穩(wěn)定的腺病毒載體及其增殖方法
                            
            
                            
            文檔序號：1028130閱讀：869來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：穩(wěn)定的腺病毒載體及其增殖方法
            
技術(shù)領(lǐng)域：
            本發(fā)明涉及醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及重組腺病毒載體及其應(yīng)用。
            
背景技術(shù)：
            人腺病毒是大小為60-90nm的無包膜二十面體顆粒。迄今為止已經(jīng)鑒別了51種血清型，基于血細胞凝集性質(zhì)及序列同源性將它們再分為6個亞群(Francki et al.1991)?；蚪M長度為34-36kb，其兩側(cè)是末端反向重復(fù)序列(ITR)。病毒感染周期分為早期和晚期階段。在早期階段(感染后6-8小時)，病毒被脫殼且基因組轉(zhuǎn)運進細胞核，之后早期基因區(qū)E1-E4成為轉(zhuǎn)錄活性的。
            
早期區(qū)-1(E1)含有稱為E1A和E1B的兩個轉(zhuǎn)錄區(qū)。E1A區(qū)編碼參與宿主細胞周期修飾及其它病毒轉(zhuǎn)錄區(qū)激活的兩個主要蛋白質(zhì)(參見Russell，2000)。E1B區(qū)編碼兩個主要蛋白質(zhì)，19K和55K，其通過不同途徑阻止得自E1A蛋白活性的凋亡的誘導(dǎo)(Rao et al.，1992；Yew and Berk，1992；參見Shenk，1996)。另外，E1B-55K蛋白是在晚期階段選擇性病毒mRNA轉(zhuǎn)運及抑制宿主蛋白質(zhì)表達所需要的(Pilder et al.，1986)。早期區(qū)-2(E2)也分為E2A和E2B區(qū)，其一起編碼三種蛋白質(zhì)，DNA結(jié)合蛋白、病毒聚合酶和終端前蛋白質(zhì)，這3種蛋白質(zhì)均參與病毒基因組的復(fù)制(參見van der Vliet，1995所述)。E3區(qū)不是體外復(fù)制所必需的，但編碼一些破壞宿主的病毒感染防御機制的蛋白質(zhì)(參見Horwitz，2001所述)。E4區(qū)編碼至少6種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)參與與病毒mRNA剪接和轉(zhuǎn)運、宿主細胞mRNA轉(zhuǎn)運、病毒和細胞轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)化相關(guān)的一些獨特功能(參見Leppard，1997所述)。
            
病毒殼體的形成及病毒基因組的包裝所需的晚期蛋白均產(chǎn)生自主要晚期轉(zhuǎn)錄單位(MLTU)，其在復(fù)制開始后成為充分活性的。差別剪接和聚腺苷酸化的復(fù)雜過程產(chǎn)生15個以上共有一個三聯(lián)前導(dǎo)序列的mRNA物種。早期蛋白E1B 55K和E4 Orf 3及Orf6在調(diào)節(jié)晚期病毒mRNA加工和從核中的轉(zhuǎn)運中起關(guān)鍵作用(參見Leppard，1998所述)。
            
新形成的病毒基因組在先成的殼體中的包裝由至少兩種腺病毒蛋白質(zhì)即晚期蛋白52/55K和中期蛋白IVa2介導(dǎo)，這通過與位于基因組左側(cè)末端的包裝序列的相互作用而進行(Grable and Hearing，1990；Gustin and Imperiale，1998；Zang et al.，2001)。另一種中期蛋白pIX是殼體的一部分而且已知其穩(wěn)定六鄰體-六鄰體之間的相互作用(Furcinitti et al.，1989)。另外，已經(jīng)將pIX描述為反式激活含有TATA的啟動子如E1A啟動子和MLP(Lutz et al.，1997)。
            
由于對病毒生物學(xué)的廣泛了解及在進入細胞之后的高效核輸送，因此腺病毒已經(jīng)成為將基因輸送進人體細胞的常用工具。另外，腺病毒載體是穩(wěn)定的并可以相對簡易地大規(guī)模生產(chǎn)。在大多數(shù)情況中，載體缺失至少E1區(qū)，這使所述載體產(chǎn)生復(fù)制缺陷。E1缺失的基于亞群C血清型Ad5或Ad2的載體的生產(chǎn)在E1互補細胞系如293(Graham etal.，1970)，911(Fallaux et al.，1996)和PER.C6TM(Fallaux et al.，1998)中完成。正如美國專利5994128所揭示的，載體和細胞系需要仔細匹配以避免通過在所述細胞系和載體中腺病毒序列之間的同源重組而產(chǎn)生有復(fù)制能力的腺病毒。因此，PER.C6TM細胞及匹配的腺病毒載體提供了生產(chǎn)C群腺病毒載體的一種優(yōu)選的系統(tǒng)(Fallaux et al.，1998)。E1序列的缺失提供了將外源基因?qū)氩《据d體中的空間。由于可以摻入病毒體的Ad5基因組的最大大小限于大約wt長度的105％，因此E1缺失的病毒可以容納大約4.8kb的外源DNA(Bett etal.，1993)。
            
缺少pIX的病毒體中最大包裝能力降低至正常基因組長度的大約95％(Ghosh-Choudhury et al.，1987)。這最可能是由pIX-(pIX-minus)病毒體的穩(wěn)定性降低所致。pIX-minus突變體Ad5中的缺乏可以由pIX在用于生產(chǎn)病毒的包裝細胞系中的附加型表達而補足(Caravokyri etal.，1995)。
            
盡管血清型Ad5和Ad2最常用作基因轉(zhuǎn)移載體，但其它血清型也可以具有優(yōu)選的特性使其更適用作治療或預(yù)防工具。例如亞群B病毒Ad35和Ad11與Ad5和Ad2病毒相比不易于被人血清中和(見WO 00/70071所揭示)。
            
腺病毒轉(zhuǎn)移載體的中和使體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效力降低。另外，發(fā)現(xiàn)與Ad5病毒相比，攜帶Ad35的尾絲的重組病毒對抗原呈遞細如樹突細胞的感染效力在體外顯著增強(WO 00/70071，WO 02/24730)。因此，基于Ad35的載體組合了在人血清中低中和度的高度改良的感染效力，使這種載體適于進行免疫接種。
            
使用下文揭示的技術(shù)可以產(chǎn)生和增殖完全E1缺失的基于Ad35的載體。然而，對多種重組基于Ad35的載體進行仔細分析表明這種載體的穩(wěn)定性較差，即與基于Ad5的載體相比可容納較少量的外源DNA。本發(fā)明的手段和方法解決了這個問題。
            
另外，需要進一步揭示針對具有更廣泛血清型用途的腺病毒的可利用的技術(shù)?，F(xiàn)有的包裝細胞系典型地包含衍生自腺病毒血清型5的E1編碼的蛋白質(zhì)。這種‘標準’包裝細胞系例如是293、911和PER.C6TM。在這些標準包裝細胞系上生產(chǎn)衍生自其它血清型的載體的嘗試不是不成功就是很費力。根據(jù)所用的特殊血清型偶爾見到一些產(chǎn)品。然而，衍生自除了亞群C之外的腺病毒亞群的，由Ad5的E1轉(zhuǎn)化和無限增殖化的細胞系上生產(chǎn)的重組腺病毒載體的產(chǎn)量很低。在Abrahamsen等(1997)的論文中，揭示了與缺乏Ad5的E4-orf6序列的293細胞相比，在包含衍生自腺病毒血清型5的E4-orf6的293細胞上觀測到E1A缺失的腺病毒血清型7載體(亞群B)的改進的噬斑純化。然而，由于在噬斑純化的原種中觀測到不希望的重組而遇到載體穩(wěn)定性的問題。另一個問題是在生產(chǎn)期間野生型腺病毒污染問題。另外，就腺病毒的大規(guī)模生產(chǎn)而言，共同轉(zhuǎn)染E4-orf6以獲得足夠高到可以應(yīng)用的滴度是無用的。生長這種腺病毒的一個選則是提供具有穩(wěn)定整合進互補/包裝細胞系的基因組中的E4-orf6基因的細胞。這種細胞在本領(lǐng)域已經(jīng)加以描述(例如WO 96/22378所述)。這個系統(tǒng)的缺點是必須產(chǎn)生新的穩(wěn)定細胞系，而且在產(chǎn)生穩(wěn)定及正確的細胞之前必須進行許多次選擇循環(huán)。這個過程費力又費時。通常地，可以確定來自除了血清型5(亞群C)之外的血清型的腺病毒如亞群B病毒的產(chǎn)生和增殖在Ad5互補細胞上難以進行。正如WO 00/70071所揭示的，基于亞群B病毒Ad35的重組病毒可以通過含有Ad35早期區(qū)-1序列(Ad35-E1)的一表達構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生。另外，僅缺失E1A序列而未缺失E1B序列的基于Ad35的病毒示出在PER.C6細胞上有效復(fù)制，提示Ad5的E1A蛋白能互補Ad35-E1A功能(WO 02/40665)。此外，該實驗示出缺少Ad35-E1B導(dǎo)致在Ad5互補細胞上產(chǎn)量較少。WO 00/70071還揭示了生產(chǎn)E1缺失的非C群腺病毒載體的細胞系，通過進一步修飾能互補腺病毒血清型5的細胞系進行。WO 00/70071進一步提示應(yīng)確立攜帶Ad35-E1序列的新的細胞系以互補缺少E1區(qū)的重組腺病毒血清型35載體(見WO 02/40665所述)。然而，正如上所述，如果針對特別需要而應(yīng)用一種特異的血清型，不得不針對每一種特異的血清型確立一種新的細胞系，或者不得不修飾能互補腺病毒血清型5的可利用的細胞系以互補感興趣的血清型。這對于應(yīng)用本領(lǐng)域已知的確立并有效的方法，應(yīng)用本領(lǐng)域可利用的確立細胞系而不經(jīng)修飾應(yīng)用這些細胞系生產(chǎn)所有其它的非Ad5血清型顯然是有利的。
            
可以推斷仍需要一種生產(chǎn)系統(tǒng)以生產(chǎn)與亞群C血清型不同的有用產(chǎn)量的腺病毒血清型。另外，仍需要包含常規(guī)包裝細胞及穩(wěn)定的并可以在這種包裝細胞上增殖的重組亞群B腺病毒的合適的包裝系統(tǒng)。
            
附圖簡述
            

            

            
圖1pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3的圖譜。
            
圖2在有和無E3區(qū)的Ad35 E1缺失的病毒上產(chǎn)生的PCR片段的凝膠分析。P1＝質(zhì)粒對照；M＝標記1kb plus ladder(Invitrogen)；mQ＝H2O。基因組長度以kb標示。
            
圖3A用MEGalign軟件(DNAstar)使用Clustal方法產(chǎn)生的多種腺病毒的近端pIX上游序列區(qū)的序列對比。序列來源在文中指明。方框內(nèi)的是Ad5和Ad2中的Sp1位點和TATA框(見Babiss和Vales，1991所述)。
            
圖3B圖3A中給出的序列的近端pIX區(qū)中推定的Sp1和TATA框的示意性對比。
            
圖4pAdApt535.Luc的圖譜。
            
圖5pAdApt535的圖譜。
            
圖6A在分離自Ad35.AdApt.Luc和Ad35.AdApt535.Luc病毒的DNA上產(chǎn)生的或者在對照質(zhì)粒上產(chǎn)生的PCR片段的凝膠分析。M＝標記(1kb plus ladder，Invitrogen)。使用兩個特異性PCR擴增分析每個病毒制備物或?qū)φ召|(zhì)粒。
            
圖6B在Ad35.AdApt.LacZΔE3(35LacZ)和Ad35.AdApt535.LacZΔE3(535LacZ)病毒上或者在對照質(zhì)粒上產(chǎn)生的PCR片段的凝膠分析。
            
圖7pBr.Ad35.ΔSM.AdApt.LacZ的圖譜。
            
圖8E1B啟動子和55K編碼區(qū)中推定的啟動子的示意圖。
            
圖9可用于產(chǎn)生獨特片段以鑒別推定的啟動子的55K區(qū)域中限制位點的示意圖。位置編號根據(jù)其在野生型Ad35中的位置而定。
            
圖10三種不同的亞群B血清型中E1A區(qū)和E1B/pIX區(qū)的polyA信號之間的區(qū)域的序列對比。
            
圖11質(zhì)粒pΔMT.Orf6.Hygro(ECACC保藏號P02041226)的示意圖。
            
圖12質(zhì)粒pAd35.ΔMT.Orf6的示意圖。
            
圖13pUC.35-5E4的示意圖。
            
圖14產(chǎn)生pUC.35-5E4的克隆步驟。
            
圖15pBr.Ad35.PRn的示意圖。
            
圖16pBr.Ad35.PR5E4(ECACC保藏號P02041229)的示意圖。
            
圖17pWE.Ad35.pIX-rITR5E4的示意圖。
            
圖18pCRscriptAmp.NFI-NcoIR的示意圖。
            
圖19pCRscriptAmp.NcoIF-NR2的示意圖。
            
圖20pCR.NF1-NR2的示意圖。
            
圖21Ad5的E4-orf6(上方序列)與克隆進Ad35主鏈中的Ad5的E4-orf6(中間序列)及Ad35 E4-orf6序列(下方序列)之間的序列對比，示出所述完整片段已經(jīng)被置換。
            
圖22Ad5的E4-orf6/7(上方序列)與克隆進Ad35主鏈中部分Ad5 E4-orf6/7(中間序列)及Ad35 E4-orf6/7序列(下方序列)之間的序列對比，示出orf6/7序列是部分嵌合的，大約在第138位的賴氨酸(K)殘基融合。
            
圖23pBr.Ad35.PR.5Orf6(ECACC保藏號P02041227)的示意圖。
            
圖24pWE.Ad35.pIX-rITR.5Orf6的示意圖。
            
圖25pBr.Ad35.PRnΔE3的示意圖。
            
圖26pBr.Ad35.ΔE3.PR5E4的示意圖。
            
圖27pBr.Ad35.ΔE3.PR5Orf6的示意圖。
            
圖28在如PER.C6的細胞中通過雙同源重組(double homologousrecombination)生產(chǎn)重組腺病毒顆粒的系統(tǒng)的示意圖。
            
圖29pWE.Ad35.pIX-EcoRV的示意圖。
            
圖30Ad35及Ad11 pIX-cDNA序列和wt Ad35序列的對比。
            
使用來自DNASTAR的SeqMan軟件對比得自實施例18中所述的克隆的cDNA片段的序列。Ad35 cDNA序列衍生自分離自wtAd35或Ad35E1B+Luc感染的培養(yǎng)物(示出7個克隆中的1個克隆的序列)的RNA，Ad11 cDNA序列衍生自分離自wtAd11感染的培養(yǎng)物的RNA。序列編號是任意的。就Ad35 wt序列而言，示出了wt Ad35序列的第3339至3628位核苷酸。內(nèi)含子序列(在cDNA序列中見到的一缺口)的兩側(cè)有剪接供體(SD)和剪接受體(SA)位點，與已知共有序列密切匹配。SeqMan軟件將來自SD的前兩個核苷酸(AG)放置在cDNA序列中的內(nèi)含子序列的3’端而不是5’端。
            
圖31Ad35病毒中pIX加帽位點的位置。
            
Ad35中E1B基因和pIX序列附近的基因組組構(gòu)的示意圖；描述了pIX mRNA中轉(zhuǎn)錄起始位點和內(nèi)含子邊界。核苷酸序列為wt Ad35DNA(WO 00/70071)。M＝MunI，B＝Bsu36I，SD＝剪接供體，SA＝剪接受體。轉(zhuǎn)錄起始位點(第3339位核苷酸，加帽位點)，55K的終止密碼子(TAA)及pIX的起始密碼子(第3484位核苷酸，ATG)以黑體字標示。虛線標示未示出的序列。
            
圖32來自保留166bp的3’E1B序列的Ad35病毒的轉(zhuǎn)基因PCR結(jié)果。
            
對Ad35.AdAptBsuLuc5Orf6(泳道1-9)和Ad35.AdAptBsuLuc病毒(泳道10-14)進行轉(zhuǎn)基因PCR分析的結(jié)果示意圖。M＝1kb+標記(Invitrogen)，P＝pAdAptBsuLuc對照質(zhì)粒。
            
發(fā)明概述
            
本發(fā)明揭示了一種重組B群腺病毒，其在接近E1B 55K的終止密碼子的E1區(qū)中有一個缺失，與相似的Ad5重組腺病毒相比可以容納較少的外源性序列。看起來當pIX編碼區(qū)在E1B 55K終止密碼子和pIX起始密碼子之間的序列之后時，這是由于在給定的包裝細胞中所述B群病毒中pIX基因的相對低表達所致。這示出當pIX啟動子通過在這種病毒中包含E1B 55K編碼區(qū)的序列或者通過使用一異源啟動子以調(diào)節(jié)pIX而至少部分恢復(fù)時，可以使這種病毒更穩(wěn)定和/或能容納更多的外源性序列，由此在給定的包裝細胞中達到正常表達或者甚至相對過表達。
            
本發(fā)明提供了一種重組腺病毒，其在E1區(qū)內(nèi)具有至少一個缺失，所述重組腺病毒的特征在于在所述腺病毒中存在編碼提高pIX基因表達的E1B 55K基因產(chǎn)物的序列的至少一部分，附帶條件是所述重組腺病毒不表達功能性E1B 55K基因產(chǎn)物。這種腺病毒與缺少全部E1B編碼序列的相應(yīng)腺病毒相比更穩(wěn)定和/或能攜帶更多的外源DNA。優(yōu)選地，所述腺病毒包含位于pIX編碼序列直接上游的大約700個或更少堿基對的序列。在優(yōu)選的實施方案中，所述腺病毒是B群腺病毒，更優(yōu)選的是衍生自或基于Ad35或Ad11的腺病毒。本發(fā)明進一步提供了提高在E1區(qū)中有至少一個缺失的重組腺病毒的穩(wěn)定性和/或包裝能力的方法，所述方法包括保留或再導(dǎo)入編碼E1B 55K基因產(chǎn)物并提高pIX基因在所述腺病毒中表達的序列的至少一部分。除了存在提高pIX基因表達的E1B 55K序列之外，將pIX編碼序列之前的序列改變?yōu)橐桓鼜姷膯幼右彩强赡艿?，從而提高pIX的表達，使得重組腺病毒穩(wěn)定性提高和/或通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的腺病毒顆粒的包裝能力提高。因此本發(fā)明進一步提供了提高缺少至少E1區(qū)及包含外源遺傳信息的重組腺病毒載體的穩(wěn)定性和/或包裝能力的方法和手段，所述方法包括當一種包裝細胞中存在升高水平的pIX基因產(chǎn)物時在所述包裝細胞中表達生產(chǎn)并裝配所述重組腺病毒載體成病毒顆粒所需的元件的步驟，其中所述pIX基因產(chǎn)物的水平升高通過使用在所述載體中的一個修飾的pIX基因而過表達編碼pIX蛋白的遺傳信息而達到，所述修飾使pIX基因產(chǎn)物過表達。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述修飾的pIX基因包含一個異源啟動子，其驅(qū)動編碼pIX的遺傳信息的表達，所述異源啟動子是使所述編碼pIX的遺傳信息在所述包裝細胞中過表達的一個啟動子。在一個實施方案中，所述異源啟動子至少部分衍生自或基于一種腺病毒血清型的pIX啟動子，所述腺病毒血清型與所述重組腺病毒載體的內(nèi)源近端pIX上游序列相比授予較高水平的pIX表達。在一個實施方案中，所述異源啟動子至少部分衍生自或基于Ad5的pIX啟動子。在一個方面，本發(fā)明提供了缺少至少E1區(qū)并包含感興趣的基因的一種重組腺病毒載體，其中pIX基因被修飾，而且其中所述重組腺病毒載體不是衍生自腺病毒血清型5。本發(fā)明再一方面提供了包含一個修飾的腺病毒pIX基因的一種重組核酸序列，其中編碼pIX蛋白的遺傳信息不是衍生自腺病毒血清型5或腺病毒血清型7 pIX編碼序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述修飾的pIX基因包含驅(qū)動編碼pIX的遺傳信息表達的一個異源啟動子。
            
本發(fā)明進一步提供了包含第一種血清型的腺病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件的重組腺病毒載體，其中所述載體進一步包含編碼E4-orf6蛋白的一個序列，其中所述序列選自以下一組中a)衍生自與所述第一種血清型不同的第二種血清型的腺病毒的E4-orf6編碼序列；b)通過一或多個密碼子的缺失、突變、添加和/或取代衍生自所述第一種血清型的腺病毒的E4-orf6編碼序列；和c)包含一種融合體的E4-orf6編碼序列，所述融合體是衍生自與所述第一種血清型不同的第二種血清型的E4-orf6編碼序列的一部分與衍生自第三種血清型的E4-orf6編碼序列的一部分的融合體，其中所述第三種血清型與所述第一種血清型可以相同或不同。
            
本發(fā)明進一步提供了生產(chǎn)包含第一種血清型腺病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件的這種重組腺病毒載體的方法，所述方法包括如下步驟a)將腺病毒的必需元件提供給包含可表達形式的衍生自第二種血清型腺病毒的E1B-55K編碼序列的互補細胞，以使得可以通過所述互補細胞裝配所述重組腺病毒載體，其中所述元件包含與所述第二種血清型不同的所述第一種血清型腺病毒的至少一些結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件及編碼與所述互補細胞中所述可表達的E1B-55K蛋白相容的功能性E4-orf6蛋白或其功能部分、衍生物和/或類似物的一個序列；b)在生產(chǎn)和裝配腺病毒載體的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述互補細胞；及c)從所述培養(yǎng)基和/或互補細胞中收獲如此生產(chǎn)的重組腺病毒載體，其中編碼相容的E4-orf6蛋白的序列存在于如此生產(chǎn)的重組腺病毒載體中。
            
本發(fā)明進一步提供了包含衍生自一種腺病毒的重組核酸分子的一種重組腺病毒，所述重組核酸分子在E1區(qū)有至少一個缺失，特征在于在所述重組核酸分子中存在編碼E1B-55K基因產(chǎn)物的序列的至少一部分和/或pIX編碼序列在一個異源啟動子的控制之下，所述重組腺病毒進一步包含第一種血清型腺病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件，其中所述重組腺病毒進一步包含編碼功能性E4-orf6蛋白或其功能部分、衍生物和/或類似物的序列，其中所述序列選自以下一組a)衍生自與所述第一種血清型不同的第二種血清型腺病毒的E4-orf6編碼序列；b)衍生自包含一或多個密碼子缺失、突變、添加和/取代的所述第一種血清型腺病毒的E4-orf6編碼序列；及c)包含一個融合體的E4-orf6編碼序列，所述融合體是衍生自第二種血清型的E4-orf6編碼序列的一部分與衍生自第三種血清型的E4-orf6編碼序列的一部分的融合體，其中所述第三種血清型與所述第一種血清型可以相同或不同。
            
本發(fā)明還提供了一種包裝系統(tǒng)，其包含本發(fā)明的一種重組腺病毒及一種包裝細胞，其中所述包裝細胞及所述重組腺病毒共同包含在所述包裝細胞中生產(chǎn)和裝配所述重組腺病毒的所有必需元件，其中所述包裝細胞表達編碼與所述重組腺病毒的E4-orf6蛋白或其功能部分、衍生物和/或類似物相容的至少一種腺病毒E1B-55K蛋白或其功能部分、衍生物和/或類似物的核酸。
            
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)一種包含第一種血清型腺病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件的穩(wěn)定重組腺病毒的方法，其中所述重組腺病毒包含衍生自一種腺病毒的重組核酸分子，所述核酸分子在E1區(qū)中有一個缺失，并且所述重組腺病毒包含衍生自編碼E1B-55K基因產(chǎn)物的序列的至少一部分的核酸，所述基因產(chǎn)物提高pIX蛋白的表達，但不引起來自所述核酸分子的功能性E1B-55K蛋白的表達和/或具有在一個異源啟動子控制下的pIX編碼序列，所述方法包括如下步驟a)將腺病毒的必需元件提供給表達可表達形式的衍生自第二種血清型腺病毒的E1B-55K編碼序列或其功能部分、衍生物和/或類似物的互補細胞，以使得可以通過所述互補細胞裝配所述重組腺病毒載體，其中所述元件包含與所述第二種血清型不同的所述第一種血清型腺病毒的至少一些結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件及一種編碼與所述互補細胞中所述可表達的E1B-55K蛋白相容的功能性E4-orf6蛋白或其功能部分、衍生物和/或類似物的序列；及b)在可以生產(chǎn)和裝配重組腺病毒的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述互補細胞；及c)從所述培養(yǎng)基和/或互補細胞中收獲如此生產(chǎn)的重組腺病毒。
            
本發(fā)明進一步提供了生產(chǎn)含有外源遺傳信息的穩(wěn)定腺病毒載體而不產(chǎn)生可復(fù)制的腺病毒的方法，其中所述載體是除了腺病毒5之外的血清型，所述方法包括如下步驟在適于腺病毒載體生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞或其祖細胞已經(jīng)被提供并表達編碼腺病毒載體生產(chǎn)和包裝所必需的所有元件的核酸，生產(chǎn)可復(fù)制的腺病毒載體所必需的元件存在于至少兩個獨立的核酸分子上而不導(dǎo)致分子間重組，所述必需元件包含來自除了Ad5之外的第一種血清型的腺病毒的至少一種決定血清型的結(jié)構(gòu)元件和非結(jié)構(gòu)元件，并包含來自與第一種血清型不同的第二種血清型的E1B 55K基因產(chǎn)物和與所述E1B 55K基因產(chǎn)物相容的E4 orf6基因產(chǎn)物。在某些實施方案中，編碼腺病毒載體生產(chǎn)和包裝所必需的所有必需元件的核酸包含一個重組pIX基因。在一個實施方案中，重組pIX基因是在一個異源啟動子控制下的pIX編碼序列。
            
另一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防人體或動物疾病或失調(diào)的方法，所述方法包括為人或動物施用本發(fā)明的重組腺病毒載體。在其它方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明腺病毒載體的疫苗和藥物組合物。另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的重組腺病毒載體在制備預(yù)防或治療人或動物疾病或失調(diào)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其包含本發(fā)明提供的細胞系和腺病毒載體以實踐本發(fā)明提供的方法。
            
發(fā)明詳述
            
本發(fā)明的一方面提供了提高在E1區(qū)有至少一個缺失的重組腺病毒的穩(wěn)定性和/或包裝能力的方法，所述方法包括以下步驟相對于當pIX編碼序列位于其沒有E1B 55K序列的內(nèi)源近端上游序列之后時含有的pIX基因產(chǎn)物的水平，當包裝細胞中存在升高水平的pIX基因產(chǎn)物時，在所述包裝細胞中表達生產(chǎn)及裝配所述重組腺病毒成病毒顆粒所需的元件。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，所述pIX基因產(chǎn)物的升高水平是通過在所述腺病毒中保留或再導(dǎo)入部分E1B 55K序列而帶來的。在其它一些實施方案中，所述pIX基因產(chǎn)物的升高水平是通過在一種異源啟動子控制下表達的pIX編碼序列而帶來的。本發(fā)明進一步提供了一種重組腺病毒，其包含在一種表達序列控制下的功能性pIX編碼序列，所述表達序列包含能在給定包裝細胞中增加pIX編碼序列表達的部分E1B 55K序列，所述表達增加是相對于位于其沒有所述部分E1B 55K序列的內(nèi)源近端pIX上游序列之后的所述pIX編碼序列的表達而言，條件是所述部分E1B 55K序列不編碼功能性E1B 55K基因產(chǎn)物。本發(fā)明示出pIX啟動子序列可以存在于所述E1B55K序列中，以及在所述表達序列中包括這些序列可以因此增加pIX表達。相對于所述pIX編碼序列在其沒有所述部分E1B 55K序列的內(nèi)源近端上游序列之后時，所述E1B 55K序列的存在增加了所述重組腺病毒的穩(wěn)定性和/或包裝能力。
            
