專利名稱：治療阿爾茨海默氏病的免疫學方法及組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及治療阿爾茨海默氏病的免疫學方法及組合物。本發明還涉及鑒別化合物的方法，所述化合物抑制淀粉樣蛋白斑的形成和/或清除與阿爾茨海默氏病及其他神經退行性疾病相關的、已經存在的淀粉樣蛋白斑。
背景技術：
作為一種腦部神經退行性疾病的阿爾茨海默氏病(“AD”)是導致老年人癡呆的主要原因之一。AD的癥狀可包括學習及記憶能力逐漸喪失、個性改變、神經肌肉變化、癲癇發作和偶有精神病行為。
阿爾茨海默氏病有兩大獨特的神經病理性特征淀粉樣蛋白斑在腦內對于記憶及其他認知性功能關鍵的區域中沉積，以及在神經細胞內出現神經原纖維纏結。據信淀粉樣蛋白斑在腦內所述關鍵區域的沉積會干擾腦的功能。類似地，認為在AD患者神經細胞內積聚的神經原纖維纏結會干擾神經元與神經元之間的通信。
阿爾茨海默氏病的另一特征是存在疏水性淀粉樣β肽(Aβ42)，該淀粉樣β肽為淀粉樣蛋白斑的主要成分。所述淀粉樣β肽(Aβ42)是由稱為淀粉樣蛋白前體(APP)或阿爾茨海默氏病淀粉樣A4蛋白的正常膜組成蛋白通過水解過程產生的片段。
淀粉樣β肽(Aβ)包含一組由APP加工而成的、長39～43個氨基酸的肽。參見Pallitto等人，《生物化學(Biochemistry)》，38卷，3570-3578頁(1999)。盡管整個Aβ肽可能具有兩性特征，但是Aβ肽通常包括APP跨膜區的11～15個殘基，因而其包含疏水區。參見Kang等人，《自然(Nature)》325卷，733-736頁(1987)。已發現Aβ肽對培養的細胞具有毒性。參見Pike等人，《歐洲藥理學雜志(Eur.J.Pharmacol.)》，207卷，367-368頁(1991)；Iversen等人，《生物化學雜志(Biochem.J.)》，311卷，1-16頁(1995)。據認為，阿爾茨海默氏病中Aβ肽的毒性與可溶性Aβ肽聚集成不溶性纖維、隨后該纖維整合入淀粉樣蛋白斑的過程相關。參見Pike等人，Eur.J.Pharmacol.，207卷，367-368頁(1991)；Pike等人，《大腦研究(Brain Research)》，563卷，311-314頁(1991)；及Pike等人，《神經科學(J.Neurosci.)》，13卷，1676-1687頁(1993)。類似地，Aβ肽也能在體外形成纖維，并且可利用所述過程來測定對Aβ肽聚集及纖維形成的抑制作用。
以前曾有幾個小組采用Aβ42抗原制備物免疫的轉基因小鼠模型用于研究阿爾茨海默氏病，所述轉基因小鼠表現出腦內淀粉樣蛋白沉積和認知缺陷。這些研究結果證明，用Aβ42免疫可以使小鼠阿爾茨海默氏病樣神經病變及空間記憶障礙的狀況得到改善。參見Schenk等人，Nature 400卷，173-177頁(1999)；Bard等人，《自然醫學分冊(Nature Medicine)》，6卷，916-919頁(2000)；Janus等人，Nature，408卷，979-982頁(2000)；及Morgan等人，Nature，408卷，982-982頁(2000)。Bard等人推測Aβ42疫苗免疫可能使小膠質細胞活化，隨后使小膠質細胞參與Aβ42的聚集。參見Bard等人，Nature Medicine，6卷，916-919頁(2000)。不幸的是，淀粉樣蛋白斑沉積減少和認知功能改善的全部免疫學機制尚未闡明。
在以前的研究中，被動施用3D6及10D5抗體可有效降低轉基因小鼠中Aβ及淀粉樣蛋白斑的負荷，所述兩種抗體的表位分別為Aβ的第1～5個殘基和第3～6個殘基。參見Bard等人，Nature Medicine，6卷，916-919頁(2000)。使用突變的、疾病相關形式的人淀粉樣蛋白前體(APP)蛋白對小鼠進行轉基因，所述APP受血小板衍生(PD)生長因子的啟動子控制。所述(PDAPP)小鼠過表達人淀粉樣蛋白前體蛋白，并表現出許多阿爾茨海默氏病的病理癥狀。參見Bard等人，Nature Medicine，6卷，916-919頁(2000)。
在另一項研究中，在外周施用針對Aβ第13～28個殘基的抗體m266后，發現可通過清除PDAPP小鼠血漿中的Aβ來降低腦內的Aβ負荷。參見Demattos等人，《美國國家科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，98卷，8850-8855頁(2001)。m266抗體針對Aβ的次要免疫原性位點，該位點具有對Aβ寡聚體、初原纖維及蛋白斑的不同的結合特異性，或者進入中樞神經系統(CNS)的差異性。
由于Aβ42抗原和APP均為自身蛋白，因而在正常情況下，在表達所述蛋白的個體內不具有免疫原性。因此，試圖生產基于這些抗原的疫苗，就必定需要誘導自身免疫作用。此外，任何試圖誘導自身免疫的免疫方案都必須仔細檢驗由所述自身抗原所誘導的免疫反應。在這種情況下，整合入Aβ42或作為Aβ42成分的任何自身抗原都不會誘導針對正常APP蛋白的自身免疫作用，也不會破壞其正常的細胞功能是非常重要的。
對于研發治療AD的有效免疫治療方法而言，希望確定Aβ42型抗原免疫后免疫作用介導的淀粉樣蛋白斑負荷降低的免疫學機制。
可以利用淀粉樣蛋白斑減少的機制來設計僅引入具有有益生物學活性表位的免疫原性組合物及抗原，所述設計思路是具有優勢的。另一優勢是此類免疫原性組合物可以被設計成不包括那些誘導有害免疫反應的表位。因此，需要有僅針對Aβ抗原異常形式的、能夠誘導非常特異和有限的免疫反應的明確抗原。
也需要有包含明確抗原的免疫原性組合物，所述抗原可在免疫治療中誘導僅針對Aβ抗原致病形式的、非常特異和有限的免疫反應。此外，將抗體與明確的Aβ表位分離開來是有利的，其中所述表位在被動免疫治療中應用時具有有益的生物學性質。更為有利的是，研發在治療開始后盡快測定阿爾茨海默氏病患者是否從Aβ抗原的免疫原性組合物治療中受益的診斷檢測方法。還需要鑒定淀粉樣蛋白沉積及纖維形成的抑制劑。
發明內容
本發明通過提供含有淀粉樣肽Aβ42(SEQ ID NO2)上的第4～10個殘基(SEQ ID NO1)的免疫原性組合物完成了上述需求，所述第4-10個殘基稱為Aβ(4-10)。本發明的抗原及免疫原性組合物可用于治療阿爾茨海默氏病、設計淀粉樣蛋白沉積的小分子抑制劑，及作為診斷試劑使用。本發明還提供了與Aβ(4-10)抗原決定簇結合的抗體。本發明的免疫原性組合物和抗體也可在改善阿爾茨海默氏病癥狀的方法中使用，其中通過減少阿爾茨海默氏病患者淀粉樣蛋白負荷實現所述癥狀的改善。
在一個實施方案中，本發明提供了下式所示的肽(A)n--(Th)m--(B)o--Aβ(4-10)--(C)p其中A、B及C均為氨基酸殘基或氨基酸殘基序列；其中n、o及p為0至約20的相互獨立整數；Th為包含輔助性T細胞表位或者其免疫增強類似物或片段的氨基酸殘基序列；當o等于0時，Th通過肽鍵直接與B細胞表位相連而不含間隔殘基；其中m為1至約5的整數；其中Aβ(4-10)為(SEQ ID NO1)或其包含保守性氨基酸替換的類似物。
在一個優選的實施方案中，本發明提供了用于誘導與Aβ肽(SEQ IDNO2)特異性結合的抗體的免疫原性組合物，該組合物包含抗原及佐劑，該抗原包含可提供有效量T細胞輔助作用的T細胞表位和由所述Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)構成的B細胞表位。
在一個特定的實施方案中，本發明提供了用于誘導與Aβ肽特異性結合的抗體的免疫原性組合物，該組合物包含一種抗原及佐劑，該抗原包含可提供有效量T細胞輔助作用的T細胞表位和由所述Aβ(4-10)(SEQ IDNO1)構成的B細胞表位，其中T細胞表位選自(a)一個或一個以上的T細胞表位，其位于同一蛋白質骨架的B細胞表位的N(氨基)端，(b)一個或一個以上的T細胞表位，其位于同一蛋白質骨架的B細胞表位的C(羧基)端，或(c)一個或一個以上的T細胞表位，其位于不同蛋白質骨架上，該蛋白骨架通過共價鍵與含有所述B細胞表位的蛋白質骨架相連。
在一個特別的實施方案中，本發明提供了具有B細胞表位和T細胞表位的免疫原性組合物，其中該T細胞表位選自以下氨基酸序列SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ IDNO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20或SEQ ID NO21。
在另一個特別的實施方案中，本發明提供了包含抗原及佐劑的免疫原性組合物，其中所述佐劑含有選自一種或一種以上的以下物質氫氧化鋁、磷酸鋁、皂甙、奎樂A(Quill A)、奎樂A/免疫刺激復合物(ISCOMs)、二甲基雙十八烷基溴化銨/艾衛定(arvidine)、聚陰離子、弗氏完全佐劑、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-異谷酰胺、N-乙酰胞壁酰基-L-蘇氨酰基-D-異谷酰胺、弗氏不完全佐劑或脂質體。
在另一個優選的實施方案中，本發明提供了一種治療患有阿爾茨海默氏病的個體的方法，該方法包括將有效量的免疫原性組合物施用于所述個體，以誘導產生與Aβ肽(SEQ ID NO2)特異性結合的抗體；其中所述組合物包含(a)抗原和(b)佐劑，所述抗原包含可提供有效量T細胞輔助作用的T細胞表位和由所述Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)構成的B細胞表位。
在另一個的優選實施方案中，本發明提供了一種減少患有阿爾茨海默氏病個體的腦內淀粉樣蛋白沉積的方法，該方法包括將有效量的免疫原性組合物施用于所述個體以誘導產生與Aβ肽(SEQ ID NO2)特異性結合的抗體；其中所述組合物包含(a)抗原和(b)佐劑，所述抗原包含可提供有效量T細胞輔助作用的T細胞表位和由所述Aβ(4-10)(SEQ IDNO1)構成的B細胞表位。
在另一個的優選實施方案中，本發明提供了一種使患有阿爾茨海默氏病個體腦內的淀粉樣蛋白纖維解聚的方法，該方法包括將有效量免疫原性組合物施用于所述個體，以誘導產生與Aβ肽(SEQ ID NO2)特異性結合的抗體；其中所述組合物包含(a)抗原和(b)佐劑，所述抗原包含可提供有效量T細胞輔助作用的T細胞表位和由所述Aβ(4-10)(SEQID NO1)構成的B細胞表位。
在另一個優選實施方案中，本發明提供了能夠與Aβ(4-10)(SEQ IDNO1)結合的分離抗體或其抗原結合片段。
在一個特定的實施方案中，本發明提供了能夠與Aβ(4-10)(SEQ IDNO1)結合的分離抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段能夠抑制淀粉樣蛋白的沉積。
在另一個實施方案中，本發明提供了能夠與Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)結合的分離抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段能夠使淀粉樣蛋白纖維解聚。
在另一個優選的實施方案中，本發明提供了一種治療患有阿爾茨海默氏病的個體的方法，該方法包括將識別Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)并與之結合的有效量抗體組合物施用于所述個體。
在一個特定的實施方案中，本發明提供了一種治療患有阿爾茨海默氏病的個體的方法，該方法包括將識別Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)并與之結合的有效量抗體組合物施用于所述個體，其中所述組合物包含多克隆抗體。
在一個特別的實施方案中，本發明提供了一種治療患有阿爾茨海默氏病的個體的方法，該方法包括將識別Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)并與之結合的有效量抗體組合物施用于所述個體，其中所述組合物包含單克隆抗體。
在另一個優選的實施方案中，本發明提供了測定一個化合物是否為淀粉樣蛋白沉積及纖維形成的抑制劑的方法，該方法包括將化合物與肽Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)接觸，檢測化合物與該肽的結合。在另一個實施方案中，該方法還包括評價所述化合物是否在體外抑制淀粉樣蛋白纖維的形成。
在另一優選實施方案中，本發明提供了預測主動免疫治療對阿爾茨海默氏病效果的診斷方法，該方法包括監測針對肽Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)的免疫反應的發展，其中對Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)的陽性免疫反應表明應繼續進行治療，缺乏免疫反應或極弱的免疫反應表明應當終止治療。
在另一個優選實施方案中，本發明提供了一種免疫原性組合物，該組合物包含抗原和佐劑，其中所述抗原包含可提供有效量T細胞輔助作用的T細胞表位和由所述Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)構成的B細胞表位，所述抗原提供了用于誘導產生抗體的有效蛋白質結構，所述抗體能夠與位于Aβ肽(SEQ ID NO2)內的免疫靶點結合。
在一個特定的實施方案中，本發明提供了一種包含B細胞表位的抗原，其中，B細胞表位的蛋白質結構提供了如在Aβ肽(SEQ ID NO2)中所發現的免疫作用靶點的模擬二級結構，這些二級結構選自β折疊、回折、螺旋、無規則卷曲或它們的組合。在另一個特定的實施方案中，所述抗原包括含有所述Aβ(4-10)肽(SEQ ID NO1)模擬物的B細胞表位。
定義除非另有說明，應將下列術語理解為下述含義佐劑——指免疫原性組合物中與抗原聯用以增強抗原免疫原性的一類物質，也可以是這些物質的混合物。佐劑的作用在于增強對抗原的免疫反應，該作用通常通過其直接作用于免疫系統和使抗原緩慢釋放而實現。
淀粉樣β肽(Aβ)——指一組由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)加工而得的39～43個氨基酸殘基的肽中的任一種。本文所用的Aβ42指42個氨基酸殘基的Aβ肽。此外，Aβ(4-10)指Aβ42中第4～10個殘基的7氨基酸殘基的肽。正如下文更為詳細的討論一樣，APP基因經過選擇性剪接后生成三種常見的同種型產物，這三種產物分別含有770個氨基酸(APP770)、751個氨基酸(APP751)和695個氨基酸(APP695)。為方便起見，即使在指代短同種型產物的密碼子位置時，也使用最長同種型產物APP770的密碼子來計數。
抗原——本發明的抗原結合了輔助性T細胞的表位和B細胞的表位。輔助性T細胞表位可位于同一多肽骨架上B細胞表位的N端或C端。例如在小分子肽與諸如鑰孔血藍蛋白的載體分子共價相連以提供免疫原性時，T細胞表位也可位于與含有B細胞表位的多肽共價相連的不同多肽骨架上。替代性地，也可以通過使用佐劑將T細胞和B細胞的表位結合在一種組合物中的方法，把T細胞表位與B細胞表位非共價相連。
抗原加工——指來自細菌、病毒或免疫原性組合物的細胞外抗原被抗原呈遞細胞(APC)通過胞飲或吞噬作用攝取的過程。隨后，所述抗原被內體或溶酶體片段化，所形成的片段再被載入I型及II型主要組織相容性(MHC)分子的結合裂隙中。
抗原呈遞——指I型及II型MHC分子與加工后的短肽結合并將這些肽呈遞到細胞表面，以通過T細胞受體介導的相互作用進行T細胞篩選的過程。
B細胞表位——指作為抗體結合靶點的抗原部分，也稱為抗原決定簇。對于蛋白質抗原決定簇而言，B細胞表位指通常按照天然結構以特定三維構象排列的氨基酸殘基。與T細胞表位不同，B細胞表位可對蛋白質構象非常敏感。
有效量——指可完成任一明確治療目標的本發明免疫原性組合物、抗體或抗原結合片段的量。有效量也包括組合物、抗體或其抗原結合片段的預防性及治療性應用。
輔助性T細胞表位——輔助性T細胞表位(Th表位)是與II型MHC分子結合并活化CD4+T細胞的肽，從而以細胞因子的形式輔助B細胞產生針對抗原的抗體反應。II型MHC分子在細胞腔室中負載長約7～30個殘基的加工肽片段，其中所述腔室與細胞外環境發生通信。因此，輔助性T細胞表位通常代表外源蛋白質片段。
免疫靶點——指抗原中B細胞表位試圖模擬的淀粉樣蛋白沉積或循環Aβ肽中實際的三維表位(天然的)。抗蛋白的抗體通常對特定二級結構中的特定氨基酸序列具有特異性。理想的情況是，誘導針對表位抗原模擬物的抗體，從而產生識別天然表位并與之結合的抗體，所述天然表位出現在病理性淀粉樣蛋白沉積或循環Aβ肽中。
免疫原——指經證明具有免疫原性的抗原。
免疫原性——指抗原引起免疫反應的能力。一般來說，為了表現出免疫原性，抗原必須與抗原呈遞細胞結合。免疫原性受許多因素影響，包括抗原大小、結構、序列、異源性程度、佐劑存在與否、患者的免疫狀態及其他遺傳因素。
