具有抗增殖活性和/或可增強核酸損傷劑或治療的效果的肽和肽模擬物的制作方法

專利名稱：具有抗增殖活性和/或可增強核酸損傷劑或治療的效果的肽和肽模擬物的制作方法
技術領域：
本發明涉及包括肽和肽模擬物的化合物，該肽和肽模擬物單獨應用或與直接或間接損傷核酸(如DNA)的治療聯合時具有抗細胞增殖活性。因此，本發明的化合物可用于抑制細胞增殖，并同樣可用于治療包括癌癥在內的細胞增殖異常。本發明的化合物尤其有助于治療轉移性和非轉移性的實體或液態瘤。
背景細胞周期包括S期(DNA復制)，M期(有絲分裂)，及S與M期之間的兩個間隔期(G1和G2期)。細胞周期中的關卡(checkpoint)可確保其準確的進行，如監控DNA完整性的狀態、DNA復制、細胞大小情況及周圍環境(Maller，J.L.Curr.Opin.Cell Biol.，326(1991))。對多細胞生物而言，維持基因組完整性尤為重要，因而存在多個可監控基因組狀態的關卡。這些關卡當中，G1和G2關卡分別出現于DNA復制和有絲分裂之前。進入S期之前糾正DNA損傷是至關緊要的，因為一旦受損的DNA得到復制，常常引發突變(Hartwell，L.Cell，71543(1992))。經由G1和G2關卡，而未修復重大的DNA損傷的細胞周期進展可導致凋亡和/或突變。
大部分癌癥細胞在G1關卡相關蛋白，如p53、Rb、MDM-2、p16INK4和p19ARF中存在異常(Levine，A.J.Cell，88323(1997))。可選地，突變可引起致癌基因產物，如Ras、MDM-2和細胞周期蛋白D的過度表達和/或過度活化，從而降低G1關卡的嚴格性。除這些突變外，生長因子的過度表達可導致過多生長因子信號的產生，也可降低G1關卡的嚴格性。與喪失和獲得功能的突變一起，生長因子受體或下游信號轉導分子的連續活化可通過跨越G1關卡而引起細胞轉化。被取消的G1關卡促成了較高的突變率以及在癌癥細胞中可觀測到的許多突變。結果是大部分癌癥細胞依賴于G2關卡以對抗過多的DNA損傷而得以存活(O’Connor and Fan，Prog.Cell Cycle Res.，2165(1996))。
DNA損傷后，促使細胞周期G2期停滯的機制被認為在從酵母到人類的物種中是保守的。存在受損DNA的情況下，由于Cdc2激酶上的蘇氨酸-14和酪氨酸-15殘基的抑制性磷酸化作用，或細胞周期蛋白B的蛋白水平降低的緣故，Cdc2/細胞周期蛋白B激酶保持無活性狀態。有絲分裂開始時，雙重磷酸酶Cdc25移除了這些抑制性磷酸鹽，從而活化了Cdc2/細胞周期蛋白B激酶。Cdc2/細胞周期蛋白B的活化便意味著M期的開始。
在裂殖酵母中，蛋白激酶Chk1對反應于受損DNA的細胞周期停滯而言是必不可少的。Chk1激酶作用于若干rad基因產物的下游，并通過基于DNA損傷的磷酸化作用得到修飾。已知芽殖酵母的激酶Rad53和裂殖酵母的Cds1均從未復制的DNA傳導信號。在Chk1與Cds1之間似乎存在某些冗余，因為二者的同時清除在破壞由受損DNA引起的G2停滯方面最為有效。有趣的是，Chk1和Cds1均可使Cdc25磷酸化，并促使Rad24與Cdc25結合，從而將Cdc25隔離到細胞溶質中，阻止了Cdc2/細胞周期蛋白B的活化。因此Cdc25似乎是這些激酶的共同目標，意味著該分子在G2關卡中是不可缺少的因子。
在人類中，裂殖酵母Chk1的人類同源物hChk1，與芽殖酵母Rad53和裂殖酵母Cds1的人類同源物Chk2/HuCds1在反應DNA損傷時，均于關鍵調節位點，即絲氨酸-216處將Cdc25C磷酸化。該磷酸化作用為裂殖酵母的Rad24和Rad25的人類同源物，即小酸性蛋白14-3-3s創建了一個結合位點。Cdc25C上的絲氨酸-216被丙氨酸取代后，便破壞了人類細胞中細胞周期G2期停滯的事實清楚地說明該磷酸化作用的調節功能。不過，G2關卡的機制尚未完全了解。
概述根據本發明，提供了具有一種或多種下述活性的肽和肽模擬物，即可抑制細胞增殖、刺激凋亡或突變，或治療諸如以細胞增殖異常為特征的不良細胞增殖或存活。一種實施方案中，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1、P2、P3、P4、P5、P6(SEQ ID NO1)或P6、P5、P4、P3、P2、P1(SEQ ID NO2)。P1為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)，一個占據相似側鏈空間的氨基酸(如Tyr或Phe)，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；P2為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2，一個占據相似側鏈空間的氨基酸(如Tyr或Phe)，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；P3、P4、P5為任意氨基酸(如P4為Trp)，或三者中的一個或以上為簡單碳鏈(如11-氨基十一酸、10-氨基癸酸、9-氨基壬酸、8-氨基辛酸、7-氨基庚酸、6-氨基己酸，或具有一個或多個不飽和碳鍵的相似結構)，從而使P2與P6之間的距離大約等同于P3、P4、P5均為氨基酸時的距離；P6為Bpa、Phe4NO2、任意氨基酸連同Tyr(如Ser-Tyr)、任意氨基酸連同Phe(如Ser-Phe)、任意氨基酸或無任何基團。
另一種實施方案中，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO3)；P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO4)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ IDNO5)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO6)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO7)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO8)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ IDNO9)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO10)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO11)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO12)；P12，P11，P6，P9，P8，P7，P2，P1(SEQ ID NO13)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO14)；P1，P2，P7，P8，P9，P6，P11，P12(SEQ IDNO15)；或P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO16).