WO 02/40665中描述了E1區(qū)具有缺失但具有完整E1B 55K編碼區(qū)的血清型35腺病毒(pBr.Ad35.leftITR.ΔE1AΔ21K)。然而，一種功能性55K基因產(chǎn)物如存在于所揭示的載體中的產(chǎn)物抑制凋亡，因此希望的是獲得缺少功能性E1B 55K表達的重組腺病毒，例如通過突變E1B 55K基因或優(yōu)選地通過包括僅僅部分E1B 55K序列，更優(yōu)選包括僅僅E1B 55K起始密碼子下游序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚使所述載體中的E1B 55K序列的量最小化對產(chǎn)生具有最大E1缺失的病毒以容納更多的外源核酸是有益的，同時保留足夠的E1B 55K序列以具有提高重組腺病毒的穩(wěn)定性和/或提高包裝能力的益處。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能發(fā)現(xiàn)E1B 55K內(nèi)使重組腺病毒穩(wěn)定和/或提高包裝能力的最低限度需要的序列，例如通過使用標準分子克隆技術(shù)以獲得從揭示的載體(pBr.Ad35.leftITR.ΔE1AΔ21K)開始的E1B 55K區(qū)域內(nèi)的連續(xù)缺失，并確定穩(wěn)定性和包裝能力而進行。因此本發(fā)明的一個目的是提供一種重組腺病毒載體，其中所述編碼E1B55K基因產(chǎn)物的序列包含正好位于pIX可讀框直接上游的大約0.7kb或更少的腺病毒序列。在其它實施方案中，所述序列包含正好位于pIX可讀框直接上游的腺病毒序列的不超過大約680、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100個核苷酸。在一個實施方案中，這種重組腺病毒載體保留166bp的55K編碼序列的3’端。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚本發(fā)明非限于存在在天然腺病毒中pIX編碼序列的直接上游鄰近序列中發(fā)現(xiàn)的一個序列。根據(jù)本發(fā)明其也可以具有更上游的即來自E1B 55K區(qū)域的序列(例如一個限制或PCR片段，見例如實施例10和圖9)與更近端的pIX調(diào)節(jié)序列融合，從而產(chǎn)生調(diào)節(jié)序列的一個人工組合，只要當與不存在任何E1B 55K序列時相對比時導(dǎo)致pIX在給定的包裝細胞中表達提高即可。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述腺病毒是B亞群腺病毒，更優(yōu)選是Ad35或Ad11腺病毒。血清型35或11的腺病毒已經(jīng)示出特別適于施用給人體，因為與目前使用最多的血清型5相比其有少得多的個體具有這些血清型的中和抗體(WO 00/70071)。本發(fā)明的另一方面提供了可作為本發(fā)明的腺病毒的基因組的核酸。
            
另外或者除了存在提高pIX基因表達的E1B 55K序列之外，也可以通過突變pIX基因，優(yōu)選其啟動子而過表達pIX自身，以提高重組腺病毒的穩(wěn)定性和/或包裝能力。一種修飾的pIX基因是具有不同啟動子和/或轉(zhuǎn)錄終止子，和/或突變的編碼序列例如通過密碼子優(yōu)化、導(dǎo)入穩(wěn)定RNA的內(nèi)含子等獲得的突變序列的pIX基因。本發(fā)明的pIX基因包含編碼pIX的遺傳信息，并包括核酸如在天然腺病毒中發(fā)現(xiàn)的pIX基因、等位基因變體形式的編碼突變pIX的cDNA及信息或者編碼突變pIX的核酸，所述突變pIX具有至少部分pIX功能，其與正常pIX可以在定量或定性程度上不同，其衍生自或基于通過氨基酸突變、缺失、添加或移位或其組合而產(chǎn)生的pIX。
            
如果一種重組腺病毒缺失至少E1B 55K區(qū)域直至包括E1B 55K基因產(chǎn)物的終止密碼子，pIX可讀框?qū)⑽挥贓1B 55K終止密碼子和pIX的起始密碼子之間的序列之后。這些序列在此稱為“內(nèi)源近端pIX上游序列”(例如基于Ad35的重組腺病毒載體中的Ad35 pIX上游序列、基于Ad11的重組腺病毒載體中的Ad11 pIX上游序列等在此方面稱為內(nèi)源性的；所述定義包括在天然發(fā)現(xiàn)的及不是在實驗室中產(chǎn)生的等位基因變體；針對一些近端pIX上游序列見圖3A所示)。
            
在此所用術(shù)語“異源啟動子”是指與天然發(fā)現(xiàn)的pIX基因上游的序列，包括E1B 55K區(qū)域的序列及內(nèi)源近端pIX上游序列不同的任何序列，并能作為啟動子從而調(diào)節(jié)pIX編碼序列的轉(zhuǎn)錄。一方面，異源啟動子可以是至少部分衍生自或基于來自與重組腺病毒載體衍生自其中的血清型不同的另一種血清型腺病毒的近端pIX上游序列(即E1B 55K終止密碼子與pIX的起始密碼子之間的序列)的一個序列(例如Ad35重組腺病毒載體中Ad5 pIX上游序列)。在此將其稱為“非內(nèi)源性近端pIX啟動子”。
            
在本發(fā)明的一個實施方案中，Ad35衍生的pIX表達由Ad5非內(nèi)源性近端pIX啟動子驅(qū)動?？梢允褂醚苌曰蚧趤碜耘c腺病毒載體的內(nèi)源性pIX近端序列相比授予較高水平pIX表達的血清型的近端pIX上游序列的任何非內(nèi)源性近端pIX啟動子。這種非內(nèi)源性近端pIX啟動子的鑒別可以基于序列信息，如本領(lǐng)域技術(shù)人員從實施例4中顯而易見的信息。在特殊的實施方案中，本發(fā)明的腺病毒載體衍生自或基于腺病毒亞群E血清型，或者優(yōu)選亞群B血清型。在特異的實施方案中，所述腺病毒載體衍生自或基于腺病毒血清型35(Ad35)、Ad11、Ad7或Ad4。在另外的實施方案中，所述非內(nèi)源性近端pIX啟動子是至少部分衍生自或基于亞群C、A、D或F的腺病毒的近端pIX上游序列。在特殊的實施方案中，所述非內(nèi)源性近端pIX啟動子至少部分衍生自或基于腺病毒血清型12(Ad12)、Ad9或Ad40，或者更優(yōu)選Ad5或Ad2的近端pIX上游序列?；蛘?，作為非內(nèi)源近端pIX啟動子的序列可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通分子學(xué)方法根據(jù)經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，如通過轉(zhuǎn)錄分析進行，其中可以常規(guī)測試啟動子強度。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚來自啟動子的元件可以交換而不用交換整個啟動子，例如添加、缺失或突變已知的啟動子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列可以影響其強度。突變至少一部分啟動子序列可以通過突變對序列加以改變而進行，如通過添加、缺失或交換一或多個核苷酸，包括具有已知功能的核苷酸序列而進行。取代啟動子序列通過一個不同的啟動子置換部分或全部這些序列而進行。這種置換可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標準分子生物學(xué)技術(shù)進行?？梢詷?gòu)建與選擇的pIX基因可操縱相關(guān)的任何啟動子并測試其作用。
            
另一方面，一種異源啟動子與腺病毒非內(nèi)源近端pIX啟動子不相關(guān)。因此，異源啟動子也可以是病毒啟動子，包括但非限于基于或衍生自巨細胞病毒(CMV，例如人CMV立即早期基因啟動子，在此稱作CMV啟動子)、勞斯肉瘤病毒(RSV，例如RSV長末端重復(fù)啟動子，在此稱作RSV啟動子)、TK、HBV、SV40等的啟動子。在一個實施方案中，一種腺病毒E1B啟動子用作異源啟動子。細胞啟動子也可以用作異源啟動子，這些啟動子包括但非限于來自PGK、金屬硫蛋白、EF1-α、β-肌動蛋白等的啟動子。本發(fā)明也可以使用包含來自一個以上啟動子的元件的合成的或雜合啟動子，這些啟動子均包含在稱為異源啟動子的范圍內(nèi)。所用的啟動子可以是組成型或可誘導(dǎo)啟動子。就可誘導(dǎo)啟動子而言，如果一種啟動子在其被誘導(dǎo)狀態(tài)提供過表達則認為其適于本發(fā)明。導(dǎo)致本發(fā)明的pIX過表達的任何啟動子序列均可用作本發(fā)明的異源啟動子。除了啟動子強度之外，另一方面確定一特殊啟動子當存在于重組腺病毒載體中時的效力是其大小，較長的啟動子將占據(jù)轉(zhuǎn)基因可利用的空間。本領(lǐng)域技術(shù)人員能使用本發(fā)明針對啟動子長度和強度考慮到插入體大小而用實驗方法優(yōu)化載體，以發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的重組載體。
            
顯而易見異源啟動子仍可以含有或包括部分或全部內(nèi)源近端pIX上游序列，或者全部置換這些序列，只要根據(jù)本發(fā)明的異源啟動子可以引起編碼pIX的遺傳信息在選擇的包裝細胞中過表達即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員也清楚當一內(nèi)源非pIX腺病毒啟動子(例如E1A、E2A、等啟動子)或例如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的一異源啟動子通過使用非pIX腺病毒基因或轉(zhuǎn)基因與pIX編碼序列(以任一順序)之間的內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)用于驅(qū)動pIX表達時，根據(jù)本發(fā)明認為該啟動子包含在稱為“異源啟動子”的范圍內(nèi)。
            
本發(fā)明中pIX基因產(chǎn)物水平的升高或增加是pIX基因在選擇的包裝細胞中過表達的結(jié)果。在此所述pIX基因的過表達是指在給定的包裝細胞中pIX的表達水平在RNA或蛋白質(zhì)水平或這兩個水平上均高于當pIX的編碼區(qū)位于內(nèi)源近端pIX上游序列之后時獲得的pIX表達水平。在本發(fā)明中“過表達”是指一腺病毒的特定異源啟動子-pIX組合與選擇的特定包裝細胞的組合的過表達。確定表達水平的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括但非限于RT-PCR、Northern印跡、Western印跡等。就本發(fā)明而言，測定過表達通過確定在選擇的給定包裝細胞中具有給定的插入體(例如熒光素酶)的重組腺病毒中的表達水平，其中編碼pIX的遺傳信息在沒有E1B 55K序列的內(nèi)源近端pIX上游序列之后，并將這些表達水平與在重組腺病毒中的那些表達水平相對比，其除了pIX編碼區(qū)由異源啟動子或來自內(nèi)源E1B 55K基因的序列(其天然啟動子已經(jīng)至少部分被重構(gòu))調(diào)節(jié)外其它都一樣。pIX的過表達是以高于1的比率表示的，所述比率是通過異源或天然啟動子獲得的表達水平與通過無E1B 55K序列的內(nèi)源近端pIX上游序列獲得的表達水平的比率。包裝細胞的選擇通過如與包裝細胞中與互補腺病毒功能相互作用的重組腺病毒的元件的血清型、產(chǎn)物純度(如沒有來自產(chǎn)生的批次物中的能復(fù)制的腺病毒)、使用便利性、生長特性等因素加以確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知包裝細胞的實例，包括在此使用的293細胞、911細胞和PER.C6TM細胞以及其適于互補特異血清型的腺病毒載體的衍生物如PER55K。
            
應(yīng)清楚在本發(fā)明的所有實施方案中，pIX編碼序列及驅(qū)動pIX表達的調(diào)節(jié)序列可以位于腺病毒基因組中其天然位置上，以及在腺病毒基因組的不同部分中，例如在最初含有E3序列的區(qū)域中。
            
穩(wěn)定性提高的重組腺病毒能將較大的基因組摻入病毒顆粒中(病毒體)。因此，提高在此使用的重組腺病毒的穩(wěn)定性使得本發(fā)明的重組腺病毒可以包括更多的外源遺傳信息，包括感興趣的基因。另外，根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定提高的重組腺病毒能增殖更多代而無不穩(wěn)定的跡象。穩(wěn)定性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一些方法測定，包括但非限于對重組病毒進行PCR以證明希望的重組腺病毒載體的存在。不穩(wěn)定將產(chǎn)生副產(chǎn)物，其也可以通過PCR等方法觀測到。也可以使用病毒DNA的限制分析、確定病毒顆粒的相對感染性、確定腺病毒顆粒的熱穩(wěn)定性等確定重組腺病毒載體的穩(wěn)定性(Caravokyri andLeppard，1995)。確定重組腺病毒載體的穩(wěn)定性/不穩(wěn)定性的方法見本申請的實施例3所述。在此使用的一種重組腺病毒，也稱作重組腺病毒載體或腺病毒載體，衍生自或基于一種腺病毒，缺少腺病毒的至少部分E1區(qū)(包含E1A和E1B基因)并可以包含希望通過所述載體輸送和/或表達的外源遺傳信息。在此所用的外源遺傳信息是非天然存在于腺病毒中的任何遺傳信息，也稱作轉(zhuǎn)基因。這包括但非限于感興趣的基因、表達盒等。這種外源遺傳信息可以充填基因組中已經(jīng)通過腺病毒E1序列的缺失而可利用的空間。重組腺病毒載體用于多種目的，如在基因治療、疫苗制備等應(yīng)用中。除了E1區(qū)缺失之外，E3序列也從這種腺病毒載體中缺失，以在某些優(yōu)選的實施方案中提高對外源遺傳信息的容量。當需要復(fù)制腺病毒載體時，如果需要與包含腺病毒載體中缺少的遺傳信息的包裝細胞組合，可以使用組合E1缺失的其它缺失及E2、E3和E4區(qū)的部分或完全缺失的多種組合。具有組合了腺病毒基因組中任選任何其它缺失的E1區(qū)缺失的所有重組腺病毒包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明的腺病毒可以用于不同方案中，如基因治療或預(yù)防和/或治療性免疫接種，包括腫瘤免疫接種和抗病毒免疫接種。為此，腺病毒載體作為基因輸送載體，其中將一種非天然基因摻入腺病毒基因組中。該腺病毒顆粒隨后可特異性定向于感興趣的靶細胞；腺病毒通過殼體-受體結(jié)合或者通過其它方式與特異細胞結(jié)合，并輸送轉(zhuǎn)基因。腺病毒的定向可以以許多不同方式進行。腺病毒載體定向領(lǐng)域的技術(shù)人員知道用于將腺病毒載體輸送于感興趣的細胞的所有不同的可能性。這種可能性包括但非限于殼體改變(尾絲、六鄰體和/或五鄰體修飾，如缺失，不同血清型的尾絲之間的交換，及添加肽和/或其它結(jié)合組分)，其中產(chǎn)生了識別感興趣的細胞上存在的受體的嵌合尾絲，或者其中利用了基于五鄰體的結(jié)合。其它可能性是將定向組分與殼體蛋白連接，其中例如將結(jié)合肽、已知的強結(jié)合蛋白或者抗體或其一部分與殼體蛋白連接以實現(xiàn)特異性定向。這種載體均可使用本發(fā)明提供的方法和手段生產(chǎn)。
            
因此，本發(fā)明還揭示了根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒載體，其進一步包含編碼非腺病毒蛋白的一個序列。這種序列可以存在于腺病毒主鏈內(nèi)的不同位置上，但優(yōu)選位于本發(fā)明的重組腺病毒載體中缺少的E1區(qū)中。E1區(qū)由互補細胞中存在的互補元件互補。啟動子、轉(zhuǎn)基因及其它調(diào)節(jié)序列的方向可以朝向左側(cè)以及右側(cè)反向末端重復(fù)。
            
本發(fā)明還用于生產(chǎn)基于腺病毒和/或其它病毒如腺伴隨病毒(AAV)的病毒載體，其中如Ad-AAV嵌合病毒的組合可以整合進宿主細胞基因組中。本領(lǐng)域已知產(chǎn)生整合的腺病毒的一些方法。通常地，本發(fā)明也用于生產(chǎn)可(特異性或非特異性)整合的腺病毒形式。
            
正如所提及的，一些非腺病毒轉(zhuǎn)基因可以克隆進本發(fā)明的重組腺病毒載體中。這些不僅包括調(diào)節(jié)性核酸序列如增強子、啟動子(例如強非腺病毒啟動子如巨細胞病毒啟動子、SV40啟動子及RSV啟動子)及聚腺苷酸化信號，也包括針對治療目的的異源基因。因此，在本發(fā)明的一個方面中，提供了本發(fā)明的重組腺病毒載體，其中所述非腺病毒蛋白選自以下一組細胞死亡誘導(dǎo)多肽、腫瘤特異性抗原、病毒蛋白、激素和細胞因子。非腺病毒因子、蛋白質(zhì)、多肽和肽的非限制性實例是轉(zhuǎn)錄因子、細胞內(nèi)信號化蛋白、磷酸酶、激酶、凋亡抑制因子、受體拮抗劑、可溶形式的膜結(jié)合受體、RNA抑制劑、反義RNA′s、誘餌因子(decoy factors)、核酶，及更特異性地，胸苷激酶、促紅細胞生成素、新紅細胞生成刺激蛋白(NESP)、IL3、ceNOS、γ-干擾素和gp100。就免疫接種目的而言，非腺病毒病毒蛋白可以克隆進通過本發(fā)明的方法和手段提供的重組腺病毒載體中。這種病毒蛋白包括但非限于針對HIV疫苗的gag、pol、env、nef等，針對人乳頭狀瘤病毒疫苗的E6和E7蛋白，針對瘧疾疫苗的來自瘧原蟲(Plasmodiumprotozoa)的環(huán)子孢子蛋白，針對輪狀病毒疫苗的輪狀病毒成分，針對埃博拉病毒(ebola)疫苗的埃博拉病毒蛋白，針對呼吸道合胞病毒疫苗的來自呼吸道合胞病毒的F和G基因產(chǎn)物，針對流感疫苗的HA和NA等。
            
根據(jù)本發(fā)明的腺病毒優(yōu)選是人腺病毒，即衍生自或基于能感染人細胞的腺病毒，但本發(fā)明同樣用于非人腺病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道除了所有人腺病毒之外，本領(lǐng)域已經(jīng)鑒別了許多非人腺病毒。明顯地，非人腺病毒也可以用于達到本發(fā)明揭示的相同結(jié)果。使用本發(fā)明的方法和手段可以生產(chǎn)的非人腺病毒的非限制性實例是狗、牛、猴和鳥腺病毒。在此所用的血清型因此超出物種限制性血清型。
            
在此所用術(shù)語“衍生自”是指在腺病毒中正常發(fā)現(xiàn)的核酸序列、基因或蛋白質(zhì)用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知產(chǎn)生這種重組腺病毒的方法，包括但非限于普通分子生物學(xué)方法如利用限制酶將遺傳信息克隆進希望的constellations中的方法等。重組腺病毒也可以基于腺病毒序列。“基于”是指包括基于對這種遺傳信息的了解合成構(gòu)建遺傳信息。這種方法包括但非限于使用腺病毒遺傳物質(zhì)作為PCR模板以構(gòu)建一種基于所述模板腺病毒的序列的新的腺病毒構(gòu)建體，構(gòu)建具有希望序列的完全合成的遺傳信息，例如通過將合成的寡核苷酸與希望的構(gòu)建體連接而進行等。應(yīng)理解“衍生自”非必需意味著野生型DNA的直接克隆。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道獲得某一核酸的突變形式的分子生物學(xué)可能性。這些突變可以導(dǎo)致不同的功能性，但它們在一種方式中也可以是沉默的，即在某些突變不改變特定DNA及其編碼的蛋白質(zhì)的功能性的方式中。因此，術(shù)語“其功能部分、衍生物和/類似物”應(yīng)理解為與其相關(guān)的核酸的等同物。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到某些缺失、交換、(點)突變、添加等也可以產(chǎn)生與原始核酸具有相似功能的核酸。因此應(yīng)理解不顯著改變蛋白質(zhì)如pIX蛋白、E4-orf6和E1B-55K基因產(chǎn)物的功能這種變化在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚獲得編碼重組腺病毒的遺傳信息的方法在不偏離本發(fā)明的范圍內(nèi)可以變化。
            
人腺病毒分為A-F亞群，其涵蓋了51個血清型(見例如EP0978566所述)。就一些應(yīng)用而言，使用衍生自或基于來自特異亞群或來自針對希望的細胞類型例如樹突細胞具有組織向性的某些血清型的腺病毒的腺病毒載體可以是有益的(WO02/24730)。在種群中一般沒有抗來自某些亞群或來自一特異性血清型的腺病毒的中和抗體對決定選擇的血清型也是一個重要參數(shù)(WO 00/70071)。由于亞群B病毒之間的相似性(見例如實施例4和11)，期望本發(fā)明特別適用于亞群B的腺病毒。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實施方案涉及衍生自或基于亞群B中分類的腺病毒的腺病毒載體。人腺病毒的亞群B包含Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35和Ad50。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案涉及衍生自或基于Ad35或Ad11血清型的重組腺病毒載體。除了針對特異性應(yīng)用而選擇血清型之外，可以使用所謂的嵌合腺病毒。這些嵌合腺病毒包含來自一或多個腺病毒血清型的編碼包被蛋白如尾絲、五鄰體或六鄰體的部分或全部遺傳序列，與來自其它血清型的剩余遺傳信息(主要腺病毒載體部分)連接，其可用于降低主要腺病毒載體的免疫原性或改變主要腺病毒載體的組織向性(EP0978566)。在此所用術(shù)語“主要”是指其為所述嵌合病毒提供大多數(shù)遺傳信息，嵌合腺病毒因此包含在這種病毒的主要部分的血清型組中。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚當這些嵌合病毒面臨相似的不穩(wěn)定性問題時，本發(fā)明也可以用于這種嵌合腺病毒?？梢岳缙谕珹d35序列作為主要部分并包含衍生自或基于例如Ad11腺病毒的尾絲的嵌合腺病毒在增殖方面與針對Ad35重組腺病毒載體所報道的具有相似的不穩(wěn)定性。因此，當在本申請中提及重組腺病毒時，嵌合腺病毒載體包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
            
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知生產(chǎn)和裝配重組腺病毒載體所必需的元件(如前述；US patent 5,994,128；Russell，2000)。以病毒體形式生產(chǎn)E1缺失的重組腺病毒是在包裝細胞中進行的，該細胞也稱作互補細胞。這種細胞反式(in trans)提供在所述重組腺病毒中缺少的生產(chǎn)重組病毒(重組病毒體)所必需的腺病毒的遺傳信息。熟知的包裝細胞是293細胞、911細胞和PER.C6TM細胞(如前)。就大多數(shù)目的而言，優(yōu)選使用一種包裝細胞和缺少引起同源重組而產(chǎn)生能復(fù)制的腺病毒的重疊序列的一種重組腺病毒載體(US patent 5,994,128)。在Centerfor Applied Microbiology and Research的European Collection ofAnimal Cell Cultures以保藏號96022940保藏的PER.C6TM因此是增殖重組腺病毒的一種非常合適的包裝細胞。也已經(jīng)設(shè)想減少產(chǎn)生能復(fù)制的腺病毒的其它方法，涉及例如操縱腺病毒序列以降低包裝細胞和載體中存在的序列之間的同源性(例如Hehir et al.，1996；Robert etal.，2001所述)。除了必需的E1區(qū)之外，包裝細胞還可包含其它腺病毒序列以在當在所用的重組腺病毒中功能性缺少例如部分或全部E2、E4等時互補其它腺病毒功能。包裝細胞中的互補信息可以整合在基因組中，或者作為染色體外拷貝存在于例如質(zhì)粒、載體、粘粒等上。其它方法利用所謂的輔助病毒，其包含在重組腺病毒中缺少的遺傳信息。重組腺病毒載體也用作所謂的輔助病毒，用于生產(chǎn)含有缺失大部分或全部腺病毒基因的基因組的重組腺病毒(gutless載體或輔助依賴性腺病毒)。在這種gutless腺病毒的最后生產(chǎn)中，需要避免輔助腺病毒的包裝。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知實現(xiàn)這種目的的方法，例如在包裝信號中遺傳工程化的位點上使用位點特異性重組酶以缺失這種包裝信號。通常必需使用CsCl梯度分離從希望的gutless病毒中分離剩余的輔助病毒。當輔助和gutless病毒的基因組長度最大程度不同時，易于達到這個目的。因此，優(yōu)選使用大的而不是小的輔助病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚本發(fā)明可同樣用于提高重組腺病毒的穩(wěn)定性，通過使用具有升高的pIX表達的重組輔助病毒進行，這可以通過本發(fā)明中所述的方法實現(xiàn)。含有可用于互補重組腺病毒的遺傳信息以產(chǎn)生重組病毒顆粒的任何細胞，包含在包裝細胞的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚通過本發(fā)明獲得的優(yōu)勢非依賴于所用的包裝細胞。
            
編碼pIX的遺傳信息可以存在于重組腺病毒載體上，也可以不依賴于所述重組腺病毒載體而存在，這種病毒外遺傳信息(extraviralgenetic information)可以整合進基因組中或者作為染色體外拷貝存在于例如質(zhì)粒、載體、粘粒等之上。將遺傳信息導(dǎo)入包裝細胞中可以根據(jù)多種方法進行，如通過lipofectamin轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、病毒感染等方法進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這種方法，而且用于導(dǎo)入遺傳信息的方法就本發(fā)明范圍不是關(guān)鍵的。本文所用的可表達形式的功能性pIX是指編碼pIX的遺傳信息，其與能驅(qū)動所述編碼pIX的遺傳信息在包裝細胞中表達的啟動子或其它調(diào)節(jié)序列可操縱地連接。將遺傳信息導(dǎo)入包裝細胞可以在導(dǎo)入重組腺病毒載體之前、同時或之后進行。發(fā)現(xiàn)pIX在基于293的包裝細胞系中的組成型附加型表達互補pIX突變體腺病毒類型5的缺乏(Caravokyri and Leppard，1995)。然而，就這種應(yīng)用而言，需要含有EBNA1表達盒的特殊附加型質(zhì)粒，而且這種細胞系中腺病毒載體的增殖經(jīng)受部分附加體非常可能成為重組腺病毒載體一部分的不利狀況。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，編碼功能性pIX的遺傳信息存在于腺病毒載體上。
            
在減少產(chǎn)生能復(fù)制的腺病毒的重組量的嘗試中，一些作者使用衍生自由Ad5的突變的pIX啟動子驅(qū)動的B群病毒Ad7的pIX基因以消除(含有Ad5衍生的序列)包裝細胞與重組腺病毒載體的核酸之間的重疊(Robert et al.，2001)。然而，那些實驗未提高病毒載體的穩(wěn)定性，而且在那些實驗中未測定這種穩(wěn)定性。在本發(fā)明中，腺病毒載體中pIX的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列根據(jù)提高病毒的穩(wěn)定性和/或提高病毒體中外源遺傳物質(zhì)的容量的目的而加以改變。本發(fā)明證明了衍生自Ad35的重組腺病毒載體與具有內(nèi)源(即Ad35衍生的)近端pIX上游序列的相應(yīng)病毒相比更穩(wěn)定/可攜帶更多外源遺傳信息，所述Ad35包含在衍生自Ad5的Ad5衍生近端pIX啟動子控制下的pIX基因。因此，本發(fā)明還提供了包含功能性pIX編碼序列并在E1區(qū)中有至少一個缺失的一種重組腺病毒，其中pIX編碼序列在異源啟動子的控制下，而且其中所述重組腺病毒衍生自或基于除了腺病毒血清型5之外的腺病毒。在某些實施方案中，所述異源啟動子是一種非內(nèi)源近端pIX啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，編碼pIX的遺傳信息衍生自或基于Ad35或Ad11。在這種實施方案中，優(yōu)選的非內(nèi)源pIX啟動子是Ad5啟動子。
            
另一方面，本發(fā)明提供了可通過本發(fā)明的方法獲得的一種重組腺病毒載體。這種重組腺病毒載體用于例如制備疫苗(WO 00/70071；WO 01/38362；WO 02/24730)，作為基因輸送載體等。
            
針對這種重組腺病毒載體選擇一種希望的主要血清型可以用于獲得與常用的Ad5腺病毒載體相比組織向性改變的載體，和/或比這種Ad5衍生的載體免疫原性低而可以被使用(WO 00/70071)。為產(chǎn)生重組腺病毒載體，將轉(zhuǎn)基因克隆進含有缺少缺失E1序列的腺病毒左側(cè)部分和具有進行克隆的限制酶位點的一個質(zhì)粒(銜接質(zhì)粒(adapterplasmid))中。然后通過包含具有5’端重疊序列的腺病毒右側(cè)部分的粘粒與銜接質(zhì)粒的3’端同源重組而產(chǎn)生重組腺病毒載體(見本申請的實施例；WO 99/38362中所述方法)。因此本發(fā)明的另一方面提供了一種重組核酸序列，其包含腺病毒左側(cè)ITR，包裝信號、E1區(qū)缺失的其它腺病毒序列、至少部分E1B 55K可讀框及pIX編碼序列。本發(fā)明的再一方面提供了一種修飾的腺病毒pIX基因，其中編碼pIX蛋白的遺傳信息不是衍生自腺病毒血清型5或腺病毒血清型7 pIX編碼序列。在優(yōu)選的實施方案中，所述修飾的pIX基因包含一個異源啟動子。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的或通過本發(fā)明的方法獲得的一種重組腺病毒載體。所述藥物組合物進一步包含一種可接受的藥物載體，通常由制備藥物領(lǐng)域的技術(shù)人員所應(yīng)用。另外，本發(fā)明涉及一種治療人體的方法，包括為人體施用本發(fā)明的重組腺病毒載體或者施用由本發(fā)明提供的一種藥物組合物。
            