肽——指通常為2個或更多個的連在一起的少數幾個氨基酸。
多肽——指更長的連在一起的氨基酸鏈，但其序列或長度常常還未確定。術語蛋白質、肽及多肽有時可以互相交換使用。
混雜輔助性T細胞表位——指能夠在表達不同MHC單元型的大量個體中誘導T細胞活化反應(T細胞輔助作用)的一類輔助性T細胞表位，所述大量個體即遺傳多樣性群體。在異源群體的多個不同個體中發揮作用的所述Th表位被認為是混雜的Th表位。
蛋白質或多肽骨架——指代表作為蛋白質序列一部分的氨基酸重復單位。多肽骨架由三種原子的序列組成酰胺氮(N-H)，α-碳(C)及羧基碳(C＝O)，常被表示為-N-C-C-。
蛋白質——通常指具有明確的序列、長度及折疊構象的特定氨基酸鏈，但是蛋白質、多肽及肽有時可以互相交換使用。
治療或處理——包括下列目標(1)在尚未診斷出具有不希望有的癥狀或病理性狀態的受試者中防止其發生；(2)抑制不希望有的癥狀或病理性狀態，即阻止其進展；或(3)改善或緩解不希望有的癥狀或病理性狀態，即促進不希望有的癥狀或病理性狀態消退。
本發明的組合物和方法來源于本發明人的發現，即免疫反應介導的淀粉樣蛋白斑沉積的減少，及相應的認知功能改善可由針對Aβ42中特定免疫靶點或B細胞表位的特異性抗體反應介導。所述關鍵免疫靶點由本發明人鑒定為Aβ42的第4～10個殘基(FRHDSGY)(SEQ ID NO1)，其中，根據最長同種型APP770密碼子來計數，所述Aβ42的第4～10個殘基對應于淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)的第675～681個殘基。由此，本發明人闡明了一種用Aβ型抗原免疫后由免疫作用介導的淀粉樣蛋白斑負荷減少的重要免疫學機制。
本發明人發現，識別Aβ42第4～10個殘基(FRHDSGY)(SEQ ID NO1)并與之結合的抗體可抑制Aβ纖維形成及Aβ的神經毒性。此外，本發明人發現識別Aβ42第4～10個殘基(FRHDSGY)(SEQ ID NO1)并與之結合的抗體可解聚已經形成的Aβ42纖維。而且，本發明發現用Aβ42免疫時產生的抗體在Aβ所致的體外死亡細胞中消失了。
本發明的實施使用TgCRND8小鼠作為人類AD的模型。TgCRND8小鼠可用作AD模型是因為其攜帶了受朊病毒蛋白啟動子控制的人類雙突變APP695轉基因，并表現出大腦皮質中Aβ42肽及神經炎性淀粉樣蛋白斑的進行性積聚(一種AD的神經病理學標志)，同時伴隨進行性認知功能障礙。參見Chishti等人，《生物化學雜志(J.Biol.Chem.)》，276卷，21562-570頁(2001)。
本發明提供了特異性針對Aβ肽N端的抗體，該抗體在用Aβ42的原纖維形式免疫C57BL6×C3H小鼠時產生。本發明還提供了與Aβ(4-10)對應的Aβ序列FRHDSGY(SEQ ID NO1)，其代表了針對阿爾茨海默氏病的保護性免疫作用的關鍵表位。此外，本發明將Aβ(4-10)鑒定為能夠在患有阿爾茨海默氏病的患者中產生有益的保護性免疫作用的免疫靶點。
抗原呈遞抗原呈遞指抗原呈遞細胞(APC)攝取和加工蛋白抗原的分子及細胞事件。加工后的抗原片段呈遞到效應細胞，然后效應細胞活化并啟動免疫應答。最具活性的抗原呈遞細胞為巨噬細胞(是單核細胞的直接發育產物)、樹突狀細胞及某些B細胞。
抗原呈遞及免疫反應過程中的關鍵分子為MHC分子，該分子是位于已知為主要組織相容性復合物Mhc的染色體區域內的多態性基因家族。人類中的I型及II型MHC分子稱為HLA(人類白細胞抗原)分子。某些MHC分子可以在細胞表面上展示獨特分子片段并促進T細胞及其他免疫系統效應分子對這些分子的識別。參見D.H.Margulies，《基礎免疫學(Fundamental Immunology)》第263-285頁中的《主要組織相容性復合物(The Major Histocompatibility Complex)》部分，第4版，W.F.Paul編，Lippencott-Raven，費城(Philadelphia)，賓夕法尼亞州(PA)(1999)。此外，I型及II型MHC分子可與抗原呈遞細胞中的肽結合，然后與T細胞表面上的αβT細胞受體相互作用。
更具體地說，I型MHC分子結合并呈遞細胞自身肽的樣品，該樣品包括內源性胞漿蛋白、全新翻譯的病毒及腫瘤抗原。I型MHC分子通常呈遞長度約7～16個殘基的肽，這些肽為CD8+細胞毒T細胞所識別。I型MHC分子參與影響細胞毒性T細胞應答，其中，感染病毒的細胞被殺死。
本發明主要涉及用于活化CD4+T細胞的T細胞表位，其中所述CD4+T細胞可輔助B細胞生成針對某一抗原的抗體。輔助性T細胞表位(Th表位)與細胞腔室中的II型MHC分子結合，其中，所述分子與長約7～30個殘基的加工后肽片段一起負載，所述細胞腔室與細胞外環境通信。參見D.H.Margulies，《基礎免疫學(Fundamental Immunology)》第263-285頁中的《主要組織相容性復合物(The Major HistocompatibilityComplex)》部分，第4版，由W.F.Paul編輯，Lippencott-Raven，費城(Philadelphia)，賓夕法尼亞州(PA)(1999)(Margulies)。更具體地，II型MHC分子結合肽樣品并將其呈遞給CD4+T細胞，所述肽樣品在緊靠細胞的細胞外環境中被抗原呈遞細胞消化。然后CD4+T細胞活化，并以細胞因子的形式輔助B細胞生成抗體。在人類中，II型MHC分子包括HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP分子，它們在不同遺傳編碼的等位基因中出現。
本發明的免疫原性組合物包括具有B細胞表位及T細胞表位的抗原，所述表位被所謂“抗原呈遞細胞”表面上的MHC分子加工并作為蛋白質或肽片段呈遞，并被作為效應細胞的CD4+T淋巴細胞所識別。
為了確保有效的免疫監視，將MHC分子的生理作用設計為能夠呈遞盡可能廣譜的抗原肽。因此，抗原呈遞細胞表面上確定的抗原肽的拷貝數很低(給定總數約為105個肽受體中確定的抗原肽的數量級為102)。也就是說，與MHC分子(“肽配體”)結合的異源性非常強的抗原肽混合物暴露于抗原呈遞細胞的細胞表面上。
術語“T細胞表位”指在抗原加工及II型MHC分子結合袋內的肽呈遞后，使CD4+T輔助(Th)淋巴細胞活化的蛋白質序列。T細胞表面上的α/βT細胞受體與肽-II型MHC分子復合物相互作用，該作用刺激了活化。因而，T細胞表位的天然構象并不重要，而是只有一級序列及其與特定MHC分子結合的能力更為重要。
本發明涉及能夠誘導產生針對Aβ病理形式抗體的肽，優選合成肽，所述Aβ病理形式例如在淀粉樣蛋白斑及纖維中發現的Aβ。
肽的免疫原性指肽誘導抗體反應的能力，所述反應包括可特異性識別肽內“B細胞表位”或“抗原決定簇”并與之結合的抗體。參見R.N.Germain，《基礎免疫學(Fundamental Immunology)》第287-340頁中的《抗原的加工和呈遞(Antigen Processing and Presentation)》部分，第4版，W.F.Paul編輯，Lippencott-Raven，費城(Philadelphia)，賓夕法尼亞州(PA)(1999)(Germain)。為表現出抗原性，含B細胞表位的肽必須與II型MHC抗原或II型T表位聯合呈遞。T細胞表位通常由抗原呈遞細胞在加工抗原時從免疫原加工而來，并以序列特異性的方式與II型MHC分子結合。參見上述Germain的文章。所述II型MHC分子-T細胞表位復合物為CD4+T淋巴細胞(Th細胞)所識別。所述Th細胞具有使產生抗體分子的特定B細胞增殖的能力，其中所述抗體分子能識別來自所呈遞免疫原的相關B細胞表位。因此，特定B細胞表位的特異抗體的產生與T細胞表位的呈遞相關聯，所述T細胞表位存在免疫原中的或與其相關。
當抗原不是外源蛋白時會產生另一個問題。由于Aβ是自身分子，其不應含有可誘導淋巴細胞活化及針對自身抗體反應的Th表位。因此，外源T細胞表位須通過包括來源于強外來免疫原的特異性序列來提供，這些免疫原包括破傷風毒素、百日咳毒素、麻疹病毒F蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)及其他免疫原。此類T細胞表位序列可以與B細胞表位Aβ(4-10)一起包含于同一蛋白質骨架上。所述T細胞表位的位置可以在B細胞表位的N端或C端。替代性地，T細胞表位也可位于不同的蛋白質骨架上，該骨架可以與含有B細胞表位的肽共價相連或不共價相連，該骨架也被稱為載體分子。
可以通過本領域內眾所周知的下述方法選擇更多的T細胞表位，例如，將免疫親和純化的II型MHC分子中的II型MHC結合肽進行酸洗脫和質譜測序，該方法在Rudensky等人，《Nature》，353卷，622-627頁(1991)；Chicz等人，《Nature》，358卷，764-768頁(1992)；及Hunt等人，《Science》，256卷，1817-1820頁(1992)中公開，并在此將其以整體引入作為參考。
理想的情況是，優選的選定Th表位能夠在表達不同MHC單元型的大量個體中引起T細胞活化反應(T細胞輔助作用)。也就是說，這些表位可在異源群體中的大量不同個體中發揮作用，且被認為是混雜Th表位。混雜Th表位具有在遺傳多樣性群體的大部分成員中引起強烈的抗Aβ抗體反應的優勢。
本發明輔助性T細胞表位的選擇不僅要考慮在給定群體的大部分成員中引起免疫反應的能力，還要考慮導致記憶/回憶反應的能力。接受Aβ免疫治療的大多數人類患者，已經用麻疹、流行性腮腺炎、風疹、白喉、百日咳、破傷風的兒童疫苗免疫過了。因此這些患者此前已暴露于免疫原混合物內超過一種的Th表位中。這些先前的暴露可能是有用的，因為標準疫苗免疫造成的先前Th表位暴露，應該生成了可直接應答并為抗體反應提供幫助的Th細胞克隆。
輔助性T細胞表位是包含Th表位的氨基酸序列(天然或非天然氨基酸)。輔助性T細胞表位可包含連續的或不連續的表位。因而并不是輔助性T細胞表位中的每個氨基酸殘基均是表位的必須部分。因此，包括Th表位類似物及片段在內的Th表位能夠增強或刺激針對Aβ的免疫反應。輔助性T細胞優勢免疫表位廣泛地在含有各種不同MHC類型的動物及人類群體中具有反應性。參見Gelis等人，《免疫學雜志(J.Immunol.)》，140卷，1808-1815頁，(1988)；Demotz等人，《J.Immunol.》，142卷，394-402頁，(1989)；Chong等人，《感染免疫學(Infect.Immun.)》，60卷，4640-4647頁，(1992)。受試肽的輔助性T細胞表位含有約10～50個氨基酸殘基，優選約10～40個氨基酸殘基，更優選約10～30個氨基酸殘基，進一步更優選約10～20個氨基酸殘基，或優選約10～15個氨基酸殘基。當存在多個輔助性T細胞表位(即n＞2)時，各個輔助性T細胞表位可相互獨立的相同或不同。
輔助性T細胞表位可包括所述輔助性T細胞表位的長約1～10個氨基酸的類似物、取代體、缺失體及插入體。輔助性T細胞表位片段是輔助性T細胞表位中的連續部分，該連續部分足以增強或刺激針對Aβ的免疫反應。輔助性T細胞表位與B細胞表位之間可被一個或一個以上的間隔氨基酸殘基隔開。
本發明的表位包括乙型肝炎表面抗原輔助性T細胞表位(HB-Th)、百日咳毒素輔助性T細胞表位(PT-Th)、破傷風毒素輔助性T細胞表位(TT-Th)、麻疹病毒F蛋白輔助性T細胞表位(MV-Th)、沙眼衣原體(Chlamydia trachamates)主要外膜蛋白輔助性T細胞表位(CT-Th)、白喉毒素輔助性T細胞表位(DT-Th)、惡性瘧原蟲環子孢子輔助性T細胞表位(PF-Th)、曼氏裂體吸蟲磷酸丙糖異構酶輔助性T細胞表位(SM-Th)、大腸埃希氏菌Tra輔助性T細胞表位(TraT-Th)和這些Th表位任意的免疫增強類似物及片段。Ladd等人的專利號為No.5,759,551的美國專利描述了廣泛反應性Th表位的選擇，在此將其公開的內容以整體引入作為參考。下面提供了輔助性T細胞表位序列的例子表1、輔助性T細胞表位HB-ThPhe--Phe--Leu--Leu--Thr--Arg--Ile--Leu--thr--Ile--Pro--Gln--Ser--Leu--Asp，SEQ ID NO3PT-ThLys--Lys--Leu--Arg--Arg--Leu--Leu--Tyr--Met--Ile--Tyr--Met--Ser--Gly--Leu--Ala--Val--Arg--Val--His--Val--Ser--Lys--Glu--Glu--Gln--Tyr--Tyr--Asp--Tyr，SEQ ID NO4TT-ThLys--Lys--Gln--Tyr--Ile--Lys--Ala--Asn--Ser--Lys--Phe--Ile--Gly--Ile--Thr--Glu--Leu，SEQ ID NO5TT2-ThLys--Lys--Phe--Asn--Asn--Phe--Thr--Val--Ser--Phe--Trp--Leu--Arg--Val--Pro--Lys--Val--Ser--Ala--Ser--His--LeuSEQ ID NO6PT-ThTyr--Met--Ser--Gly--Leu--Ala--Val--Arg--Val--His--Val--Ser--Lys--Glu--Glu，SEQ ID NO7
TT3-ThTyr--Asp--Pro--Asn--Tyr--Leu--Arg--Thr--Asp--Ser--Asp--Lys--Asp--Arg--Phe--Leu--Gln--Thr--Met--Val--Lys--Leu--Phe--Asn--Arg--Ile--Lys，SEQ ID NO8PT-ThGly--Ala--Tyr--Ala--Arg--Cys--Pro--Asn--Gly--Thr--Arg--Ala--Leu--Thr--Val--Ala--Glu--Leu--Arg--Gly--Asn--Ala--Glu--LeuSEQ ID NO9MVF1-ThLeu--Ser--Glu--Ile--Lys--Gly--Val--Ile--Val--His--Arg--Leu--Glu--Gly--Val SEQ ID NO10MVF2-ThGly--Ile--Leu--Glu--Ser--Arg--Gly--Ile--Lys--Ala--Arg--Ile--Thr--His--Val--Asp--Thr--Glu--Ser--Tyr SEQ ID NO11TT4-ThTrp--Val--Arg--Asp--Ile--Ile--Asp--Asp--Phe--Thr--Asn--Glu--Ser--Ser--Gln--Lys--Thr SEQ ID NO12TT5-ThAsp--Val--Ser--Thr--Ile--Val--Pro--Tyr--Ile--Gly--Pro--Ala--Leu--Asn--His--Val SEQ ID NO13CT-ThAla--Leu--Asn--Ile--Trp--Asp--Arg--Phe--Asp--Val--Phe--Cys--Thr--Leu--Gly--Ala--Thr--Thr--Gly--Tyr--Leu--Lys--Gly--Asn--Ser SEQ ID NO14DT-ThAsp--Ser--Glu--Thr--Ala--Asp--Asn--Leu--Glu--Lys--Thr--Val--Ala--Ala--Leu--Ser--Ile--Leu--Pro--Gly--His--Gly--CysSEQ ID NO15DT-ThGlu--Glu--Ile--Val--Ala--Gln--Ser--Ile--Ala--Leu--Ser--Ser--Leu--Met--Val--Ala--Gln--Ala--Ile--Pro--Leu--Val--Gly--Glu--Leu--Val--Asp--Ile--Gly--Phe--Ala--Ala--Thr--Asn--Phe--Val--Glu--Ser--CysSEQ ID NO16