P1為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2，一個占據相似側鏈空間的氨基酸(如d-或l-Tyr、d-或l-Phe)，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；P2為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)，一個占據相似側鏈空間的氨基酸(如Tyr或Phe)，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；P3、P4、P5為任意氨基酸(如P4為Trp)，或三者中的一個或以上為簡單碳鏈(如11-氨基十一酸、10-氨基癸酸、9-氨基壬酸、8-氨基辛酸、7-氨基庚酸、6-氨基己酸，或具有一個或多個不飽和碳鍵的相似結構)，從而使P2與P6之間的距離大約等同于P3、P4、P5均為氨基酸時的距離；P6為Bpa、Phe4NO2、任意氨基酸連同Tyr(如Ser-Tyr)、任意氨基酸連同Phe(如Ser-Phe)；并且P7、P8、P9、P10、P11、P12中的至少三個為堿性氨基酸，其余為任意氨基酸或缺乏。
一種進一步的實施方案中，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQID NO17)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO18)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO19)；or P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO20).
P1為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2，一個占據相似側鏈空間的氨基酸，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；P2為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)，一個占據相似側鏈空間的氨基酸(如Tyr或Phe)，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；P3、P4、P5為任意氨基酸(如P4為Trp)，或三者中的一個或以上為簡單碳鏈(如氨基十一酸或8-氨基辛酸)，從而使P2與P6之間的距離大約等同于P3、P4、P5均為氨基酸時的距離；P6為Bpa、Phe4NO2、任意氨基酸連同Tyr(如Ser-Tyr)、任意氨基酸連同Phe(如Ser-Phe)、任意氨基酸或無任何基團；并且P7、P8、P9、P10、P11、P12中的至少三個為堿性氨基酸，其余為任意氨基酸或缺乏。
另一種實施方案中，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1、P2、P3、P4、P5、P6(SEQ ID NO21)或P6、P5、P4、P3、P2、P1(SEQ ID NO22)。P1為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2、Tyr或Phe；P2為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2、Tyr或Phe；P3為Ser、Arg、Cys、Pro或Asn；P4為Trp；P5為Ser、Arg或Asn；或者P3、P4、P5為單個氨基十一酸或單個8-氨基辛酸；P6為Bpa、Phe4NO2、(Ser-Tyr)或(Ser-Phe)。
還有一種實施方案，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQID NO23)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO24)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO25)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO26)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO27)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO28)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO29)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO30)；P12，P11，P6，P9，P8，P7，P2，P1(SEQ IDNO31)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO32)；P1，P2，P7，P8，P9，P6，P11，P12(SEQ ID NO33)；or P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO34).
P1為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2、Tyr或Phe；P2為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2、Tyr或Phe；P3為Ser、Arg、Cys、Pro或Asn；P4為Trp；P5為Ser、Arg或Asn；或者P3、P4、P5為單個氨基十一酸或單個8-氨基辛酸；P6為Bpa、Phe4NO2、(d-Ser-d-Tyr)或(d-Ser-d-Phe)；并且P7、P8、P9、P10、P11、P12中的至少三個為Arg或Lys，其余為任意氨基酸或缺乏。
還有一種實施方案，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQID NO35)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO36)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO37)；or P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO38).