本發(fā)明進一步提供了一種重組腺病毒包裝細胞，其包含根據(jù)本發(fā)明的一種重組腺病毒。在一個實施方案中，所述重組腺病毒包裝細胞包含能互補所述重組腺病毒的E1B 55K缺乏的核酸，其中所述重組腺病毒包含的核酸分子包含編碼提高pIX基因表達的E1B 55K基因產(chǎn)物的序列的一部分，附帶條件是后者重組核酸分子不編碼功能性E1B 55K基因產(chǎn)物，其中所述細胞和所述重組腺病毒不包含導(dǎo)致包含編碼功能性E1B 55K蛋白的核酸的重組腺病毒形成的序列重疊。這個實施方案特別適用于防止包含額外的腺病毒功能的重組腺病毒的形成。
            
本發(fā)明進一步揭示解決與在Ad包裝/互補細胞中減少非C群腺病毒載體的互補相關(guān)的某些難題的方法和手段。盡管在Ad5互補細胞系中存在功能性Ad5 E1B-55K表達，但發(fā)現(xiàn)當腺病毒主鏈是非C群腺病毒來源時僅可以產(chǎn)生非常低滴度的腺病毒載體；這個發(fā)現(xiàn)意味著E1B-55K與另一種(病毒)蛋白的相互作用中的血清型特異性。本發(fā)明揭示了這種血清型依賴性可以通過提供與互補細胞系提供的E1B-55K蛋白相容的E4-orf6蛋白而避免。正如本發(fā)明所揭示的，E1B-55K和E4-orf6形成參與抑制將細胞mRNA從核轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)的一種復(fù)合物，該復(fù)合物也參與刺激病毒mRNA從核轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)(參見Leppard 1997和1998所述)。本發(fā)明人已經(jīng)觀測到包裝細胞中病毒載體的適當互補需要存在相容的E1B-55K和E4-orf6基因產(chǎn)物。如果包裝細胞包含編碼互補應(yīng)包裝的載體未提供的功能的蛋白質(zhì)的某些序列，則包裝細胞也稱作互補細胞。在此所用術(shù)語“相容“是指可利用的E1B-55K基因產(chǎn)物之間的一種復(fù)合物能與可利用的E4-orf6基因產(chǎn)物形成一種功能性復(fù)合物，在某種意義上這種蛋白復(fù)合物支持病毒復(fù)制、增殖和/或包裝為與野生型情況相似或者與當重組腺病毒血清型5載體在Ad5互補細胞系如293或PER.C6TM上生產(chǎn)時發(fā)現(xiàn)的情況相似的水平。如果在其中病毒形成的生產(chǎn)期間包裝細胞包含相容的至少E1B-55K蛋白和E4-orf6蛋白，則在包裝細胞中的載體復(fù)制是有效的。優(yōu)選地，E1B-55K和E4-orf6序列來自相同腺病毒亞群(如A、B、C、D、E或F)內(nèi)的腺病毒。更優(yōu)選地，E1B-55K和E4-orf6序列來自相同血清型。由于本領(lǐng)域可利用能支持亞群C如血清型5的腺病毒生長的確立細胞系，甚至更優(yōu)選E1B-55K和E4-orf6基因衍生自腺病毒血清型5。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道相容性可以在腺病毒載體生產(chǎn)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的互補測試或分析中確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道本發(fā)明也可用于在任何互補細胞系上生產(chǎn)任何腺病毒血清型，只要E1B-55K和E4-orf6蛋白是相容的即可。
            
進一步觀測到與互補細胞系中E1B“匹配”的E4-orf6基因產(chǎn)物可以由腺病毒載體提供，通過將選擇的腺病毒載體中的E4-orf6用與包裝細胞系中存在的E1B基因相容的E4-orf6編碼序列置換而進行。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)這種修飾對載體的穩(wěn)定性、復(fù)制、包裝、裝配和生產(chǎn)無不利作用。
            
本發(fā)明的一特異方面是現(xiàn)在能在通常用于生產(chǎn)腺病毒血清型5或者亞群C的其它血清型如血清型1、2和6的細胞系上有效生產(chǎn)與亞群C的那些血清型不同的腺病毒血清型。本發(fā)明提供了生產(chǎn)非C群腺病毒而不需要單獨提供具有E4-orf6的互補(包裝)細胞的方法，因為與互補E1B-55K序列相容的E4-orf6序列摻入腺病毒主鏈中。
            
本發(fā)明提供了包含第一種血清型的腺病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件的一種重組腺病毒載體，其中所述載體進一步包含編碼功能性E4-orf6蛋白的一個序列或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中所述序列選自以下一組a)衍生自與所述第一種血清型不同的第二種血清型的腺病毒的E4-orf6編碼序列；b)衍生自包含一或多個密碼子的缺失、突變、添加和/或取代的所述第一種血清型的腺病毒的E4-orf6編碼序列；及c)包含一個融合體的E4-orf6編碼序列，所述融合體是衍生自與所述第一種血清型不同的第二種血清型的E4-orf6編碼序列的一部分與衍生自第三種血清型的E4-orf6編碼序列的一部分的融合體，其中所述第三種血清型與所述第一種血清型可以相同或不同。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種重組腺病毒載體，其中所述第一種血清型與所述第二種血清型來自不同的腺病毒亞群。在一個優(yōu)選的實施方案中，提供了一種本發(fā)明的重組腺病毒載體，其中所述第一種血清型來自除了亞群C之外的一個亞群，而且其中所述E4-orf6編碼序列衍生自亞群C的腺病毒血清型。更優(yōu)選本發(fā)明的重組腺病毒，其中所述第一種血清型來自亞群B，所述第二種血清型來自亞群C。甚至更優(yōu)選地，所述E4-orf6編碼序列衍生自腺病毒血清型5。本發(fā)明的重組腺病毒包含結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件。結(jié)構(gòu)元件的實例是編碼殼體蛋白如尾絲、六鄰體和五鄰體蛋白的基因以及其自身基因產(chǎn)物。非結(jié)構(gòu)元件的實例是早期基因，其在感染細胞時表達而且當感染周期進行時被下調(diào)。非結(jié)構(gòu)元件的其它實例是編碼在復(fù)制期間活性蛋白質(zhì)的基因，如pol和pTP。
            
核酸中的一些變化如缺失、突變、添加和/或取代一或多個密碼子可以顯著改變編碼的基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和/或功能性。本發(fā)明因此還涉及E4-orf6編碼序列，其衍生自與攜帶例如結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件的基因的主鏈相同的腺病毒血清型，但其中E4-orf6編碼序列已經(jīng)突變由此其變得與生產(chǎn)腺病毒載體的互補細胞中存在的E1蛋白(如E1B-55K基因產(chǎn)物)相容?？梢詫⒚艽a子完全改變以改變編碼的氨基酸，但其也可以部分突變以改變編碼的氨基酸。核酸的缺失可以導(dǎo)致喪失一或多個編碼的氨基酸，同時這也可以導(dǎo)致移碼。本發(fā)明還涉及腺病毒核酸中存在的E4-orf6序列，其包含衍生自不同血清型的不同部分，其中可以使用來自一個血清型的使蛋白質(zhì)在相容性中起作用的結(jié)構(gòu)域，而E4-orf6序列的剩余部分或其一部分衍生自另一種(不)相關(guān)的血清型(例如來自相同亞群，來自不同亞群或者來自不同物種或其組合)。因此應(yīng)用相容的E4-orf6融合蛋白也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這種融合蛋白可以是一些核酸的產(chǎn)物。
            
本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到除了所有人腺病毒之外，本領(lǐng)域還鑒別許多非人腺病毒。顯然也可以應(yīng)用非人腺病毒以達到與本發(fā)明揭示的相同結(jié)果。技術(shù)人員清楚E1B-55K與E4-orf6之間的相容性可以非限于人腺病毒，而且來自特異于不同物種的腺病毒的元件也可以是相容的。因此，本發(fā)明的另一方面是可以在本領(lǐng)域可利用的已知包裝細胞系上生產(chǎn)高滴度的非人腺病毒，只要E1B-55K與E4-orf6基因產(chǎn)物是相容的即可。使用本發(fā)明的方法和手段可以生產(chǎn)的非人腺病毒的非限制性實例是狗、牛、綿羊、青蛙、豬、馬、猴和鳥類腺病毒。因此在此所用的血清型超出物種限制性血清型。如果例如一種猴腺病毒E4-orf6基因產(chǎn)物與包裝細胞提供的E1B-55K相容，則這種組合包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。同樣，當不同的血清型或者衍生自例如與包裝細胞的E1B基因相容的人和鳥類腺病毒的E4-orf6序列之間的融合體應(yīng)用時，則這種特殊組合也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
            
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)包含第一種血清型的腺病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件的重組腺病毒載體的方法，所述方法包括如下步驟a)將腺病毒的必需元件提供給攜帶可表達形式的衍生自第二種血清型腺病毒的E1B-55K編碼序列或其功能部分、衍生物和/或類似物的互補細胞，以使得可以通過所述互補細胞裝配所述重組腺病毒載體，其中所述元件包含與所述第二種血清型不同的所述第一種血清型的至少一些結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件及編碼功能性E4-orf6蛋白的一個序列或其功能部分、衍生物和/或類似物，其與所述互補細胞中所述可表達的E1B-55K蛋白相容；b)在生產(chǎn)和裝配腺病毒載體的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述互補細胞；及c)從所述培養(yǎng)基和/或互補細胞中收獲如此生產(chǎn)的重組腺病毒載體，其中編碼相容的E4-orf6蛋白的序列存在于如此生產(chǎn)的重組腺病毒載體中。
            
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述E4-orf6編碼序列選自以下一組i)衍生自所述第二種血清型的腺病毒的E4-orf6編碼序列；ii)衍生自與所述第一種和第二種血清型不同的第三種血清型的腺病毒的E4-orf6編碼序列；iii)衍生自包含缺失、突變、添加和/或取代一或多個密碼子的所述第一種血清型的腺病毒的E4-orf6編碼序列；及iv)包含一個融合體的E4-orf6編碼序列，所述融合體是衍生自第三種血清型的E4-orf6編碼序列的一部分與衍生自所述第二種血清型腺病毒的E4-orf6編碼序列的一部分的融合體，其中所述第三種血清型與所述第一種血清型可以相同或不同。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述第一種和所述第二種血清型來自不同的亞群。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述第二種血清型是亞群C的腺病毒血清型。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述第二種血清型是腺病毒血清型5。在本發(fā)明的其它特殊方面中，所述第一種血清型是亞群B的腺病毒血清型。優(yōu)選地，所述第一種血清型選自由腺病毒血清型11、14、16、21、34、35和50組成的組中。
            
本領(lǐng)域已知用于互補重組腺病毒載體的一些包裝細胞以生產(chǎn)、裝配和包裝腺病毒顆粒。這種細胞系的非限制性實例是HEK-293、911和PER.C6TM細胞。優(yōu)選使用經(jīng)證實輸送高滴度腺病毒原種的細胞系。這種細胞系以穩(wěn)定形式表達E1蛋白，這因此是本發(fā)明使用細胞系和方法的一個優(yōu)選方面，其中所述E1B-55K編碼序列整合進所述互補細胞的基因組中。更優(yōu)選的是衍生自原代二倍體人體細胞或其祖細胞的互補細胞。甚至更優(yōu)選地，所述互補細胞衍生自原代人成視網(wǎng)膜細胞、原代人胚胎腎細胞、原代人神經(jīng)元細胞或者原代人羊膜細胞(primary human amniocyte)。特別優(yōu)選的是互補細胞在本發(fā)明的方法中的應(yīng)用，其中所述互補細胞是PER.C6TM細胞或其衍生物。本領(lǐng)域熟知當使用與PER.C6TM細胞提供的核酸不重疊的腺病毒DNA時，PER.C6TM細胞不產(chǎn)生能復(fù)制的腺病毒。本領(lǐng)域使用的許多腺病毒載體缺少E1區(qū)，因此在本發(fā)明的一個方面中，所述互補細胞包含整合進其基因組的編碼至少一種腺病毒E1A蛋白的核酸。優(yōu)選地，所述編碼至少一種腺病毒E1A蛋白的核酸衍生自與亞群B不同的亞群的腺病毒血清型。更優(yōu)選地，所述編碼至少一種腺病毒E1A蛋白的核酸衍生自亞群C的腺病毒血清型。特別優(yōu)選的實施方案是其中所述編碼至少一種腺病毒E1A蛋白的核酸衍生自腺病毒血清型5。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種方法，其中所述E4-orf6編碼序列及所述E1B-55K編碼序列衍生自不同的腺病毒血清型，其中所述不同的腺病毒血清型是相同腺病毒亞群的成員。優(yōu)選地，所述E4-orf6編碼序列和所述E1B-55K編碼序列衍生自不同的腺病毒血清型，其中所述不同的腺病毒血清型均是亞群C的成員。更優(yōu)選地，所述E4-orf6編碼序列和所述E1B-55K編碼序列衍生自相同的腺病毒血清型。特別優(yōu)選這樣的方法，其中所述E4-orf6編碼序列和所述E1B-55K編碼序列衍生自腺病毒血清型5。
            
本發(fā)明還涉及這樣的方法，其中腺病毒載體可以使用適當?shù)幕パa/包裝細胞和感興趣的腺病毒載體生產(chǎn)。為進行一種有效的生產(chǎn)程序，應(yīng)用具有適當腺病毒載體的正確細胞是有益的。因此，本發(fā)明還涉及一種試劑盒(kit of parts)(也稱為包裝系統(tǒng))，其包含a)生產(chǎn)包含第一種血清型腺病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件的重組腺病毒載體的互補細胞，所述細胞攜帶可表達形式的衍生自第二種血清型腺病毒的E1B-55K編碼序列或其功能部分、衍生物和/或類似物；及b)-或多個可復(fù)制的核酸載體，所有必需的腺病毒元件如可以通過所述互補細胞裝配所述重組腺病毒載體，其中所述元件包含來自與所述第二種血清型不同的所述第一種血清型的腺病毒的至少一些結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件及一個編碼與所述互補細胞中所述可表達的E1B-55K蛋白相容的功能性E4-orf6蛋白或其功能部分、衍生物和/或類似物的序列。優(yōu)選地，使用一種試劑盒，其中所述E4-orf6編碼序列選自以下一組a)衍生自所述第二種血清型的腺病毒的E4-orf6編碼序列；b)衍生自與所述第一種和第二種血清型不同的第三種血清型的腺病毒的E4-orf6編碼序列；c)衍生自包含一或多個密碼子的缺失、突變、添加和/或取代的所述第一種血清型的腺病毒的E4-orf6編碼序列；及d)包含一個融合體的E4-orf6編碼序列，所述融合體是衍生自第三種血清型的E4-orf6編碼序列的一部分與衍生自所述第二種血清型腺病毒的E4-orf6編碼序列的一部分的融合體，其中所述第三種血清型與所述第一種血清型可以相同或不同。
            
本發(fā)明特別用于復(fù)制E1缺失的嵌合腺病毒，其幾乎全部衍生自除了腺病毒5之外的血清型。這種載體僅需要為其提供編碼腺病毒5E4orf6或其功能部分、衍生物和/或類似物的核酸。一旦如此，該載體可以在正常腺病毒5 E1互補包裝細胞系上有效復(fù)制。該載體的穩(wěn)定性得以改良，而且該載體可以互補E1A和E1B中的缺失。通過為這種載體提供編碼腺病毒E4orf6的核酸，當在293或911細胞上生長時，在不存在額外的野生型污染問題的情況中，可以有效進行噬斑純化及良好生產(chǎn)。當然，在PER.C6中也可以通過其它方式防止野生型腺病毒污染。
            
本發(fā)明的重組載體的另一個優(yōu)點是不需要從整合進基因組的核酸中產(chǎn)生特殊的細胞系腺病毒E4-orf6。盡管存在這類細胞系，但如擴大生產(chǎn)等生產(chǎn)參數(shù)和/或調(diào)節(jié)問題的解決還未達到如PER.C6TM細胞系相同的程度。這至少部分是由于越來越多的外源基因插入細胞系的基因組中，難以保持所有外源序列的穩(wěn)定性(或其表達)所致。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)至少一些與基于非腺病毒血清型5的載體的低產(chǎn)量及來自亞群B如腺病毒血清型7、11和35的腺病毒血清型的載體在腺病毒血清型5包裝細胞上的穩(wěn)定性相關(guān)的問題可以用本發(fā)明的重組腺病毒載體克服。
            
應(yīng)清楚本發(fā)明的兩個主要方面可以組合以提供可在易于利用的常規(guī)包裝細胞上生長的穩(wěn)定的重組腺病毒。本發(fā)明因此提供了包含E1區(qū)中有至少一個缺失的重組核酸分子的一種重組腺病毒，特征在于所述重組核酸分子中存在編碼提高pIX基因表達的E1B 55K基因產(chǎn)物的序列的至少一部分，附帶條件是所述重組核酸分子不編碼功能性E1B 55K基因產(chǎn)物；所述重組腺病毒進一步包含第一種血清型腺病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件，其中所述腺病毒進一步包含編碼功能性E4-orf6蛋白或其功能部分、衍生物和/或類似物的一個序列，其中所述序列是衍生自與所述第一種血清型不同的第二種血清型的腺病毒的E4-orf6編碼序列。另外或者除了具有至少一部分E1B 55K序列之外，所述核酸可具有由一個異源啟動子調(diào)節(jié)的一個pIX基因產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述第二種血清型及因此的E4-orf6序列衍生自C群腺病毒，更優(yōu)選衍生自腺病毒血清型5。優(yōu)選地，所述第一種血清型來自C群之外的一個亞群，優(yōu)選亞群B血清型如Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35或Ad50。在一個實施方案中，重組腺病毒進一步包含編碼非腺病毒蛋白、多肽或肽的一個序列。當重組腺病毒中的E4-orf6與Ad5 E1基因產(chǎn)物相容時，例如當所述腺病毒中的E4-orf6衍生自Ad5時，這種重組腺病毒是穩(wěn)定的并可以在易于利用的包裝細胞上生長，所述包裝細胞如含有Ad5 E1的包裝細胞，優(yōu)選PER.C6TM細胞。防止能復(fù)制的腺病毒或含有功能性E1蛋白的腺病毒顆粒產(chǎn)生是本領(lǐng)域中意識到的一個問題，并且已經(jīng)通過防止腺病毒中存在的E1序列與包裝細胞中存在的序列重疊而解決(US patent 5,994,128)。在本發(fā)明的實施方案中，例如包含通過影響pIX表達而提高病毒穩(wěn)定性的E1B55K序列的Ad35衍生的腺病毒，組合包含來自Ad5的E1區(qū)的包裝細胞，不導(dǎo)致伴隨包含編碼功能性E1B 55K蛋白的核酸的重組腺病毒伴隨形成的同源重組。因此本發(fā)明的另一方面提供了一種包裝系統(tǒng)，其包含一種包裝細胞和一種包含第一種血清型的腺病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件的重組腺病毒，其中所述包裝細胞表達衍生自第二種血清型的腺病毒的編碼至少E1B-55K蛋白或其功能部分、衍生物和/或類似物的核酸，其中所述重組腺病毒可以在所述包裝細胞中復(fù)制以產(chǎn)生穩(wěn)定的重組腺病毒，所述腺病毒包含在E1區(qū)有一個缺失的核酸分子并進一步包含一部分編碼E1B-55K基因產(chǎn)物的序列，所述核酸進一步包含編碼與所述包裝細胞中的所述可表達的E1B-55K蛋白相容的功能性E4-orf6蛋白或其功能部分、衍生物和/或類似物的序列。優(yōu)選所述第一種血清型是Ad 35或Ad11。優(yōu)選所述第二種血清型是Ad5。更優(yōu)選地，所述包裝細胞是PER.C6TM。優(yōu)選地，編碼功能性E4-orf6蛋白或其功能部分、衍生物和/或類似物的所述序列衍生自第一種血清型的腺病毒。這個系統(tǒng)可以使重組腺病毒復(fù)制而不伴隨含有功能性E1蛋白的腺病毒產(chǎn)生?；蛘撸龊怂峥梢院性谕庠磫幼涌刂葡碌膒IX編碼序列。本發(fā)明的另一方面是提供一種生產(chǎn)穩(wěn)定的包含第一種血清型腺病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件的重組腺病毒的方法，其中所述重組腺病毒包含衍生自其核酸分子在E1區(qū)具有缺失的腺病毒的重組核酸分子，并包含衍生自至少一部分編碼提高pIX蛋白表達但不引起來自所述核酸分子的功能性E1B-55K蛋白表達的E1B-55K基因產(chǎn)物的序列和/或具有在異源啟動子控制下的pIX編碼序列，所述方法包含如下步驟a)將腺病毒的必需元件提供給可表達形式的衍生自第二種血清型腺病毒的E1B-55K編碼序列或其功能部分、衍生物和/或類似物的互補細胞，以使得可以通過所述互補細胞裝配所述重組腺病毒載體，其中所述元件包含與所述第二種血清型不同的第一種血清型腺病毒的至少一些結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)元件及編碼與所述互補細胞中所述可表達的E1B-55K蛋白相容的功能性E4-orf6蛋白或其功能部分、衍生物和/或類似物的一個序列；b)在生產(chǎn)和裝配重組腺病毒的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述互補細胞；及c)從所述培養(yǎng)基和/或互補細胞中收獲如此生產(chǎn)的重組腺病毒。本發(fā)明進一步提供了本發(fā)明的重組腺病毒在治療人或動物、免疫接種、基因治療方面及制備治療疾病或失調(diào)的藥物中的應(yīng)用方法。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的腺病毒的藥物制品。
            
現(xiàn)在通過一些實施例例證本發(fā)明，這些實施例非限制本發(fā)明的范圍。
            
實施例
            
除非特別說明均使用標準分子生物學(xué)方法(例如Sambrook andRussel，2001)。引物序列在表IV中提供。
            
實施例1針對E1缺失的Ad35病毒的基于PER.C6TM的互補細胞系
            
在補加最多10％的FBS(Gibco BRL)和10mM MgCl2(4.9M原液，Sigma))的PER.C6培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco BRL)中，將PER.C6細胞以3×106個細胞/皿的密度接種于10cm培養(yǎng)皿中。兩天后，將9個培養(yǎng)皿用1μg ScaI線性化的pIG35.55K DNA(如前述)轉(zhuǎn)染及將9個培養(yǎng)皿用1.5μg Scal線性化的pIG35.55K DNA轉(zhuǎn)染。單獨的對照培養(yǎng)皿用1或1.5μg ScaI線性化的pAdApt35.LacZ(WO 00/70071所述)轉(zhuǎn)染以監(jiān)測轉(zhuǎn)染效力并用1或1.5μg ScaI線性化的pcDNA.nlsLacZ轉(zhuǎn)染。pcDNA.nlsLacZ(WO99/55132所述)是一種基于pcDNA3的質(zhì)粒(Invitrogen)，具有由CMV啟動子驅(qū)動的nlsLacZ基因。pcDNA.nlsLacZ還含有一個neor表達盒。作為陰性對照，將一個額外的培養(yǎng)皿用線性化的pAdApt35.LacZ轉(zhuǎn)染，這是缺少neor選擇基因的一種構(gòu)建體。所有轉(zhuǎn)染均用LipofectAmine轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen/Life Technologies)根據(jù)廠商說明書使用5ml LipofectAmine試劑/μg DNA進行。將細胞用所述轉(zhuǎn)染混合物溫育4小時，之后將該培養(yǎng)基用PER.C6培養(yǎng)基更換。第2天，除了用1或1.5μg pAdApt35.LacZ轉(zhuǎn)染的兩個培養(yǎng)皿之外，將培養(yǎng)基用含有0.5mg/mlG418(Gibco BRL)的培養(yǎng)基更換。前者用于監(jiān)測在轉(zhuǎn)染兩天后的LacZ表達。在將這些培養(yǎng)物經(jīng)X-gal染色后，在用1.5μg DNA轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)皿中在略微更藍的細胞為大約40％時評估轉(zhuǎn)染效率。在剩余的轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)皿中每周更新兩次選擇培養(yǎng)基。在第一次加入選擇培養(yǎng)基之后的兩周內(nèi)，陰性對照培養(yǎng)皿(用1.5μg pAdApt35.LacZ轉(zhuǎn)染)中大多數(shù)細胞死亡。在用pcDNA.nlsLacZ轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)皿中，可見明顯的細胞克隆。由于用pIG35.55K轉(zhuǎn)染的細胞似乎對G418更具抗性，因此在轉(zhuǎn)染后3周將濃度提升至0.75mg/ml。在3和7天后，從用pIG35.55K轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)皿中挑取共196個細胞克隆并接種于96孔平板的各個孔中。
            
將從兩個用1μg pIG35.55K DNA轉(zhuǎn)染的10cm培養(yǎng)皿中挑取集落后剩余的細胞經(jīng)胰蛋白酶消化，集合(pooled)并擴展以提供集合(pool)PER55K(1.0)。對用1.5μg轉(zhuǎn)染的兩個培養(yǎng)皿同樣處理。將PER55K(1.0)細胞集合擴展并以3.5×106個細胞/瓶的密度接種于4個T25培養(yǎng)瓶中，進行轉(zhuǎn)染以測試病毒產(chǎn)生。另外，以相同密度將親代PER.C6細胞接種于3個T25培養(yǎng)瓶中。將pAdApt35.eGFP(一種基于pAdApt35IP1(WO 00/70071中所述)的銜接質(zhì)粒，但也含有作為衍生自pIPspAdapt.eGFP的HindIII-BamHI片段克隆進pAdApt35IP1中的綠色熒光蛋白作為標記基因(WO 02/24933中所述))用PacI消化以從質(zhì)粒主鏈中釋放腺病毒序列。將pWE.Ad35.pIX-rITR(WO 00/70071中所述)用NotI消化以從粘粒主鏈中釋放腺病毒序列。將具有PER.C6細胞的2個培養(yǎng)瓶和具有PER55K(1.0)細胞的2個培養(yǎng)瓶均用2μg消化的pAdApt35.eGFP和6μg消化的pWE.Ad35.pIX-rITR轉(zhuǎn)染。將每種細胞系的1個培養(yǎng)瓶用8μg pAdApt35.LacZ轉(zhuǎn)染以監(jiān)測轉(zhuǎn)染效力。具有PER55K(1.0)細胞的剩余的培養(yǎng)瓶作為陰性對照并如其它培養(yǎng)瓶同樣處理，但不接受轉(zhuǎn)染混合物。所有轉(zhuǎn)染均用LipofectAmine(Invitrogen/Life Techn.)根據(jù)廠商說明書使用針對每次轉(zhuǎn)染的共8μg DNA和40μl LipofectAmine試劑。在溫育4小時后將轉(zhuǎn)染混合物除去并加入新鮮培養(yǎng)基。在接種細胞后一天進行轉(zhuǎn)染，再兩天后將T25培養(yǎng)瓶中的細胞移至一個T80培養(yǎng)瓶中，LacZ對照轉(zhuǎn)染除外。在溫和固定(mild fixation)之后用X-gal溶液染色。用染色溶液溫育5小時后，在這兩個培養(yǎng)瓶中估計藍色細胞的百分比為大約90％，示出這兩種細胞系均良好轉(zhuǎn)染。在移至T80培養(yǎng)瓶中4天后，轉(zhuǎn)染的PER55K(1.0)培養(yǎng)物示出起始CPE(致細胞病變作用，表明病毒復(fù)制)為接近100事件(events)/培養(yǎng)瓶。將未轉(zhuǎn)染的PER55K(1.0)細胞生長至鋪滿，無CPE跡象。在轉(zhuǎn)染的PER.C6培養(yǎng)物中，在鋪滿的細胞單層中僅觀測到三個CPE事件。再三天后，轉(zhuǎn)染的PER55K(1.0)培養(yǎng)物示出完全的CPF，所有細胞均是圓形的并成塊分散。相反，在PER.C6培養(yǎng)物中，很少量CPE不進展，所有細胞仍是單層。這證實了早期的觀測結(jié)果，即E1缺失的基于Ad35的病毒的產(chǎn)生對PER.C6非常無效。正如所期望的，未轉(zhuǎn)染的PER55K(1.0)培養(yǎng)物示出無CPE的一鋪滿單層。收獲具有完全CPE的PER55K(1.0)培養(yǎng)瓶中的細胞和培養(yǎng)基并進行兩次冷凍/解凍循環(huán)，之后在臺式離心機中在3000rpm離心10分鐘除去細胞碎片。所得粗制裂解物之一用于感染T175培養(yǎng)瓶中PER55K(1.0)細胞的新鮮培養(yǎng)物(1.5ml/瓶)。4天后在完全CPE時收獲細胞和培養(yǎng)基。這示出感染的病毒已經(jīng)在初始轉(zhuǎn)染中形成。GFP表達通過熒光顯微鏡檢測粗制裂解物感染的A549細胞而證實。然后如下所述使用該粗制裂解物分析各個克隆中E1缺失的Ad35.AdApt.eGFP病毒的互補。
            