PF-ThAsp--His--Glu--Lys--Lys--His--Ala--Lys--Met--Glu--Lys-Ala--Ser--Ser--Val--Phe--Asn--Val--Val--Asn--SerSEQ ID NO17SM-ThLys--Trp--Phe--Lys--Thr--Asn--Ala--Pro--Asn--Gly--Val--Asp--Glu--Lys--His--Arg--His SEQ ID NO18TraT1-ThGly--Leu--Gln--Gly--Lys--Hfis--Ala--Asp--Ala--Val--Lys--Ala-Lys--Gly SEQ ID NO19TraT2-ThGly--Leu--Ala--Ala--Gly--Leu--Val--Gly--Met--Ala--Ala--Asp--Ala--Met--Val--Glu--Asp-Val--Asn SEQID NO20TraT-ThSer--Thr-Glu--Thr--Gly--Asn-Gln--His--His--Tyr--Gln--Thr-Arg--Val--Val--Ser--Asn--Ala--Asn--Lys SEQ ID NO21在-些實施方案中，本發明包含具有選自以下氨基酸序列的T細胞表位SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ IDNO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20或SEQ IDNO21。
抗原設計本發明的免疫原性組合物包含抗原，該抗原包含提供有效量T細胞輔助性T細胞表位和由所述Aβ(4-10)肽構成的B細胞表位。
本發明的抗原肽由下式表示I.(A)n--(Th)m--(B)o--Aβ(4-10)--(C)pII.(A)n--Aβ(4-10)--(B)o--(Th)m--(C)oIII.(D)q--Aβ(4-10)--(E)r其中A、C、D及E為相互獨立的氨基酸殘基或氨基酸殘基序列；其中作為間隔子的B是氨基酸殘基或氨基酸殘基序列；當o等于0時，Th通過不含任何間隔殘基的肽鍵與B細胞表位直接相連；
其中n、o及p為相互獨立的0至約20的整數；當o等于0時，Th直接與B細胞表位相連而不含任何間隔殘基；其中m為1至約5的整數；其中q和r為相互獨立的0至約100的整數；Th為包含輔助性T細胞表位或者其免疫增強類似物或片段的獨立氨基酸序列；或者含有保守氨基酸替換的所述氨基酸序列類似物；Th可以呈串聯重復；Aβ(4-10)為Aβ42SEQ ID NO1的第4～10個殘基(FRHDSGY)，或者是其含有保守氨基酸替換的類似物；Aβ(4-10)SEQ ID NO1可以串聯重復，或以多拷貝形式存在。
本發明也包括式I、II和III所示的兩個或更多個肽的組合物。式I的一個或一個以上的肽可以組合從而形成組合物。替代性地，來自式I、II和III的一個或一個以上的肽可以組合從而形成混合物或組合物。
本發明的抗原肽含約20～100個氨基酸殘基，或者含有約20～80個氨基酸殘基。在一個特定的實施方案中，本發明的抗原肽含有約20～60個氨基酸殘基，優選約20～50個氨基酸殘基，更優選約25～40個氨基酸殘基。在另一個優選的實施方案中，抗原肽含有約20～35個氨基酸殘基。
當A、B、C、D及E為氨基酸殘基時，它們可以是任意的非天然存在的氨基酸或任意天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸包括但不限于β-丙氨酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、甲狀腺氨酸、γ-氨基丁酸、原絲氨酸、瓜氨酸，等等。天然存在的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸及纈氨酸。此外，當m至少為1且A、B、C、D或E基團中兩個或更多個為氨基酸殘基時，各個氨基酸相互獨立的相同或不同。
A、B、C、D或E基團的氨基酸殘基可以被脂肪酸修飾。例如，可在Aβ表位的N端或C端加上一個或一個以上的ε-棕櫚酰賴氨酸，使整個肽可以錨定于囊泡的表面。囊泡可含免疫刺激劑脂質A。參見Nicolau等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》，99卷，2332-2337頁(2002)，其公開的內容在此以整體引入作為參考。
通過使用用于構建蛋白質抗原的正交偶聯策略，可將Aβ(4-10)表位引入蛋白質的樹枝狀結構(dendrimer)中。特定構建的樹枝狀結構可形成裝配有效疫苗抗原的基礎，例如可包括Tam的專利號為No.6,310,810的美國專利中所描述的多元抗原肽構建，其公開的內容在此以整體引入作為參考。
用作抗原和疫苗的合成肽在很多情況下，已經證明使用完整蛋白或糖蛋白作為開發感染制劑和用于人類疾病的有效疫苗及免疫治療方法的免疫原，不是由于缺乏免疫原性而導致沒有效果，就是因為包含非保護性表位而致使感染及疾病的惡化。參見Osterhaus等人，《疫苗(Vaccine)》，7卷，137-141頁(1989)；Gilbert等人，《病毒研究(Virus Research)》，7卷，49-67頁(1987)；Burke，D.《生物醫學前景(Perspect.Biol.Med.)》，35卷，511-530頁(1992)。
在疫苗或免疫原性組合物中使用合成肽抗原可以避免與重組疫苗相關的許多問題。使用與特定蛋白質結構域相對應的合成肽的優勢包括僅選擇和包括保護性表位，排除使疾病惡化的表位，排除有害的自身免疫表位，排除感染性物質；且合成的肽在化學上是非常明確的，并能夠以合理的成本生產。參見Arnon和Horwitz，《最新免疫學觀點(Curr.Opin.Immunol.)》，4卷，449-453頁(1992)。
不足之處在于小分子合成肽不含加工及與I型和II型主要組織相容性復合物(MHC)蛋白結合、呈遞給免疫系統所需的精確氨基酸序列。參見Rothbard，《生物技術(Biotechnology)》，20卷，451-465頁(1992)。另一個不足之處是小分子肽的三維溶液結構可能與天然蛋白中觀察到的不同，因此，該肽可能無法誘導具有適當特異性和親和性的體液免疫以提供保護性免疫。參見Bernard等人，《艾滋病研究和人類逆轉錄病毒(Aids Res.and Hum.Retroviruses)》，6卷，243-249頁(1990)。
本發明的肽抗原能夠以廣泛的各種方式制備。所述肽由于相對較小，可以根據常規技術在溶液中或在固相支持物上合成。目前可從商業途徑獲得各種不同的自動化或人工合成儀，并可按照已知方案使用。例如，可參見Finn等人的專利號為No.5,827,666的美國專利；Stewart和Young，《固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)》，第2版，PierceChemical Co.，1984年；及Tam等人，《美國化學協會雜志(J.Am Chem.Soc.)(1983)105卷，6442頁，其公開的內容在此以整體引入作為參考。
替代性地，當采用編碼所述多肽的單鏈或其基本互補序列制備合成基因時，可使用雜交DNA技術，此時單鏈發生重疊并可在退火介質中合在一起以便雜交。可將雜交的鏈加以連接以形成完整的基因，并可通過選擇恰當的末端將該基因插入到表達載體中，目前許多載體均可容易地獲得；例如，可參見Sambrook，Fritsch & Maniatis，《分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)》，第2版(1989)，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，ColdSpring Harbor，紐約(N.Y.)(本文中稱為“Sambrook等人，1989”)；然后在原核或真核表達系統中表達，以產生所需的肽。
載體例如在本申請中所述的本發明Aβ(4-10)表位抗原，可以與載體分子結合以提供T細胞輔助作用。
本發明抗原所共價相連(偶聯)的載體分子是有益的、無毒的、制藥學上可接受的，且大小足以在哺乳動物中產生免疫反應。適當載體分子的例子包括破傷風毒素、鑰孔血藍蛋白(KLH)及與gp120包膜糖蛋白T細胞表位(即T1和T2)相對應的肽，其中所述糖蛋白可替代非艾滋病(non-AIDS)病毒衍生的載體分子(Cease，《Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)》，84卷，4249頁，1987年；Kennedy等人，《J.Biol.Chem.》，262卷，5769頁，1987年)。所述肽可與制藥學上可接受的佐劑如明礬一起施用，或與其他免疫原性超過破傷風毒素的載體分子結合后施用。
載體分子可直接或通過間隔分子與本發明的肽抗原相連。間隔分子是有益的、無毒的，并具有反應性。在肽的氨基末端增加的兩個甘氨酸殘基，可以提供用于將Aβ(4-10)或其部分和載體分子連接的適當間隔分子；替代性地，Aβ(4-10)或其部分例如可以合成為與例如另一個免疫原性淀粉樣蛋白序列直接相連。半胱氨酸可加入到Aβ(4-10)肽的N端或C端用于與載體分子偶聯，或者同時加入到其兩端以通過二硫鍵的形成來促進鏈間的多聚體化，從而形成更大的分子聚集物。載體分子與肽的偶聯使用偶聯劑來完成。如Green等人，《細胞(Cell)》，28卷，477頁(1982)；及Palker等人，《Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.》，84卷，2479頁(1987)所述，優先使用異質功能(heterofunctional)偶聯劑M-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)或水溶性化合物M-馬來酰亞胺苯甲酰磺化琥珀酰亞胺酯(磺化-MBS)。許多其他偶聯劑如戊二醛，可用于使肽和其他分子偶聯。偶聯方法在本領域內眾所周知。例如可參見G.T.Hermanson著的《生物偶聯技術(Bioconjugate Techniques)》中的第9章(419～455頁)及第11章(494～527頁)，學院出版社(AcedemicPress)，圣地亞哥(San Diego)，1996年，其公開的內容在此以整體入作為參考。
佐劑抗原的兩大特征是其免疫原性或其誘導體內免疫反應(包括特異性抗體的形成)的能力；和抗原性，即可被對該序列和結構具有特異性的抗體選擇性識別的能力。
某些抗原獨自施用時僅有微弱的免疫原性。因此，微弱免疫原性的抗原不能誘導提供有效免疫治療或保護該生物的免疫反應。
可通過將抗原與稱為佐劑的額外物質混合施用，來增強其免疫原性。佐劑通過直接作用于免疫系統和使抗原緩慢釋放的作用，來增強針對抗原的免疫反應。因此，佐劑改變了抗原的藥物動學性質，且提高了抗原與免疫系統之間相互作用的時間。佐劑的用途在本領域內眾所周知，有許多可以使用的適當佐劑。在《疫苗設計-亞基和佐劑方法(VaccineDesign--The subunit and adjuvant approach)》(Powell和Newman編輯)，《制藥學生物技術(Pharmaceutical Biotechnology)》，6卷，Plenum出版社(1995)中，概要描述了免疫原性組合物的制備及佐劑的應用，其公開地內容在此以整體引入作為參考。
應用最為廣泛的佐劑是弗氏佐劑和弗氏不完全佐劑，前者為在礦物油中包含溶于鹽水溶液的死亡分枝桿菌的乳劑，后者不含分枝桿菌。
佐劑可增強針對特異抗原的免疫反應的強度，或產生免疫系統的特異性活化。佐劑通常分成五類，包括(1)鋁鹽，如氫氧化鋁或磷酸鋁；(2)表面活性劑，如皂甙、奎樂A、奎樂A/免疫刺激復合物、二甲基雙十八烷基溴化銨/艾衛定；(3)聚陰離子；(4)細菌衍生物，如弗氏完全佐劑、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-異谷酰胺(胞壁酰二肽)、N-乙酰胞壁酰基-L-蘇氨酰基-D-異谷酰胺(蘇氨酰MDP)；(5)賦形劑及緩釋物質，如弗氏不完全佐劑(油乳劑)及脂質體。參見《新一代疫苗(New Generation Vaccines)》，第11章，129-140頁，“用于新一代疫苗的佐劑(Adjuvants for a New Generation of Vaccines)”，A.C.Allison及N.E.Byars著，Marcel Dekker，紐約，1990年。
本發明的免疫原性組合物包含抗原和佐劑。適當的佐劑包括明礬，其為鋁鹽如氫氧化鋁凝膠或磷酸鋁，但也可以是鈣、鐵或鋅的鹽。其他適當的佐劑包括酰化酪氨酸的不溶性懸液、酰化糖類、陽離子或陰離子衍生的多糖、或聚磷腈。
可使用佐劑組合以產生佐劑系統。適當的佐劑系統包括例如單磷酸脂質A與鋁鹽的組合，其中單磷酸脂質A優選3-去氧酰化單磷酸脂質A(3D-MPL)。一個替代性的佐劑系統包含例如RIBI ADJUVANT SYSTEMTM，其為單磷酸脂質A、合成的海藻糖二棒分枝桿菌酸酯(trehalosedicorynomycolate)及細胞壁骨架物質的組合，其中單磷酸脂質A優選3-去氧酰化單磷酸脂質A。一個增強的系統包括單磷酸脂質A與皂甙衍生物的組合，尤其是WO 94/00153中公開的QS21和3D-MPL的組合，或反應原性更小的組合物，其中QS21用WO 96/33739中公開的膽固醇猝滅。WO 95/17210中描述了一種包含水包油乳劑中QS21、3D-MPL及生育酚的特別強效的佐劑制劑，其為優選的制劑。WO 94/00153、WO 96/33739及WO 95/17210所公開的內容在此以整體引入作為參考。
此外，本發明的組合物可像Fullerton的專利號為No.4,235,877的美國專利中所述的那樣封裝入脂質體或微囊中，其公開的內容在此以整體引入作為參考。
抗體結構本發明設計了可與Aβ(4-10)表位結合并抑制淀粉樣蛋白沉積及纖維形成的抗體或其抗原結合片段。一般來說，已知基本的抗體結構單元包括四聚體。每一個四聚體包括兩對相同的多肽鏈，每對含一條“輕鏈”(約25kDa(千道爾頓))和一條“重鏈”(約50～70kDa)。每條鏈的氨基端部分可包括約100～110或更多個氨基酸的可變區，其主要負責抗原識別。每條鏈的羧基端部分可界定一個恒定區，其主要負責起效應器作用。人類輕鏈一般分為κ和λ輕鏈。此外，人類重鏈一般分為μ、δ、γ、α及ε，它們分別將抗體的同種型界定為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈和重鏈的內部，可變區和恒定區用長約12或更多個氨基酸的“J”區相連，其中重鏈也包括長約10個或更多個氨基酸的“D”區。參見J.K.Frazer和J.D.Capra，《基礎免疫學(Fundamental Immunology)》第37-75頁的“免疫球蛋白結構與功能(ImmunoglobulinsStructure andFunction)”，第4版，W.F.Paul編輯，Lippencott-Raven，Philadelphia，PA(1999)(Frazer)，將其內容以整體引入作為所有目的之參考。
每個輕鏈/重鏈對的可變區可形成抗體結合部位。因此，一般來說，完整的IgG有兩個結合部位。除了雙功能或雙特異性抗體外，一般來說這兩個結合部位是相同的。
正常情況下，所有的鏈均表現出由三個高度可變區連接的相對保守框架區(FR)的相同通用結構，高度可變區也稱為互補決定區或CDRs。來自每對鏈中兩條鏈的CDRs通常沿框架區排列，使得可以與特異性表位結合。一般來說，從N端到C端，輕鏈和重鏈均含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4結構域。各結構域的氨基酸通常與“免疫學目標蛋白Kabat序列”(美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)，Bethesda，Md.(1987和1991)；Chothia等人，《分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)》，196卷，901-917頁(1987)；或Chothia等人，《Nature》，342卷，878-883頁(1989)的定義一致。
抗體的類型術語“抗體分子”包括但不限于抗體或其片段。該術語包括單克隆抗體、多克隆抗體、雙特異性抗體、Fab抗體片段、F(ab)2片段、Fv抗體片段(如VH或VL)、單鏈Fv抗體片段及dsFv抗體片段。而且，本發明的抗體分子可以是完全人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。抗體分子優選為單克隆完全人類抗體。
優選本發明的抗Aβ(4-10)抗體分子識別人類的淀粉樣蛋白Aβ肽蛋白及肽；但是，本發明包括識別來自不同種屬的淀粉樣蛋白Aβ肽蛋白及肽的抗體分子，所述不同種屬優選哺乳動物(如小鼠、大鼠、兔、羊或狗)。
此外，本發明的抗Aβ(4-10)抗體可來源于人類單克隆抗體。此類抗體可從轉基因小鼠獲得，其中所述小鼠已被“改造成”對抗原攻擊應答時產生特異的人類抗體。在此技術中，將人類重鏈及輕鏈基因座的元件導入了小鼠株中，所述小鼠株來源于內源重鏈及輕鏈基因座受到定向破壞的胚胎干細胞系。轉基因小鼠可以合成針對人類抗原的特異性人類抗體，并且該小鼠可用于生產分泌人類抗體的雜交瘤。在以下文獻中描述了從轉基因小鼠中獲取人類抗體的方法Green等人，《自然遺傳學(Nature Genet.)》，7卷，13頁(1994)；Lonberg等人，《Nature》，368卷，856頁，(1994)；以及Taylor等人，《國際免疫學(Int.Immun.)》，6卷，579頁(1994)。