P1為Cha或Nal(2)；P2為(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)；P3為Ser；P4為Trp；P5為Ser或Asn；P6為Bpa、Phe4NO2、(Ser-Tyr)或(Ser-Phe)；并且P7、P8、P9、P10、P11、P12中的至少三個為Arg，其余為任意氨基酸或缺乏。
還有另一種實施方案，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1、P2、P3、P4、P5、P6(SEQ ID NO39)或P6、P5、P4、P3、P2、P1(SEQ ID NO40)。P1為Cha或Nal(2)；P2為(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)；P3為Ser；P4為Trp；P5為Ser；P6為Bpa或(Ser-Tyr)。
還有一種進一步的實施方案，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO41)；P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO42)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ IDNO43)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO44)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO45)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO46)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQID NO47)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO48)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO49)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO50)；P12，P11，P6，P9，P8，P7，P2，P1(SEQ ID NO51)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO52)；P1，P2，P7，P8，P9，P6，P11，P12(SEQ ID NO53)；or P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO54).
P1為Cha或Nal(2)；P2為(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)或(Phe-4CF3)；P3為任意氨基酸(如Ser或Pro)；P4為d-或l-Trp；P5為任意氨基酸(如Ser或Pro)；P6為Bpa或(Ser-Tyr)；P7為Arg；P8為Arg；P9為Arg；P10為Gln或Arg；P11為Arg；P12為d-或l-Arg。
還有一些進一步的實施方案，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQID NO55)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO56)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO57)；or P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO58).
P1為Cha或Nal(2)；P2為(Phe-2，3，4，5，6-F)；P3為Ser；P4為Trp；P5為Ser；P6為Bpa或(Ser-Tyr)；P7為Arg；P8為Arg；P9為Arg；P10為Gln或Arg；P11為Arg；P12為Arg。
幾種特定情況中，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ IDNO99)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO100)；(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ IDNO59)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO60)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO61)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO62)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO63)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO64)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO65)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO66)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser).(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO67)；(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO68)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO69)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO70)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO71)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Bpg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ IDNO72)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO73)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO74)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO75)；或(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO76)；(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO77).
