析結果如圖10所示。所給予的放射能中，排到尿液中的放射能的比例在99mTc(HMPAO)-CD脂質體給予組為59％，99mTc(MRP20)-CD脂質體給予組為74％。對于給予99mTc(MRP20)-CD脂質體后排到尿液中的放射能，其中的91.2％泳動到EP中陽極一側6.0cm處，在RP-HPLC(B)中在保留時間22.5分鐘后被洗脫出來。
(討論)在脂質體的99mTc標記法中最為通常的、內包99mTc-HMPAO和谷胱甘肽的脂質體的包封是可以以高效率進行的。但是，由于這樣的包封有99mTc的脂質體中內包了99mTc-HMPAO的還原性分解產物，由于99mTc化合物聚集在網狀內皮系統而產生非特異性放射性滯留，這產生了圖像精度降低的問題。通過直接包封制備的99mTc-CD脂質體，包封效率非常低，實用性差，不過脂質體中內包的99mTc-CD的放射化學純度的理論值大體為100％，從之前的討論中已清楚實際給予小鼠后，所給予的放射能的約80％排到尿液中，顯示放射性迅速地從非目標組織中消散。在考慮在圖像診斷中的實際應用時，需要實現與現有的標記法同樣高的放射化學收率，同時還要實現與直接包封法相匹敵的高的放射化學純度。
本實施例中，通過使用99mTc-HMPAO或99mTc-MRP20進行配體交換反應，制備包封有99mTc-CD的脂質體，使包封率由直接包封186Re-CD時的3.2％，大幅上升到66-70％。使用99mTc-HMPAO和99mTc-MRP20的任意一種作為膜透過性絡合物，均未見包封率有大的差異，但可見到包封后，脂質體中內包的99mTc-CD的放射化學純度的顯著的差異。與99mTc-MRP20相比，99mTc(HMPAO)-CD脂質體內的99mTc-CD純度低很多。其原因是生成了可能是99mTc-HMPAO的水解產物、具有負電荷的放射性化合物。配體交換反應中，作為起始原料的絡合物需要置換活性高，比較不穩定，因此目標絡合物的生成反應與原料絡合物的分解反應競爭性地進行。哪一個反應優先進行，這與原料絡合物的穩定性有很強的相關關系，但不僅是絡合物本身的穩定性，推測脂質體內的配體濃度也是重要的因素。由HMPAO和MRP20的分配系數可知游離狀態下的MRP20比HMPAO的脂溶性高很多。膜外的MRP20通過被動擴散容易地透過脂質體膜，因此在脂質體內部也顯示高的游離MRP20濃度，可認為有這樣的過剩的游離配體的共存，可能使絡合物處于難以被水解的狀態。另外還顯示作為絡合物的99mTc-MRP20本身比99mTc-HMPAO的穩定性高(圖4)，是與CD的反應性高的絡合物(圖5)，可推斷這些因素有利于與CD的配體交換反應，在脂質體內也可以以高純度生成99mTc-CD。
脂質體內部的99mTc-CD的放射化學純度越高，則越有望使放射性從肝臟和脾臟迅速消散，因此99mTc-MRP20-CD脂質體比現有的包封有99mTc-CD的脂質體和99mTc-HMPAO-CD脂質體更能大幅降低肝臟和脾臟中的放射性滯留，這可能是由于內部的99mTc-CD純度對給予后的體內放射性分布有很大影響。從所給予的放射性的74％排到尿液中，其中的91％以99mTc-CD的化學形式被檢測出這一結果也支持上述推測。以上結果顯示通過使用99mTc-MRP20進行配體交換反應，可以以高的放射化學收率制備可解決現有技術的問題——使非特異性放射能的滯留降低、包封有99mTc-CD的脂質體。本發明的包封法對于可進行高精度圖像診斷的99mTc標記脂質體的制備有效。另外本發明的包封法有望為以癌的內用放射治療為目的的細胞殺傷性186/188Re標記脂質體的制備提供基礎認識。
產業實用性通過膜透過性絡合物99mTc-MRP20與CD的配體交換反應，可以高收率獲得99mTc-CD，因此通過本發明的使用99mTc-MRP20進行的配體交換反應，可以以高的放射化學收率和純度制備包封有99mTc-CD的脂質體。另外，由本方法制備的包封有99mTc-CD的脂質體顯示可解決現有技術的問題——大幅降低肝臟和脾臟中的非特異性放射性滯留。本發明可以提高使用99mTc標記脂質體的圖像診斷精度。另外，本發明的方法也可應用于以癌的內用放射線治療為目的的細胞殺傷性186/188Re標記脂質體的制備。
權利要求
1.包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體的制備方法，該方法包括將短半衰期的金屬放射性核素與N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺的絡合物、包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體混合，進行培養。
2.包封有99mTc-亞乙雙半胱氨酸(CD)絡合物的脂質體的制備方法，該方法包括將99mTc-N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺和包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體混合，進行培養。
3.包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體，該脂質體通過將短半衰期的金屬放射性核素與N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺的絡合物、包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體混合、培養來制備。
4.包封有99mTc-亞乙雙半胱氨酸(CD)絡合物的脂質體，該脂質體將99mTc-N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺和包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體混合、培養來制備。
5.診斷劑或治療劑，該診斷劑或治療劑含有權利要求3或4的脂質體。
6.用于實施權利要求1的包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體的制備方法的試劑盒，該試劑盒包含至少一種選自下述的物質一種或以上的形成脂質體的物質；亞乙雙半胱氨酸(CD)；包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體；短半衰期的金屬放射性核素；N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺；或短半衰期的金屬放射性核素與N-[2(1H-吡咯基甲基)]-N’-(4-戊烯-3-酮-2)乙-1，2-二胺的絡合物。
7.權利要求6的試劑盒，其中短半衰期的金屬放射性核素為99mTc或其鹽。
全文摘要
本發明的目的在于提供以可實用化的放射化學收率和純度制備包封有短半衰期的金屬放射性核素與CD的絡合物的脂質體的方法。本發明提供包封有短半衰期的金屬放射性核素與亞乙雙半胱氨酸(CD)的絡合物的脂質體的制備方法，該方法包括將短半衰期的金屬放射性核素與N－[2(1H－吡咯基甲基)]－N’－(4－戊烯－3－酮－2)乙－1，2－二胺的絡合物、包封有亞乙雙半胱氨酸(CD)的脂質體混合，進行培養。
文檔編號A61P35/00GK1649628SQ0380944
公開日2005年8月3日 申請日期2003年2月25日 優先權日2002年2月26日
發明者荒野泰, 金子惠美, 村上正裕 申請人:天藤制藥株式會社