在一個優選的實施方案中，利用攜帶部分人類免疫系統而不是小鼠系統的轉基因小鼠產生針對Aβ(4-10)的完全人類單克隆抗體。這些轉基因小鼠在本文可稱為“HuMAb”小鼠，其含有人類免疫球蛋白基因的小基因座(miniloci)，它編碼未重排的人類重鏈(μ、γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列，并產生了使內源μ和κ鏈基因座失活的定點突變(Lonberg，N.等人，(1994)，《Nature》，368(6474)856-859頁)。因此，該小鼠表現為小鼠IgM或κ表達減少，并在對免疫產生應答時，導入的人類重鏈及輕鏈轉基因發生類型交換和體細胞突變，以產生高親和力的人類IgG單克隆抗體(Lonberg，N.等人，(1994)，《Nature》，368(6474)856-859頁；Lonberg，N.(1994)，《實驗藥理學手冊(Handbook of ExperimentalPharmacology)》，11349-101頁中的綜述；以及Lonberg，N.等人，(1995)，《國際免疫學綜述(Intern.Rev.Immunol)》，1365-93頁)。HuMAb小鼠的制備在本領域內是已知的，并在例如下列文獻中描述Lonberg等人，(1994)《Nature》，368(6474)856-859頁；Lonberg，N.(1994)《Handbook of Experimental Pharmacology》，11349-101頁；Lonberg，N.等人，(1995)《Intern.Rev.Immunol.》，13卷，65-93頁；Fishwild，D.等人，(1996)《自然生物技術分冊(NatureBiotechnology)》，14845-851頁。進一步可參見Lonberg和Kay及GenPharm International的專利號為No.5,814,318、5,874,299和5,770,429的美國專利；Surani等人的專利號為No.5,545,807的美國專利。將其所有公開的內容以整體引入作為參考。
為了產生針對Aβ(4-10)的完全人類單克隆抗體，可用含有本發明的Aβ(4-10)抗原的免疫原性組合物免疫HuMAb小鼠。優選在第一次免疫時小鼠應為6～16周齡。例如，含有本發明Aβ(4-10)抗原的免疫原性組合物可用于腹腔內免疫HuMAb小鼠。小鼠也可用完整的HEK293細胞免疫，其中所述細胞已用含有Aβ(4-10)的基因穩定轉化或轉染。“抗原性Aβ(4-10)多肽”可指在HuMAb小鼠中引起抗Aβ(4-10)免疫反應的Aβ(4-10)多肽或其片段。
一般來說，起初用完全弗氏佐劑中的抗原進行腹腔內(IP)免疫，然后每隔一周(通常總時間最多為6周)用不完全弗氏佐劑中的抗原進行IP免疫，采用所述方法的HuMAb轉基因小鼠的免疫應答最好。首先，可用表達Aβ(4-10)的細胞(如穩定轉化的HEK293細胞)免疫小鼠，再用含有Aβ(4-10)的抗原的可溶片段如本發明的免疫原性組合物免疫，然后連續用這兩種抗原交替免疫。可以采用眶后采血或尾部取血的方法采集血漿樣品，來監測所述免疫方案的過程中的免疫反應。血漿可用于檢測是否存在抗Aβ(4-10)抗體，如使用ELISA(酶聯免疫吸附檢測)方法檢測，具有足夠免疫球蛋白滴度的小鼠可用于融合。可在處死小鼠及取脾臟前3天用抗原進行靜脈內增強免疫。預計需要對每一抗原進行2～3次融合。每一抗原可以免疫數只小鼠。例如，可以免疫總共12只的HC07和HC012株HuMAb小鼠。
然后可用本領域內通常已知的方法生成可產生單克隆完全人類抗Aβ(4-10)抗體的雜交瘤細胞。這些方法包括但不限于以下技術最初由Kohler等人，《Nature》，256卷，495-497頁(1975)開發的雜交瘤技術；以及Hering等人，《生物醫學和生物化學學報(Biomed.Biochim.Acta.)》，47卷，211-216頁，(1988)，和Hagiwara等人，《人類抗體雜交瘤(Hum.Antibod.Hybridomas)》，4卷，15頁(1993)所研發的三瘤(trioma)技術；Kozbor等人，《今日免疫學(Immunology Today)》4卷72頁(1983)的人類B細胞雜交瘤技術；及Cote等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，80卷，2026-2030頁，(1983)；以及EBV-雜交瘤技術(Cole等人，《單克隆抗體與癌癥治療(Monoclonal Antibodies andCancer Therapy)》，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁，1985年)。優選按標準方案用PEG將分離得到的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系融合。將所得的雜交瘤進行生成抗原特異性抗體的篩選。例如，將來源于免疫小鼠的脾淋巴細胞單細胞懸液，用50％PEG(聚乙二醇)與1/6數量的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤細胞(ATCC(美國典型培養物保藏中心)，CRL 1580)融合。將細胞以約2×105個細胞的量接種到平底微量滴定板中，在含20％胎牛血清、18％″653″條件培養基、5％origen(IGEN)、4mM(毫摩爾每升)L(左旋)-谷氨酰胺、1mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、5mM HEPES、0.055mM 2-巰基乙醇、50單位/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素及1X HAT(次黃嘌呤、氨甲蝶呤和胸腺嘧啶核苷)(Sigma；融合后24小時加入HAT)的選擇培養性培養基中孵育2周。兩周后，細胞在將HAT替換成HT(次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷)的培養基中培養。然后在每個培養孔中用ELISA方法進行抗Aβ(4-10)單克隆IgG及IgM抗體的篩選。當發生雜交瘤大量生長時，常常在10～14天后觀察培養基。將分泌抗體的雜交瘤重新種植和篩選，并且如果仍為人類IgG、抗Aβ(4-10)單克隆抗體陽性，則可用有限稀釋法進行至少兩次亞克隆。然后將穩定的亞克隆于體外培養，以在組織培養基中產生用于鑒定的少量抗體。
本發明的抗Aβ抗體分子也可以由重組生成(例如，在如上所述的大腸埃希氏菌(E.Coli)/T7表達系統中生成)。在本實施方案中，可以將編碼本發明抗體分子(如VH或VL)的核酸插入基于pet的質粒中，并在E.Coli/T7系統中表達。本領域內有數種眾所周知的生產重組抗體的方法。專利號為No.4,816,567的美國專利公開了一種抗體重組生產方法的實例，在此將其整體引入作為參考。抗體分子也可在CHO或NSO細胞中重組生成。
本文中的術語“單克隆抗體”指從基本同源的抗體的群體中所獲得的抗體，即除了可能存在的少量天然發生的突變外，包含所述群體的單一抗體是相同的。單克隆抗體具有高度特異性，其針對單一抗原位點。單克隆抗體的優勢在于其被一種雜交瘤培養物合成，且基本上不會被其他免疫球蛋白污染。修飾詞“單克隆”表明抗體是從抗體基本同源的群體獲得的這一特征，并不是指需要采用任何特定方法來生成抗體。正如前面所提到的，按照本發明使用的單克隆抗體可用Kohler等，《Nature》，256卷，495頁(1975)中最初所述的雜交瘤方法制備。
多克隆抗體是在一種或一種以上的不同抗體存在下產生的抗體。一般來說，多克隆抗體在有其他B淋巴細胞存在的條件下從B淋巴細胞中產生的，其他淋巴細胞產生不同的抗體。多克隆抗體通常由直接免疫動物獲得。
術語“完全人類抗體”指僅包含人類免疫球蛋白序列的抗體。類似地，“小鼠抗體”指僅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗體。
本發明包括“嵌合抗體”——該抗體包含本發明所述抗體的可變區，該可變區與來自于另一個非人類種屬(如小鼠、馬、兔、狗、牛、雞)的抗體區(如恒定區)融合或嵌合。這些抗體可用于調節非人類種屬中Aβ(4-10)的表達或活性。
“人源化抗體”指在其他人類抗體框架內包括非人類CDR的抗體，或是非人類抗體可變區與其他人類抗體恒定區相連的抗體。本發明設計了人源化抗體，該抗體包括來源于非人類種屬的CDR或可變區，該CDR或可變區包含本發明可變區或CDR的氨基酸序列。
根據重鏈恒定域的氨基酸序列的差異，免疫球蛋白可分為不同的類別。至少有5大類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM；其中有數種還可進一步分成亞類(同種型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本發明的抗體分子優選IgG-1或IgG-4。
本發明的抗體也可與諸如99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211AT、212pb、47Sc、109Pd、234Th及40K的放射性同位素標記，及諸如157Gd、55Mn、52Tr和56Fe的非放射性同位素標記偶聯。
本發明的抗體也可與熒光標記或化學發光標記偶聯，所述標記包括熒光團，例如稀土螯合物、熒光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、異硫氰酸鹽、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛、熒光胺、152Eu、丹酰、傘形花內酯、熒光素、魯米那標記物、異魯米那標記物、芳香吖啶酯標記物、咪唑標記物、吖啶鹽標記物、草酸酯標記物、水母素標記物、2，3-二氫二氮雜萘酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記物及穩定自由基。
可采用本領域中已知的任何方法，將本發明的抗體分子與各種成分偶聯，所述方法包括在下列文獻中描述的方法Hunter等人，《Nature》，144卷，945頁(1962)；David等人，《Biochemistry》，13卷，1014頁(1974)；Pain等人，《免疫學方法雜志(J.Immunol.Meth.)》，40卷，19頁(1981)；及Nygren，《組織化學和細胞化學雜志(J.，Histochem.and Cytochem.)》，30卷，407頁，(1982)，在此將其公開的內容以整體引入作為參考。偶聯抗體的方法是常規的，并在本領域內眾所周知。
本發明也涉及基于施用免疫原性組合物的某些治療方法，其中組合物含有Aβ(4-10)或與Aβ肽結合的分子。因此，可以施用含有Aβ(4-10)的抗原，以抑制或加強衰老中或諸如阿爾茨海默氏病的人類疾病中的蛋白斑沉積。
本發明也包括制備、鑒別、純化、鑒定Aβ(4-10)抗原及其類似物的方法，和使用Aβ(4-10)抗原及其類似物的方法。Aβ(4-10)抗原可以通過修飾產生，所述修飾方法包括利用基因工程技術、例如固相肽合成的化學合成方法對從天然來源的大淀粉樣蛋白肽進行蛋白水解切割；或利用基因工程方法或固相肽合成重新生成。
分子生物學依據本發明，可在本領域技術內采用常規的分子生物學、微生物學及重組DNA技術。這些技術已在文獻中得以全面的闡述。例如，可參見Sambrook，Fritsch & Maniatis，《Molecular CloningA LaboratoryManual》，第二版(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(本文稱為“Sambrook等人，1989年”)；《DNA克隆一種實用方法(DNA CloningA Practical Approach)》，第I和II卷(D.N.Glover ed.1985)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》，(M.J.Gait ed.1984)；《核酸雜交(Nucleic AcidHybridization)》[B.D.Hames和S.J.Higgins eds.(1985)]；《轉錄與翻譯(Transcription And Translation)》[B.D.Hames和S.J.Higgins，eds.(1984)]；《動物細胞培養(Animal Cell Culture)》[R.I.Freshney，ed.(1986)]；《固定細胞與酶(Immobilized Cells AndEnzymes)》[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，《分子克隆實用指南(APractical Guide To Molecular Cloning)》，(1984)；F.M.Ausubel等人(eds.)，《分子生物學最新方案(Current Protocols in MolecularBiology)》，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
CRND8小鼠CRND8小鼠是AD動物模型，該模型到3月齡時表現出CNS中Aβ高水平合成和淀粉樣蛋白沉積。參見2001年12月27日公布的國際公開號為No.WO01/97607的專利，在此將其整體引入作為參考。此外，TgCRND8小鼠在淀粉樣蛋白沉積開始的期間表現出認知功能的改變。根據CNS中Aβ淀粉樣蛋白的表達，和組織學分析結果、神經病學及行為學上的缺陷，此轉基因TgCRND8小鼠模型的特征與天然發生的阿爾茨海默氏病表型非常相似。
APP基因發生變異性剪接，從而產生三種常見的同種型。最長的同種型含有770個氨基酸(APP770)，第二長的同種型含有751個氨基酸(APP751)，它們在大部分組織中均有表達。第三個轉錄產物含有695個氨基酸(APP695)，主要在腦內表達。即使在指更短一些的同種型時，傳統上仍使用最長同種型密碼子APP770計數。
TgCRND8轉基因小鼠包含表達腦內特異性APP695突變形式的轉基因，此轉基因同時攜帶了“瑞典”和“印地安那州”的APP突變。
產生了含有K595N/M596L突變(瑞典突變)和V642F突變(印地安那州突變)的APP695cDNA(使用APP695的密碼子計數)。在本文中一般通過更常用的APP770密碼子計數系統提及所述突變及其他突變，即K670N/M671L突變(瑞典突變)和V717F突變(印地安那州突變)這兩個突變。
將雙突變APP695cDNA序列組件插入到粘粒表達載體cosTet中，該載體含有敘利亞倉鼠(Syrian hamster)朊病毒蛋白基因啟動子。然后將載體微注射入小鼠的卵細胞中，以產生命名為TgCRND8的轉基因細胞系。這些小鼠到3月齡時表現出多發性淀粉樣蛋白沉積，此時其空間學習能力的缺陷很明顯。
TgCRND8小鼠與其他帶有AD相關突變的不同轉基因小鼠交配，以產生雙轉基因小鼠，其表現出進一步的、更強的AD相關神經病理學病變。
施用制劑及治療方法本發明也包括了使用Aβ(4-10)抗原來鑒定可干擾Aβ42與蛋白斑結合的藥物的方法。此方面包括藥物篩選測定以鑒定與Aβ42作用相仿和/或互補的藥物。在一個這樣的實施方案中，通過測定含Aβ(4-10)的肽與特定小分子的結合活性來篩選藥物庫。監測有希望的藥物對Aβ42與蛋白斑親和力的影響。如果該藥能夠降低Aβ42與蛋白斑的結合親和性，則成為侯選藥物。可以通過檢測破壞蛋白斑形成、阻礙纖維生成過程或解聚已形成纖維的能力來篩選藥物。
本發明中的抗原、抗體或其他可用化合物，可作為藥用組合物的成分導入。藥用組合物優選為，含有治療量或預防量的帶有藥學有效載體的抗原、抗體或其他化合物中的至少一種。
在制備本方法中有用的藥用組合物時，應當采用可任意配伍的、無毒的藥用載體，所述藥用載體適于將抗原、抗體或其結合片段或治療性化合物輸送至患者，所述治療性化合物根據本文公開的方法鑒定得到。無菌水、乙醇、脂肪、蠟類、惰性固體甚至脂質體均可用作載體。制藥學上可接受的佐劑(緩沖劑、分散劑)也可導入藥用組合物中。因此，抗體及藥用組合物非常利于腸道外施用，即靜脈內、動脈內、肌肉內或皮下施用。但是，鼻內或其他噴霧制劑也可使用。制劑中的化合物如抗體的濃度可以有很大的不同，即按重量計算從約少于0.5％到高達15％或20％，通常至少為1％，其選擇主要基于流體容積、粘性等，基于所選擇的具體施用方式進行優選。制備可施用組合物的實際方法對于本領域的熟練技術人員而言是已知的或顯而易見的，更詳細的描述例如可參見《Remington氏藥物科學(Remington’s Pharmaceutical Science)》，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1990)，在此將其整體引入作為參考。