另一種情況中，肽和肽模擬物序列包括一個或多個l-型或d-型殘基；由一個l-殘基取代的d-殘基；或者由一個d-殘基取代的l-殘基。
肽和肽模擬物序列具有下述一種或多種活性抑制細胞增殖；消除細胞的細胞周期G2關卡；刺激細胞凋亡；刺激細胞突變。
肽和肽模擬物序列包括長度為大約6到大約12、10到大約20、18到大約25、25到大約100、25到大約200，或者50到大約300個殘基的序列。
本發明進一步提供了包含本發明的肽和肽模擬物序列的組合物。一種實施方案中的組合物包括肽或肽模擬物序列和一種核酸損傷劑。一種實施方案中的組合物包括肽或肽模擬物序列和一種抗增殖劑。另一種實施方案中的組合物包括一種藥學可接受載體或賦形劑和肽或肽模擬物序列，并任選包括一種核酸損傷劑或抗增殖劑。
此外，本發明還提供了包括本發明的肽和肽模擬物序列，并任選聯合一種核酸損傷療法(如核酸損傷劑)，或抗增殖劑的試劑盒。一種實施方案中的試劑盒包括肽或肽模擬物序列，以及實踐本發明方法的使用說明書。一種特定情況中，說明書針對的是抑制細胞增殖。
本發明也提供了利用本發明的肽和肽模擬物序列的方法。一種實施方案中的方法包括使細胞與一定量足以抑制該細胞增殖的肽或肽模擬物接觸。另一種實施方案中的方法包括使細胞與核酸損傷劑接觸，或者使細胞暴露于核酸損傷療法。
本發明提供了提高細胞對核酸損傷劑或治療的敏感性的方法。一種實施方案中的方法包括使細胞與一定量足以提高該細胞對核酸損傷劑或治療的敏感性的肽或肽模擬物接觸。
本發明進一步提供了增加對細胞的核酸損傷的方法。一種實施方案中的方法包括使細胞與一定量足以增加細胞的核酸損傷的肽或肽模擬物接觸。
在本發明方法的多種情況中，細胞為培養細胞，或存在于受試者體內的細胞。另一些情況中的方法進一步包括使細胞與核酸損傷劑接觸，或者使細胞暴露于核酸損傷療法。
本發明還提供了治療細胞增殖異常的方法。一種實施方案中的方法包括對患有細胞增殖異常或者處于患有細胞增殖異常危險當中的受試者施用一定量可有效治療細胞增殖異常的肽或肽模擬物。幾種特定情況中，細胞增殖異常包括良性或惡性的實體或液態瘤(如轉移或非轉移性肉瘤或癌，或者諸如骨髓瘤、淋巴瘤或白血病的造血性癌癥)。另一種特定情況中，至少一部分包含增殖異常細胞的細胞存在于血液、乳腺、肺、甲狀腺、頭或頸、腦、淋巴、胃腸道、鼻咽、生殖泌尿道、膀胱、腎、胰腺、肝臟、骨、肌肉或皮膚中。
本發明的方法包括通過任意途徑的給藥。一些特定實施方案中，是通過局部、區域或全身性地施用本發明的肽或肽模擬物。
本發明的方法包括可改善受試者狀況的療法。一些特定實施方案中，狀況改善包括至少一部分包含增殖異常細胞的細胞出現下述情況中的一種或幾種，即細胞增殖減少、細胞數量減少、增強的細胞增殖受抑制、細胞數量的增加受抑制、凋亡增加，或存活減少。
本發明方法包括對受試者施用核酸損傷劑、核酸損傷療法、抗增殖劑，或抗增殖治療。幾種特定情況中，該藥劑或治療包括藥物(如化學治療藥，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、雷別卡霉素、阿霉素(ADR)、博萊霉素(Bleo)、培洛霉素，順鉑衍生物諸如順鉑(CDDP)或奧沙利鉑，或喜樹堿(camptotecin)(CPT)、放射(如UV放射、IR放射，或α-、β-或γ-放射)、放射性同位素(如I131、I125、90Y、177Lu、213Bi或211At)、環境沖擊(如體溫過高)。
附圖簡述

圖1所示為針對經博萊霉素處理后的Jurkat細胞采用不同化合物后，每一化合物的劑量反應曲線。X軸指示劑量，Y軸指示處理后的％G2/M細胞。
圖2所示為針對經秋水仙堿處理后的Jurkat細胞采用不同化合物后，每一化合物的劑量反應曲線。X軸指示劑量，Y軸指示處理后的％G2/M細胞。
圖3A和3B所示為經(A)博萊霉素(Bleo)或(B)阿霉素(ADR)，以及不同劑量化合物處理后的人類胰腺癌來源細胞系MIAPaCa2。對收獲細胞進行DNA染色并利用流式細胞儀分析。％亞G1細胞群體被標示為死細胞。
圖4A-4C所示為G2關卡取消因子(l-Gly)(l-Arg)(l-Lys)(l-Lys)(l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(l-Cha)(l-Phe-2，3，4，5，6-F)(l-Arg)(l-Ser)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr)(l-Tyr)(SEQID NO78)的結構活性關系示意圖(A)對經博萊霉素處理后的Jurkat細胞中的l-Cha而言，氨基酸取代的G2關卡取消活性順序為[l-Cha＝l-Nal(2)]＞[l-Ala(3-Bzt)＝l-Nal(1)＝l-Trp＝l-Dph]＞[l-Ala(tBu)＝Cys(tBu)＝Leu]；(B)對經秋水仙堿處理后的Jurkat細胞中的l-Cha而言，氨基酸取代的M期關卡取消活性和/或非特異性毒性順序為[Ala(3-Bzt)＝l-Nal(1)＝l-Dph]＞[l-Cha＝l-Nal(2)]；(C)對l-Phe-2，3，4，5，6-F而言，氨基酸取代的G2關卡取消活性順序為l-(Phe-2，3，4，5，6-F)＝l-(Phe-3，4，5-F)＝l-(Phe-4CF3)]＞[l-(Phe-3Br，4Cl，5Br)＝l-(Phe-4Cl)＝l-Tyr]。
圖5所示為多個富精氨酸序列的G2取消活性。將指定的肽添加至經由或未經由博萊霉素處理后的Jurkat細胞中。Y軸指示％G2/M細胞。X軸指示如下1，僅由博萊霉素處理；2，0.2μg/ml；3，0.39μg/ml；4，0.78μg/ml；5，1.56μg/ml；6，3.125μg/ml；7，6.25μg/ml；8，12.5μg/ml；9，25μg/ml；10，50μg/ml。肽序列如下“rrrqrrkkr，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Lys)(d-Lys)(d-Arg)(SEQ ID NO79)；CBP501，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO80)；no TAT，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO81)；rqrr，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO82)；rrqrr，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO83)；rrrq，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(SEQ ID NO84)；and rrrqr，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(SEQ ID NO85).