將從pIG35.55K轉(zhuǎn)染的PER.C6細胞中挑取的前述克隆擴展并測試其維持Ad35.AdApt.eGFP復(fù)制的能力。為此將所述克隆以兩種密度接種于6孔平板中，1天后用15ml上述粗制裂解物感染。隨后監(jiān)測CPE。以此方式測試的146個克隆中，19個克隆在第2或3天出現(xiàn)完全CPE，68個克隆在第5或6天出現(xiàn)完全CPE。剩余的克隆僅呈現(xiàn)部分CPE或者示出少量非進展性事件。后者從作為陰性對照的PER.C6細胞中不能辨別。
            
基于這些結(jié)果，選擇24個克隆，在用pAdApt35.GFP銜接質(zhì)粒和大pWE.Ad35.pIX-rITR粘?？寺∞D(zhuǎn)染后對其進一步篩選產(chǎn)生重組E1缺失的病毒的能力。為此將克隆鋪板于T25培養(yǎng)瓶中并用2μg的銜接質(zhì)粒和6μg的主鏈質(zhì)粒使用上述LipofectAmine進行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染2天后，將細胞移至T80培養(yǎng)瓶中以防止培養(yǎng)物過度鋪滿。在24個克隆中，在經(jīng)過移至T80后3天有5個克隆出現(xiàn)完全CPE，另有13個克隆隨后出現(xiàn)完全CPE。剩余的6個克隆示出無CPE或者僅開始CPE。對比之下，在移至T80培養(yǎng)瓶之后4-6天，PER.C6細胞上的E1缺失的Ad5載體的常規(guī)產(chǎn)生通常導(dǎo)致完全CPE。
            
這示出新克隆有效互補E1缺失的腺病毒載體。上述克隆(16個克隆)之一用于產(chǎn)生及生產(chǎn)多批次的含有不同轉(zhuǎn)基因的E1和E1/E3缺失的Ad35病毒。為此，將得自如上述轉(zhuǎn)染但使用不同銜接質(zhì)粒的粗制裂解物中的病毒在新細胞系中進行噬斑純化。對單一噬斑測試轉(zhuǎn)基因活性，然后在4-8個三層培養(yǎng)瓶(3×175cm/瓶)中擴大培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)。在完全CPE時收獲細胞并如針對腺病毒同樣常規(guī)將病毒釋放并純化。病毒顆粒的量通過HPLC(Shabram et al.，1997)確定。表I示出在具有PER55K克隆#16細胞的三層培養(yǎng)瓶上E1和E1/E3缺失的Ad35病毒的中等規(guī)模生產(chǎn)的下游處理(downstream processing)后的產(chǎn)量。純化的病毒顆粒的量與在PER.C6細胞上基于Ad5的載體的產(chǎn)量相似。
            
我們推斷已經(jīng)產(chǎn)生了有效互補完全E1缺失的基于Ad35的載體的多個細胞系。因此，Ad5互補細胞系中Ad35 E1B-55K表達促進Ad35載體的復(fù)制。
            
實施例2pWE.Ad.pIX-rITRΔE3的產(chǎn)生
            
人腺病毒的早期區(qū)-3含有干擾宿主對腺病毒感染的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)的多個編碼區(qū)。當腺病毒載體用作疫苗載體時，這種干擾是不希望的。因此，我們構(gòu)建了一種缺少E3區(qū)的Ad35主鏈粘粒。
            
為此，將構(gòu)建體pBr.Ad35.PRn(圖15；EP1054064中實施例13所述)用StuI和MluI消化并使用瓊脂糖酶(Roche)根據(jù)廠商說明書將17.3kb載體片段從低解鏈點(LMP)凝膠中純化。接著，使用引物35E3for和35E3rev在pBr.Ad35.PRn上產(chǎn)生PCR片段。為進行擴增，根據(jù)廠商說明書使用Pwo DNA聚合酶(Roche)進行，程序設(shè)定為94℃2分鐘，30次循環(huán)(94℃30秒，58℃30秒及72℃1分鐘)及最后在68℃溫育8分鐘。將833bp PCR產(chǎn)物使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化并用MluI和StuI消化。消化的DNA使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從凝膠中純化。連接這兩個分離的片段并轉(zhuǎn)化進DH5α感受態(tài)細胞(Invitrogen/Life Technologies)中以產(chǎn)生pBr.Ad35.PRnΔE3(圖25)。該質(zhì)粒通過限制分析進行檢測并對PCR擴增的插入體進行測序。然后將E3缺失克隆進pWE.Ad35.pIX-rITR粘粒主鏈中。
            
為此，將pWE.Ad35.pIX-rITR用PacI消化并將DNA通過用異丙醇沉淀而純化并用70％EtOH洗滌。在milliQ水中再懸浮之后，將該DNA用SwaI消化并將含有22.8kb載體的片段使用上述瓊脂糖酶從LMP凝膠中純化。將構(gòu)建體pBr.Ad35.PRnΔE3以相同方式用PacI和SwaI消化并也使用瓊脂糖酶分離16.6kb片段。將這兩個分離的片段連接，每個片段使用0.5-0.6μg。然后將連接的片段使用λ-噬菌體包裝提取物(Stratagene)根據(jù)廠商說明書進行包裝并與STBL-2細胞混合。將細菌鋪板于LB+Amp平板上并分析所得菌落中正確構(gòu)建體的存在情況。這樣提供了構(gòu)建體pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3(圖1)。E3缺失從Ad35序列的第27648位核苷酸延伸至第30320位核苷酸(WO00/70071中所述)并因此跨越2.6kb的區(qū)域。
            
NotI消化的pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3和pIPsp-1(New EnglandBiolabs)消化的pAdApt35.eGFP在PER55-克隆#16細胞(如前述)上的共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生表達GFP的基于Ad35的病毒。在從這些病毒中分離病毒DNA，E3區(qū)的PCR擴增示出正如所期望的該病毒缺失E3序列的2.6kb。
            
實施例3包裝E1缺失的基于Ad35的載體大小的限制
            
含有不同插入體的基于Ad35的E1缺失的和E1/E3缺失的載體通過用以下轉(zhuǎn)染的PER55K-克隆#16細胞產(chǎn)生(見實施例1所述)
            
1.5μg的攜帶用PacI或pIPsp-1酶消化的特異性轉(zhuǎn)基因的Ad35銜接質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以從所述質(zhì)粒載體序列中釋放腺病毒插入體及，
            
4.5μg經(jīng)NotI消化的pWE.Ad35.pIX-rITR或者用NotI酶消化的pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3進行轉(zhuǎn)染。
            
銜接質(zhì)粒的右側(cè)和主鏈質(zhì)粒的左側(cè)末端含有介導(dǎo)重組事件的同源序列，其產(chǎn)生完整的E1缺失的病毒基因組(如WO 00/70071所述)。
            
針對每組構(gòu)建體使用30μl Lipofectamine試劑(Invitrogen/LifeTechnologies)根據(jù)廠商說明書進行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染混合物加入于T25培養(yǎng)瓶中70％鋪滿的PER55K克隆16細胞中。對以下組合進行轉(zhuǎn)染
            
1.pAdApt35IP1+pWE.Ad35.pIX-rITR
            
2.pAdApt35IP1+pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
            
3.pAdApt35eGFP+pWE.Ad35.pIX-rITR
            
4.pAdApt35eGFP+pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
            
5.pAdApt35Luc+pWE.Ad35.pIX-rITR
            
6.pAdApt35Luc+pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
            
7.pAdApt35LacZ+pWE.Ad35.pIX-rITR
            
8.pAdApt35LacZ+pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
            
將銜接質(zhì)粒用pIPsp-1酶消化以從質(zhì)粒載體主鏈中釋放腺病毒序列。將pWE.Ad35.pIX-rITR和pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3用NotI消化之后出于同樣原因進行轉(zhuǎn)染。銜接質(zhì)粒及pWE.Ad35.pIX-rITR主鏈粘粒的產(chǎn)生如先前WO 00/70071所述。pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3的產(chǎn)生如前文所述。
            
在轉(zhuǎn)染兩天后，將細胞傳代至T80并進一步溫育直至獲得完全CPE。在觀測到完全CPE后收獲細胞和培養(yǎng)基。將該混合物進行一次冷凍/解凍循環(huán)并在1500rpm旋轉(zhuǎn)15分鐘以沉淀細胞碎片，之后收集上清。將以此方式獲得的粗制裂解物用于分離病毒DNA。為此，將275μl粗制裂解物與10μl的10mg/ml DNaseI在37℃溫育30分鐘。隨后加入6.0μl 0.5M EDTA(pH8.0)，7.5μl 20％SDS和1.5μl 20mg/ml蛋白酶K并渦旋混合。然后將此混合物在50℃溫育1小時。最后，使用GeneClean Spin試劑盒(Bio 101，Inc.)分離病毒DNA。在20μlmilliQ H2O中洗脫病毒DNA之后，轉(zhuǎn)基因區(qū)域通過PCR擴增進行分析。為此，使用引物AdApt35CMVF和35pIXR。使用Taq DNA聚合酶(Invitrogen)用2μl分離的病毒DNA進行擴增。反應(yīng)混合物含有5μl10×緩沖液(Invitrogen)，2μl 50mM MgCl2，5μl 2mM dNTPs，3μl每種引物(10μM原液)及2.5單位的Taq酶，總體積為50μl。程序設(shè)定為94℃2分鐘，隨后30次(94℃30秒，60℃30秒及72℃4分鐘)循環(huán)。對照反應(yīng)是對5ng銜接質(zhì)粒進行。在完成PCR之后，將5μl反應(yīng)物加樣于凝膠上進行分析。圖2示出了上述轉(zhuǎn)染的結(jié)果。引物從CMV啟動子的5’端至pIX編碼區(qū)的5’端擴增序列。從圖2中可以看出，沒有轉(zhuǎn)基因或具有GFP插入體的病毒示出期望的條帶(與對照質(zhì)粒相對比；針對每個病毒的泳道PL)?？梢娸^小片段具有較大插入體，熒光素酶和LacZ，這些缺失在總長度較大的病毒中更明顯(與有或無E3的LacZ或Luc病毒相對比)。因此，基因組長度的增加與轉(zhuǎn)基因區(qū)域中缺失的出現(xiàn)相關(guān)。Ad35.AdApt.eGFP和Ad35.AdApt.LacZΔE3的總基因組長度分別為33.7和33.4kb(如圖2所示)，這個事實與缺失僅發(fā)現(xiàn)在LacZ病毒樣品中的結(jié)果相似，表明前者E1區(qū)的序列或插入體的大小也可以影響缺失的出現(xiàn)。
            
實施例4腺病毒血清型5和35的pIX基因區(qū)的序列對比
            
重組Ad35病毒的基因組長度增加在轉(zhuǎn)基因區(qū)域中出現(xiàn)缺失的發(fā)現(xiàn)可以提示，依此類推在pIX-缺陷的Ad5病毒中(Ghosh-Choudhury etal.，1987)，存在殼體穩(wěn)定性的問題?？梢援a(chǎn)生總長度為36.7kb的Ad35.E1B+.AdApt.Luc病毒(其中E1A序列由AdApt.Luc盒置換)的事實表明E1B的缺失起作用。這也許是通過E1B蛋白之一的自身功能或者通過這個區(qū)域中未知的影響其它腺病毒蛋白表達的調(diào)節(jié)序列的功能所致。我們的知識還未描述E1B蛋白自身影響腺病毒的包裝能力。然而，已經(jīng)描述了E1B-21K蛋白非特異性使轉(zhuǎn)染的DNA穩(wěn)定(Herrman and Mathews，1989)及21K蛋白中的突變在感染期間導(dǎo)致細胞和病毒DNA降解(Pilder et al.，1984；White et al.，1984)。由于Ad5 E1B-21K蛋白在PER.C6細胞中表達，因此這些發(fā)現(xiàn)就我們的觀測結(jié)果未提供解釋。
            
PIX基因就位于E1B-55K編碼區(qū)的3’端。就Ad5而言，已知pIX啟動子和編碼序列位于E1B轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)，因為pIX和E1B共有聚腺苷酸化信號。pIX表達所必需的最小啟動子序列已經(jīng)在Ad5的情況中加以研究(Babiss and Vales，1991)。示出含有上游Sp1位點和TATA框序列的啟動子片段就pIX表達是足夠的。Sp1位點與TATA框以及TATA框自身的序列之間的間隔示出影響pIX表達水平。Ad35中的相應(yīng)區(qū)域是否對穩(wěn)定病毒而言也足以驅(qū)動pIX表達至足夠高的水平還未知。序列對比表明Sp1位點和TATA序列均與在Ad5 pIX啟動子中發(fā)現(xiàn)的那些序列不同。使用可從Genbank中獲得的序列信息，對來自不同亞群的血清型的近端pIX上游序列(即E1B-55K的終止密碼子與pIX基因的起始密碼子之間)進行對比。以下具有SEQ ID NO和Genbank參考序列的腺病毒用于進行對比Ad2(SEQ ID NO45；Genbank NC_001405)，Ad5(SEQ ID NO46；Genbank M73260)，Ad12(SEQ ID NO47；Genbank NC_001460)，Ad9(SEQ ID NO48；Genbank AF099665)，Ad40(SEQ ID NO49；Genbank L19443)，Ad4(SEQ ID NO50；NC_003266)，Simian 25(SEQ ID NO51；GenbankAF394196)，Ad7(SEQ ID NO54；Genbank AD7001)。Ad35序列(SEQID NO52)在WO00/70071中公布。Ad11序列(SEQ ID NO53)在先前未公布，在此提供。圖3A示出上述序列在E1B-55K蛋白的終止密碼子(全部序列中的前3個核苷酸)與pIX蛋白的起始密碼子(最后3個核苷酸)之間的序列對比。Ad2和Ad5中的Sp1位點和TATA序列在方框中標示。在大多數(shù)情況中，在其它序列中針對Sp1和TATA框沒有足夠的同源性。因此，由Bucher，P(1990)公布的GC和TATA框的共有序列用于鑒別多種序列中推定的Sp1和TATA框。圖3b示出推定的Sp1和TATA框序列及它們之間的間隔。分別屬于亞群A、D和F的Ad12、Ad9和Ad40具有Sp1和TATA序列，其與共有序列相當匹配。然而，兩個框之間的距離小于Ad5和Ad2之間的距離。這不是不同尋常的，因為Ad5 E1B啟動子也含有間隔11個核苷酸的Sp1框和TATA序列。然而，Sp1與TATA框之間的Ad5 pIX啟動子序列缺失(20個核苷酸中的)9個核苷酸降低pIX水平(Babiss and Vales，1991)。亞群B血清型Ad35、Ad11和Ad7以及亞群E病毒Ad4具有不同的TATA框序列及在推定的Sp1序列與TATA框之間具有不的同間隔。人腺病毒4型中近端pIX區(qū)與猿猴腺病毒25(CV68)中該區(qū)域相同，這是最近提議作為治療性載體的一種血清型(Farina et al.，2001)。因此，對于穩(wěn)定的殼體，基于非人腺病毒pIX表達的復(fù)制缺陷的載體也不是足夠的。
            
有充分理由相信pIX表達在Ad35病毒和其它人及非人腺病毒中是以不同方式調(diào)節(jié)的，調(diào)節(jié)序列或者甚至啟動子序列自身位于E1B序列的上游或者甚至更上游?；蛘?，由于pIX表達是由E1A蛋白激活的，因此在存在屬于相同血清型或亞群的E1A蛋白的情況下獲得高水平的pIX表達是可能的。
            
我們測試了將內(nèi)源近端pIX上游序列改變?yōu)楫愒磫幼右蕴岣咻d體中pIX表達是否產(chǎn)生更穩(wěn)定的病毒及更好的包裝能力(如前述)?；蛘?，pIX功能也許通過包裝細胞系反式(in trans)遞送。作為一個非限制性實施例，我們描述了具有與在Ad5病毒中發(fā)現(xiàn)的相同的非內(nèi)源近端pIX啟動子的重組的基于Ad35的病毒，并示出這些病毒與未改變的重組載體相比具有更好的穩(wěn)定性。
            
實施例5具有Ad5 pIX啟動子的銜接質(zhì)粒的產(chǎn)生
            
pAdApt535是一種Ad35銜接質(zhì)粒，其具有部分Ad5 pIX啟動子序列但其它部分與Ad35銜接質(zhì)粒pAdApt35IP1(見WO 00/70071所述)相同。其構(gòu)建如下所述
            
用引物SV40for和pIX5Rmfe產(chǎn)生第一個PCR片段。該反應(yīng)使用Pwo DNA聚合酶(Roche)根據(jù)廠商說明書進行，但最終混合物中具有3％DMSO。取pAdApt作為模板，這是Ad5 E1缺失的病毒的一種銜接質(zhì)粒(100ng；見WO 00/70071所述)。程序設(shè)定如下94℃2分鐘，然后進行30次(94℃30秒(解鏈)，52℃30秒(退火)及72℃30秒(延伸))循環(huán)，隨后72℃8分鐘。所得PCR片段含有來自pAdApt的SV40聚腺苷酸化信號的3’端和Genbank登記號M73260所示從3511至3586位核苷酸的Ad5 pIX啟動子區(qū)域及在3’端的一個MfeI位點。
            
如上述產(chǎn)生第二個PCR片段，但使用引物pIX35Fmfe和35R4進行。取100ng pAdApt35IP1作為模板，PCR程序的退火設(shè)定在58℃30秒，延伸設(shè)定在72℃90秒。這個PCR擴增了從3467至4669位核苷酸的Ad35序列(序列編號如WO 00/70071所述)并在5’端加入了一個MfeI位點。
            
然后將這兩個PCR片段用MfeI消化并使用Qiagen PCR純化試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商說明書進行純化。純化的片段的濃度通過將樣品在瓊脂糖凝膠上運行而評估，并將接近等摩爾量的兩個片段混合于40μl體積的含有5μg DNA，4μl 10×連接酶緩沖液和2μl連接酶(NewEngland Biolabs)的連接反應(yīng)物中。在室溫溫育2小時以上的時間后，將該混合物加樣于TAE中的1.2％瓊脂糖凝膠上，使用Geneclean II試劑盒(Bio101，Inc.)根據(jù)廠商說明書分離長度為1.4kb的DNA片段。
            
將該DNA在30μl無菌水中洗脫并將1μl用于PCR擴增反應(yīng)中，使用如上述引物SV40for和35R4進行。如上述進行PCR，退火溫度為52℃，延伸時間為90秒。所得產(chǎn)物使用Qiagen凝膠提取試劑盒從凝膠中分離并用AgeI和BglII消化。所得0.86kb條帶使用GenecleanII試劑盒根據(jù)廠商說明書從凝膠中分離。
            
將pAdApt35.Luc(見WO 00/70071所述)也用BglII和AgeI消化并將5.8kb載體片段使用Geneclean II試劑盒如上述從凝膠中分離。將這個片段如前述含有Ad5-Ad35嵌合pIX啟動子的分離的BglII-AgeI片段連接，產(chǎn)生pAdApt535.Luc(圖4)。
            
然后如下產(chǎn)生含有Ad5 pIX啟動子的其它銜接質(zhì)粒
            
將pAdApt535.Luc用BglII和ApaI消化并使用Geneclean II試劑盒根據(jù)廠商說明書從凝膠中純化1.2kb的插入體。將pAdApt35IP1也用BglII和ApaI消化并如上述分離3.6kb的載體片段。將這兩個分離的片段連接產(chǎn)生pAdApt535(圖5)。接著，使用標準克隆技術(shù)使用pAdApt535將其它標記基因如eGFP(衍生自pAdApt35.eGFP)和LacZ(衍生自pAdApt35.LacZ)克隆進多克隆位點，產(chǎn)生pAdApt535.eGFP和pAdApt535.LacZ。
            
實施例6具有含有Ad5 pIX啟動子的銜接質(zhì)粒的E1缺失的基于Ad35的載體的產(chǎn)生
            
重組病毒如上述通過在PER55K克隆16細胞上轉(zhuǎn)染銜接質(zhì)粒和Ad35載體主鏈粘粒而產(chǎn)生。為此，使用如下質(zhì)粒
            
T1.pAdApt535eGFP+pWE.Ad35.pIX-rITR
            
T2.pAdApt535eGFP+pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
            
T3.pAdApt35Luc+pWE.Ad35.pIX-rITR
            
T4.pAdApt535Luc+pWE.Ad35.pIX-rITR
            
T5.pAdApt535Luc+pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
            
T6.pAdApt535LacZ+pWE.Ad35.pIX-rITR
            
T7.pAdApt535LacZ+pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
            
T8.pAdApt35LacZ+pWE.Ad35.pIX-rITR
            
T9.pAdApt35LacZ+pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
            
將銜接質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染之前用PacI消化，除了pAdApt535.Luc和pAdApt35.Luc用pIPsp-1酶消化及pWE.Ad35.pIX-rITR和pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3用NotI消化。將2μg每種銜接質(zhì)粒和6μg的主鏈DNA與40μl Lipofectamine(Invitrogen/Life Technologies)根據(jù)廠商說明書混合并與T25培養(yǎng)瓶中70％鋪滿的PER55K克隆16細胞溫育。4小時后除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并將細胞在37℃/10％CO2中進一步溫育。在轉(zhuǎn)染兩天后，將細胞傳代至T80培養(yǎng)瓶并對致細胞病變作用(CPE)的出現(xiàn)情況評分。5天后所有培養(yǎng)物均示出進展中的或完全的CPE，T6(無CPE)和T8(CPE事件)除外。再兩天后，T6和T8示出開始CPE，所有其它培養(yǎng)物均呈現(xiàn)完全CPE。通過收集培養(yǎng)基和細胞收獲所有培養(yǎng)物。將該混合物在-20℃貯存。將樣品解凍，將該混合物在1500rpm旋動15分鐘以沉淀細胞碎片，收集上清。在一些樣品中(4種LacZ表達病毒，T6-T9)，取2ml用于再次感染于T80培養(yǎng)瓶中80％鋪滿的PER55K克隆16細胞以進一步擴增病毒滴度。在進展的(T6+T8)或完全(T7+T9)CPE中收獲細胞和培養(yǎng)基并如上述制備粗制裂解物。
            
以此方式獲得的粗制裂解物用于分離病毒DNA。為此，將275μl粗制裂解物與10μl的10mg/ml DNaseI在37℃溫育30分鐘。隨后加入6.0μl 0.5M EDTA(pH8.0)，7.5μl 20％SDS和1.5μl 20mg/ml蛋白酶K并渦旋混合。然后將該混合物在50℃溫育1小時。最后，使用GeneClean Spin試劑盒(Bio 101，Inc.)分離病毒DNA。將病毒DNA在50μl milliQ水中洗脫并將5μl樣品用于分析轉(zhuǎn)基因區(qū)域。應(yīng)注意pWE.Ad35.pIX-rITR+/-E3主鏈粘粒不改變并因此仍含有Ad35 pIX啟動子。由于該啟動子位于粘粒的5’端，因此認為重組事件產(chǎn)生野生型Ad35啟動子的機會很少。然而，不排除產(chǎn)生仍含有Ad35 pIX啟動子的病毒。因此，針對每個病毒制備物進行兩次特異性PCR擴增第一次用引物組1(Ad35特異的)進行AdApt35CMVF和AdApt35pIXrev。這個PCR特異性擴增含有Ad35 pIX啟動子的病毒中的轉(zhuǎn)基因區(qū)域。對5μl分離的病毒DNA樣品用重組Taq聚合酶(Invitrogen)根據(jù)廠商說明書進行PCR反應(yīng)，但反應(yīng)中使用4mMMgCl2和4單位的Taq酶。PCR程序設(shè)定為在94℃2分鐘，隨后進行30次(94℃30秒、60℃30秒及72℃5分鐘)循環(huán)，最后以68℃8分鐘結(jié)束。
            
第2次用引物AdApt35CMVF和pIX5Rmfe進行并因此特異性擴增含有Ad5 pIX啟動子的病毒中的轉(zhuǎn)基因區(qū)域(引物組2)。
            
對5μl分離的病毒DNA使用Pwo DNA聚合酶(2.5單位/μl，Genaxis)于含有0.3μl每種引物(100μM原液)、5μl 2mM dNTP混合物、5μl 10×完全緩沖液(包含Mg2+)，1.5μl DMSO和0.8μl Pwo酶的50μl體積反應(yīng)液中進行PCR擴增。PCR程序設(shè)定如下94℃2分鐘，隨后進行30次(94℃30秒、60℃30秒及72℃5分鐘)循環(huán)，最后以68℃8分鐘結(jié)束。在PCR期間，加熱和冷卻坡度設(shè)為2℃/秒。然后，將5μl加樣緩沖液加入樣品中并將8μl混合物加樣于凝膠上進行分析。
            
含有Ad5 pIX啟動子序列和eGFP轉(zhuǎn)基因(轉(zhuǎn)染T1和T2)的E1和E1/E3缺失的Ad35病毒具有期望高度的PCR擴增條帶而無較短的片段。圖6a示出對攜帶E1缺失的熒光素酶的病毒(轉(zhuǎn)染T3和T4)進行PCR擴增的結(jié)果。泳道5-8是用這兩個引物組對AdApt535Luc(泳道5和6)和AdApt35Luc質(zhì)粒(泳道7和8)進行的對照PCR。泳道1-4是對病毒DNA分離物進行的PCR。引物組1(特異于Ad35 pIX區(qū)域)擴增期望長度的一個條帶并示出Ad35.AdApt35.Luc病毒上另外的較短片段(泳道4；與圖2熒光素酶+E3相對比)。相反，當用AdApt535.Luc質(zhì)粒產(chǎn)生病毒時，引物組2(特異于Ad5 pIX啟動子)僅示出無缺失片段的期望長度的一個條帶(泳道1)。由此推斷Ad5 pIX啟動子序列的插入提高了Ad35-E1缺失的病毒的穩(wěn)定性和包裝能力。圖6b證實了攜帶LacZ作為轉(zhuǎn)基因的Ad35 E1/E3缺失的病毒的這些結(jié)果。泳道1-4是對AdApt535.LacZ和AdApt35.LacZ質(zhì)粒使用每個引物組進行的對照PCR。尤其使用引物組1見到一些背景條帶1(泳道2和4)，但對同源樣品就每個引物組也見到期望高度的強特異性條帶(泳道1和4)。在轉(zhuǎn)染及如上述一次擴增循環(huán)之后分離病毒DNA。引人矚目地，引物組2在Ad35.AdApt535.LacZ病毒上產(chǎn)生期望的片段而無缺失片段(泳道5和9)，而含有Ad35 pIX啟動子序列的病毒樣品明顯示出除了正確長度的片段之外缺失的片段(在擴增后可見(泳道11)。
            
總而言之，這些結(jié)果示出將Ad35-pIX啟動子序列取代為Ad5-pIX啟動子序列提高了具有較大基因組的病毒中轉(zhuǎn)基因區(qū)域的穩(wěn)定。較強的啟動子或者額外的啟動子元件甚至可以增強這種作用。
            
實施例7pWE.Ad35-3481的產(chǎn)生
            
如上所示，粘粒pWE.Ad35.pIX-rITR中的腺病毒插入體在其5’端含有Ad35 pIX啟動子。這可以導(dǎo)致Ad35 pIX啟動子再次插入用基于pAdApt535的銜接質(zhì)粒產(chǎn)生的病毒中。因此，產(chǎn)生一種新的Ad35主鏈粘粒，其缺少pIX啟動子序列。為此，使用pIXcosF-2和Adapt35-3引物產(chǎn)生一個PCR片段。使用Pwo DNA聚合酶(2.5單位/μl，Genaxis)在含有3μl每種引物(10μM原液)，5μl 2mM dNTP混合物，5μl 10×完全緩沖液(包含Mg2+)，1.5μl DMSO，0.5μl Pwo酶和10ngpAdApt35IP1模板的50μl體積反應(yīng)液中進行擴增。PCR程序設(shè)定為94℃2分鐘，隨后進行5次(94℃30秒，58℃30秒及72℃1.5分鐘)循環(huán)，然后進行25次(94℃30秒，60℃30秒及72℃1.5分鐘)循環(huán)，最后在68℃8分鐘結(jié)束。所得1.2kb PCR產(chǎn)物含有從第3481-4663位核苷酸的Ad35序列(根據(jù)WO 00/70071公布的Ad35序列編號)，AatII和NotI位點附于5’端。將PCR產(chǎn)物使用PCR純化試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商說明書進行純化并根據(jù)廠商說明書克隆進pPCR-Script Amp載體(Stratagene)中。然后將克隆的片段的序列通過測序證實，隨后通過用AatII和AgeI消化從該構(gòu)建體中除去。所得780bp片段使用Geneclean spin試劑盒(Bio101，Inc.)根據(jù)廠商說明書從凝膠中純化。
            