本發明的免疫原性組合物、抗體或抗原結合片段，以足以在受試者體內調節淀粉樣蛋白沉積(淀粉樣蛋白負荷)的治療有效劑量施用。相對于未治療的受試者，“治療有效劑量”優選為調節淀粉樣蛋白沉積減少至少20％，更優選為至少40％，進一步更優選為至少60％，再進一步更優選至少80％。調節淀粉樣蛋白沉積的方法的能力，可以在能預測人類疾病中調節淀粉樣蛋白沉積能力的模型系統中加以評價，所述模型系統例如本領域內已知的動物模型系統(例如包括在國際公開號為WO 96/28187的PCT(專利合作條約)專利中所描述的方法)，或用體外方法如國際公開號為WO 97/07402的PCT專利中所描述的Chakrabartty方法，或本文所述的TgCRND8模型系統。而且，受試者體內淀粉樣蛋白的含量或分布能夠以無創性的方式在體內加以監測，例如可以使用與淀粉樣蛋白沉積相關的放射性標記示蹤劑，然后用閃爍掃描技術使淀粉樣蛋白成像來監測(例如，可參見Aprile，C.等人，《歐洲核醫學雜志(Eur.J.Nuc.Med.)》，22卷，1393頁(1995)；Hawkins，P.N.，《Baill ieres Clin.Rheumatol.》，8卷，635頁(1994)，及其所引用的文獻)。因此，舉例來說，在經過一段時間的治療后，受試者的淀粉樣蛋白負荷可按本發明的方法加以評價，并與該受試者開始用本發明的治療性化合物治療前的淀粉樣蛋白負荷比較，以確定治療性化合物對受試者中淀粉樣蛋白沉積的影響。
應該認識到，本發明方法調節淀粉樣蛋白沉積或淀粉樣蛋白負荷的能力，可在某些實施方案中通過觀察體內與淀粉樣蛋白沉積或淀粉樣蛋白負荷相關的癥狀或體征加以評價。因此，舉例來說，本發明方法減少淀粉樣蛋白沉積或淀粉樣蛋白負荷的能力，可能與淀粉樣蛋白相關疾病狀態或病情中的臨床表現的可觀察到的改善相關，或者與所述病情癥狀的進展減慢或延緩相關。因此，監測疾病的臨床表現可用于評價本發明所述的方法調節淀粉樣蛋白的療效。
本發明的方法可用于治療與發生淀粉樣蛋白沉積的其他疾病相關的淀粉樣變性。臨床上，淀粉樣變性可以原發的、繼發的、家族性的或單發的。可采用淀粉樣蛋白中的淀粉樣蛋白原性蛋白類型對淀粉樣蛋白進行分類。按照其所鑒定的淀粉樣蛋白原性蛋白，可調節淀粉樣蛋白的非限制性實例如下(淀粉樣蛋白原性蛋白后括號內為相關的疾病)β-淀粉樣蛋白(阿爾茨深入海默癥、唐氏綜合征、遺傳性大腦出血性淀粉樣變性[荷蘭]、腦血管病)，淀粉樣蛋白A(反應性[繼發性]淀粉樣變性、家族性地中海熱、伴發蕁麻疹及耳聾的家族性淀粉樣變性[默-韋綜合征(Muckle-Wells syndrome)])，淀粉樣蛋白κL-鏈或淀粉樣變性λL-鏈(特發性(原發性)，骨髓瘤或巨球蛋白血癥相關的)，Aβ2M(長期血液透析)，ATTR(家族性淀粉樣蛋白多發性神經病[葡萄牙、日本、瑞典]，家族性淀粉樣蛋白心臟病[丹麥]、單發性心臟淀粉樣蛋白、系統性老年淀粉樣變性)，AIPP或胰島淀粉樣多肽(成年起病型糖尿病、胰島瘤)，心房芐氟噻(嗪)因子((atrial naturetic factor)，單發性心房淀粉樣蛋白)、降鈣素原(甲狀腺髓樣瘤)，凝膠溶素(家族性淀粉樣變性[芬蘭])，抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(遺傳性大腦出血性淀粉樣變性[冰島])，AAPOA-I(家族性淀粉樣變性(amyloidotic)多發性神經病[愛荷華州])，AAPOA-II(在小鼠中加速衰老)，纖維原相關的淀粉樣蛋白，溶菌酶相關的淀粉樣蛋白，以及AScr或PrP-27(羊遲發性病毒感染(瘙癢病)、克-雅綜合征、格-施-沙綜合癥(Gerstmann-Straussler-Scheinkersyndrome)、牛海綿狀腦炎)。
具體實施例方式
以示例的而非限制的方式描述以下實施例。
實施例1抗原合成及結構鑒定在此實施例中，發明人說明了如何合成、純化及鑒定合成的Aβ肽免疫原。
用ABIMED EPS-221半自動肽合成儀、NovaSyn(NovaBiochem)PEG移植物多聚體樹脂和Fmoc N端保護方法，按其所述完成下列Aβ肽的合成Aβ42、Aβ40、Aβ30及N端表位肽。參見Mayer-Fligge等人，《肽科學雜志(J.Pept.Sci.)》，4卷，355-363頁(1998)。Fmoc去保護步驟及最終的去保護循環用分光光度計監測。合成的肽用半制備、反相C18μbondapak HPLC(高效液相色譜)柱純化。
然后用血漿解吸附作用(MALDI)及電噴霧(ESI)質譜鑒定純化后合成肽的分子量。只將分子量與預測分子量的肽相同的組分用于隨后的免疫。
用循環兩向色性(CD)評價溶液中肽的二級結構。用JASCO J-500旋光分光計記錄CD譜。參見Mayer-Fligge等人，《J.Pept.Sci.》，4卷，355-363頁(1998)。然后，將Bruker-AMX-600儀器按以前所述進行2D-NMR-NOESY分析來完成NMR研究。Michels等，“糖特異性離子通道蛋白(scry-porin)周質N端多肽域的結構及功能鑒定(Structure andFunctional Characterization of the periplasmis N-terminalpolypeptide domain of the sugar specific ion channel protein(scry-porin))”，《蛋白質科學(Protein Science)》(2002)。
實施例2
用Aβ42免疫CRND8小鼠在此實施例中，發明人表明Aβ42肽在表達APP的轉基因小鼠及非轉基因小鼠中均具有免疫原性。
小鼠TgCRND8小鼠已由Chishti等人，《J.Biol.Chem.》，276卷，21562-21570頁(2001)在別處作了說明，在此將其整體引入作為參考。小鼠在遠親繁殖的C3H/C57BL/6J背景下培養，所述C3H/C57BL/6J在APP695轉錄物上順式過度表達β-APP瑞典及β-APPV717F突變。β-APP瑞典及β-APPV717F基因受敘利亞倉鼠朊病毒基因啟動子的調控。來源于C3H/C57BL(82％/18％)轉基因陽性半合子小鼠與野生型C57BL/6J雜交的TgCRND8小鼠斷奶后，測定基因型以確定β-APP轉基因的存在，并以同一性別每組2～4只小鼠在同一標準的小鼠籠內飼養。小鼠自由供給食物小丸、粉末狀食物及水。所有小鼠在免疫前均管理一周，記錄每次免疫前一天及免疫后兩天的體重。所有試驗組別的性別和體重均匹配。
免疫方案及血清的分離合成的Aβ42及由胰島淀粉樣蛋白多肽(IAPP)肽第8～37個殘基(ATQRLANFLVHSSNNFGAIL-SSTNVGSNTY)(SEQ ID NO52)組成的對照肽在C18μbondapak HPLC柱上通過反相HPLC分開，用質譜及氨基酸分析測定純度。
免疫方案和計劃以前已由Schenk等人，《Nature》，400卷，173-177頁，(1999)作了描述，在此將其內容以整體引入作為參考。接下來，測定血清樣品(200μ血)中的抗體滴度，樣品于13周齡時通過后肢靜脈穿刺，及25周齡于該過程停止時通過心臟穿刺來收集。在這些研究中使用所述血液之前，于56℃孵育30分鐘以滅活補體。在5ml G蛋白柱上分離Ig(免疫球蛋白)組分。將樣品上樣，用PBS洗滌，用0.1M的檸檬酸鈉洗脫，用1M Tris進行緩沖。所有Ig組分在使用前均過濾除菌。
免疫結果從未免疫小鼠(N＝18)和TgCRND8小鼠及其非轉基因同窩出生仔分離血清，其中所述TgCRND8小鼠及其非轉基因同窩出生仔已用Aβ42(n＝34；18只TgCRND8和16只非Tg)或外周淀粉樣蛋白肽(胰島淀粉樣蛋白多肽(IAPP)，免疫過的小鼠數為17，其中10只為TgCRND8，7只為非轉基因(非Tg))，重復免疫超過5個月。所述小鼠對Aβ42(1∶5000-1∶50,000)和IAPP(1∶5000-1∶30,000)表現出顯著的抗體滴度。有趣的是，在TgCRND8小鼠和其非轉基因同窩出生仔中未檢測到抗Aβ42滴度的差異。來自Aβ42所免疫小鼠的血清的每一樣品，均可在來自于20周齡非免疫TgCRND8小鼠的腦組織學切片中染出陽性成熟的Aβ蛋白斑。與此相反，來自對照肽IAPP所免疫小鼠及未免疫小鼠的血清的樣品，不能在來自于20周齡非免疫TgCRND8小鼠的腦組織學切片中染出陽性成熟Aβ斑。因此，所述結果表明可誘導產生能識別含Aβ的神經病理性蛋白斑并與之結合的抗體自身免疫。
實施例3小鼠免疫血清對纖維形成的抑制在此實施例中，如表2所示，本發明人顯示來自大部分Aβ42所免疫小鼠的血清能夠抑制纖維形成。
在14天的孵育期內，低濃度的Aβ肽溶液可自發性裝配成纖維。這些纖維具有特征性的50～70(埃)直徑，其可由下述的電子顯微鏡術監測。
電子顯微檢測Aβ42在水中溶解成10mg/ml濃度的儲備液后直接使用，或聚集成成熟淀粉樣蛋白纖維后使用。在有血清及無血清的條件下，以肽終濃度為100μg/ml孵育Aβ42。將各種血清的序列稀釋液加到Aβ42中，并于室溫(RT)孵育多至2周。對于負染色電子顯微術，將碳包被的聚乙烯醇縮醛網浮于肽的水溶液之上。將網進行印跡并晾干后，樣品用1％(w/v)的磷鎢酸染色。在Hitachi 7000電子顯微鏡下觀察肽聚集物，工作電壓為75V、放大倍數為60,000倍。
電子顯微鏡檢測結果為了評估Aβ免疫的小鼠的血清對Aβ聚集成纖維的影響，血清在存在或不存在Aβ42的條件下如上述條件于37℃孵育多至14天。在第1、3、7、10及14天，使用負染色電子顯微術檢測來自各反應混合物的試樣中是否存在Aβ42。
在無血清或有未免疫的血清時，Aβ42形成特征性的直徑為50～70的長纖維(～7500)。因此，長纖維表明在目前條件下正常血清組分不能抑制纖維形成。有來自IAPP免疫的動物的血清時，很少產生長的Aβ42肽，但形成的纖維具有特征性的50～70直徑。與此相反，如表2所示，雖然有少量血清(n＝7/34)效果甚微或無效，但是大部分Aβ42免疫小鼠的血清(n＝27/34)很大程度上阻止了纖維的形成。而且，來自TgCRND8小鼠或非轉基因同窩出生仔的Aβ免疫血清可等效地抑制Aβ纖維的形成，所述現象表明抗體的總量僅取決于免疫原，而不是內源性Aβ42的負荷。
正如表2所總結的，當在未免疫小鼠血清中孵育時，未檢測到纖維結構的差異。來自用IAPP免疫的小鼠的血清降低了纖維形成的程度，但所形成的纖維與僅由Aβ42形成的纖維類似。最后，來自Aβ42免疫小鼠的血清可不同程度地抑制纖維生成，從完全抑制到僅稍微降低纖維密度均有。見表2。
表2未免疫小鼠、Aβ42免疫小鼠及IAPP免疫血清對纖維形成、纖維解聚和細胞毒性的影響的總結
實施例4免疫血清對已存在纖維的破壞在此實施例中，本發明人顯示來自Aβ42所免疫小鼠的血清使預先形成的Aβ42纖維解聚，但預先形成的Aβ42不受與未免疫對照小鼠血清或來自IAPP免疫小鼠的血清一起孵育的影響。
為了確定來自Aβ42免疫小鼠的血清能否破壞預先形成的Aβ42，將來自Aβ42免疫小鼠的血清與預先形成的Aβ42一起孵育多至30天。有證據證明，通過將高濃度的Aβ42試樣量持續攪拌來生成聚集的Aβ42纖維。預先形成的Aβ42與無血清(僅Aβ)、IAPP免疫血清或未免疫血清(數據未顯示)一起孵育并無解聚效果，即使在孵育30天后也一樣。與此相反，來自Aβ42免疫小鼠的血清(n＝26/34)使Aβ42纖維解聚成直徑30、平均長度為100的短小纖維，或解聚成無定形的聚集物。此解聚僅在孵育后3天就很明顯，到14天時就完成了。此外，解聚呈濃度依賴性，升高抗體濃度可縮短纖維解聚所需時間。最后，由于抗體與Aβ42的1∶1比例不是解聚必需的，所以很可能抗Aβ抗體僅與例如初原纖維寡聚體或其他前體的Aβ種類子集結合。結果用實施例4中所述的電子顯微檢測方法測定，放大倍數為60,000倍。
實施例5小鼠抗血清所識別的Aβ42靶表位的質譜測定在此實施例中，本發明人說明如何精確鑒別在淀粉樣蛋白沉積疾病中具有關鍵生物學意義的表位。
一般圖表為了闡明抗Aβ42血清所識別的表位，在與下面所討論的表位切除和表位提取方法聯用時，采用了使用納米-電噴霧(nESI)和MALDI-離子化的高分辨率傅立葉-轉換離子加旋加速器共振質譜(FT-ICR-MS；Marshall等人，《質譜評論(Mass Spectrom.Rev.)》，17卷，1-35頁(1998))。參見Macht等人，《Biochemistry》，3515，633-15，639(1996)；Suckau等人，《Proc.Natl Acad.Sci.USA》，87卷，9848-9852頁(1990)；Przybylski等人，《通過聯用蛋白質化學和質譜來鑒定三級及超級分子蛋白質結構(Approaches to the characterization of tertiary andsupramolecular protein structures by combination of proteinchemistry and mass spectrometry)》，《生物分子復合物研究的新方法(New Methods for the study of Biomolecular Complexes)》，KluwerAcad.Publ.，Amsterdam，17-43頁(1998)。
在一種已知的表位切除的過程中，我們將完整的固定化的免疫復合物的選擇性蛋白水解切割與結合肽釋放后的質譜肽圖結合。具體地說，將來自Aβ42免疫的TgCRND8小鼠的抗血清、來自IAPP免疫的小鼠的對照抗血清、小鼠(單克隆)和兔(多克隆)Aβ42抗體固定于瓊脂糖-微毛細管中。接下來，將固定化的抗體暴露于Aβ42聚集物，并使其與Aβ42表位結合。可利用各種蛋白酶及外肽酶或酶的組合來實施免疫復合物的表位切割過程。見表2。
另外，可使用表位提取過程。對于表位提取來說，用各種蛋白酶預消化Aβ42，隨后將蛋白酶加工后的Aβ42肽的相應混合物加到抗體柱上，從而使抗體能與表位結合。所述表位在結合肽洗脫時用質譜鑒定。所述過程稱為表位提取。
下面詳細地說明了單個過程抗體固定化在干燥的NHS活化的6-氨基己酸偶聯瓊脂糖(Sigma)中加入100μg偶聯緩沖液(0.2M NaHCO3、0.5M NaCl，pH8.3)，偶聯反應于20℃進行60分鐘。然后將瓊脂糖物質轉到100μm微毛細管柱上，該柱允許充分沖洗而不丟失物質。參見Macht等人，《Biochemistry》，3515，633-15，639(1996)。按其所述，該柱可交替地用阻斷緩沖液(氨基乙醇/NaCl)和洗滌緩沖液(NaAc/NaCl)沖洗，該柱最終儲存于4℃、pH7.5的PBS中。參見Macht等，Biochemistry 3515，633-15，639(1996)。
表位切割表位切割過程實施時，首先將2～5μg Aβ42或其他Aβ抗原上樣到抗體微柱上，于20℃輕輕振搖孵育60分鐘。每次用4ml PBS連續洗滌5次(5×4ml PBS)后，在柱上于37℃使用溶于200μl PBS中的0.2μg蛋白酶進行2小時的蛋白酶消化處理。蛋白酶包括胰蛋白酶、Lys-C蛋白酶、Asp-N-蛋白酶、α-糜蛋白酶和Glu-C蛋白酶。用5×4ml PBS洗去未結合的及消化了的肽或上清液。接下來，加入500μl 0.1％(v/v)TFA(表位洗脫液)將抗體所結合的肽解離并進行洗脫。將表位洗脫組分于20℃孵育15分鐘后凍干，并在10μl 0.1％TFA中重構用于質譜分析。進行額外的外肽酶消化過程時，將所述表位與0.1μg氨肽酶M或羧肽酶Y孵育30分鐘，然后用5×4ml PBS洗滌。
表位提取除了將蛋白裂解消化混合物上樣到抗體柱并在20℃孵育60分鐘的條件不同以外，表位提取過程采用與表位洗脫相同的方法完成。隨后，用5×4ml PBS洗滌除去未結合的肽(上清)。接下來加入500μl 0.1％(v/v)TFA(表位洗脫液)，使抗體結合的表位解離并洗脫下來。將表位洗脫組分于20℃孵育15分鐘后凍干，并在10μl 0.1％的TFA中重構用于質譜分析。
蛋白裂解消化對游離抗原進行蛋白裂解消化，其條件如下用50mM NH4HCO3溶解5-50μg肽，底物對蛋白酶比率為50∶1，在37℃孵育2小時。將反應混合物凍干用于質譜分析，或制備用于表位提取。所用蛋白酶為胰蛋白酶(Promega，Madison)、Lys-C、Asp-N、Glu-C(Roche-BoehringerMannheim)、α-糜蛋白酶、氨肽酶M及羧肽酶Y(Sigma)。