圖6所示為多個無(d-Bpa)的肽的G2取消活性。將指定的肽添加至經由或未經由博萊霉素處理后的Jurkat細胞中。Y軸指示％G2/M細胞。X1軸指示如下1，僅由博萊霉素處理；2，0.2μg/ml；3，0.39μg/ml；4，0.78μg/ml；5，1.56μg/ml；6，3.125μg/ml；7，6.25μg/ml；8，12.5μg/ml；9，25μg/ml；10，50μg/ml。肽序列如下CBP0，(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO86)；CBP451，(d-Tyr)(d-Ser)(d-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO87)；CBP452，(d-Tyr)(d-Ser)(l-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO88)；和CBP501，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO80).
圖7所示為多個富精氨酸和富賴氨酸肽序列的G2取消活性。將指定的肽添加至如上述的Jurkat細胞中，并計算％G2/M細胞(Y軸)。肽序列如下CBP603，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe4NO2)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO89)；CBP607，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO90)；CBP608，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO91)；和CBP609，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(SEQID NO92).
圖8所示為序列中富精氨酸部分的位點是可變的。將所示肽添加至如上述的Jurkat細胞中，并計算％G2/M細胞(Y軸)。肽序列如下CBP501，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO80)；CBP510，(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO93)；CBP511，(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO94)；和CBP512，(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQID NO95).
圖9所示為若干經特意取代的肽序列的結構。G2取消活性隨著淺陰影部分取代(*)的增多而升高，M期關卡取消活性和/或非特異性毒性隨著深陰影部分取代(**)的增多而升高，對其它取代而言，基本保持不變。
圖10所示為經CBP501和順鉑處理后的scid小鼠體內腫瘤生長(人類胰腺癌)受抑制情況。第0天表示治療開始。Y軸指示每個治療小組具有標準差的平均腫瘤尺寸，X軸指示治療開始后的天數。
圖11所示為具有激酶抑制序列區和基于HIV-TAT轉導序列的序列區的肽的G2取消活性，如上。Y軸指示％G2/M。X軸指示如下1，僅由博萊霉素處理；2，0.2μg/ml；3，0.39μg/ml；4，0.78μg/ml；5，1.56μg/ml；6，3.125μg/ml；7，6.25μg/ml；8，12.5μg/ml；9，25μg/ml；10，50μg/ml。肽序列如下
CBP501，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ IDNO80)；CBP700，(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO96)；CBP701，(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO97)；CBP702，(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO98)；CBP703，(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO99).
圖12所示為經博萊霉素或秋水仙堿處理后的肽的G2取消活性與M取消活性和/或非特異性毒性之間的對比，其中對G2取消分析而言，采用博萊霉素處理，對M取消活性和/或非特異性毒性而言，采用秋水仙堿處理。將指定的肽添加至經博萊霉素或秋水仙堿處理后的Jurkat細胞中。Y軸指示％G2/M細胞。X軸指示如下1，僅由博萊霉素或秋水仙堿處理；2，0.2μg/ml；3，0.39μg/ml；4，0.78μg/ml；5，1.56μg/ml；6，3.125μg/ml；7，6.25μg/ml；8，12.5μg/ml；9，25μg/ml；10，50μg/ml。肽序列如下CBP501，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO80).
發明詳述本發明提供了包含可抑制細胞增殖的肽和肽模擬物的化合物。因此本發明的化合物可用于治療以不良或有害細胞增殖為特征的細胞增殖異常或生理狀況，如良性和惡性腫瘤細胞。本發明的肽和肽模擬物抑制細胞增殖的能力似乎至少部分地源于對細胞周期G2關卡的取消。由于細胞反應核酸損傷時可被誘導進入細胞周期G2關卡，以使細胞在DNA復制和細胞分裂發生之前修復損傷，通過抑制G2關卡，本發明的肽和肽模擬物可使細胞對核酸損傷劑和治療方案敏感。累積足夠多核酸損傷的細胞將由于G2關卡的破壞而不能完成受損核酸的修復。這種細胞便表現出增殖減少(如由于未修復對存活起關鍵作用的基因的突變)并最終進行凋亡。
具有正常G1的細胞較不易受累積中的受損核酸的影響，因為G1期間也可發生核酸修復。因此，正常細胞較不易受本發明化合物作用的影響。而細胞周期G1關卡已受損或被破壞的細胞則更可能累積受損核酸，因為G1關卡受損或被破壞后，細胞完全修復受損核酸的可能性較少。因此，采用可破壞G2關卡的本發明肽或肽模擬物處理G1已受損或被破壞的細胞，可使這些細胞完全修復受損核酸的可能性還要更少。所以，G1已受損或被破壞的細胞尤其易感于本發明的肽和肽模擬物。而包括本發明的肽和肽模擬物的化合物也因而可用于大體上抑制或預防細胞增殖，尤其可以抑制G1關卡已受損或被破壞的細胞的增殖。
G1細胞周期關卡已受損或被破壞的細胞包括但不僅限于快速增殖的細胞。以快速生長的細胞、過度生長的細胞，或未進行凋亡而存活的細胞為特征的細胞增殖異常和生理狀況往往存在G1細胞周期關卡已受損或被破壞的情況。因此，由于本發明的肽和肽模擬物抑制增殖或刺激凋亡的功能似乎至少部分地源于G2細胞周期關卡的破壞，從而使因G1關卡已受損或被破壞而出現快速或不良增殖的細胞成為尤其具有吸引力的目標。
由于破壞G2關卡很可能致使核酸損傷在細胞分裂時累積，因此包括的肽和肽模擬物的本發明化合物也可能僅通過其本身，而不聯合其它可損傷核酸或具有抗增殖活性的治療抑制細胞增殖。相應地，單獨采用本發明的化合物，或聯合核酸損傷療法(如化學試劑或治療方案)處理出現異常或不良增殖或存活的細胞，可抑制或預防細胞的增殖或刺激細胞凋亡/突變。