將構(gòu)建體pWE.Ad35ΔNdeI(如前所述)也用AatII和AgeI消化，所得12kb載體片段使用Geneclean spin試劑盒(Bio101，Inc.)根據(jù)廠商說明書從凝膠中分離。將這兩個分離的片段連接產(chǎn)生構(gòu)建體pWE.Ad35-3481ΔNdeI。
            
構(gòu)建體pWE.Ad35ΔNdeI的構(gòu)建如WO 00/70071所述，其含有從第3401位核苷酸至在第6541位核苷酸的NdeI位點的Ad35序列及從在第33167位核苷酸的NdeI位點至右側(cè)ITR末端的Ad35序列，這兩個Ad35片段通過NdeI位點連接(也見WO 00/70071中圖13所示)。
            
然后將pWE.Ad35-3481ΔNdeI用NdeI線性化，用CIP酶(NewEngland Biolabs)去磷酸化及使用Geneclean spin試劑盒(Bio101，Inc.)根據(jù)廠商說明書從凝膠中純化。然后將這個載體片段與分離自Ad35wt DNA的26.6kb NdeI片段連接，之后將該混合物使用λ噬菌體包裝提取物(Stratagene)根據(jù)廠商說明書用于包裝粘粒。所得混合物用于轉(zhuǎn)化STBL-2細菌(Invitrogen)，產(chǎn)生pWE.Ad35-3481。
            
實施例8pIG35.55K的構(gòu)建
            
構(gòu)建體pIG35.55K含有可操縱地與人磷酸甘油酸激酶啟動子(hPGK)連接的Ad35 E1B-55K基因的編碼序列和HBV聚腺苷酸化序列。另外，其含有可操縱地與RSV啟動子連接的新霉素抗性基因和HBVpA。pIG35.55K的構(gòu)建如下所述。
            
將構(gòu)建體pIG270(WO 00/70071所述)用EcoRI消化，用Klenow酶處理并使用PCR純化試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商說明書進行純化。然后將回收的DNA用AgeI消化并將～5kb的載體片段使用Geneclean試劑盒(Bio101，Inc.)根據(jù)廠商說明書從凝膠中分離。接著，將Ad35 E1B-55K序列使用35D21和35B3引物在pIG270模板DNA上通過PCR擴增。使用Pwo DNA聚合酶(Roche)根據(jù)廠商說明書對2ng模板DNA進行PCR擴增，但使用于PCR混合物中終濃度為3％的DMSO。程序設(shè)定為94℃2分鐘，隨后進行25次(94℃30秒，56℃30秒及72℃30秒)循環(huán)，最后在72℃溫育10分鐘結(jié)束。所得PCR片段使用PCR純化試劑盒(Qiagen)純化并用NcoI消化。在經(jīng)Klenow處理以補平突出端之后，將DNA用AgeI進一步消化并再次柱純化。然后將如此處理的PCR片段克隆進上述制備的EcoRI/AgeI消化的載體片段中以產(chǎn)生pIG270.ΔE1AΔ21K。將pIG270.ΔE1AΔ21K用AvrII和XbaI消化并使用Klenow酶補平突出端。如上述將含有PGK啟動子和Ad35 E1B-55K的2.9kb片段從凝膠中分離。接著，將pRSVneo4(如前述構(gòu)建)用BglII消化，用Klenow酶產(chǎn)生平端，去磷酸化并從凝膠中分離。然后將來自pIG270.ΔE1AΔ21K的平端的AvrII/XbaI片段與上述制備的pRSVneo4載體片段連接以產(chǎn)生pIG35.55K。
            
pRSVneo4如下產(chǎn)生將構(gòu)建體pRSVhbvNeo(WO 00/70071所述)用ScaI和BamHI消化并將突出端用Klenow酶補平。將含有部分氨芐青霉素基因和RSV啟動子的1070bp片段使用Geneclean試劑盒(BIO 101，Inc.)從凝膠中分離。接著，將pRSVhbvNeo用ScaI和EcoRI消化，用Klenow產(chǎn)生平端并如上述分離含有neo基因、HBVpA、載體和部分氨芐青霉素基因的3.2kb片段。然后將這兩個片段連接產(chǎn)生pRSVneo4。
            
實施例9由RSV啟動子介導(dǎo)的提高的pIX表達增加Ad35病毒的穩(wěn)定性
            
作為驅(qū)動pIX基因表達的一個異源啟動子的實例，將RSV啟動子插入含有LacZ或熒光素酶報道基因的Ad35銜接質(zhì)粒中。RSV啟動子相應(yīng)于得自pRc-RSV(Invitrogen)的NruI/ApaLI片段。突出端使用Klenow酶(New England Biolabs)根據(jù)廠商說明書補平。將含有RSV啟動子的388bp片段使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從瓊脂糖凝膠中分離。將銜接質(zhì)粒pAdApt35.Luc和pAdApt35.LacZ用BglII線性化，隨后經(jīng)Klenow處理以產(chǎn)生平端。BglII消化正好在轉(zhuǎn)基因表達盒的SV40聚腺苷酸化序列之后。關(guān)于基于pAdApt35的銜接質(zhì)粒的描述見WO 00/70071所述。然后將處理的銜接質(zhì)粒使用蝦堿性磷酸酶(SAP)根據(jù)廠商(Roche)說明書去磷酸化。分離的RSV啟動子片段然后與每種處理的載體連接并轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細菌(Invitrogen)中。對菌落分析相對于pIX基因RSV啟動子正向插入產(chǎn)生的pAdApt35.Luc.rsv和pAdApt35.LacZ.rsv。
            
另外，從通過PCR從缺失轉(zhuǎn)基因區(qū)域的Ad35重組病毒中分離的序列中產(chǎn)生一個銜接質(zhì)粒。對得自pAdApt35.LacZ和pWE.Ad35.pIX-rITR Ad35主鏈構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染的粗制裂解物進行分析及隨后的噬斑純化示出該病毒在大約2.8kb的轉(zhuǎn)基因區(qū)域中有一個缺失。將這個病毒的5’序列使用引物35F1和35R4從分離的DNA中經(jīng)PCR擴增。該反應(yīng)使用Pwo聚合酶(Roche)根據(jù)廠商說明書進行。程序設(shè)定如下94℃2分鐘，然后進行5次(94℃30秒；48℃30秒；72℃2.5分鐘)循環(huán)，隨后進行25次(94℃30秒；56℃30秒；72℃2.5分鐘)循環(huán)，最后在68℃8分鐘結(jié)束。
            
所得2kb片段通過PCR純化試劑盒(Qiagen)純化并根據(jù)廠商說明書克隆進pCR-Script-Amp載體(Stratagene)中，產(chǎn)生pCR.Ad35Δ2.8kb。對這個質(zhì)粒進行測序以確定缺失程度。這種缺失影響大多數(shù)CMV啟動子、轉(zhuǎn)基因和SV40 polyA。這導(dǎo)致CMV啟動子5′的317bp與pIX基因上游的Ad35序列連接。這個CMV片段含有3個GC-框和21-bp重復(fù)(Boshart et al.，1985)。可能，CMV啟動子的剩余序列可以增加pIX表達，產(chǎn)生更穩(wěn)定的病毒。另一種可能性是病毒較小則導(dǎo)致穩(wěn)定性增加。為對此進行研究，將一個完整表達盒以如下方式克隆回來，產(chǎn)生具有這個新的銜接質(zhì)粒的病毒。含有擴增的序列的pCR-Script-based載體(更名為pCR.C4)在ΔCMV-pIX序列之前有一個唯一的AvrII位點。如上述將該載體用AvrII線性化，用Klenow酶產(chǎn)生平端并使用SAP酶(Roche)去磷酸化。將銜接質(zhì)粒pAdApt535.LacZ(實施例5)和pAdApt.Luc(WO 00/70071)用AvrII和BglII消化并將DNA用Klenow處理以補平突出端。將相應(yīng)于LacZ和熒光素酶表達盒(CMV-TG-pA)的片段如上述從凝膠中分離并與AvrII線性化的pCR.C4載體連接。如上述轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞并選擇所述表達盒與左側(cè)ITR正向的菌落，產(chǎn)生pCR.C4.LacZ和pCR.C4.Luc。
            
使用以下新的銜接質(zhì)粒如實施例6所述產(chǎn)生Ad35病毒用PacI消化的pCR.C4.LacZ，用ApaI消化的pCR.C4.Luc及用PI-PspI消化的pAdApt35.LacZ.rsv和pAdApt35.Luc.Rsv。
            
將該銜接質(zhì)粒在PER55K細胞(WO 02/40665)上與用NotI消化的pWE.Ad35.pIX-rITR或pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3共轉(zhuǎn)染。另外，將銜接質(zhì)粒pBr.Ad35.ΔE1AΔ21K.Luc(如下述構(gòu)建)用PI-PspI消化并與NotI消化的pWE.Ad35.pIX-rITR共轉(zhuǎn)染。在完全致細胞病變作用(CPE)時，通過一次冷凍/解凍循環(huán)收獲培養(yǎng)物并離心以除去細胞碎片。然后在將PER55K細胞接種于T80培養(yǎng)瓶中的前一天將300μl的所得澄清的裂解物用于再次感染PER55K細胞。在完全CPE時，制備粗制裂解物并用于感染A549細胞以測試轉(zhuǎn)基因表達并對PER55K細胞進行噬斑分析。
            
將A549細胞以5×105個細胞/孔的密度接種于6孔平板中，5小時后用10、1或0.1μl每種LacZ病毒原液感染并溫育兩天。然后將A549細胞針對LacZ活性進行染色并計數(shù)藍色細胞。藍色細胞的百分比示于表II。
            
當RSV啟動子驅(qū)動pIX基因表達時，與缺失的CMV啟動子相比LacZ表達病毒顯然更穩(wěn)定。這些結(jié)果使用熒光素酶病毒證實。為測定熒光素酶病毒活性，將A549細胞以1×105個細胞/孔的密度接種于24孔平板中，并用10、1、0.1或0.01μl的病毒原液感染并溫育。在兩天后，將細胞用PBS洗滌兩次及再懸浮于100μl裂解緩沖液(Promega)中，在-20℃貯存直至使用。使用Steady-Glo熒光素酶分析系統(tǒng)(Promega)根據(jù)廠商說明書測定熒光素酶。結(jié)果示于表III。
            
在實施例3中我們描述了含有E3區(qū)和AdApt.Luc或AdApt.LacZ表達盒的完全缺失E1的Ad35病毒是不穩(wěn)定的。顯然，在新描述的構(gòu)建體中，在pIX前面的缺失的CMV啟動子不阻止轉(zhuǎn)基因區(qū)域的缺失。然而，使用驅(qū)動pIX基因的RSV啟動子，我們現(xiàn)在能產(chǎn)生比野生型更長的病毒。Ad35.AdApt.Luc.rsv和Ad35.AdApt.LacZ.rsv分別為35kb和36.5kb(也見圖2)。Ad35.ΔE1AΔ21K.Luc(36.4kb)也示出高度轉(zhuǎn)基因活性。
            
我們接著測試了在噬斑純化之后病毒是否是完整的。為此，將PER55K細胞以0.9×106個細胞/孔的密度接種于6孔平板中并用Ad35.AdApt.LacZ粗制裂解物的不同的10倍稀釋液感染。將從10-5至10-8的稀釋液鋪板并在第2天加入一層瓊脂覆蓋。為此，將細胞首先用PBS洗滌，然后加入3ml預(yù)熱的瓊脂溶液，該溶液通過將2×MEM(GibcoBRL；9.14ml)，F(xiàn)BS(Gibco；0.36ml)，MgCl2(4.9M；0.037ml)與瓊脂糖(SeaPlaque GTG；于水中2.5％，7.2ml)混合而制備。在凝固之后，將平板在37℃/5％CO2中進一步溫育。4天后見到噬斑并將LacZ染色溶液加入孔中瓊脂之上并使其排干。所有病毒均示出范圍在10-7至10-9的清晰的單獨的噬斑，但僅在具有驅(qū)動pIX基因的RSV啟動子病毒的情況中，所有噬斑均染成藍色。在缺失的CMV啟動子驅(qū)動pIX的兩種情況中，至少部分噬斑不染色。這清晰地示出可包裝的基因組大小/穩(wěn)定在具有調(diào)節(jié)pIX的RSV啟動子的病毒中增加。
            
本發(fā)明首次提供了衍生自或基于腺病毒血清型5的缺少功能性E1B基因表達的一種穩(wěn)定的重組腺病毒。這種腺病毒在E1區(qū)有至少一個缺失。在本發(fā)明提供的特殊實施方案中，使用本發(fā)明的方法，所述穩(wěn)定的重組腺病毒具有4.2kb以上的外源插入序列及33.4kb以上的一個包裝的基因組。因此本發(fā)明的一個方面是提供了一種穩(wěn)定的重組腺病毒，其a)攜帶4.2kb以上的一個外源核酸序列，和/或b)具有33.4kb以上的一個包裝的基因組。在特殊的實施方案中，本發(fā)明提供了基于Ad35或Ad11的重組腺病毒，其a)攜帶至少4.6kb的一個外源核酸序列，和/或b)具有33.8kb以上的一個包裝的基因組?；蛘撸霭b的基因組大小分別為至少34.6、35.0、36.1和36.5kb。這些實施方案中的外源序列可包括驅(qū)動pIX表達的一個異源啟動子。另一方面，所述穩(wěn)定的重組腺病毒是血清型11。根據(jù)本發(fā)明這個方面的穩(wěn)定的腺病毒可以在包裝細胞上傳代以提供一批重組腺病毒，10％以下，優(yōu)選5％以下，優(yōu)選無一單獨的克隆在所述重組腺病毒中的外源序列中產(chǎn)生缺失，這例如可以通過實施例3中例證的PCR方法測定。
            
pBr.Ad35.ΔE1AΔ21K.Luc(見上文)如下產(chǎn)生。將構(gòu)建體pBr.ALd35.ΔE1AΔ21K(WO 02/40665)用HpaI消化，用CIP(NewEngland Biolabs)去磷酸化并從凝膠中分離5kb的載體片段。將構(gòu)建體pBr.Ad35.ΔE1A.Luc也用HpaI消化并從凝膠中分離3.3kb的插入體，并與分離的載體片段連接。在轉(zhuǎn)化入感受態(tài)STBL-2細胞(Invitrogen)之后，選擇具有正確方向的插入體的菌落。這樣產(chǎn)生了構(gòu)建體pBr.Ad35.ΔE1AΔ21K.Luc。pBr.Ad35.ΔE1A.Luc(也稱為pBr.Ad35.E1B+.Luc，因為其仍含有E1B區(qū))通過將取自經(jīng)AvrII和BglII消化及用Klenow酶產(chǎn)生平端的pAdApt.Luc的AdApt.Luc盒插入經(jīng)SnaBI和HindIII消化及用Klenow產(chǎn)生平端的載體片段pBr.Ad35.leftITR-pIX(WO 02/40665)中而產(chǎn)生。選擇具有正向表達盒的集落，產(chǎn)生pBr.Ad35.ΔE1A.Luc。
            
實施例10pIX調(diào)節(jié)序列的鑒別
            
先前的實施例示出其中E1A和E1B的編碼區(qū)完全除去的Ad35重組病毒如果基因組大小增加則逐漸變得不穩(wěn)定。我們在本申請中示出了加入驅(qū)動pIX表達的一個異源啟動子可以克服這種不穩(wěn)定性。在WO 02/40665和前文中，我們揭示了保留完整E1B-55K編碼序列的Ad35病毒可以在PER.C6上產(chǎn)生而且是穩(wěn)定的。對保留全部E1B編碼序列的病毒也同樣(WO00/70071；Abrahamsen et al.，1997)。結(jié)合這些結(jié)果產(chǎn)生這樣的可能性，即在亞群B病毒中pIX基因的表達與在亞群C中pIX基因的表達相比以不同方式調(diào)節(jié)。因為保留由E1B啟動子驅(qū)動的E1B-55K基因的病毒是穩(wěn)定的(見上文)，因此pIX調(diào)節(jié)序列可能位于這個區(qū)域中。為對此進行研究，我們產(chǎn)生了保留不同長度的55K序列的3’端的一系列構(gòu)建體。為此，首先如下產(chǎn)生pBr.Ad35ΔSM.AdAptLacZ。將構(gòu)建體pBr.Ad35.lITR-pIX(見WO00/70071中所述)用SnaBI和MfeI消化，用Klenow產(chǎn)生平端及用SAP酶(Roche)去磷酸化。然后將4.4kb的載體片段從瓊脂糖凝膠中分離。將構(gòu)建體pAdApt.LacZ(一種具有LacZ轉(zhuǎn)基因插入體的基于Ad5的銜接質(zhì)粒pAdApt；WO 99/55132)用AvrII和BglII消化(及任選用SalI消化以增加片段大小的差別)及用Klenow酶產(chǎn)生平端。然后將4.2kbCMV.LacZ.pA插入體從凝膠中分離。然后將這兩個分離的片段連接以產(chǎn)生pBr.Ad35.ΔSM.AdAptLacZ(圖7)。方向可以通過限制性消化檢測，因為以正確方向連接可恢復(fù)AvrII位點和MfeI位點。構(gòu)建體pBr.Ad35ΔSM.AdAptLacZ在相對于pIX基因的野生型位置中保留0.6kb的3′E1B-55K序列(野生型Ad35第2804-3400位核苷酸)。先前我們已經(jīng)示出這些55K序列不引起功能性E1B-55K蛋白的表達，因為在PER.C6細胞上增殖是不可能的(pBr.Ad35ΔSM；WO 02/40665)。從pBr.Ad35ΔSM.AdAptLacZ開始，可以通過用MfeI(MunI的同切點酶)和或者StuI、NsiI或BglII消化，隨后在5’或3’突出端分別使用Klenow或T4 DNA聚合酶平端化突出末端而產(chǎn)生680bp(0.7kb)的E1B-55K區(qū)域的不同缺失。將消化的DNA再次連接產(chǎn)生功能性銜接質(zhì)粒，其然后用于在PER55K細胞上通過與如上述pWE.Ad35.pIX-rITR共轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生重組病毒。通過使用酶DraIII、Bsu36I、BssHII或BamHI，通過本領(lǐng)域已知的方法對所述載體進行部分消化(LacZ基因也含有這些酶的一個識別位點)，隨后通過選擇正確的克隆而產(chǎn)生另外的構(gòu)建體。如上述針對Ad35.AdApt.LacZ.rsv構(gòu)建體測試穩(wěn)定性。穩(wěn)定的構(gòu)建體(即在轉(zhuǎn)基因區(qū)域中不獲得缺失)含有pIX表達的適當調(diào)節(jié)區(qū)域。另外，可以通過插入報道基因上游序列而直接測試給定序列中的啟動子活性。pGL3basic(Promega)是這樣的一種報道基因構(gòu)建體。使用引物組Ad3555KmfeF和Ad35pIXNcoR擴增MunI與pIX基因起始處之間的區(qū)域。這個PCR(94℃2分鐘；然后進行30次(94℃30秒，59℃30秒，72℃60秒)循環(huán)；隨后68℃8分鐘；根據(jù)廠商說明書使用Pwo(Genexis)，另外具有3％DMSO)擴增了從2804至3491位的Ad35序列(編號如在野生型Ad35中)，從而將pIX的起始密碼子周圍的序列改變?yōu)镹coI位點并在5’端導(dǎo)入一個HindIII位點。將這個擴增的片段用HindIII和NcoI消化并克隆進用相同的酶消化的pGL3basic中，產(chǎn)生pGL3-MN。然后pGL3-MN用于通過組合HindIII與例如PacI、NsiI、StuI、Bsu36I、BssHII或BglII消化，隨后通過平端化突出末端和再連接而缺失熒光素酶編碼區(qū)上游的序列。啟動子活性通過使用lipofectamine試劑根據(jù)廠商說明書將獲得的構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染進PER.C6細胞中而測試。在轉(zhuǎn)染兩天后，使用Steady-Glo熒光素酶分析系統(tǒng)(Promega)根據(jù)廠商說明書分析熒光素酶活性?；蛘?，在pGL3basic載體中插入不同的區(qū)域，該區(qū)域是通過使用Ad35 E1B-55K區(qū)域中一特異性序列的5’(正向)引物并組合了Nco-pIXrev引物使一個HindIII位點附于5’端的PCR擴增而產(chǎn)生的。在此方式中，非限于存在進行克隆的一個唯一的限制位點。
            
PIX啟動子的位置通過使用軟件進一步研究以發(fā)現(xiàn)推定的啟動子序列(Reese and Eeckman，1995)。圖8示出了與55K編碼序列(如在pBr.Ad35.ΔE1AΔ21K中)直接關(guān)聯(lián)的E1B啟動子的啟動子分值(最小值設(shè)定為0.65)。標記為A的區(qū)域相應(yīng)于E1B啟動子，區(qū)域B和C位于55K編碼區(qū)內(nèi)。pIX上游區(qū)域不認為是啟動子序列。在這三個區(qū)域中，區(qū)域C具有最高分值(0.96)(甚至高于已知的E1B啟動子)因而可能包含影響pIX表達的序列。
            
為通過實驗定位和鑒別一個可能的pIX啟動子，產(chǎn)生一系列相應(yīng)于55K編碼序列的3’端的不同(重疊)部分的小片段。圖9示出了這些片段及其相對于推定的啟動子區(qū)域和pIX基因的位置。所述片段通過使用指定的酶進行限制性消化而產(chǎn)生。片段用Klenow(5’突出端)或T4 DNA聚合酶(3’突出端)平端化并克隆進也經(jīng)Klenow處理而平端化并經(jīng)SAP處理(Roche)而去磷酸化的pGL3basic載體(Promega)的NcoI位點中。在轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌中之后，通過限制性消化對獲得的質(zhì)粒檢測插入體的方向。然后通過使用lipofectamine試劑根據(jù)廠商說明書將獲得的熒光素酶構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染進PER.C6細胞中而分析啟動子活性。空的pGL3basic質(zhì)粒作為陰性對照。另外的對照通過將i)來自含有Ad5 pIX啟動子的pAdApt535的BglII-MfeI片段，ii)一個388bp的NruI-ApaLI RSV啟動子片段(如上述)，或者iii)Ad35 pIX上游區(qū)域作為PCR片段克隆進上述pGL3basic的平端NcoI位點而產(chǎn)生。使用引物SV40-for及5′-磷酸化的Ad35pIXrev在pAdApt35IP1上擴增Ad35上游pIX區(qū)域。在擴增之后，將該DNA用BglII消化并用Klenow處理。
            
將構(gòu)建體也轉(zhuǎn)染進不含有腺病毒E1的人細胞(例如A549，Hela)中以研究E1A表達的依賴性。
            
將片段也克隆進銜接質(zhì)粒pBr.Ad35ΔSM.AdAptLacZ(見上述)中以能產(chǎn)生重組病毒并研究病毒基因組的穩(wěn)定性。為此，將構(gòu)建體pBr.Ad35ΔSM.AdAptLacZ用MfeI和BglII消化，用Klenow酶平端化并去磷酸化。在從凝膠中分離所述載體片段后，可將DNA與上述片段連接(見圖9)以產(chǎn)生具有不同長度的pIX基因上游55K片段的一組銜接質(zhì)粒。病毒可以用上述構(gòu)建體pWE.Ad35.pIX-rITR產(chǎn)生。用pBr.Ad35ΔSM.AdAptLacZ，pAdApt35.LacZ和pAdApt35.LacZ.rsv構(gòu)建體進行對照轉(zhuǎn)染。在出現(xiàn)完全CPE之時，通過一次冷凍/解凍循環(huán)收獲細胞和培養(yǎng)基并用于再次感染新鮮的PER55K細胞。在完全CPE時再次收獲細胞和培養(yǎng)基，制備粗制裂解物并用于進行噬斑分析。在出現(xiàn)噬斑后，加入X-gal染色溶液以檢測LacZ表達。
            
上述實驗的結(jié)果有助于發(fā)現(xiàn)Ad35 E1B-55K區(qū)域中pIX調(diào)節(jié)序列的位置。
            
或者，pIX基因表達可以通過作為異源啟動子的E1B啟動子驅(qū)動以產(chǎn)生重組病毒。為此，將pAdApt535.LacZ用BglII和MfeI消化，隨后經(jīng)Klenow處理而平端化末端及去磷酸化。然后將如此處理的4.8kb載體片段從凝膠中分離。E1B啟動子區(qū)域使用pBr.Ad35.leftITR-pIX作為靶DNA及Epr-F和Epr-R引物作為PCR片段而分離，而這兩個引物均磷酸化。使用Pwo DNA聚合酶(Genaxis/Inno-train Diagnostik Gmbh)根據(jù)廠商說明書進行PCR。然后將所得151bp片段克隆進分離的載體中以產(chǎn)生pAdApt35Epr.LacZ。
            
該質(zhì)粒然后用于產(chǎn)生基于Ad35的病毒并如前述測試穩(wěn)定性。
            
為鑒別含有pIX序列的不同轉(zhuǎn)錄物，從感染的細胞中分離RNA并將含有pIX的RNA通過與標記的特異性探針雜交而鑒別。為此，將PER55K細胞用如下病毒以感染復(fù)數(shù)為10和50感染wtAd35、Ad35.E1B.AdApt.Luc、Ad35ΔE3.AdApt.Luc、Ad35ΔE3.AdApt535.Luc、Ad35.AdApt.Luc.rsv。8小時后(wtAd35在2和18小時后)收獲感染的細胞，使用TRI-zol試劑(Invitrogen)分離RNA。將該RNA在1.5％瓊脂糖凝膠上進行大小分級分離，移至Northern印跡并與衍生自pIX編碼區(qū)的32P標記的探針雜交。本領(lǐng)域已知該程序(見MolecularCloningA laboratory manual，by Sambrook and Russell，2001或較早的版本)。如果包含已知RNA大小標記并給出含有pIX序列的RNA物種的指示，則RNA的長度可以確定。為鑒別在E1B啟動子中開始的mRNA，可以將印跡剝離并再與5′21K探針雜交。不與E1B-21K探針雜交的含有pIX的轉(zhuǎn)錄物可能通過與E1B啟動子不同的啟動子產(chǎn)生。
            
由于可能的(及期望的)剪接事件，仍難以通過這種方法準確確定轉(zhuǎn)錄起始位點。這可如下實現(xiàn)。將分離的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并使用GeneRacer系統(tǒng)(Invitrogen)根據(jù)廠商說明書使用pIX編碼序列的反向引物將該cDNA用于特異性擴增含有pIX的RNA的5’端，所述引物是pIXrev和嵌套引物pIXrev-N2。對擴增的片段進行克隆和測序提供了轉(zhuǎn)錄起始位點的位置及含有pIX序列的mRNA的5’序列。在這種方式中，鑒別了可能的pIX編碼mRNA。pIX表達水平與相應(yīng)的重組腺病毒的穩(wěn)定性之間的關(guān)系因此也可以確定。
            
實施例11來自B群腺病毒的E1B和pIX序列
            
上述實施例使用Ad35病毒作為實例。彼此相當同源的B亞群的其它成員可能具有相似的pIX調(diào)節(jié)。
            
為對此進行研究，我們將B亞群成員的E1B和pIX序列進行序列對比。Ad7的序列(SEQ ID NO57)通過Genbank登記號X03000獲得。Ad11的序列(SEQ ID NO56)通過與針對Ad35序列(SEQ ID NO55)所述(WO 00/70071)相似的Lark技術(shù)(UK)，對分離自Ad11p野生型病毒的DNA序列進行鳥槍法(shotgun)測序而揭示。Ad11和Ad35是彼此高度同源的(整體98.1％相似性)，主要差別位于六鄰體和尾絲結(jié)(knob)中。Ad11序列也在WO 02/053759中揭示。E1A的聚腺苷酸化位點(pA)與pIX基因的pA下游之間的序列用于序列對比(圖10)。Ad35與Ad11的整體相似性(在這個區(qū)域中)為98.4％，與Ad7的整體相似性為82.9％。這使得在這些病毒中pIX的表達是以相同方式調(diào)節(jié)是非?？赡艿?。
            