質譜用裝有7T超導磁鐵和ICR分析儀比色皿的Bruker(Bruker Daltonik，Bremen，FRG)Apex II FTICR光度計進行FTICR-MS。參見Bauer等人，《生物化學年報(Anal.Biochem.)》，298卷，25-31頁(2001)。對帶有脈沖振動Apollo-nano-ESI-source的MALDI-FTICR、儀器條件和質量校正先前已有描述。參見Fligge等人，《Biochemistry》，39卷，8491-8496頁(2000)。質量測定可以精確到約1ppm(MALDI)，通常質量分辨率為約200,000時可精確到0.5-1ppm(ESI)。將2，5二羥苯甲酸(DHB)作為MALDI-MS樣品制備的基質。參見Bauer等人，《Anal.Biochem.》，298卷，25-31頁，(2001)。ESI-MS通常用水性0.01％TFA溶液進行。參見Fligge等人，《Biochemistry》，39卷，8491-8496頁(2000)。
質譜結果使用固定于瓊脂糖微毛細管的抗體進行表位切割和提取，并用ESI質譜和MALDI-FTICR質譜進行分析。參見Macht等人，《Biochemistry》，35卷，15633-39頁(1996)；Fligge等人，《Biochemistry》，39卷，8491-8496頁(2000)；參見Bauer等人，《Anal.Biochem.》，298卷，25-31頁(2001)；Przybylski等人，《通過聯用蛋白質化學和質譜來鑒定三級及超級分子蛋白結構(Approaches to the characterization oftertiary and supramolecular protein structures by combination ofprotein chemistry and mass spectrometry)》，《生物分子復合物研究的新方法(New Methods for the study of Biomolecular Complexes)》，Kluwer Acad.Publ.，Amsterdam，17-43頁(1998)。首先，游離Aβ42抗原的胰蛋白酶肽混合物的MALDI-MS顯示了所有預期的Aβ蛋白分解肽，這些肽包括肽分子量(Da)1.Aβ(1-16)1954.88922.Aβ(6-16)1336.60303.Aβ(17-28)1325.67354.Aβ(29-42)1268.78045.Aβ(17-42)2575.4164使用Lys-C和胰蛋白酶消化進行表位切割，洗脫出單一肽片段，該片段使用MALDI-FTICR檢測時產生單一的離子類型Aβ(4-10)1954.8806。在該情況下，Aβ的R5殘基被Lys-C和胰蛋白酶消化屏蔽掉了。
金黃色葡萄球菌(S.Aureus)的Glu-C蛋白酶表位切割物洗脫出肽片段Aβ(1-11)1324.5395Da。
α-糜蛋白酶及氨肽酶M切割后的表位提取物洗脫物的ESI質譜及MALDI質譜分析，產生片段Aβ(1-10)1195.4968Da和Aβ(4-10)880.3827Da。
利用抗體所結合的糜蛋白酶片段及Aβ(1-10)免疫復合物的氨肽酶M消化物測定核心表位。此雙消化物將Aβ(4-10)FRHDSGY鑒定為具有與Aβ42相當的親和力的最小表位。因為與Aβ42相比，利用羧肽酶A從Y10上進一步消化C端得到的肽的親和力顯著降低，所以C端的氨基酸為Y10。
表3列出了利用抗Aβ抗體和Aβ肽的表位切割及提取過程的質譜所獲得的肽片段。當Aβ42肽(表3，第1行)用胰蛋白酶預消化時，從抗體結合部位獲得的肽與表3第1行所示的序列一致。聯用胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶鑒定出相同的16殘基肽(表3，第2行)。當蛋白酶為金黃色葡萄球菌Glu-C蛋白酶，并在表位切割中使用該酶時，從抗體結合部位洗脫出11殘基的肽，如第3行所示。僅用α-糜蛋白酶消化則觀察到10殘基的肽(表3，第4行)。如表3第5行所示，當用α-糜蛋白酶和氨基肽酶M實施蛋白酶消化時觀察到7個殘基的肽。
表3 質譜所鑒別的肽
總結MALDI-MS及ESI-MS分析鑒定出一段包含N端序列的線性肽，Aβ(1-10)是表位切割時唯一的特異性產物。見表3和表4。游離Aβ42抗原的胰蛋白酶消化物的質譜產生所有預期的肽(1-16)、(6-16)、(17-28)和(29-42)。見表3和表4。用胰蛋白酶和Lys-C蛋白酶進行表位切割產生單一的肽(1-16)。Glu-C蛋白酶和α-糜蛋白酶僅分別產生片段(1-11)和(1-10)。見表3和表4。與此相反，用這些酶消化時，R5、E3和F4殘基分別免受消化。用外肽酶進一步消化抗體所結合的內切蛋白酶片段，以確定核心表位。糜蛋白酶片段的氨基肽酶M消化鑒定出Aβ(4-10)；FRHDSGY為與Aβ42具有相當親和力的最小表位，然而從Y10進一步C端消化(羧肽酶A)時，肽的親和力顯著降低。質譜表位切割試驗中獲得的親和力差異，與ELISA測定的合成表位肽親和力完全一致，其中所述合成表位肽在N端通過烷酰胺間隔基團生物素化。參見Gitlin等人，《Biochem.J.》，242卷，923-926頁(1987)；Craig等人，《Anal.Chem.》，68卷，697-701頁(1996)。通過單一同位素分子離子的高測定精確度(0.5-2ppm)，得以明確鑒定表位。此外，通過將選定分子離子在FTICR譜中用IR-多光子激光解離進行序列特異性片段化，以及使用突變及同源Aβ42肽的對照試驗(數據未顯示)，使所述結果得到確認。參見Fligge等人，《Biochemistry》，39卷，8491-8496頁(2000)。因此，含有R5G和Y10F雙突變的大鼠Aβ42，在表位切割時不產生洗脫產物。相反，人Aβ(1-40)和Aβ(1-30)提供了與Aβ42相同的表位(4-10)。來自IAPP免疫小鼠的對照抗體未產生可檢測到的表位肽。見表3和表4。
表4.Aβ42免疫血清及IAPP免疫血清的表位切割/提取質譜數據總結鑒定得到的肽c表位實蛋白酶bAβ42抗血清的 洗脫 IAPP抗血清c的 洗脫驗a上清組分 上清組分切割 Lys-C 17-28 29-42 1-16 1-16 17-28-d29-42胰蛋白酶17-28 29-42 1-16 1-5 6-16 17-28-29-42Glu-C 12-22 23-42 1-11 4-11 12-22-23-42Asp-N 23-422-22 2-22 23-42 -提取 胰蛋白酶1-5 6-16 1-16 1-5 6-16 17-28 -17-28 29-4229-42α-糜蛋白酶 5-10 11-20 1-10 1-4 5-10 11-20 -21-42 21-42α-糜蛋白酶/1-4 5-10 4-10 未檢測 -
氨基肽酶-M 11-20e胰蛋白酶/氨 6-16 7-16e4-16 未檢測 -基肽酶-Ma表位切割及提取(參見《方法》及內容)b《方法》中給定的蛋白酶濃度；氨基肽酶M，微粒體氨基肽酶。
c上清及用TFA洗脫的表位組分中鑒別出的主要肽的序列d沒有可檢測到的Aβ序列的結合e只給出了N端肽實施例6Aβ肽的結構鑒定在本實施例中，發明者比較了鑒定得到的合成的表位肽的親和力與用于固定抗體的Aβ42的親和力，并鑒定了溶液中合成的表位肽的二級結構。
采用相應真實肽、生物素-Gly-Gly-Aβ(1-10)及生物素-Aβ(4-10)的合成肽、二級結構分析及免疫分析進一步鑒定由質譜鑒定的表位。首先，使用ELISA及表位肽的點印跡分析評估各種肽的抗Aβ抗體親和力(數據未列出)。結果表明，表3中所示的所有肽表現出與Aβ42相當的親和力。
為了評價活性表位可能的構象效應，將肽N端的二級結構與以前所報道的Aβ40和Aβ42的結構加以對比。N端、極性肽Aβ(1-10)和Aβ(1-16)的CD及2D NMR-NOESY譜(數據未列出)表明無任何明確的Aβ片段的溶液結構。但是，這些數據提示表位對于抗體識別具有一定的柔性。這與Aβ42序列的二級結構預測結果一致，該Aβ42序列能夠阻斷在Aβ(4-10)表位區域周圍形成α螺旋的傾向性。與此相反，在包含跨膜區(Aβ(18-42)的序列中觀察到形成α螺旋的傾向性及螺旋-卷曲/β折疊構象的轉變。參見Coles等人，《Biochemistry》，37卷，11064-11077頁(1998)；Kohno等人，《Biochemistry》，35卷，16094-16104頁(1996)。
實施例7
血清對Aβ所誘導的毒性的影響在本實施例中，發明者評估了Aβ免疫的血清抑制Aβ42所誘導的細胞毒性的能力。
綜合計劃為了探討Aβ免疫后TgCRND8小鼠記憶缺陷的預防，是否可以反映對Aβ細胞的毒性的類似影響，發明人用PC-12細胞進行標準的Aβ42細胞毒性測定。參見McLaurin等人，《J.Biol.Chem.》，275卷，18495-502頁(2000)；Pallitto等人，《Biochemistry》，38卷，3570-78頁(1999)。首先，在有血清或沒有血清的條件下，將PC-12細胞與Aβ42一起孵育24小時。然后使用Alamar藍檢測方法(Ahmed等人，《J.Immunol.Methods》，170卷，211-24頁(1994))和存活/死亡檢測方法(Pike等人，《J.Biol.Chem.》，270卷，23895-98頁(1995))來鑒定細胞毒性，其中，所述Alamar藍檢測方法顯示代謝活性，存活/死亡檢測方法同時指示細胞內酯酶活性及質膜完整性。
Aβ毒性的測定將PC-12細胞以每孔500個細胞的密度接種到96孔板中，并懸浮于用N2/DMEM(Gibco/BRL，Rockville，MD)稀釋的30ng/ml的NGF(AlamoneLabs，以色列)中。使細胞分化5-7天，使其細胞數達到每孔10,000-15,000個。在將Aβ加到培養物中前，將其于室溫在溶液(25微摩爾)中維持3天，以誘導纖維生成。如電子顯微檢測所測定的(數據未列出)，該Aβ制備物含有大量聚集的寡聚體，該寡聚體包括ADDLs及原纖維(到目前為止鑒定為具神經毒性的Aβ種類)。參見Lambert等人，《J.Neurochem.》，79卷，595-605頁(2001)；Walsh等人，《J.Biol.Chem.》，274卷，25945-52頁(1999)；Hartley等人，《J.Neuroscience》，19卷，8876-8884頁(1999)。此外，蛋白質印跡分析證明，Aβ42免疫的血清能夠識別Aβ42單體、四聚體、六聚體及超過98kDa的更大寡聚體(數據未列出)。在預孵育3天后，將Aβ以終濃度為0.1μg/μl加到細胞培養物中，于37℃繼續孵育24小時。然后，用存活/死亡測定方法(MolecularProbes，Eugene，OR)及Alamar藍測定法(Biosource Inc，Camarillo，CA)測定毒性。
結果來自未免疫或IAPP免疫的小鼠的血清對Aβ的毒性無影響。相反，從Aβ42所免疫小鼠分離的血清，以濃度依賴性方式預防Aβ42的細胞毒性，但是在效果的程度方面具有顯著變化。在所述測定中，與Aβ42誘導的毒性相比，n＝18/22，p＜0.01及n＝4/22，p＜0.001。對每一個體的血清，繪制細胞存活與纖維解聚的相關曲線，并發現血清抑制毒性的效果與使纖維解聚的效果直接相關。而且，抑制纖維形成/解聚方面最有效的抗體，在降低毒性時也最有效(與無活性血清相比，第3天p＜0.001，第7天p＜0.0001)。
預防細胞毒性所需的抗體對Aβ的化學計量學可提供對作用機制的深刻理解。為了測定激發細胞毒性抑制作用所需的抗體對Aβ的化學計量學，我們檢測了10份反應血清的EC50。EC50為1∶100-1∶300，平均值±標準差為234±39，將EC50定義為使Aβ誘導的毒性降低50％所需的血清量。結果發現在抗體對Aβ比值較低(為50∶1)時，檢測到保護性效果，該結果提示抗體與諸如Aβ寡聚體、原纖維或前體蛋白片段的低豐度Aβ種類結合，而不是與單體Aβ或Aβ聚集物結合。而且，活性血清在所有受試劑量中均使Aβ細胞毒性顯著降低，該現象提示細胞死亡由血清特異性阻斷的過程所誘導。使用單因素方差分析完成統計分析，其中Fischer的PLSD的*p＜0.01，p＜0.001。
實施例8介導保護作用的血清組分在本實施例中，發明者顯示如何測定降低Aβ細胞毒性的血清組分。發明者發現，活性組分在來自于血清的純化IgG組分中，其他血清組分均不能抑制Aβ介導的細胞死亡。
為了驗證Aβ免疫是由Aβ誘導的抗體所引起，而不是其他作用如其他血清蛋白的表達的繼發性變化。因此，為了確認只有抗體選擇性靶向Aβ(4-10)表位是有效的，發明人使用來自Aβ42免疫血清的純化IgG組分進行了細胞毒性實驗。此外，還包括了對Aβ特定表位具有特異性的市售單克隆抗體4G8、6E10及Bam10。
結果是無可置疑的。從Aβ42免疫血清純化的免疫球蛋白G顯示了與未加工血清相同的毒性抑制作用，該結果提示血清的其他組分對保護性反應沒有作用。此外，這些IgG組分抑制Aβ纖維形成及誘導Aβ纖維解聚的程度與全血清相同。分別識別Aβ序列17-24及11-17的抗體4G8和6E10不能抑制纖維形成，但確實能降低總纖維的含量。后一效應的出現可能是因為這些抗體會與溶液中的一小部分游離Aβ肽結合，從而阻止其形成纖維。與此相反，識別Aβ(1-10)中一段序列的Bam10抗體與Aβ42免疫的血清類似，都能夠抑制纖維形成。這些結果進一步證明，只有識別Aβ序列N末端的抗體才是有效的纖維生成抑制劑，且Aβ42免疫的血清中活性成分為特異性IgG。
實施例9-27抗原設計表5中所示肽及實施例9-27按如下式I設計I.(A)n--(Th)m--(B)o--Aβ(4-10)--(C)p其中Aβ(4-10)只存在一個拷貝，n為0，m為1，o為2，B為甘氨酸，C為甘氨酸，p為1，而T細胞輔助表位為SEQ ID NO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21中的任何一個。這些含有抗原的組合的B細胞及T細胞表位對應于SEQ ID NO25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42及43。
表5 Aβ肽抗原
<p>表4
與SEQ ID NO45一致的、實施例29中所示的肽(表5)是一個實例，其中n為0，m為1，o為0，T細胞表位通過肽鍵直接與B細胞相連，C為甘氨酸，p為1，而T細胞輔助表位為SEQ ID NO21。含抗原的組合的B細胞及T細胞表位與SEQ ID NO45所示的肽一致。
實施例30抗原設計與SEQ ID NO46一致的、實施例30中所示的肽(表5)是一個實例，其中n為0，m為1，o為0，T細胞表位通過肽鍵直接與B細胞相連，C為甘氨酸，p為1，而T細胞輔助表位為SEQ ID NO21。含抗原的組合的B細胞及T細胞表位與SEQ ID NO46所示的肽一致。
實施例31-33抗原設計實施例31-33(表5)中所示的肽按如下式II設計II.(A)n--Aβ(4-10)--(B)o--(Th)m--(C)p其中Aβ(4-10)只存在一個拷貝，n為2，m為1，o為2，A和B為甘氨酸，p為0，而T細胞輔助表位為SEQ ID NO21。這些含抗原的組合的B細胞及T細胞表位與SEQ ID NO47、48及49一致。
實施例34和35抗原設計實施例34(表5)中所示的肽按如下式II設計II.(A)n--Aβ(4-10)--(B)o--(Th)m--(C)p其中Aβ(4-10)只存在一個拷貝，n為0，m為1，在實施例34中o為2，在實施例35中o為1，B為甘氨酸，p為0，而T細胞輔助表位為SEQID NO21。這些含抗原的組合的B細胞及T細胞表位與SEQ ID NO50和51一致。