與快速導向于增殖細胞，而無視該細胞是否正常或異常(如癌癥細胞)的常規抗細胞增殖劑不同，本發明的化合物優先導向于細胞周期G1關卡已受損或被破壞的細胞。例如，與順鉑不同的CBP501，并不影響HUVEC細胞的生長(見如表3)。CBP501也不影響秋水仙堿所誘導的M期細胞周期停滯和/或非特異性毒性(見如圖12)。因此，本發明的化合物較不可能產生過多與常規抗細胞增殖治療劑相關的不良副作用，如骨髓抑制、惡心、食欲喪失、腹瀉及脫發。此外，由于絕大多數的癌癥細胞具有已受損或被破壞的細胞周期G1關卡，因此癌癥細胞對可取消細胞周期G2關卡的本發明化合物的敏感性表現為增加。正常細胞較不易感也意味著包括肽和肽模擬物的本發明的化合物的用量可以更大。
根據本發明，提供了包括具有抗細胞增殖活性和/或可取消G2細胞周期關卡的肽和肽模擬物的化合物。該肽或肽模擬物包含可抑制細胞增殖或刺激細胞凋亡的序列。該肽或肽模擬物也包含可取消細胞周期G2關卡的序列。一種實施方案中，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1、P2、P3、P4、P5、P6(SEQ ID NO1)或P6、P5、P4、P3、P2、P1(SEQ ID NO2)；其中P1為d-或l-Cha、d-或l-Nal(2)、d-或l-(Phe-2，3，4，5，6-F)、d-或l-(Phe-3，4，5F)、d-或l-(Phe-4CF3)，一個占據相似側鏈空間的氨基酸(如d-或l-Tyr，d-或l-Phe)，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；P2為d-或l-Cha、d-或l-Nal(2)、d-或l-(Phe-2，3，4，5，6-F)、d-或l-(Phe-3，4，5F)、d-或l-(Phe-4CF3)、d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2，一個占據相似側鏈空間的氨基酸(如d-或l-Tyr，d-或l-Phe)，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；P3、P4、P5為任意氨基酸，或三者中的一個或以上為簡單碳鏈，從而使P2與P6之間的距離大約等同于P3、P4、P5均為氨基酸時的距離(d-或l-Trp是P4的一個實例)；P6為d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2、任意氨基酸連同d-或l-Tyr(如d-Ser-d-Tyr)、任意氨基酸連同d-或l-Phe(如d-Ser-d-Phe)、任意氨基酸或無任何基團。多種情況中，具有簡單碳鏈的氨基酸為d-或l-11-氨基十一酸、d-或l-10-氨基癸酸、d-或l-9-氨基壬酸、d-或l-8-氨基辛酸、d-或l-7-氨基庚酸、d-或l-6-氨基己酸，或具有一個或多個不飽和碳鍵的相似結構。
另一種實施方案中，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構
P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO3)；P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO4)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ IDNO5)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO6)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO7)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO8)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ IDNO9)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO10)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO11)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO12)；P12，P11，P6，P9，P8，P7，P2，P1(SEQ ID NO13)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO14)；P1，P2，P7，P8，P9，P6，P11，P12(SEQ IDNO15)；或P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO16)；其中P1為d-或l-Cha、d-或l-Nal(2)、d-或l-(Phe-2，3，4，5，6-F)、d-或l-(Phe-3，4，5 F)、d-或l-(Phe-4CF3)、d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2，一個占據相似側鏈空間的氨基酸(如d-或l-Tyr，d-或l-Phe)，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；P2為d-或l-Cha、d-或l-Nal(2)、d-或l-(Phe-2，3，4，5，6-F)、d-或l-(Phe-3，4，5F)、d-或l-(Phe-4CF3)，一個占據相似側鏈空間的氨基酸(如d-或l-Tyr，d-或l-Phe)，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；P3、P4、P5為任意氨基酸，或三者中的一個或以上為簡單碳鏈，從而使P2與P6之間的距離大約等同于P3、P4、P5均為氨基酸時的距離(d-或l-Trp是P4的一個實例)；P6為d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2，任意氨基酸連同d-或l-Tyr(如d-Ser-d-Tyr)、任意氨基酸連同d-或l-Phe(如d-Ser-d-Phe)，并且P7、P8、P9、P10、P11、P12中的至少3個為堿性氨基酸，其余為任意氨基酸或缺乏。多種情況中，具有簡單碳鏈的氨基酸為d-或l-11-氨基十一酸、d-或l-10-氨基癸酸、d-或l-9-氨基壬酸、d-或l-8-氨基辛酸、d-或l-7-氨基庚酸、d-或l-6-氨基己酸，或具有一個或多個不飽和碳鍵的相似結構。
一種進一步的實施方案中，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構