因此，在先前的實施例中例證的本發(fā)明的方法和手段可以用于增加亞群B的其它重組腺病毒的穩(wěn)定性和/或插入容量，在此通過Ad11和Ad7例證。
            
實施例12在Ad5互補細胞系上表達Ad5-E4/Orf6的缺失E1的Ad35病毒的產(chǎn)生
            
腺病毒血清型35基因組的測序以及基于質(zhì)粒的載體系統(tǒng)的構(gòu)建和重組的基于Ad35的病毒的產(chǎn)生已經(jīng)在WO 00/70071中詳細描述。
            
如下將Ad5-E4-orf6編碼序列克隆進pAdApt35IP1(ECACC保藏號P02041228，關(guān)于這個質(zhì)粒的克隆詳見于WO 00/70071)中。將該質(zhì)粒用NheI和AvrII消化并用牛小腸磷酸酶(New England Biolabs)去磷酸化。消化的DNA使用GeneClean試劑盒從凝膠中分離。將質(zhì)粒pΔMT.Orf6.Hygro(圖11，ECACC保藏號P02041226)用NheI消化，隨后用XbaI部分消化。在凝膠上分離所得條帶后，將與E4-orf6序列連接的ΔMT啟動子相應(yīng)的1350bp片段從凝膠中純化。接著，將這兩個分離的片段連接并轉(zhuǎn)化進電感受態(tài)DH10B細胞(Invitrogen/LifeTechnologies)，之后，選擇具有與SV40 poly(A)信號方向正確的插入體的一個集落進行大規(guī)模DNA制備。這樣產(chǎn)生了構(gòu)建體pAd35.ΔMT.Orf6(圖12)，其含有與突變的金屬硫蛋白(ΔMT)啟動子功能性連接的Ad5 E4-orf6編碼序列。ΔMT啟動子已經(jīng)由Hagmeyer et al.(1996)描述。Ad5 E4-orf6序列相應(yīng)于Ad5序列中的第33193-34077位核苷酸(Genbank登記號M73260)。為測試Ad5 E4-orf6蛋白的表達是否使得完全缺失E1的Ad35載體可能在Ad5互補細胞上生產(chǎn)，將pAd35.ΔMT.Orf6與Ad35主鏈構(gòu)建體pWE.Ad35.pIX-rITR在PER.C6細胞上共轉(zhuǎn)染。為此，將pAd35.ΔMT.Orf6用PI-Psp-1消化并將pWE.Ad35.pIX-rITR用NotI消化以從主鏈中釋放腺病毒插入體。將2μg消化的pAd35.ΔMT.Orf6和6μg消化的pWE.Ad35.pIX-rITR使用LipofectAmine轉(zhuǎn)染。將該轉(zhuǎn)染混合物加入在前一天以3.5×106個細胞/T25培養(yǎng)瓶的密度接種的PER.C6中。第二天，將培養(yǎng)基更換為PER.C6培養(yǎng)基(具有10％FBS和10mM MgCl2的DMEM)并將細胞在37℃/10％CO2中進一步溫育。對照轉(zhuǎn)染使用pAdApt35.Luc與pWE.Ad35.pIX-rITR共轉(zhuǎn)染及單獨的pWE.Ad35.pIX-rITR進行。在轉(zhuǎn)染兩天后，將細胞從T25傳遞至T80培養(yǎng)瓶并入上述溫育。再三天后，用pAd35.ΔMT.Orf6與Ad35主鏈一起轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物示出表示病毒復(fù)制的致細胞病變作用(CPE)，在進一步溫育2天后收獲(包括細胞和培養(yǎng)基)。將細胞懸浮液進行2次冷凍/解凍循環(huán)，并將所得材料(粗制裂解物)在-20℃保存直至進一步使用。其它培養(yǎng)瓶未示出CPE，在移至T80中6天后在T80培養(yǎng)瓶中以1∶3傳代。再過5天后，pAdApt35.Luc+pWE.Ad35.pIX-rITR轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)瓶示出少量的類CPE事件，但不進一步進展。將得自pAd35.ΔMT.Orf6轉(zhuǎn)染的0.2和0.5ml的粗制裂解物用于再次感染于T80培養(yǎng)瓶中大約85％鋪滿的PER.C6細胞。這樣在溫育一天后產(chǎn)生完全CPE，表明所述粗制裂解物中存在感染性病毒。這些培養(yǎng)物也通過兩次冷凍/解凍循環(huán)收獲。單獨用構(gòu)建體pAd35.ΔMT.Orf6在PER.C6細胞上進行另外的對照轉(zhuǎn)染，以證實orf6自身的表達不產(chǎn)生細胞毒性及類CPE細胞死亡。總之，只有用pAd35.ΔMT.Orf6與pWE.Ad35.pIX-rITR一起轉(zhuǎn)染才產(chǎn)生CPE及病毒復(fù)制。
            
進行PCR分析以證實用Ad5-E4-orf6置換從前的E1區(qū)的基于Ad35的病毒基因組的存在。為此，將病毒DNA如下從粗制裂解物中分離。將275μl的粗制裂解物與10μl DNaseI(10mg/ml)在37℃溫育30分鐘。隨后，加入6.0μl 0.5M EDTA(pH8.0)、7.5μl 20％SDS和1.5μl20mg/ml蛋白酶K并渦旋混合。然后將該混合物在50℃溫育1小時。最后，使用GeneClean Spin試劑盒(Bio 101，Inc.)分離病毒DNA。將2μl分離的DNA使用引物35psi-For和35R4進行PCR擴增。程序設(shè)定為94℃2分鐘，隨后進行30次(94℃30秒，58℃30秒及72℃5分鐘)循環(huán)，最后在72℃10分鐘結(jié)束反應(yīng)。所述引物特異于Ad35序列并產(chǎn)生一個2.9kb的片段，范圍從包裝序列至第4669位核苷酸(編號如野生型Ad35序列)，其因此包括Ad5 orf6轉(zhuǎn)基因盒。對獲得的PCR片段進行電泳示出該片段具有期望的長度，與在銜接質(zhì)粒pAd35.ΔMT.Orf6上產(chǎn)生的對照PCR片段匹配。因此，如果病毒也表達Ad5-E4orf6，則可以在Ad5互補細胞上產(chǎn)生完全缺失E1的基于Ad35的載體。
            
實施例13pWE.Ad35.pIX-rITR5E4的構(gòu)建
            
將第一個PCR片段使用引物DF35-1和35FR擴增。擴增使用pWE.Ad35.pIX-rITR(見WO 00/70071)作為模板DNA，使用Pwo DNA聚合酶(Roche)及另外的DMSO(Sigma，終濃度3％)進行。程序如下94℃2分鐘，隨后進行30次(94℃30秒，52℃30秒及72℃3分鐘)循環(huán)，最后的步驟是72℃8分鐘以保證完整的片段。擴增產(chǎn)生相應(yīng)于Ad35序列的第30224-31805位核苷酸的1.6kb的片段。將BamHI位點導(dǎo)入3’端。將擴增的DNA使用GeneClean試劑盒從凝膠中純化并與pCRScript/Amp克隆載體試劑盒(Stratagene)連接。在轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)DH10B細胞中后，選擇白色集落進行進一步分析。這樣產(chǎn)生構(gòu)建體pCR-fiber35。由于平端克隆，該PCR片段可以2個方向插入。選擇在5’端pCRScript/Amp載體多接頭中具有BamHI位點的插入體的克隆。用BamHI消化因此產(chǎn)生一個1.6kb的片段。測序證實PCR片段的正確擴增。將第二個PCR片段使用引物5E4F和5E4R擴增。用pWE.Ad5.AflII-rITRsp進行擴增，其是含有pWE.Ad5.AflII-rITR(ECACC保藏號P97082116，WO 02/40665所述)中的一個額外的PacI位點的一種粘粒載體。pWE.Ad5.AflII-rITRsp作為模板，使用上述PwoDNA聚合酶，盡管pWE.Ad5.AflII-rITR也可以用于相同目的。在從凝膠中純化后，將該DNA用SstI和BamHI(在PCR期間導(dǎo)入的兩個位點)消化并將3kb的片段使用GeneClean試劑盒從瓊脂糖凝膠中純化。擴增的Ad5 E4區(qū)域相應(yīng)于Ad5序列的第32794至35828堿基對。第三個PCR片段使用引物355ITR和353ITR在pWE.Ad35.pIX-rITR上產(chǎn)生。如上所述進行PCR擴增。SstI位點(5’端)和EcoRI位點(3’端)位于所得160bp片段兩側(cè)。在如上述從凝膠中純化后，將DNA用SstI和EcoRI消化。然后將相應(yīng)于Ad35的右側(cè)ITR的160bp的片段在低熔點的瓊脂糖凝膠上從消化的末端中分離并在凝膠中收集。接著，將pUC119用BamHI和EcoRI消化并將3.1kb的片段使用GeneClean試劑盒從凝膠中分離。然后將上述處理的第二個和第三個PCR片段與BamHI/EcoRI消化的pUC119連接，產(chǎn)生pUC.Ad5E4-35ITR。對克隆的PCR衍生的插入體進行測序以核實正確的擴增。接著，將pCR-fiber35中的1.6kb插入體用BamHI切除并將該片段如上述從凝膠中純化。將pUC.Ad5E4-35ITR也用BamHI消化并將該線性片段從凝膠中純化。將這兩個片段連接并選擇具有相互正確方向的克隆，產(chǎn)生pUC.35-5E4(圖14)。pUC.35-5E4的構(gòu)建步驟示于圖13。將pUC.35-5E4中的腺病毒插入體亞克隆進pBr.Ad35.PRn中(圖15；見WO 00/70071)，這是具有Ad35 3’序列的一種構(gòu)建體。為此，將構(gòu)建體pUC.35-5E4用MluI和NotI消化并使用GeneClean試劑盒將4.7kb片段從凝膠中純化。然后將這個片段與得自經(jīng)MluI和NotI消化的構(gòu)建體pBr.Ad35.PRn的載體片段連接。將這個16.3kb的片段使用瓊脂糖酶(Roche)從凝膠中純化。然后將該連接物轉(zhuǎn)化進感受態(tài)DH10B細胞中。所得構(gòu)建體稱為pBr.Ad35.PR5E4(圖16，ECACC保藏號P02041229)。最后的步驟是需將修飾的Ad35序列的3’末端克隆進病毒粘?？寺WE.Ad35.pIX-rITR中。為此，將兩個片段在λ噬菌體包裝反應(yīng)(Stratagene)中根據(jù)廠商說明書組合。第一個片段是通過用PacI和SwaI消化的得自pBr.Ad35.PR5E4的16.8kb的修飾的Ad35插入體，第二個片段是通過用PacI和SwaI消化pWE.Ad35.pIX-rITR獲得的22.8kb的片段。這兩個片段的正確組合產(chǎn)生pWE.Ad35.pIX-rITR5E4(圖17)。因此在這個構(gòu)建體中，Ad35主鏈中的E4區(qū)由衍生自Ad5的相應(yīng)區(qū)域置換。
            
實施例14pWE.Ad35.pIX-rITR5Orf6的構(gòu)建
            
為獲得含有從pIX基因(Ad35序列中的第3401位核苷酸)至右側(cè)ITR的末端的Ad35序列，而且E4-orf6和-orf6/7的序列交換為Ad5的相應(yīng)序列的一種腺病毒主鏈構(gòu)建體，將Ad35和Ad5序列經(jīng)PCR擴增并如下述組合。PCR片段使用添加直至3％的DMSO的Pwo DNA聚合酶產(chǎn)生。第一個PCR使用pBr.Ad35.PRn(圖15；見WO 00/70071)作為模板及使用引物E4-F1和E4-R2。其程序設(shè)定為94℃2分鐘，隨后進行5次(94℃30秒，50℃30秒及72℃1分鐘)循環(huán)，接著進行30次(94℃30秒，60℃30秒及72℃1分鐘)循環(huán)，最后在68℃8分鐘結(jié)束反應(yīng)。將所得1.8kb的片段使用GeneClean試劑盒純化。第二個PCR使用pWE.Ad5.AflII-rITRsp作為模板，其是含有pWE.Ad5.AflII-rITR(ECACC保藏號P97082116，見WO 02/40665所述)中一個PacI位點的粘粒載體，并使用引物E4-F3和E4-R4進行。其程序設(shè)定如下94℃2分鐘，隨后進行30次(94℃30秒，62℃30秒及72℃1分鐘)循環(huán)，最后在68℃8分鐘結(jié)束。將1.1kb片段如上純化。第三個PCR用pBr.Ad35.PRn作為模板及使用引物E4-F5和E4-R6進行。其程序設(shè)定如下94℃2分鐘，隨后進行5次(94℃30秒，48℃30秒及72℃45秒)循環(huán)，接著進行30次(94℃30秒，56℃30秒及72℃45秒)循環(huán)，最后在68℃8分鐘結(jié)束。將366bp片段如上述純化。將純化的片段的樣品加樣于凝膠上以估計濃度，然后將該片段混合在一起，含有700ng PCR-1、650ng PCR-2和430ng PCR-3，共30μl。向此混合物中加入3μl EcoPol緩沖液(New England Biolabs)，3μl 2mM dNTP溶液及3μl milliQ H2O。將所得混合物在94℃溫育3分鐘，然后在一個PCR設(shè)備中以0.5℃/秒的速度冷卻至65℃。在65℃溫育10分鐘后，將該混合物以0.05℃/秒的速度進一步冷卻至20℃并在20℃溫育10分鐘。然后加入1μl(5單位)Klenow酶(NewEngland Biolabs)，隨后在37℃溫育60分鐘。將5μl的這種Klenow混合物用作模板以如下單獨擴增兩個片段。在一個反應(yīng)中使用引物組1NF-1和NcoI-R，使用Pwo DNA聚合酶(Roche)，加入DMSO至終濃度為3％并使用如下PCR程序94℃2分鐘，隨后進行30次(94℃30秒，66℃30秒及72℃3分鐘)循環(huán)，最后在68℃8分鐘結(jié)束。在一個反應(yīng)中使用引物組2NcoI-F和NR-2，使用Pwo DNA聚合酶(Roche)，加入DMSO至終濃度為3％并使用如下PCR程序94℃2分鐘，隨后進行30次(94℃30秒，62℃30秒及72℃90秒)循環(huán)，最后在68℃8分鐘結(jié)束。將所得2.7kb片段(引物組1)和1.1kb片段(引物組2)使用GeneClean試劑盒從凝膠中純化，并均與pCRscriptAmp載體(Stratagene)連接及轉(zhuǎn)化進DH10B電感受態(tài)細胞中。這樣產(chǎn)生構(gòu)建體pCRscriptAmp.NFI-NcoIR(圖18)和構(gòu)建體pCRscriptAmp.NcoIF-NR2(圖19)。由于插入體含有平端，因此每個克隆獲得兩個方向。使用KpnI消化，選擇具有進一步克隆所需方向的構(gòu)建體(見圖18和19)。然后對插入體進行測序以核實正確的擴增。接著，將來自pCRscriptAmp-NcoIF-NR2的部分插入體使用BamHI和NcoI切除，并如上述從凝膠中純化。將pCRscriptAmp-NFI-NcoIR用相同的酶消化并將含有載體的片段也從凝膠中純化。將這些片段連接產(chǎn)生pCR.NF1-NR2(圖20)。pCR.NF1-NR2含有Ad35序列的第30162-33234位核苷酸之間的Ad35序列及第31879-32974位核苷酸之間的E4-orf6和E4-orf6/7序列置換為位于Genbank中公布的Ad5序列(登記號M73260)第32968至34077位之間的Ad5衍生序列。因此，正如從圖21和22所示氨基酸序列對比中可見，克隆的E4-orf6蛋白的氨基酸序列與在Ad5(SEQ ID NO61；Ad35的E4-orf6的氨基酸序列為SEQ ID NO62)中發(fā)現(xiàn)的E4-orf6序列相同，而且E4-orf6/7氨基酸序列與Ad5中存在的E4-orf6/7序列絕大部分相同(Ad 5的E4-orf6/7序列為SEQ ID NO63，Ad35的E4-orf6/7序列為SEQ IDNO64，克隆的融合蛋白為SEQ.ID.NO.65)。顯然，使用不偏離本發(fā)明的上述一般方法可以設(shè)計不同的雜合Ad35-Ad5 E4構(gòu)建體。然后將來自pCR.NF1-NR2的這種嵌合插入體克隆進pWE.Ad35.pIX-rITR將pCR.NF1-NR-2用MluI和NdeI消化并將所得2.8kb片段使用GeneClean試劑盒從凝膠中純化。將構(gòu)建體pBr.Ad35.PRn也用MluI和NdeI消化并將18kb載體片段使用瓊脂糖酶(Roche)從凝膠中分離。將這兩個片段連接產(chǎn)生構(gòu)建體pBr.Ad35.PR.5Orf6(圖23，ECACC保藏號P02041227)。將這個構(gòu)建體中含有嵌合E4區(qū)域的PacI和SwaI之間的Ad35序列使用上述λ噬菌體包裝克隆進構(gòu)建體pWE.Ad35.pIX-rITR中。所得pWE.Ad35pIX-rITR.5Orf6(圖24)通過在PER.C6包裝細胞上與Ad35銜接質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染用于產(chǎn)生重組的基于Ad35的病毒。
            
實施例15構(gòu)建pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3.5E4和pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3.5Orf6
            
將Ad35主鏈通過缺失E3序列而進一步修飾。已知E3蛋白調(diào)節(jié)宿主對腺病毒感染的免疫應(yīng)答并因此對重組病毒的體外增殖是非必需的。另外，E3序列的缺失使得可以在載體中插入一個更大的異源序列而不損害包裝效力。同樣，就腺病毒載體用作免疫接種的載體而言，由E3區(qū)編碼的免疫調(diào)節(jié)基因不是優(yōu)選的。
            
如前述構(gòu)建pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3(圖1)。為構(gòu)建上述E3缺失形式的E4修飾的主鏈構(gòu)建體，如下在pBr.Ad35.PRnΔE3(圖25)構(gòu)建體中導(dǎo)入E4修飾。將構(gòu)建體pUC.35-5E4(圖13)用MluI和NotI消化并將4.7kb片段使用GeneCleanII試劑盒從凝膠中分離。將構(gòu)建體pBr.Ad35.PRnΔE3也用MluI和NotI消化并將13.6kb載體片段使用GeneClean spin試劑盒從凝膠中分離。將這些片段連接產(chǎn)生構(gòu)建體pBr.Ad35.ΔE3.PR5E4(圖26)。將構(gòu)建體pCR.NF1-NR2(圖20)用MluI、NdeI和BglI消化(后者將載體片段消化為較小片段)，并將2.8kb片段使用GeneClean spin試劑盒從凝膠中分離。將構(gòu)建體pBr.Ad35.PRnΔE3用MluI和NdeI消化，使用CIP酶(New EnglandBiolabs)去磷酸化并將15.2kb載體片段使用GeneClean spin試劑盒從凝膠中分離。將這些片段連接產(chǎn)生構(gòu)建體pBr.Ad35.ΔE3.PR5Orf6(圖27)。
            
然后將pBr.Ad35.ΔE3.PR5E4和pBr.Ad35.ΔE3.PR5Orf6用于將pWE.Ad35.pIX-rITR中的3’PacI-SwaI片段交換為pBr.Ad35.ΔE3.PR5E4和pBr.Ad35.ΔE3.PR5Orf6中的相應(yīng)區(qū)域。這樣產(chǎn)生構(gòu)建體pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3.5E4和pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3.5Orf6。產(chǎn)生這些大粘粒的另一種方法是在連接反應(yīng)中使用三個片段包裝一個來自pWE.Ad35.pIX-rITR的14.7kb的NotI-PacI片段、來自pBr.Ad35.ΔE3.PR5E4或pBr.Ad35.ΔE3.PR5Orf6的PacI-NotI插入體及NotI消化的pWE15粘粒載體片段(Stratagene)。后一片段也可以分離自NotI/PacI消化的pWE.Ad35.pIX-rITR。例如NotI-消化的pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3.5Orf6與例如PI-PspI消化的pAdApt35.LacZ.rsv(實施例9)共轉(zhuǎn)染進PER.C6TM細胞中將產(chǎn)生衍生自Ad35的重組腺病毒，該重組腺病毒包含衍生自Ad5的E4-orf6(授予在PER.C6上增殖的能力)，所述重組腺病毒進一步具有一個異源pIX啟動子，導(dǎo)致pIX表達水平升高及產(chǎn)生穩(wěn)定的病毒體。
            
實施例16在PER.C6細胞上產(chǎn)生E1和E1/E3缺失的基于Ad35的載體
            
為使用基于pBr.Ad35.PRn的構(gòu)建體能在互補細胞系PER.C6上產(chǎn)生重組Ad35病毒，我們首先產(chǎn)生含有Ad35序列(WO 00/70071)的第3401至24650堿基對的Ad35序列的一種新的構(gòu)建體，并因此與銜接質(zhì)粒和基于pBr.Ad35.PRn的構(gòu)建體重疊。將這三個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進PER.C6細胞中，進行雙同源重組產(chǎn)生一個完整的病毒基因組，重組病毒的復(fù)制如圖18所示。需要的質(zhì)粒通過缺失pWE.Ad35.pIX-rITR中的大部分Ad35序列而產(chǎn)生。為此，將pWE.Ad35.pIX-rITR用EcoRV消化并將含有29kb載體的片段使用Geneclean spin試劑盒從低熔點凝膠中純化。將純化的DNA自身連接并用于轉(zhuǎn)化DH10B電感受態(tài)細菌(Invitrogen/LTI)產(chǎn)生pWE.Ad35.pIX-EcoRV(圖29)。
            
用于轉(zhuǎn)染的所有DNA均如表V所示消化，在65℃熱失活15分鐘，用于轉(zhuǎn)染中時不用進一步處理。將PER.C6細胞在轉(zhuǎn)染前一天以3×106個細胞/培養(yǎng)瓶的密度接種于T25培養(yǎng)瓶中并如表V所示使用LipofectAmine(Invitrogen/LTI)根據(jù)廠商說明書進行轉(zhuǎn)染，除了在5小時后將無血清DMEM培養(yǎng)基(Gibco/BRL)中轉(zhuǎn)染混合物用PER.C6培養(yǎng)基(DMEM，10％FBS和10mM MgCl2)置換。第2天，通過熒光顯微鏡估計轉(zhuǎn)染效力為50％。兩天后，將細胞經(jīng)胰蛋白酶消化并再接種于T80培養(yǎng)瓶中并在37℃/10％CO2中進一步溫育。在轉(zhuǎn)染6天后，所有培養(yǎng)物均示出完全致細胞病變作用(CPE，表示病毒增殖)，除了用Ad35.AdApt.eGFP+pWE.Ad35.pIX-rITR轉(zhuǎn)染的PER.C6培養(yǎng)物。一天后，收獲具有CPE的培養(yǎng)瓶中的細胞和培養(yǎng)基并進行兩次冷凍/解凍循環(huán)，通過離心(10分鐘，1500rpm)從細胞碎片中澄清，并將100μl這些粗制裂解物用于再次感染于T80培養(yǎng)瓶中85％鋪滿的新鮮PER.C6細胞。通過胰蛋白酶消化收獲沒有示出CPE跡象的Ad35.AdApt.eGFP+pWE.Ad35.pIX-rITR轉(zhuǎn)染物。感染新鮮PER.C6細胞2天后，所有培養(yǎng)瓶均示出了完全CPE，除了一個在開始收獲時沒有示出CPE跡象。這清楚示出當Ad5 E4-orf6基因產(chǎn)物從Ad35主鏈中表達時，完全缺失E1的基于Ad35的病毒可以在PER.C6細胞上生產(chǎn)。
            
實施例17具有驅(qū)動pIX表達的異源啟動子的缺失E1的Ad35病毒
            
為研究在完全缺失E1的病毒中異源啟動子序列激活pIX基因的作用，使用一系列銜接質(zhì)粒產(chǎn)生重組Ad35病毒。為此，將pAdApt35LacZ、pAdApt35.LacZ.rsv(實施例9)、pAdApt535.LacZ(實施例5)和pAdApt35BLacZ(在pIX基因的前面含有Ad35 E1B啟動子序列；見下述)用pIPsp-1消化并如實施例2(及WO 00/70071)所述用于產(chǎn)生具有NotI消化的粘粒pWE/Ad35-3481和pWE/Ad35-3481ΔE3(實施例7)的病毒。另外，產(chǎn)生具有銜接質(zhì)粒pBr.Ad35.ΔSM.AdAptLacZ(圖7；實施例10)的病毒。這個銜接質(zhì)粒缺失E1A和大部分E1B序列。其保留0.6kb的3’E1B-55K序列及還具有55K的終止密碼子與pIX的起始密碼子之間的wt序列。
            
在完全CPE時，收獲細胞和培養(yǎng)基，冷凍/解凍并離心以除去細胞碎片。然后將每個轉(zhuǎn)染物的上清(澄清的裂解物)用于進行如實施例9所述的噬斑分析。將澄清的裂解物系列稀釋10倍并將10-5至10-9的稀釋液鋪板。
            
在加入瓊脂覆層后一周，噬斑變得可見并將其用X-gal染色以監(jiān)測LacZ活性。表VI概括示出了這些實驗的結(jié)果。具有除了調(diào)節(jié)pIX的內(nèi)源近端pIX上游序列的額外或其它序列所有Ad35病毒進行的更好，在我們的分析中與E1缺失的Ad35.AdApt.LacZ病毒相比具有較高數(shù)目的表達噬斑。注意Ad35.ΔSM.LacZ病毒的基因組總長度(是野生型Ad35的106％)超過針對Ad5病毒(105％)測定的最大可包裝長度。這也許影響針對這個病毒獲得的結(jié)果。Ad35.AdApt.LacZ.rsv(105％)也在理論上可包裝大小的邊界。綜合這些結(jié)果示出驅(qū)動pIX表達的一個異源啟動子改善最大耐受的包裝大小及E1缺失的Ad35病毒的穩(wěn)定性。針對具有較長內(nèi)源近端序列的病毒(Ad35.ΔSM.LacZ)也同樣，這提示在此額外的(E1B 55K)序列含有pIX表達的調(diào)節(jié)序列。
            
pAdapt35BLacZ是具有調(diào)節(jié)pIX基因的Ad35 E1B啟動子序列的一個Ad35銜接質(zhì)粒。
            
銜接質(zhì)粒pAdApt35BLacZ如下產(chǎn)生。將E1B啟動子片段使用引物35E1Blong和Ad35E1Bpromrev擴增。這兩個引物均被磷酸化。使用Pwo DNA聚合酶(Inno-train，Diagnostic GmbH)根據(jù)廠商說明書進行反應(yīng)。pBr.Ad35.leftITR-pIX用作模板DNA(25ng，見WO 02/40665所述)。該程序設(shè)定如下94℃2分鐘，然后進行30次(94℃30秒，60℃30秒及72℃1分鐘)循環(huán)，最后在72℃10分鐘結(jié)束。冷卻/加熱坡度設(shè)定為2℃/秒。這個PCR導(dǎo)致125個核苷酸的Ad35的潛在的E1B啟動子擴增。然后將構(gòu)建體pAdapt535.LacZ(實施例5)用MfeI和BglII消化。在消化后，將該載體用Klenow酶處理以產(chǎn)生平端。去磷酸化步驟使用SAP(Roche)進行。然后將如此處理的8kb載體片段從凝膠中分離。將E1B啟動子區(qū)域也從凝膠中分離。連接這兩個片段并轉(zhuǎn)化進DH5α-T1r感受態(tài)細胞中(Invitrogen)。所得質(zhì)粒中E1B啟動子的正確方向通過用HpaI和ApaLI消化而證實。在選擇正確的克隆后，插入的E1B啟動子序列也通過測序加以核實。
            