實施例36合成設計的肽利用人工固相肽合成及Symphony肽合成儀，使用Fmoc保護的RinkAmide MBHA樹脂、Fmoc(9-芴甲氧羰基)保護的氨基酸、溶于N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中并用N-甲基嗎啉(NMM)活化的聯苯并三唑-1-基-N，N，N’，N四甲基脲六氟磷酸(HBTU)，以及哌啶除去Fmoc基團保護，在100微摩爾水平上合成按SEQ ID NO25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及51所設計的肽和對照肽，即胰島淀粉樣蛋白多肽(IAPP)(SEQID NO52)(第一步)。需要時，以人工方式實施Lys(Aloc)基團的選擇性去保護，該步驟通過用溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)的3當量Pd(PPh3)4溶液處理樹脂2小時來完成(第二步)。用CHCl3(6×5mL)、二氯甲烷(DCM)中的20％HOAc(6×5mL)、DCM(6×5mL)以及DMF(6×5mL)洗滌樹脂。在某些情況下，在加入一個AEEA(氨基乙氧基乙氧基醋酸(aminoethoxyethoxyacetic acid))基團、加入醋酸或加入3-順丁烯二酰亞丙酸(MPA)時，所述合成過程能夠重新自動化(第三步)。用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷及5％酚進行樹脂的切割及產物的分離，然后用干冰冷卻的乙醚進行沉淀(第4步)。產物利用Varian(Rainin)制備型二元HPLC系統通過制備型反相HPLC進行純化使用Phenomenex Luna10μ苯基-己基、21mm×25cm柱及214和254nm UV檢測器(Varian DynamaxUVD II)，用30％-55％梯度洗脫液B(H.sub.2 0(A)中的0.045％TFA及CH3CN(B)中的0.045％TFA)以9.5mL/min的速度洗脫180分鐘。采用裝有二極管矩陣檢測儀的惠普(Hewlett Packard)LCMS-1100系列分光光度計以及電噴霧離子化的RP-HPLC質譜測定純度及分子量，其結果為95％。
實施例37用按照式I及II設計的肽抗原免疫CRND8小鼠實施例2中所述的TgCRND8小鼠，斷奶并測定基因型以確定β-APP轉基因的存在，并在標準小鼠籠中以相同性別每組2-4只小鼠飼養。小鼠自由供給食物小丸、粉末狀食物及水。所有小鼠在免疫前均管理一周，記錄每次免疫前一天及免疫后兩天的體重。所有試驗組別的性別和體重均匹配。
免疫方案及血清的分離將與SEQ ID NO25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及51一致的合成肽及對照肽，即胰島淀粉樣蛋白多肽(IAPP)(SEQ ID NO52)，用于免疫轉基因CRND8小鼠。免疫方案和日程以前已由Schenk等人，在《Nature》，400卷，173-177頁(1999)中作了描述，在此將其內容以整體引入作為參考。每組注射所用的每種肽均從凍干粉新鮮制備。免疫時，取每種肽2mg加入含0.9ml去離子水的單獨容器內，將混合物混懸以將溶液混合。然后向每種肽溶液中加入100μl 10×磷酸緩沖鹽(PBS)(1×PBS為0.15M NaCl、0.01磷酸鈉，pH7.5)。將各溶液再次混懸，于37℃靜置過夜。首次免疫時，所述肽以1∶1(v/v)比率用完全弗氏佐劑乳化，隨后的增強免疫時用不完全弗氏以相同比率乳化。第一次增強免疫在起始免疫兩周后進行，以后每月一次。給每只動物每次注射約100μg抗原。每個免疫組含6-10只小鼠。接下來，測定血清樣品(200μl血)中的抗體滴度。血清樣品于13周齡時通過后肢靜脈穿刺，及25周齡于該過程停止時通過心臟穿刺來收集。樣品在用于研究之前，于56℃孵育30分鐘以滅活補體。在5-ml G蛋白柱上分離Ig組分。將樣品上樣，用PBS洗滌，用0.1M的檸檬酸鈉洗脫用1M Tris緩沖。所有Ig組分在使用前均過濾除菌。
免疫結果從用與SEQ ID NO25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及51一致的合成肽及對照肽胰島淀粉樣蛋白多肽(IAPP)(SEQ ID NO52)免疫的小鼠，和未免疫的TgCRND8小鼠及其非轉基因同窩出生仔中分離血清。
大部分小鼠均產生了對Aβ42免疫原或對IAPP的明顯滴度。有趣的是，在TgCRND8轉基因小鼠和其非轉基因同窩出生仔中未檢測到抗Aβ42滴度差異。來自于Aβ42所免疫小鼠的血清，能夠在來自于20周齡非免疫TgCRND8小鼠的腦組織學切片染上陽性成熟Aβ蛋白斑。與此相反，來自于對照肽IAPP所免疫小鼠和未免疫小鼠的血清，不能在來自于20周齡非免疫TgCRND8小鼠的腦組織學切片染上陽性成熟Aβ蛋白斑。因此，所述結果表明，可以誘導能夠識別含有Aβ的神經病理性蛋白斑并與之結合的抗體自身免疫。
實施例38小鼠免疫血清對纖維形成的抑制正如實施例3中所述，經過14天的孵育期后，Aβ肽將自發地聚集成纖維，這些纖維具有特征性的50-70的直徑，其可由下面所述的電子顯微鏡檢測術監測。
電子顯微鏡檢測Aβ42在溶解于水形成10mg/ml的儲備液后直接使用，或聚集成成熟淀粉樣蛋白纖維后使用。在有血清及無血清、對照肽、胰島淀粉樣蛋白多肽(IAPP)的條件下孵育Aβ42，肽終濃度為100μg/ml，其中血清來自于用與SEQ ID NO25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及51一致的肽抗原免疫的小鼠。將各種血清的系列稀釋液加到Aβ42中，并于室溫(RT)孵育多達2周。對于負染色電子顯微術來說，碳包被的聚乙烯醇縮醛網浮于肽的水溶液之上。將網進行印跡并晾干后，樣品用1％(w/v)的磷鎢酸染色。在日立(Hitachi)7000電子顯微鏡下觀察肽聚積物，工作電壓為75V、放大倍數為60,000倍。
電子顯微鏡檢測結果為了評估免疫小鼠的血清對Aβ聚積成纖維的影響，在存在或不存在Aβ42的條件下、如上所述條件將血清于37℃孵育多達14天。在第1、3、7、10及14天利用負染色電子顯微術檢驗來自等份的各反應混合物中是否存在Aβ42。
無血清或有未免疫血清時，Aβ42形成長纖維(約7500)，具有特征性的50-70的直徑。存在來自于IAPP免疫動物的血清時，產生的長Aβ42肽減少了，但形成的纖維確實具有特征性的50-70的直徑。相反，來自于與含有B細胞表位Aβ(4-10)的SEQ ID NO25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及51一致的肽抗原所免疫小鼠的血清中，雖然有少量血清效果甚微或無效，但是大部分免疫小鼠的血清能夠極大地阻止纖維形成。
此外，當用未免疫小鼠的血清進行孵育時，未檢測到纖維結構的差異。來自于用IAPP免疫的小鼠的血清降低了纖維形成的程度，但所形成的纖維與僅由Aβ42形成的纖維類似。最后，來自用SEQ ID NO25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50及51一致的肽抗原所免疫小鼠的血清可不同程度地抑制纖維生成。
序列信息
Aβ421 510152025 30(APP-672) D A E F R H D S G Y E V H H Q K L V F F A E D VG S N K G A31 3540I I G L M V G G V V I A-(APP-713)
序列表<110>多倫多大學董事局<120>治療阿爾茨海默氏病的免疫學方法及組合物<130>P04CA104563<140>PCT/CA03/00502<141>2003-04-07<150>US 60/373,914<151>2002-04-19<160>52<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>7<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr1 5<210>2<211>42<212>PRT<213>智人<400>2Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>3<211>15<212>PRT<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<400>3Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp1 5 10 15
<210>4<211>30<212>PRT<213>百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)<400>4Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu Ala1 5 10 15Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr20 25 30<210>5<211>17<212>PRT<213>破傷風梭菌(Clostridium tetani)<400>5Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu1 5 10 15Leu<210>6<211>22<212>PRT<213>破傷風梭菌<400>6Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys1 5 10 15Val Ser Ala Ser His Leu20<210>7<211>15<212>PRT<213>百日咳博德特氏菌<400>7Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu1 5 10 15<210>8<211>27<212>PRT<213>破傷風梭菌
<400>8Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu1 5 10 15Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys20 25<210>9<211>24<212>PRT<213>百日咳博德特氏菌<400>9Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala1 5 10 15Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu20<210>10<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>10Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val1 5 10 15<210>11<211>20<212>PRT<213>麻疹病毒<400>11Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp1 5 10 15Thr Glu Ser Tyr20<210>12<211>17<212>PRT<213>破傷風梭菌<400>12Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys1 5 10 15
Thr<210>13<211>16<212>PRT<213>破傷風梭菌<400>13Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn His Val1 5 10 15<210>14<211>25<212>PRT<213>霍亂弧菌(Vibrio cholerae)<400>14Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala1 5 10 15Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser20 25<210>15<211>23<212>PRT<213>白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)<400>15Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser1 5 10 15Ile Leu Pro Gly His Gly Cys20<210>16<211>39<212>PRT<213>白喉棒桿菌<400>16Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala1 5 10 15Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala20 25 30Thr Asn Phe Val Glu Ser Cys35
<210>17<211>21<212>PRT<213>惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)<400>17Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe1 5 10 15Asn Val Val Asn Ser20<210>18<211>17<212>PRT<213>曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)<400>18Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg1 5 10 15His<210>19<211>14<212>PRT<213>大腸埃希氏菌(Escherichia coli)<400>19Gly Leu Gln Gly Lys His Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly1 5 10<210>20<211>19<212>PRT<213>大腸埃希氏菌<400>20Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val Glu1 5 10 15Asp Val Asn<210>21<211>20<212>PRT
<213>大腸埃希氏菌<400>21Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser1 5 10 15Asn Ala Asn Lys20<210>22<211>16<212>PRT<213>智人<400>22Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15<210>23<211>11<212>PRT<213>智人<400>23Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu1 5 10<210>24<211>10<212>PRT<213>智人<400>24Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr1 5 10<210>25<211>25<212>PRT<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>嵌合序列(chimeric sequence)<400>25Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Gly1 5 10 15
Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25<210>26<211>40<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>26Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu Ala1 5 10 15Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly20 25 30Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly35 40<210>27<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>27Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu1 5 10 15Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25<210>28<211>32<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>28Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys1 5 10 15