P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQID NO17)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO18)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO19)；或P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO20)；其中P1為d-或l-Cha、d-或l-Nal(2)、d-或l-(Phe-2，3，4，5，6-F)、d-或l-(Phe-3，4，5F)、d-或l-(Phe-4CF3)、d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2，一個占據相似側鏈空間的氨基酸(如d-或l-Tyr，d-或l-Phe)，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；P2為d-或l-Cha、d-或l-Nal(2)、d-或l-(Phe-2，3，4，5，6-F)、d-或l-(Phe-3，4，5F)、d-或l-(Phe-4CF3)，一個占據相似側鏈空間的氨基酸(如d-或l-Tyr，d-或l-Phe)，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；P3、P4、P5為任意氨基酸，或三者中的一個或以上為簡單碳鏈，從而使P2與P6之間的距離大約等同于P3、P4、P5均為氨基酸時的距離(d-或l-Trp是P4的一個實例)；P6為d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2、任意氨基酸連同d-或l-Tyr(如d-Ser-d-Tyr)、任意氨基酸連同d-或l-Phe(如d-Ser-d-Phe)；并且P7、P8、P9、P10、P11、P12中的至少3個為堿性氨基酸，其余為任意氨基酸或缺乏。多種情況中，具有簡單碳鏈的氨基酸為d-或l-氨基十一酸、d-或l-8-氨基辛酸。
還有一種實施方案，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1、P2、P3、P4、P5、P6(SEQ ID NO21)或P6、P5、P4、P3、P2、P1(SEQ ID NO22)；其中P1為d-或l-Cha、d-或l-Nal(2)、d-或l-(Phe-2，3，4，5，6-F)、d-或l-(Phe-3，4，5F)、d-或l-(Phe-4CF3)、d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2、d-或l-Tyr、或者d-或l-Phe；P2為d-或l-Cha、d-或l-Nal(2)、d-或l-(Phe-2，3，4，5，6-F)、d-或l-(Phe-3，4，5F)、d-或l-(Phe-4CF3)、d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2、d-或l-Tyr，或者d-或l-Phe；P3為d-或l-絲氨酸、d-或l-精氨酸、d-或l-半胱氨酸、d-或l-脯氨酸，或者d-或l-天冬酰胺；P4為d-或l-色氨酸；P5為d-或l-絲氨酸、d-或l-精氨酸、或d-或l-天冬酰胺；或者P3、P4、P5均為單個d-或l-氨基十一酸或單個d-或l-8-氨基辛酸；P6為d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2、(d-Ser-d-Tyr)或(d-Ser-d-Phe)。
還有一種實施方案，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQID NO23)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO24)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO25)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO26)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO27)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO28)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO29)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO30)；P12，P11，P6，P9，P8，P7，P2，P1(SEQ IDNO31)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO32)；P1，P2，P7，P8，P9，P6，P11，P12(SEQ ID NO33)；或P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO34)；其中P1為d-或l-Cha、Nal(2)、d-或l-(Phe-2，3，4，5，6-F)、d-或l-(Phe-3，4，5F)、d-或l-(Phe-4CF3)、d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2、d-或l-Tyr、或者d-或l-Phe；P2為d-或l-Cha、d-或l-Nal(2)、d-或l-(Phe-2，3，4，5，6-F)、d-或l-(Phe-3，4，5F)、d-或l-(Phe-4CF3)、d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2、d-或l-Tyr，或者d-或l-Phe；P3為d-或l-絲氨酸、d-或l-精氨酸、d-或l-半胱氨酸、d-或l-脯氨酸，或者d-或l-天冬酰胺；P4為d-或l-色氨酸；P5為d-或l-絲氨酸、d-或l-精氨酸，或者d-或l-天冬酰胺；或者P3、P4、P5均為單個d-或l-氨基十一酸，或者單個d-或l-8-氨基辛酸；P6為d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2、(d-Ser-d-Tyr)或(d-Ser-d-Phe)；并且P7、P8、P9、P10、P11、P12中的至少3個為d-或l-Arg，或d-或l-Lys，其余為任意氨基酸或缺乏。
另一種實施方案中，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQID NO35)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO36)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO37)；或P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO38)；其中P1為d-或l-Cha，或d-或l-Nal(2)；P2為d-或l-(Phe-2，3，4，5，6-F)、d-或l-(Phe-3，4，5F)、d-或l-(Phe-4CF3)；并且P7、P8、P9、P10、P11、P12中的至少3個為d-或l-Arg，其余為任意氨基酸或缺乏；P3為d-或l-絲氨酸；P4為d-或l-色氨酸；P5為d-或l-絲氨酸，或者d-或l-天冬酰胺；P6為d-或l-Bpa、d-或l-Phe4NO2、(d-或l-Ser-d-或l-Tyr)或(d-或l-Ser-d-或l-Phe)。
還有一種實施方案，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1、P2、P3、P4、P5、P6(SEQ ID NO39)或P6、P5、P4、P3、P2、P1(SEQ ID NO40)；其中P1為d-或l-Cha，或者d-或l-Nal(2)；P2為(d-或l-Phe-2，3，4，5，6-F)、(d-或l-Phe-3，4，5F)或(d-或l-Phe-4CF3)；P3為d-或l-Ser；P4為d-或l-Trp；P5為d-或l-Ser；P6為d-或l-Bpa，或(d-或l-Ser-d-或l-Tyr)。