實施例18pIX基因的啟動子位于Ad35和Ad11病毒中E1B-55K編碼序列的3’端。
            
基于上述結(jié)果，我們期望亞群B病毒中的pIX啟動子位于E1B-55K編碼區(qū)。為對此加以研究，我們?nèi)鐚嵤├?0所述開始鑒別pIX mRNA加帽位點。為此，使用wtAd35、wtAd11和Ad35.E1B+.AdApt.Luc病毒以50VP/細胞的MOI感染PER55K克隆16細胞。取wtAd5作為對照，因為這個病毒的啟動子和mRNA起始位點已知。在感染后16-18小時，使用TRIzol試劑(Invitrogen)根據(jù)廠商說明從感染的培養(yǎng)物中分離RNA。在該程序結(jié)束時，將分離的RNA貯存在100％甲酰胺中。使用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)擴增pIX轉(zhuǎn)錄物的5’末端，以確定轉(zhuǎn)錄起始的位置。在開始GeneRacer方案之前，如GeneRacer方案所述將5μg RNA通過乙酸鈉沉淀從甲酰胺中純化。將純化的RNA根據(jù)廠商方案進行處理以擴增pIXmRNA的5’末端。在磷酸酶處理和隨后用煙草酸焦磷酸酶除去帽結(jié)構(gòu)及與Generacer RNA oligo連接后，使用來自該試劑盒的SuperScriptTM II反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。CDNA通過使用pIX的一個基因特異性(反向)引物的反轉(zhuǎn)錄合成。就Ad35(wt及E1B+.Luc病毒)和wtAd11而言，使用引物pIXrev，就Ad5而言，使用引物pIXrev-Ad5。所得cDNA(1μl，未知濃度)用作PCR模板以產(chǎn)生dsDNA。這個PCR使用Pwo DNA聚合酶(Roche)根據(jù)廠商說明書進行，并添加DMSO(Sigma；3％v/v)。所述擴增使用來自該試劑盒的特異于與所述mRNA的5’端連接的寡核苷酸的GeneRacer 5’引物，及如上述基因特異性反向引物進行。反應(yīng)條件如下在94℃變性2分鐘，隨后進行30次(94℃30秒，60℃30秒，72℃2分鐘)循環(huán)，最后在68℃延長8分鐘。所得DNA片段通過在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳而按大小分離。就Ad5而言，獲得一個480bp的片段，就Ad35(兩個病毒)和Ad11而言，獲得一個200bp的片段。Ad11還示出一個2kb片段。切下所有片段并從瓊脂糖凝膠中純化。將純化的DNA片段克隆進pCR4Blunt-TOPO_載體(Invitrogen)中。對此載體使用商業(yè)M13正向和反向引物進行測序。將所得序列與野生型序列相對比以確定pIX轉(zhuǎn)錄起始的位置。從Ad35和Ad11 cDNA制品中分離的200bp條帶組成真正的pIXmRNA，分離自Ad11的2kb片段源于E1B啟動子。圖30示出Ad35(SEQ ID NO59)和Ad11(SEQ ID NO58)cDNA序列與wt Ad35序列(SEQ.ID.NO.60)的對比。該對比揭示了pIX mRNA中剪接的內(nèi)含子序列的位置。圖31示出Ad35的E1B-pIX區(qū)域中鑒別的加帽位點和剪接位點的位置。就Ad5而言，鑒別了期望的pIX mRNA(Babiss andVales，1991)的加帽位點位于第3580位(未示出，編號如Genbank登記號M73260)。就Ad35而言，所述加帽位點位于E1B-55K基因3’末端第3339位的A殘基上(Ad35序列，WO 00/70071)。在Ad11中，所述加帽位點相似地在T殘基上發(fā)現(xiàn)(Genbank登記號AY163756第3339位)。令人感興趣地，在pIX的啟動子位于在Ad5病毒中之處，55K基因的終止密碼子和pIX的起始密碼子之間的序列在Ad35和Ad11病毒中被從mRNA中剪接掉。這些結(jié)果提供了有利證據(jù)表明在Ad35和Ad11中，pIX基因表達是由位于55K基因的3’末端的一個啟動子調(diào)節(jié)的。
            
實施例19保留3’E1B-55K序列的一段短序列的E1缺失的Ad35病毒具有較大的包裝能力
            
隨著pIX mRNA加帽位點的鑒別，在病毒載體中包含天然的Ad35啟動子以正確表達pIX以及盡可能多地限制E1B-55K序列成為可能。在此作為一個非限制性實例，我們揭示了保留166bp的55K編碼序列的3’末端的Ad35銜接質(zhì)粒的構(gòu)建(pAdApt35Bsu.Luc)及穩(wěn)定性和/或包裝能力增加的E1缺失的Ad35Luc病毒的產(chǎn)生。這個166bp的序列不編碼一個功能性55K基因產(chǎn)物，但在其相對于pIX編碼序列的天然位置中含有在前述實施例中鑒別的pIX mRNA加帽位點。
            
如下產(chǎn)生構(gòu)建體pAdApt35Bsu.Luc
            
首先使用40ng pBr.Ad35.leftITR-pIX作為靶DNA(見WO02/40665所述)及使用引物Bsu55KF和Age-pIXR產(chǎn)生一個PCR片段。該PCR使用Pwo DNA聚合酶(Genaxis)根據(jù)廠商說明書進行。另外，使用3％v/v DMSO(Sigma)。程序設(shè)定如下94℃2分鐘，然后進行30次(94℃30秒，60℃30秒及72℃1.5分鐘)循環(huán)，最后在68℃8分鐘結(jié)束。將所得1.2kb產(chǎn)物根據(jù)廠商的方案直接克隆進pCR4Blunt-TOPO載體(Invitrogen)中，產(chǎn)生pCR4Blunt-TOPO.Bsu-Age。將該構(gòu)建體通過用PvuII(New EnglandBiolabs)消化進行檢測。將Bsu-Age片段從用Bsu36I(New EnglandBiolabs)消化及用Klenow酶(New England Biolabs)處理以產(chǎn)生平端的pCR4Blunt-TOPO.Bsu-Age質(zhì)粒中分離。然后將該DNA使用PCR純化試劑盒(Qiagen)純化及用AgeI(New England Biolabs)消化。將1kb的片段使用Gene clean II試劑盒(Bio1O1，Inc.)從凝膠中分離。平行地，將構(gòu)建體pAdApt35.Luc(見WO 00/70071所述)用BglII消化并用Klenow酶處理。將該DNA使用PCR純化試劑盒(Qiagen)純化。純化的DNA用AgeI(New England Biolabs)消化及用SAP(Roche)去磷酸化。將5.8-Kb片段使用Gene clean II試劑盒(Bio101)從凝膠中分離。將這兩個片段在連接反應(yīng)中以等摩爾量混合并轉(zhuǎn)化進T1抗性EMDH10B細胞(Invitrogen)中。這樣產(chǎn)生了質(zhì)粒pAdApt35Bsu.Luc。
            
為產(chǎn)生E1-缺失的病毒，將pAdApt35Bsu.Luc用pIPsp-I消化并與NotI消化的pWE.Ad35-3481(實施例7)及前述的pWE.Ad35-3481ΔE3在PER55K克隆16細胞上共轉(zhuǎn)化。pWE.Ad35-3481ΔE3含有與pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3(實施例2)相同的E3缺失，根據(jù)實施例7所述方法使用構(gòu)建體pWE.Ad35-3481ΔNdeI和一個來自pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3的26.6kb的NdeI片段產(chǎn)生。
            
另外，產(chǎn)生E1-缺失的Ad35病毒，其在病毒主鏈中含有來自Ad5的E4-Orf6和E4-Orf6/7序列代替天然的Ad35序列(見實施例16在未修飾的PER.C6細胞上產(chǎn)生這種病毒)。在本實施例中，將用pIPsp-I消化的pAdApt35Bsu.Luc與NotI/EcoRV消化的pWE.Ad35.pIX-EcoRV及與PacI/NotI消化的pBr.Ad35.PR5Orf6(有或無E3區(qū))共轉(zhuǎn)染。所有轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染后一周內(nèi)均產(chǎn)生完全CPE，如上述收獲細胞和培養(yǎng)基。然后將病毒進行噬斑純化，并針對轉(zhuǎn)基因區(qū)域的完整性通過PCR分析在合適的互補細胞上擴增的及源自單個噬斑的病毒原種(viral stocks)。如實施例3所述使用引物AdApt35CMVF和pIXrevN2進行轉(zhuǎn)基因PCR。圖32示出了對源自Ad35Bsu.Luc及源自Ad35Bsu.Luc.5Orf6病毒的噬斑進行PCR的結(jié)果實例。
            
盡管在病毒主鏈中存在E3區(qū)或E4-Orf6序列，但所有測試的噬斑(每個病毒5-10個)均含有一個完整的轉(zhuǎn)基因。一個例外出現(xiàn)在來自Ad35Bsu.Luc病毒的一個噬斑，其示出可能源自具有少量缺失的病毒的大約1.6kb的一個模糊條帶(圖32；泳道12)。在所有病毒樣品中均出現(xiàn)的大約500bp的模糊條帶是引物在病毒主鏈上的背景條帶。具有熒光素酶表達盒的含有E3的Ad35病毒在噬斑純化后被證實是穩(wěn)定的，這個觀測結(jié)果與先前用Ad35.AdApt.Luc病毒獲得的結(jié)果相反，該病毒完全缺失E1而且不含有所述166bp的3’55K編碼序列。使用標準pAdApt35.Luc質(zhì)粒，我們不能產(chǎn)生含有E3區(qū)的噬斑純化的病毒。因此隨著在主鏈中摻入額外的55K序列，我們現(xiàn)在可以產(chǎn)生總長度超過34.6kb但無明顯的不穩(wěn)定性的病毒。這與wt Ad35病毒的長度密切匹配。如果使用E3-缺失的主鏈，外源序列的容量理論上超過5kb。顯然，在不偏離本發(fā)明范圍內(nèi)，可以比在現(xiàn)有的實施例中摻入更多的E1B-55K序列和/或?qū)?’55K序列與異源增強子序列組合。
            
表I在三層培養(yǎng)瓶中的克隆#16細胞上E1-和E1/E3-缺失的Ad35病毒的產(chǎn)量。
            
病毒Scale(T175III培養(yǎng)瓶) Total#of Virus DSP后病毒顆?？倲?shù)VP/細胞Ad35.AdApt.eGFP4 7.5×10112500Ad35.ΔE3.AdApt.empty8 2×10123300Ad35.ΔE3.AdApt.LacZ8 3.8×1011600Ad35.ΔE3.AdApt.MV-F4 8.8×10112900Ad35.ΔE3.AdApt.MV-H8 2.6×10124250
            
表II對A549使用第二代病毒的粗制裂解物的轉(zhuǎn)基因(LacZ)活性測試。％藍色細胞代表用于感染的每種病毒的量。
            
病毒 10μl1μl0.1μlAd35.AdApt.LacZ.rsv 9515＜1Ad35.ΔE3.AdApt.LacZ.rsv 9010＜1Ad35.AdApt.LacZ.C4 2＜0.10Ad35.ΔE3.AdApt.LacZ.C4 15＜1＜0.1
            
表III對A549使用第二代病毒的粗制裂解物的轉(zhuǎn)基因(熒光素酶)活性測試?；钚员硎緸橄鄬鈫挝?RLU)。
            
病毒  10μl  1μl0.1μl0.01μlAd35.AdApt.Luc.rsv  845453  2794017826Ad35.ΔE3.AdApt.Luc.rsv  258269  2217466Ad35.AdApt.Luc.C4  6130  1751833Ad35.ΔE3.AdApt.Luc.C4  814642  627814723Ad35.ΔE1AΔ21K.Luc  1514698  5019650357
            
表IV引物序列。
            
名稱序列SEQ.ID.NO.35FR5′-CGGGATCCACTTTATTTTAGTTGTCGTCTTC-3′135R45′-CGGAATTCTTAATTAAGGGAAATGCAAATCTGTGAGG-3′235psi-For5′-GTGGTATTTATGGCAGGGTG-3′3DF35-15′-CACTCACCACCTCCAATTCC-3′45E4F5′-CGGGATCCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTG-3′55E4R5′-GCTGGCGAGCTCGGCGGAGTAACTTGTATGTG-3′6355ITR5′-GATCCGGAGCTCACAACGTCATTTTCCCACG-3′7353ITR5′-AGGAATTCGCGGCCGCATTTAAATC-3′8E4-F15′-AGAGGAACACATTCCCCC-3′9E4-R25′-GGGGAGAAAGGACTGTGTATTCTGTCAAATCG-3′10E4-F35′-TTTGACAGAATACACAGTCCTTTCTCCCCGGCTGG-3′11E4-R45′-ACAAAATACGAGAATGACTACGTCCGGCGTTCC-3′12E4-F55′-GGACGTAGTCATTCTCGTATTTTGTATAGC-3′13E4-R65′-TCACCAACACAGTGGGGG-3′14NF-15′-CCACAACCCCCACTACTCCC-3′15NR-25′-CGTCTCTTCCCTCTCCTCTCC-3′16NcoI-R5′-AGGATCATCCGCTGCTGCCC-3′17NcoI-F5′-CATCAGGATAGGGCGGTGG-3′1835E3for5′-AATGACTAATGCAGGTGCGC-3′1935E3rev5′-CGACGCGTTGTAGTCGTTGAGCTTCTAG-3′20AdApt35CMVF5′-GTAGGTGTCAGCCTAGGTGGTC-3′2135pIXR5′-TCATGTCAGCTGCAAGACAG-3′22SV40for5′-CAATGTATCTTATCATGTCTAG-3′23pIX5Rmfe5′-CTCTCTCAATTGCAGATACAAAACTACATAAGACC-3′24pIX35Fmfe5′-CTCTCTCAATTGTCTGTCTTGCAGCTGACATG-3′25
            
AdApt35pIXrev5′-CAATCTGTCCATCTGAAAATCC-3′26pIXcosF-25′-CTGCTGGACGTCGCGGCCGCGACATGAGTGGAAATGCTTC-3′27Adapt 35-35’-TGCAAATCTGTGAGGGGAAC-3′2835D215′-TTA GAT CCA TGG ATC CCG CAG ACT C-3′2935B35′-CCT CAG CCC CAT TTC CAG-3′3035F15′-CGGAATTCTTAATTAATCGACATCATCAATAATATACCTTATAG-3′3135R45′-CGGAATTCTTCTTAATTAAGGGAAATGCAAATCTGTGAGG-3′32Ad3555KMfeF5′-AACCAAGCTTCAATTGTCTCTGAA-3′33Ad35pIXNcoR5′-CCACCCATGGCAGCTGCAAGACAG-3′34Ad35pIXrev5′-TCAGCTGCAAGACAGAAAAAAC-3′35Epr-F5′-GTGTTTACTTAAGGTGACGTC-3′36Epr-R5′-GAAAGCCAGCTCCTATGAGC-3′37pIXrev5′-GGCGGGTTGAACGGGTCTTCCA-3′38pIXrev-N25′-GATGGGAGACGCCCTGTCAGATAAGG-3′3935E1Blong5′-AAGGTGACGTCAATATTTGTGTG-3′40Ad35E1bpromrev5′-ATGAAAGCCAGCTCCTATGAG-3′41pIXrev-Ad55′-AGGGGAGGAAGCCTTCAGG-3′42Bsu55KF5′-AGG TGG GCG TAG AGG AAT G-3′43Age-pIXR5′-CAA GAC GGG ATC TTG GCG G-3′44
            
表V實施例所述用于在PER.C6細胞上產(chǎn)生E1缺失的基于Ad35的病毒的構(gòu)建體列表。銜接構(gòu)建體用PacI消化，pWE.Ad35.pIX-EcoRV用NotI和EcoRV消化，E4-修飾的基于pBR的構(gòu)建體用PacI和NotI消化。
            
No.構(gòu)建體CPE1pAdApt35.eGFPpWE.Ad35.pIX-EcoRVpBr.Ad35.PR5E4有2pAdApt35.eGFPpWE.Ad35.pIX-EcoRVpBr.Ad35.PR5orf6有3pAdApt35.eGFPpWE.Ad35.pIX-EcoRVpBr.Ad35.ΔE3PR5E4有4pAdApt35.eGFPpWE.Ad35.pIX-EcoRVpBr.Ad35.ΔE3.PR5orf6有5pAdApt35.eGFP  pWE.Ad35.pIX-rITRxNotI無6pAdApt5.eGFP  pWE.Ad5.AflII-rITRxPacI有
            
表VI具有不同的驅(qū)動pIX表達的啟動子序列的Ad35病毒的LacZ陽性噬斑的百分比。(NP＝無可見噬斑)
            
  藍色噬斑％病毒名稱有E3區(qū)無E3區(qū)病毒長度(包括E3區(qū))Ad35.AdApt.LacZ0％50％36,1kbAd535.AdApt.LacZNP100％36,1kbAd35.AdAptB.LacZ5％80％36,2kbAd35.AdApt.LacZ.rsv90％100％36,5kbAd35ΔSM.LacZ50％100％36,7kb
            
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<170>PatentIn version 3.2
            
<210>1
            
<211>31
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 35FR
            
<400>1
            
cgggatccac tttattttag ttgtcgtctt c 31
            
<210>2
            
<211>37
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 35R4
            
<400>2
            
cggaattctt aattaaggga aatgcaaatc tgtgagg   37
            
<210>3
            
<211>20
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 35psi-For
            
<400>3
            
gtggtattta tggcagggtg  20
            
<210>4
            
<211>20
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer DF35-1
            
<400>4
            
cactcaccac ctccaattcc  20
            
<210>5
            
<211>30
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 5E4F
            
<400>5
            
cgggatccgt ttgtgttatg tttcaacgtg   30
            
<210>6
            
<211>32
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 5E4R
            
<400>6
            
gctggcgagc tcggcggagt aacttgtatg tg32
            
<210>7
            
<211>31
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 355ITR
            
<400>7
            
gatccggagc tcacaacgtc attttcccac g 31
            
<210>8
            
<211>25
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 353ITR
            
<400>8
            
aggaattcgc ggccgcattt aaatc25
            
<210>9
            
<211>18
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer E4-F1
            
<400>9
            
agaggaacac attccccc18
            
<210>10
            
<211>32
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer E4-R2
            
<400>10
            
ggggagaaag gactgtgtat tctgtcaaat gg32
            
<210>11
            
<211>35
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer E4-F3
            
<400>11
            
tttgacagaa tacacagtcc tttctccccg gctgg 35
            
<210>12
            
<211>33
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer E4-R4
            
<400>12
            
acaaaatacg agaatgacta cgtccggcgt tcc   33
            
<210>13
            
<211>30
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer E4-F5
            
<400>13
            
ggacgtagtc attctcgtat tttgtatagc   30
            
<210>14
            
<211>18
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer E4-R6
            
<400>14
            
tcaccaacac agtggggg18
            
<210>15
            
<211>20
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer NF-1
            
<400>15
            
ccacaacccc cactactccc  20
            
<210>16
            
<211>21
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer NR-2
            
<400>16
            
cgtctcttcc ctctcctctc c21
            
<210>17
            
<211>20
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer NcoI-R
            
<400>17
            
aggatcatcc gctgctgccc  20
            
<210>18
            
<211>19
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer NcoI-F
            
<400>18
            
catcaggata gggcggtgg   19
            
<210>19
            
<211>20
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 35E3for
            
<400>19
            
aatgactaat gcaggtgcgc  20
            
<210>20
            
<211>28
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 35E3rev
            
<400>20
            
cgacgcgttg tagtcgttga gcttctag 28
            
<210>21
            
<211>22
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer AdApt35CMVF
            
<400>21
            
gtaggtgtca gcctaggtgg tc   22
            
<210>22
            
<211>20
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 35pIXR
            
<400>22
            
tcatgtcagc tgcaagacag  20
            
<210>23
            
<211>22
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer SV40for
            
<400>23
            
caatgtatct tatcatgtct ag   22
            
<210>24
            
<211>35
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer pIX5Rmfe
            
<400>24
            
ctctctcaat tgcagataca aaactacata agacc 35
            
<210>25
            
<211>32
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer pIX35Fmfe
            
<400>25
            
ctctctcaat tgtctgtctt gcagctgaca tg32
            
<210>26
            
<211>22
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer AdApt35pIXr
            
<400>26
            
caatctgtcc atctgaaaat cc   22
            
<210>27
            
<211>40
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer pIXcosF-2
            
<400>27
            
ctgctggacg tcgcggccgc gacatgagtg gaaatgcttc40
            
<210>28
            
<211>20
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer Adapt35-3
            
<400>28
            
tgcaaatctg tgaggggaac  20
            
<210>29
            
<211>25
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 35D21
            
<400>29
            
ttagatccat ggatcccgca gactc25
            
<210>30
            
<211>18
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 35B3
            
<400>30
            
cctcagcccc atttccag18
            
<210>31
            
<211>44
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 35F1
            
<400>31
            
cggaattctt aattaatcga catcatcaat aatatacctt atag   44
            
<210>32
            
<211>40
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 35R4
            
<400>32
            
cggaattctt cttaattaag ggaaatgcaa atctgtgagg40
            
<210>33
            
<211>24
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer Ad3555KMfeF
            
<400>33
            
aaccaagctt caattgtctc tgaa 24
            
<210>34
            
<211>24
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer Ad35pIXNcoR
            
<400>34
            
ccacccatgg cagctgcaag acag 24
            
<210>35
            
<211>22
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer Ad35pIXrev
            
<400>35
            
tcagctgcaa gacagaaaaa ac   22
            
<210>36
            
<211>21
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer Epr-F
            
<400>36
            
gtgtttactt aaggtgacgt c21
            
<210>37
            
<211>20
            
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<213>Artificial
            
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<223>primer Epr-R
            
<400>37
            
gaaagccagc tcctatgagc  20
            
<210>38
            
<211>22
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer pIXrev
            
<400>38
            
ggcgggttga acgggtcttc ca   22
            
<210>39
            
<211>26
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer pIXrev-N2
            
<400>39
            
gatgggagac gccctgtcag ataagg   26
            
<210>40
            
<211>23
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer 35E1Blong
            
<400>40
            
aaggtgacgt caatatttgt gtg  23
            
<210>41
            
<211>21
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer Ad35E1bpromrev
            
<400>41
            
atgaaagcca gctcctatga g21
            
<210>42
            
<211>19
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer pIXrev-Ad5
            
<400>42
            
aggggaggaa gccttcagg   19
            
<210>43
            
<211>19
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer Bsu55KF
            
<400>43
            
aggtgggcgt agaggaatg   19
            
<210>44
            
<211>19
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>primer Age-pIXR
            
<400>44
            
caagacggga tcttggcgg   19
            
<210>45
            
<211>102
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 2
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad2 proximal pIX upstream sequence
            
<220>
            
<221>E1B 55K stopcodon
            
<222>(1)..(3)
            
<220>
            
<221>Sp1 site
            
<222>(18)..(24)
            
<220>
            
<221>TATA_signal
            
<222>(45)..(51)
            
<220>
            
<221>pIX startcodon
            
<222>(99)..(102)
            
<400>45
            
tgaggtactg aaatgtgtgg gcgtggctta agggtgggaa agaatatata aggtgggggt  60
            
ctcatgtagt tttgtatctg ttttgcagca gccgccgcca tg102
            
<210>46
            
<211>105
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 5
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad5 proximal pIX upstream sequence
            
<220>
            
<221>E1B 55K stopcodon
            
<222>(1)..(3)
            
<220>
            
<221>Sp1 site
            
<222>(18)..(24)
            
<220>
            
<221>TATA_signal
            
<222>(45)..(51)
            
<220>
            
<221>pIX startcodon
            
<222>(103)..(105)
            
<400>46
            
tgaggtactg aaatgtgtgg gcgtggctta agggtgggaa agaatatata aggtgggggt  60
            
cttatgtagt tttgtatctg ttttgcagca gccgccgccg ccatg 105
            
<210>47
            
<211>84
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 12
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad12 proximal pIX upstream sequence
            
<220>
            
<221>E1B 55K stopcodon
            
<222>(1)..(3)
            
<220>
            
<221>pIX startcodon
            
<222>(81)..(84)
            
<400>47
            
tgaggtaagt gggtggagct aggtgggatt ataaaaggct ggaagtcaac taaaaattgt  60
            
ttttgttctt ttaacagcac gatg 84
            
<210>48
            
<211>93
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 9
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad9 proximal pIX upstream sequence
            
<220>
            
<221>E1B 55K stopcodon
            
<222>(1)..(3)
            
<220>
            
<221>pIX startcodon
            
<222>(91)..(93)
            
<400>48
            
tagaggtagg tcgagtgagt agtgggcgtg gctaaggtga ctataaaggc gggtgtctta  60
            
cgagggtctt tttgcttttc tgcagacatc atg   93
            
<210>49
            
<211>73
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 40
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad40 proximal pIX upstream sequence
            
<220>
            
<221>E1B 55K stopcodon
            
<222>(1)..(3)
            
<220>
            
<221>pIX startcodon
            
<222>(71)..(73)
            
<400>49
            
taagggtaag gggcggagcc tattacaggt ataaaggttg gggtagagta aaaaaaaggg  60
            
aagttacaaa atg 73
            
<210>50
            
<211>90
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 4
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad4 proximal pIX upstream sequence
            
<220>
            
<221>E1B 55K stopcodon
            
<222>(1)..(3)
            
<220>
            
<221>pIX startcodon
            
<222>(88)..(90)
            
<400>50
            
tagagtgagt agtgttctgg ggcgggggag gacctgcatg agggccagaa taactgaaat  60
            
ctgtgctttt ctgtgtgttg cagcagcatg   90
            
<210>51
            
<211>90
            
<212>DNA
            
<213>simian Adenovirus type 25
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>sAd25 proximal pIX upstream sequence
            
<220>
            
<221>E1B 55K stopcodon
            
<222>(1)..(3)
            
<220>
            
<221>pIX startcodon
            
<222>(88)..(90)
            
<400>51
            
tagagtgagt agtgttctgg ggcgggggag gacctgcatg agggccagaa taactgaaat  60
            
ctgtgctttt ctgtgtgttg cagcagcatg   90
            
<210>52
            
<211>89
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 35
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad35 proximal pIX upstream sequence
            
<220>
            
<221>E1B 55K stopcodon
            
<222>(1)..(3)
            
<220>
            
<221>pIX startcodon
            
<222>(87)..(89)
            
<400>52
            
taaggtgagt attgggaaaa ctttggggtg ggattttcag atggacagat tgagtaaaaa  60
            
tttgtttttt ctgtcttgca gctgacatg89
            
<210>53
            
<211>89
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 11
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad11 proximal pIX upstream sequence
            
<220>
            
<221>E1B 55K stopcodon
            
<222>(1)..(3)
            
<220>
            
<221>pIX stopcodon
            
<222>(87)..(89)
            
<400>53
            
taaggtgagt attgggaaaa ctttggggtg ggattttcag atggacagat tgagtaaaaa  60
            
tttgtttttt ctgtcttgca gctgtcatg89
            
<210>54
            
<211>100
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 7
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad7 proximal pIX upstream sequence
            
<220>
            
<221>E1B 55K stopcodon
            
<222>(1)..(3)
            
<220>
            
<221>pIX startcodon
            
<222>(98)..(100)
            
<400>54
            
taaagtaagt agtgggggca aaatgtggat ggggactttc aggttggtaa ggtggacaaa  60
            
ttgggtaaat tttgttaatt tctgtcttgc agctgccatg   100
            
<210>55
            
<211>2430
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 35
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad35 E1B-pIX region
            