Val Ser Ala Ser His Leu Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25 30<210>29<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>29Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gly1 5 10 15Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25<210>30<211>37<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>30Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu1 5 10 15Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys Gly Gly Phe Arg His20 25 30Asp Ser Gly Tyr Gly35<210>31<211>34<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>31Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala1 5 10 15
Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly20 25 30Tyr Gly<210>32<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>32Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Gly1 5 10 15Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25<210>33<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>33Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp1 5 10 15Thr Glu Ser Tyr Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25 30<210>34<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>嵌合序列<223>
<400>34Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys1 5 10 15
Thr Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25<210>35<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>35Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn His Val1 5 10 15Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25<210>36<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>36Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala1 5 10 15Thr Thr Gly Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Gly Gly Phe Arg His Asp20 25 30Ser Gly Tyr Gly35<210>37<211>33<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>37Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser1 5 10 15
Ile Leu Pro Gly His Gly Cys Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr20 25 30Gly<210>38<211>49<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>38Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala1 5 10 15Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala20 25 30Thr Asn Phe Val Glu Ser Cys Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr35 40 45Gly<210>39<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>39Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe1 5 10 15Asn Val Val Asn Ser Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25 30<210>40<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列
<400>40Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg1 5 10 15His Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25<210>41<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>41Gly Leu Gln Gly Lys His Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly Gly Gly1 5 10 15Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20<210>42<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>42Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val Glu1 5 10 15Asp Val Asn Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25<210>43<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>43Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser1 5 10 15
Asn Ala Asn Lys Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25 30<210>44<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>44Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser1 5 10 15Asn Ala Asn Lys Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25<210>45<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>45Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser1 5 10 15Asn Ala Asn Lys Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly20 25<210>46<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>46Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser1 5 10 15Asn Ala Asn Lys Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr20 25
<210>47<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>47Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Glu Thr Gly1 5 10 15Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys20 25 30<210>48<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>48Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn1 5 10 15Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys20 25 30<210>49<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>49Gly Gly Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln1 5 10 15His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys20 25<210>50<211>29<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>50Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln1 5 10 15His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys20 25<210>51<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>嵌合序列<400>51Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His1 5 10 15His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys20 25<210>52<211>30<212>PRT<213>智人<400>52Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe1 5 10 15Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr Tyr20 25 30
權利要求
1.下式所示的肽(A)n--(Th)m--(B)o--Aβ(4-10)--(C)p其中A、B及C均為氨基酸殘基或氨基酸殘基序列；其中n、o及p為0到20的相互獨立的整數；Th為相互獨立地包含輔助性T細胞表位或其免疫增強類似物或片段的氨基酸殘基序列；當o等于0時，Th通過肽鍵直接與B細胞表位相連而不含任何間隔殘基；其中m為1到5的整數；和Aβ(4-10)為SEQ ID NO1或其包含保守氨基酸替換的類似物。
2.如權利要求1所述的肽，其中Th選自以下序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ IDNO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ IDNO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ IDNO20或SEQ ID NO21。
3.如權利要求1所述的肽，該肽選自以下序列SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35、SEQ ID NO36、SEQ ID NO37、SEQ ID NO38、SEQ ID NO39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41、SEQ ID NO42、SEQ ID NO43、SEQ ID NO44、SEQ ID NO45或SEQ ID NO46。
4.一種肽組合物，該肽組合物包含兩個或兩個以上的下式所示的肽的混合物(A)n--(Th)m--(B)o--Aβ(4-10)--(C)p其中A、B及C均為氨基酸殘基或氨基酸殘基序列；其中n、o及p為0到20的相互獨立的整數；Th為包含輔助性T細胞表位或其免疫增強類似物或片段的氨基酸殘基序列；當o等于0時，Th通過肽鍵直接與B細胞表位相連而不含任何間隔殘基；其中m為1到5的整數；和Aβ(4-10)為SEQ ID NO1或其包含保守氨基酸替換的類似物。
5.用于誘導產生與淀粉樣β肽(SEQ ID NO2)特異性結合的抗體的免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含(a)抗原，該抗原包含提供有效量T細胞輔助作用的T細胞表位和由肽Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)構成的B細胞表位；和(b)佐劑。
6.如權利要求5所述的組合物，其中T細胞表位選自(a)一個或一個以上的T細胞表位，其位于同一蛋白質骨架上的B細胞表位的N端，(b)一個或一個以上的T細胞表位，其位于同一蛋白質骨架上的B細胞表位的C端，或(c)一個或一個以上的T細胞表位，其位于不同的蛋白質骨架上，該蛋白質骨架通過共價鍵與含有所述B細胞表位的蛋白質骨架相連。
7.如權利要求5所述組合物，其中所述T細胞表位具有選自以下序列的氨基酸序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20或SEQ ID NO21。
8.如權利要求5所述組合物，其中所述佐劑包含選自以下一種或多種物質氫氧化鋁、磷酸鋁、皂甙、奎樂A、奎樂A/免疫刺激復合物、二甲基雙十八烷基溴化銨/艾衛定、聚陰離子、弗氏完全佐劑、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-異谷酰胺、N-乙酰胞壁酰基-L-蘇氨酰基-D-異谷酰胺、弗氏不完全佐劑或脂質體。
9.一種治療患有阿爾茨海默氏病的個體的方法，該方法包括將如權利要求5-8中任一項所述有效量的免疫原性組合物施用于所述個體。
10.一種減少患有阿爾茨海默氏病的個體的腦內淀粉樣蛋白沉積量的方法，該方法包括將如權利要求5-8中任一項所述的有效量免疫原性組合物施用于所述個體。
11.一種使患有阿爾茨海默氏病的個體的腦內淀粉樣蛋白纖維解聚的方法，該方法包括將如權利要求5-8中任一項所述的有效量免疫原性組合物施用于所述個體。
12.能與肽Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)結合的分離的抗體或其抗原結合片段。
13.如權利要求12所述的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段抑制淀粉樣蛋白的沉積。
14.如權利要求12所述的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段使淀粉樣蛋白纖維解聚。
15.一種治療患有阿爾茨海默氏病的個體的方法，該方法包括將識別肽Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)并與之結合的有效量抗體組合物施用于所述個體。
16.如權利要求15所述方法，其中所述抗體組合物包含多克隆抗體。
17.如權利要求15所述方法，其中所述抗體組合物包含單克隆抗體。
18.檢測化合物是否為淀粉樣蛋白沉積及纖維形成的抑制劑的方法，該方法包括(i)將化合物與肽Aβ(4-10)(SEQ ID NO1)接觸；和(ii)檢測化合物與該肽的結合。
19.如權利要求18所述方法，該方法還包括評價所述化合物是否在體外抑制淀粉樣蛋白纖維的形成。
全文摘要
本發明涉及包含淀粉樣肽Aβ
文檔編號A61K39/00GK1646559SQ03808858
公開日2005年7月27日 申請日期2003年4月7日 優先權日2002年4月19日
發明者彼得·圣喬治-希斯洛普, 喬安妮·麥克勞林 申請人:多倫多大學懂事局