<400>55
            
aataaaaata tgttaactgt tcactggttt ttattgcttt ttgggcgggg actcaggtat  60
            
ataagtagaa gcagacctgt gtggttagct cataggagct ggctttcatc catggaggtt 120
            
tgggccattt tggaagacct taggaagact aggcaactgt tagagagcgc ttcggacgga 180
            
gtctccggtt tttggagatt ctggttcgct agtgaattag ctagggtagt ttttaggata 240
            
aaacaggact ataaacaaga atttgaaaag ttgttggtag attgcccagg actttttgaa 300
            
gctcttaatt tgggccatca ggttcacttt aaagaaaaag ttttatcagt tttagacttt 360
            
tcaaccccag gtagaactgc tgctgctgtg gcttttctta cttttatatt agataaatgg 420
            
atcccgcaga ctcatttcag caggggatac gttttggatt tcatagccac agcattgtgg 480
            
agaacatgga aggttcgcaa gatgaggaca atcttaggtt actggccagt gcagcctttg 540
            
ggtgtagcgg gaatcctgag gcatccaccg gtcatgccag cggttctgga ggaggaacag 600
            
caagaggaca acccgagagc cggcctggac cctccagtgg aggaggcgga gtagctgact 660
            
tgtctcctga actgcaacgg gtgcttactg gatctacgtc cactggacgg gataggggcg 720
            
ttaagaggga gagggcatcc agtggtactg atgctagatc tgagttggct ttaagtttaa 780
            
tgagtcgcag acgtcctgaa accatttggt ggcatgaggt tcagaaagag ggaagggatg 840
            
aagtttctgt attgcaggag aaatattcac tggaacaggt gaaaacatgt tggttggagc 900
            
cagaggatga ttgggcggtg gccattaaaa attatgccaa gatagctttg aggcctgata 960
            
aacagtataa gatcagtaga cggattaata tccggaatgc ttgttacata tctggaaatg1020
            
gggctgaggt ggtaatagat actcaagaca agacagttat tagatgctgc atgatggata1080
            
tgtggcctgg agtagtcggt atggaagcag tcacttttgt aaatgttaag tttaggggag1140
            
atggttataa tggaatagtg tttatggcca ataccaaact tatattgcat ggttgtagct1200
            
tttttggttt caacaatacc tgtgtagatg cctggggaca ggttagtgta cgggggtgta1260
            
gtttctatgc gtgttggatt gccacagctg gcagaaccaa gagtcaattg tctctgaaga1320
            
aatgcatatt ccaaagatgt aacctgggca ttctgaatga aggcgaagca agggtccgtc1380
            
actgcgcttc tacagatact ggatgtttta ttttaattaa gggaaatgcc agcgtaaagc1440
            
ataacatgat ttgtggtgct tccgatgaga ggccttatca aatgctcact tgtgctggtg1500
            
ggcattgtaa tatgctggct actgtgcata ttgtttccca tcaacgcaaa aaatggcctg1560
            
tttttgatca caatgtgttg accaagtgca ccatgcatgc aggtgggcgt agaggaatgt1620
            
ttatgcctta ccagtgtaac atgaatcatg tgaaagtgtt gttggaacca gatgcctttt1680
            
ccagaatgag cctaacagga atctttgaca tgaacacgca aatctggaag atcctgaggt1740
            
atgatgatac gagatcgagg gtgcgcgcat gcgaatgcgg aggcaagcat gccaggttcc1800
            
agccggtgtg tgtagatgtg accgaagatc tcagaccgga tcatttggtt attgcccgca1860
            
ctggagcaga gttcggatcc agtggagaag aaactgacta aggtgagtat tgggaaaact1920
            
ttggggtggg attttcagat ggacagattg agtaaaaatt tgttttttct gtcttgcagc1980
            
tgacatgagt ggaaatgctt cttttaaggg gggagtcttc agcccttatc tgacagggcg2040
            
tctcccatcc tgggcaggag ttcgtcagaa tgttatggga tctactgtgg atggaagacc2100
            
cgttcaaccc gccaattctt caacgctgac ctatgctact ttaagttctt cacctttgga2160
            
cgcagctgca gccgctgccg ccgcctctgt cgccgctaac actgtgcttg gaatgggtta2220
            
ctatggaagc atcgtggcta attccacttc ctctaataac ccttctacac tgactcagga2280
            
caagttactt gtccttttgg cccagctgga ggctttgacc caacgtctgg gtgaactttc2340
            
tcagcaggtg gccgagttgc gagtacaaac tgagtctgct gtcggcacgg caaagtctaa2400
            
ataaaaaaaa ttccagaatc aatgaataaa 2430
            
<210>56
            
<211>2429
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 11
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad11 E1B-pIX region
            
<400>56
            
aataaaaata tgttaactgt tcactggttt ttattgcttt ttgggcgggg actcaggtat  60
            
ataagtagaa gcagacctgt gtggttagct cataggagct ggctttcatc catggaggtt 120
            
tgggccattt tggaagacct taggaagact aggcaactgt tagagaacgc ttcggacgga 180
            
gtctccggtt tttggagatt ctggttcgct agtgaattag ctagggtagt ttttaggata 240
            
aaacaggact ataaacaaga atttgaaaag ttgttggtag attgcccagg actttttgaa 300
            
gctcttaatt tgggccatca ggttcacttt aaagaaaaag ttttatcagt tttagacttt 360
            
tcaaccccag gtagaactgc tgctgctgtg gcttttctta cttttatatt agataaatgg 420
            
atcccgcaga ctcatttcag caggggatac gttttggatt tcatagccac agcattgtgg 480
            
agaacatgga aggttcgcaa gatgaggaca atcttaggtt actggccagt gcagcctttg 540
            
ggtgtagcgg gaatcctgag gcatccaccg gtcatgccag cggttctgga ggaggaacag 600
            
caagaggaca acccgagagc cggcctggac cctccagtgg aggaggcgga gtagctgact 660
            
tgtctcctga actgcaacgg gtgcttactg gatctacgtc cactggacgg gataggggcg 720
            
ttaagaggga gagggcatct agtggtactg atgctagatc tgagttggct ttaagtttaa 780
            
tgagtcgcag acgtcctgaa accatttggt ggcatgaggt tcagaaagag ggaagggatg 840
            
aagtttctgt attgcaggag aaatattcac tggaacaggt gaaaacatgt tggttggagc 900
            
ctgaggatga ttgggaggtg gccattaaaa attatgccaa gatagctttg aggcctgata 960
            
aacagtataa gattactaga cggattaata tccggaatgc ttgttacata tctggaaatg1020
            
gggctgaggt ggtaatagat actcaagaca aggcagttat tagatgctgc atgatggata1080
            
tgtggcctgg ggtagtcggt atggaagcag taacttttgt aaatgttaag tttaggggag1140
            
atggttataa tggaatagtg tttatggcca ataccaaact tatattgcat ggttgtagct1200
            
tttttggttt caacaatacc tgtgtagatg cctggggaca ggttagtgta cggggatgta1260
            
gtttctatgc gtgttggatt gccacagctg gcagaaccaa gagtcaattg tctctgaaga1320
            
aatgcatatt tcaaagatgt aacctgggca ttctgaatga aggcgaagca agggtccgcc1380
            
actgcgcttc tacagatact ggatgtttta ttttgattaa gggaaatgcc agcgtaaagc1440
            
ataacatgat ttgcggtgct tccgatgaga ggccttatca aatgctcact tgtgctggtg1500
            
ggcattgtaa tatgctggct actgtgcata ttgtttccca tcaacgcaaa aaatggcctg1560
            
tttttgatca caatgtgatg acgaagtgta ccatgcatgc aggtgggcgt agaggaatgt1620
            
ttatgcctta ccagtgtaac atgaatcatg tgaaagtgtt gttggaacca gatgcctttt1680
            
ccagaatgag cctaacagga atttttgaca tgaacatgca aatctggaag atcctgaggt1740
            
atgatgatac gagatcgagg gtacgcgcat gcgaatgcgg aggcaagcat gccaggttcc1800
            
agccggtgtg tgtagatgtg actgaagatc tcagaccgga tcatttggtt attgcccgca1860
            
ctggagcaga gttcggatcc agtggagaag aaactgacta aggtgagtat tgggaaaact1920
            
ttggggtggg attttcagat ggacagattg agtaaaaatt tgttttttct gtcttgcagc1980
            
tgtcatgagt ggaaacgctt cttttaaggg gggagtcttc agcccttatc tgacagggcg2040
            
tctcccatcc tgggcaggag ttcgtcagaa tgttatggga tctactgtgg atggaagacc2100
            
cgtccaaccc gccaattctt caacgctgac ctatgctact ttaagttctt cacctttgga2160
            
cgcagctgca gctgccgccg ccgcttctgt tgccgctaac actgtgcttg gaatgggtta2220
            
ctatggaagc atcatggcta attccacttc ctctaataac ccttctaccc tgactcagga2280
            
caagttactt gtccttttgg cccagctgga ggctttgacc caacgtctgg gtgaactttc2340
            
tcagcaggtg gtcgagttgc gagtacaaac tgagtctgct gtcggcacgg caaagtctaa2400
            
ataaaaaaat cccagaatca atgaataaa  2429
            
<210>57
            
<211>2426
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 7
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad7 E1B-pIX region
            
<400>57
            
aataaaatta tgtcagctgc tgagtgtttt attacttctt gggtggggtc ttggatatat  60
            
aagtaggagc agatctgtgt ggttagctca cagcaacttg ctgccatcca tggaggtttg 120
            
ggctatcttg gaagacctca gacagactag gctactacta gaaaacgcct cggacggagt 180
            
ctctggcctt tggagattct ggttcggtgg tgatctagct aggctagtgt ttaggataaa 240
            
acaggactac agggaagaat ttgaaaagtt attggacgac attccaggac tttttgaagc 300
            
tcttaacttg ggccatcagg ctcattttaa ggagaaggtt ttatcagttt tagatttttc 360
            
tactcctggt agaactgctg ctgctgtagc ttttcttact tttatattgg ataaatggat 420
            
ccgccaaact cacttcagca agggatacgt tttggatttc atagcagcag ctttgtggag 480
            
aacatggaag gctcgcagga tgaggacaat cttagattac tggccagtgc agcctctggg 540
            
agtagcaggg atactgagac acccaccgac catgccagcg gttctgcagg aggagcagca 600
            
ggaggacaat ccgagagccg gcctggaccc tccggtggag gagtagctga cctgtttcct 660
            
gaactgcgac gggtgcttac taggtctacg accagtggac agaacagggg aattaagagg 720
            
gagaggaatc ctagtgggaa taattcaaga accgagttgg ctttaagttt aatgagccgc 780
            
aggcgtcctg aaactgtttg gtggcatgag gttcagagcg aaggcaggga tgaagtttca 840
            
atattgcagg agaaatattc actagaacaa cttaagacct gttggttgga acctgaggat 900
            
gattgggagg tggccattag gaattatgct aagatatctc tgaggcctga taaacaatat 960
            
agaattacta agaagattaa tattagaaat gcatgctaca tatcagggaa tggggcagag1020
            
gttataatag atacacaaga taaagcagct tttagatgtt gtatgatggg tatgtggcca1080
            
ggggttgtcg gcatggaagc aataacactt atgaatatta ggtttagagg ggatgggtat1140
            
aatggcattg tatttatggc taacactaag ctgattctac atggttgtag cttttttggg1200
            
tttaataata cgtgtgtaga agcttggggg caagttagtg tgaggggttg tagtttttat1260
            
gcatgctgga ttgcaacatc aggtagggtg aagagtcagt tgtctgtgaa gaaatgcatg1320
            
tttgagagat gtaatcttgg catactgaat gaaggtgaag caagggtccg ccactgcgca1380
            
gctacagaaa ctgcctgctt cattctaata aagggaaatg ccagtgtgaa gcataatatg1440
            
atctgtggac attcggatga gaggccttat cagatgctaa cctgcgctgg tggacattgc1500
            
aatattcttg ctaccgtgca tatcgtttca catgcacgca agaaatggcc tgtatttgaa1560
            
cataatgtga ttaccaagtg caccatgcat ataggtggtc gcaggggaat gtttatgcct1620
            
taccagtgta acatgaatca tgtgaaggta atgttggaac cagatgcctt ttccagagtg1680
            
agcgtaacag gaatctttga tatgaatatt caactatgga agatcctgag atatgatgac1740
            
actaaaccaa gggtgcgcgc atgcgaatgc ggaggcaagc atgctagatt ccagccggtg1800
            
tgcgtggatg tgactgaaga cctgaggccc gatcatttgg tgcttgcctg cactggagcg1860
            
gagttcggtt ctagtggtga agaaactgac taaagtaagt agtgggggca aaatgtggat1920
            
ggggactttc aggttggtaa ggtggacaaa ttgggtaaat tttgttaatt tctgtcttgc1980
            
agctgccatg agtggaagcg cttcttttga ggggggagta tttagccctt atctgacggg2040
            
caggctccca ccatgggcag gagttcgtca gaatgtcatg ggatccactg tggatgggag2100
            
acccgtccag cccgccaatt cctcaacgct gacctatgcc actttgagtt cgtcaccatt2160
            
ggatgcagct gcagccgccg ccgctactgc tgccgccaac accatccttg gaatgggcta2220
            
ttacggaagc attgttgcca attccagttc ctctaataat ccttcaaccc tggctgagga2280
            
caagctactt gttctcttgg ctcagctcga ggccttaacc caacgcttag gcgaactgtc2340
            
taagcaggtg gcccagttgc gtgagcaaac tgagtctgct gttgccacag caaagtctaa2400
            
ataaagatct caaatcaata aataaa 2426
            
<210>58
            
<211>240
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 11
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad11 pIX cDNA sequence
            
<400>58
            
cgactggagc acgaggacac tgacatggac tgaaggagta gaaatcattt ggttattgcc  60
            
cgcactggag cagagttcgg atccagtgga gaagaaactg actaagctgt catgagtgga 120
            
aacgcttctt ttaagggggg agtcttcagc ccttatctga cagggcgtct cccatcctgg 180
            
gcaggagttc gtcagaatgt tatgggatct actgtggatg gaacacccgt tcaacccgcc 240
            
<210>59
            
<211>227
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 35
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>Ad35 pIX cDNA sequence
            
<400>59
            
ggacactgac atggactgaa ggagtagaaa atcatttggt tattgcccgc actggagcag  60
            
agttcggatc cagtggagaa gaaactgact aagctgacat gagtggaaat gcttctttta 120
            
aggggggagt cttcagccct tatctgacag ggcgtctccc atcctgggca ggagttcgtc 180
            
agaatgttat gggatctact gtggatggaa gacccgttca acccgcc   227
            
<210>60
            
<211>289
            
<212>DNA
            
<213>Adenovirus type 35
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>wild-type Ad35 sequence nt 3339-3628
            
<220>
            
<221>Intron
            
<222>(62)..(138)
            
<220>
            
<221>startcodon pIX
            
<222>(146)..(148)
            
<400>60
            
atcatttggt tattgcccgc actggagcag agttcggatc cagtggagaa gaaactgact  60
            
aaggtgagta ttgggaaaac tttggggtgg gattttcaga tggacagatt gagtaaaaat 120
            
ttgttttttc tgtcttgcag ctgacatgag tggaaatgct tcttttaagg ggggagtctt 180
            
cagcccttat ctgacagggc gtctcccatc ctgggcagga gttcgtcaga atgttatggg 240
            
atctactgtg gatggaagac ccgttcaacc cgccaattct tcaacgctg 289
            
<210>61
            
<211>294
            
<212>PRT
            
<213>Adenovirus type 5
            
<220>
            
<221>MISC_FEATURE
            
<223>amino acid sequence of the E4-orf6 protein of Ad5
            
<400>61
            
Met Thr Thr Ser Gly Val Pro Phe Gly Met Thr Leu Arg Pro Thr Arg
            
1   5   10  15
            
Ser Arg Leu Ser Arg Arg Thr Pro Tyr Ser Arg Asp Arg Leu Pro Pro
            
20  25  30
            
Phe Glu Thr Glu Thr Arg Ala Thr Ile Leu Glu Asp His Pro Leu Leu
            
35  40  45
            
Pro Glu Cys Asn Thr Leu Thr Met His Asn Val Ser Tyr Val Arg Gly
            
50  55  60
            
Leu Pro Cys Ser Val Gly Phe Thr Leu Ile Gln Glu Trp Val Val Pro
            
65  70  75  80
            
Trp Asp Met Val Leu Thr Arg Glu Glu Leu Val Ile Leu Arg Lys Cys
            
85  90  95
            
Met His Val Cys Leu Cys Cys Ala Asn Ile Asp Ile Met Thr Ser Met
            
100 105 110
            
Met Ile His Gly Tyr Glu Ser Trp Ala Leu His Cys His Cys Ser Ser
            
115 120 125
            
Pro Gly Ser Leu Gln Cys Ile Ala Gly Gly Gln Val Leu Ala Ser Trp
            
130 135 140
            
Phe Arg Met Val Val Asp Gly Ala Met Phe Asn Gln Arg Phe Ile Trp
            
145 150 155 160
            
Tyr Arg Glu Val Val Asn Tyr Asn Met Pro Lys Glu Val Met Phe Met
            
165 170 175
            
Ser Ser Val Phe Met Arg Gly Arg His Leu Ile Tyr Leu Arg Leu Trp
            
180 185 190
            
Tyr Asp Gly His Val Gly Ser Val Val Pro Ala Met Ser Phe Gly Tyr
            
195 200 205
            
Ser Ala Leu His Cys Gly Ile Leu Asn Asn Ile Val Val Leu Cys Cys
            
210 215 220
            
Ser Tyr Cys Ala Asp Leu Ser Glu Ile Arg Val Arg Cys Cys Ala Arg
            
225 230 235 240
            
Arg Thr Arg Arg Leu Met Leu Arg Ala Val Arg Ile Ile Ala Glu Glu
            
245 250 255
            
Thr Thr Ala Met Leu Tyr Ser Cys Arg Thr Glu Arg Arg Arg Gln Gln
            
260 265 270
            
Phe Ile Arg Ala Leu Leu Gln His His Arg Pro Ile Leu Met His Asp
            
275 280 285
            
Tyr Asp Ser Thr Pro Met
            
290
            
<210>62
            
<211>299
            
<212>PRT
            
<213>Adenovirus type 35
            
<220>
            
<221>MISC_FEATURE
            
<223>amino acid sequence of the E4-orf6 protein of Ad35
            
<400>62
            
Met Ser Gly Ser Asn Ser Ile Met Thr Arg Leu Arg Ala Arg Ser Thr
            
1   5   10  15
            
Ser Cys Ala Arg His His Pro Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Pro Arg Cys
            
20  25  30
            
Glu Glu Asn Glu Thr Arg Ala Ser Met Thr Glu Asp His Pro Leu Leu
            
35  40  45
            
Pro Asp Cys Asp Thr Met Thr Met His Ser Val Ser Cys Val Arg Gly
            
50  55  60
            
Leu Pro Cys Ser Ala Ser Phe Thr Val Leu Gln Glu Leu Pro Ile Pro
            
65  70  75  80
            
Trp Asp Met Phe Leu Asn Pro Glu Glu Leu Lys Ile Met Arg Arg Cys
            
85  90  95
            
Met His Leu Cys Leu Cys Cys Ala Thr Ile Asp Ile Phe His Ser Gln
            
100 105 110
            
Val Ile His Gly Arg Glu Asn Trp Val Leu His Cys His Cys Asn Gln
            
115 120 125
            
Gln Gly Ser Leu Gln Cys Met Ala Gly Gly Ala Val Leu Ala Val Trp
            
130 135 140
            
Phe Arg Lys Val Ile Leu Gly Cys Met Ile Asn Gln Arg Cys Pro Trp
            
145 150 155 160
            
Tyr Arg Gln Ile Val Asn Met His Met Pro Lys Glu Ile Met Tyr Val
            
165 170 175
            
Gly Ser Val Phe Leu Arg Glu Arg His Leu Ile Tyr Ile Lys Leu Trp
            
180 185 190
            
Tyr Asp Gly His Ala Gly Ala Ile Ile Ser Asp Met Ser Phe Gly Trp
            
195 200 205
            
Ser Ala Phe Asn Tyr Gly Leu Leu Asn Asn Ile Val Ile Met Cys Cys
            
210 215 220
            
Thr Tyr Cys Lys Asp Leu Ser Glu Ile Arg Met Arg Cys Cys Ala His
            
225 230 235 240
            
Arg Thr Arg Lys Leu Met Leu Arg Ala Ile Lys Ile Met Leu Gln Glu
            
245 250 255
            
Thr Val Asp Pro Asp Pro Ile Asn Ser Ser Arg Thr Glu Arg Arg Arg
            
260 265 270
            
Gln Arg Leu Leu Val Gly Leu Met Arg His Asn Arg Pro Ile pro Phe
            
275 280 285
            
Ser Asp Tyr Asp Ser His Arg Ser Ser Ser Arg
            
290 295
            
<210>63
            
<211>150
            
<212>PRT
            
<213>Adenovirus type 5
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>amino acid sequence of the E4-orf6+7 protein of Ad5
            
<400>63
            
Met Thr Thr Ser Gly Val Pro Phe Gly Met Thr Leu Arg Pro Thr Arg
            
1   5   10  15
            
Ser Arg Leu Ser Arg Arg Thr Pro Tyr Ser Arg Asp Arg Leu Pro Pro
            
20  25  30
            
Phe Glu Thr Glu Thr Arg Ala Thr Ile Leu Glu Asp His Pro Leu Leu
            
35  40  45
            
Pro Glu Cys Asn Thr Leu Thr Met His Asn Ala Trp Thr Ser Pro Ser
            
50  55  60
            
Pro Pro Val Lys Gln Pro Gln Val Gly Gln Gln Pro Val Ala Gln Gln
            
65  70  75  80
            
Leu Asp Ser Asp Met Asn Leu Ser Glu Leu Pro Gly Glu Phe Ile Asn
            
85  90  95
            
Ile Thr Asp Glu Arg Leu Ala Arg Gln Glu Thr Val Trp Asn Ile Thr
            
100 105 110
            
Pro Lys Asn Met Ser Val Thr His Asp Met Met Leu Phe Lys Ala Ser
            
115 120 125
            
Arg Gly Glu Arg Thr Val Tyr Ser Val Cys Trp Glu Gly Gly Gly Arg
            
130 135 140
            
Leu Asn Thr Arg Val Leu
            
145 150
            
<210>64
            
<211>141
            
<212>PRT
            
<213>Adenovirus type 35
            
<220>
            
<221>misc_feature
            
<223>amino acid sequence of the E4-orf6+7 protein of Ad35
            
<400>64
            
Met Ser Gly Ser Asn Ser Ile Met Thr Arg Leu Arg Ala Arg Ser Thr
            
1   5   10  15
            
Ser Cys Ala Arg His His Pro Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Pro Arg Cys
            
20  25  30
            
Glu Glu Asn Glu Thr Arg Ala Ser Met Thr Glu Asp His Pro Leu Leu
            
35  40  45
            
Pro Asp Cys Asp Thr Met Thr Met His Ser Met Thr Val Ile Gln Thr
            
50  55  60
            
Pro Glu Ser His Pro Gln Gln Leu Asp Cys Glu Ser Ala Leu Lys Asp
            
65  70  75  80
            
Tyr Arg Asp Gly Phe Leu Ser Ile Thr Asp Pro Arg Leu Ala Arg Ser
            
85  90  95
            
Glu Thr Val Trp Asn Val Glu Ser Lys Thr Met Ser Ile Ser Asn Gly
            
100 105 110
            
Ile Gln Met Phe Lys Ala Val Arg Gly Glu Arg Leu Val Tyr Ser Val
            
115 120 125
            
Lys Trp Glu Gly Gly Gly Lys Ile Thr Thr Arg Ile Leu
            
130 135 140
            
<210>65
            
<211>150
            
<212>PRT
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>amino acid sequence of the E4-orf6+7 fusion protein from Ad5 and
            
 Ad35
            
<400>65
            
Met Thr Thr Ser Gly Val Pro Phe Gly Met Thr Leu Arg Pro Thr Arg
            
1   5   10  15
            
Ser Arg Leu Ser Arg Arg Thr Pro Tyr Ser Arg Asp Arg Leu Pro Pro
            
20  25  30
            
Phe Glu Thr Glu Thr Arg Ala Thr Ile Leu Glu Asp His Pro Leu Leu
            
35  40  45
            
Pro Glu Cys Asn Thr Leu Thr Met His Asn Ala Trp Thr Ser Pro Ser
            
50  55  60
            
Pro Pro Val Lys Gln Pro Gln Val Gly Gln Gln Pro Val Ala Gln Gln
            
65  70  75  80
            
Leu Asp Ser Asp Met Asn Leu Ser Glu Leu Pro Gly Glu Phe Ile Asn
            
85  90  95
            
Ile Thr Asp Glu Arg Leu Ala Arg Gln Glu Thr Val Trp Asn Ile Thr
            
100 105 110
            
Pro Lys Asn Met Ser Val Thr His Asp Met Met Leu Phe Lys Ala Ser
            
115 120 125
            
Arg Gly Glu Arg Thr Val Tyr Ser Val Lys Trp Glu Gly Gly Gly Lys
            
130 135 140
            
Ile Thr Thr Arg Ile Leu
            
145 150
            
權(quán)利要求
            
1.一種重組腺病毒，其包含在一個表達序列控制下的一個功能性pIX編碼序列，所述表達序列包含部分E1B 55K序列，相對于當所述pIX編碼序列位于其內(nèi)源近端pIX上游序列之后且沒有所述部分E1B 55K序列時的表達而言，所述部分E1B 55K序列能在給定的包裝細胞中增加pIX編碼序列的表達，條件是所述部分E1B 55K序列不編碼功能性E1B 55K基因產(chǎn)物。
            
2.權(quán)利要求1中的重組腺病毒，其中所述表達序列含有大約0.7kb或更少的腺病毒序列，該腺病毒序列位于pIX可讀框的直接上游。
            
3.一種包含功能性pIX編碼序列并在E1區(qū)中具有至少一個缺失的重組腺病毒，其中所述pIX編碼序列在一異源啟動子的控制下，且其中所述重組腺病毒衍生自或基于除腺病毒血清型5之外的腺病毒。
            
4.權(quán)利要求3中的重組腺病毒，其中所述異源啟動子包含一種選自由非內(nèi)源近端pIX啟動子、病毒啟動子、細胞啟動子、合成啟動子和雜合啟動子組成的一組中的核酸序列。
            
5.權(quán)利要求4中的重組腺病毒，其中所述異源啟動子選自由如下序列組成的一組所述序列至少部分衍生自或基于Ad5近端pIX啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子和腺病毒E1B啟動子。
            
6.權(quán)利要求1-5中任一項的重組腺病毒，其中所述腺病毒衍生自或基于亞群B中的一種腺病毒。
            
7.權(quán)利要求1-6中任一項的重組腺病毒，其中所述腺病毒衍生自或基于腺病毒血清型35或腺病毒血清型11。
            
8.衍生自或基于腺病毒血清型35或腺病毒血清型11的缺乏功能性E1B基因表達的一種重組腺病毒，其中所述腺病毒
            
a)含有至少4.6kb的外源DNA；和/或
            
b)具有至少33.8kb的包裝的基因組。
            
10.權(quán)利要求6-8中任一項的重組腺病毒，特征在于其進一步包含編碼衍生自或基于亞群C腺病毒的功能性E4-orf6蛋白的一個序列。
            
11.一種分離的核酸，其在導(dǎo)入合適的包裝細胞時組成權(quán)利要求1-10中任一項的重組腺病毒的基因組。
            
12.一種增加在E1區(qū)有至少一個缺失的重組腺病毒的穩(wěn)定性和/或包裝能力的方法，所述方法包括在如下情況下在包裝細胞中表達將所述重組腺病毒生產(chǎn)和裝配為病毒顆粒所需的元件的步驟，所述情況是指相對于當pIX編碼序列位于其內(nèi)源近端上游序列之后且沒有E1B 55K序列時獲得的pIX基因產(chǎn)物的水平而言，所述包裝細胞中的pIX基因產(chǎn)物水平是升高的。
            
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述pIX基因產(chǎn)物的水平升高是通過在所述腺病毒中保留或再導(dǎo)入部分E1B 55K序列而實現(xiàn)的。
            
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述pIX基因產(chǎn)物的水平升高是通過在一異源啟動子控制下表達pIX編碼序列而實現(xiàn)的。
            
15.權(quán)利要求12-14中任一項的方法，其中所述重組腺病毒衍生自或基于亞群B中一個腺病毒。
            
16.權(quán)利要求12-15中任一項的方法，其中所述重組腺病毒衍生自或基于腺病毒血清型35或腺病毒血清型11。
            
17.權(quán)利要求14-16中任一項的方法，其中所述異源啟動子選自非內(nèi)源近端pIX啟動子、病毒啟動子、細胞啟動子、合成啟動子和雜合啟動子組成的組中。
            
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述異源啟動子選自Ad5近端pIX啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子及腺病毒E1B啟動子組成的組中。
            
19.一種疫苗，其包含權(quán)利要求1-10中任一項的重組腺病毒，任選地包含一種合適的載體或佐劑。
            
20.一種重組腺病毒包裝細胞，其包含權(quán)利要求1-10中任一項的重組腺病毒。
            
全文摘要
            
本發(fā)明提供了通過在腺病毒包裝細胞中pIX的過表達而增加重組腺病毒穩(wěn)定性和/或包裝能力的方法和手段，這通過在重組腺病毒載體中保留至少一部分E1B 55K區(qū)或者通過用異源啟動子調(diào)節(jié)pIX而進行。本發(fā)明進一步涉及在互補細胞系上生產(chǎn)這種腺病毒的方法和手段，其中早期區(qū)域4可讀框6(E4－orf6)編碼核酸存在于所述腺病毒中，而且其中E4－orf6基因產(chǎn)物與互補細胞中E1基因產(chǎn)物的一或多個產(chǎn)物相容，由此腺病毒載體可以由互補細胞有效產(chǎn)生。
            
文檔編號A61K35/76GK1650021SQ03809208
            
公開日2005年8月3日 申請日期2003年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月25日
            
發(fā)明者曼納德·福格爾斯, 曼佐·揚斯·埃姆柯·海文加, 戴維·阿德里亞努斯·特奧多魯斯·祖伊德吉斯特 申請人:克魯塞爾荷蘭公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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