一種進一步的實施方案中，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO41)；P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO42)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ IDNO43)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO44)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO45)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO46)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQID NO47)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO48)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO49)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO50)；P12，P11，P6，P9，P8，P7，P2，P1(SEQ ID NO51)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO52)；P1，P2，P7，P8，P9，P6，P11，P12(SEQ ID NO53)；或P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO54)；其中P1為d-或l-Cha，或者d-或l-Nal(2)；P2為(d-或l-Phe-2，3，4，5，6-F)、(d-或l-Phe-3，4，5F)或(d-或l-Phe-4CF3)；P3為任意氨基酸(如d-或l-Ser，或者d-或l-Pro)；P4為d-或l-Trp；P5為任意氨基酸(如d-或l-Ser)；P7為d-或l-Arg；P8為d-或l-Arg；P9為d-或l-Arg；P10為d-或l-Gln或d-或l-Arg；P11為d-或l-Arg；P12為d-或l-Arg；P6為d-或l-Bpa，或者(d-或l-Ser-d-或l-Tyr)。
還有一種實施方案，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構
P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQID NO55)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO56)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO57)；或P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO58)；其中P1為d-或l-Cha，或者d-或l-Nal(2)；P2為(d-或l-Phe-2，3，4，5，6-F)；P3為d-或l-Ser；P4為d-或l-Trp；P5為d-或l-Ser；P7為d-或l-Arg；P8為d-或l-Arg；P9為d-或l-Arg；P10為d-或l-Gln，或者d-或l-Arg；P11為d-或l-Arg；P12為d-或l-Arg；P6為d-或l-Bpa，或者(d-或l-Ser-d-或l-Tyr)。
還有一些進一步的實施方案，相鄰肽或肽模擬物序列包括下列結構(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO99)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO100)；(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ IDNO59)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO60)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ IDNO61)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO62)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ IDNO63)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO64)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ IDNO65)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO66)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ IDNO67)；(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO68)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO69)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO70)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQID NO71)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO72)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO73)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO74)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQID NO75)；or(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO76).
還有一種實施方案，肽或肽模擬物序列包括下列結構(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO77).
為協助跨越細胞膜，本發明的肽和肽模擬物可任選包含一個聚賴氨酸和/或精氨酸序列。由于其它氨基酸序列(如細胞表面受體/蛋白的配體，HIV tat等)也可跨膜，并且還可利用其它分子以利于G2取消肽和肽模擬物進入細胞(如脂質體、微團及其它脂質分子、病毒和其它載體、電穿孔等)，因而包含聚賴氨酸和/或聚精氨酸是任選而非必須的。因此，在另一些實施方案中，本發明的肽和肽模擬物并不具有可協助其進入細胞的聚賴氨酸和/或精氨酸序列。例如，在兩種特定實施方案中，不具有可協助跨越細胞膜的聚賴氨酸/精氨酸序列的最小序列包括P6、P5、P4、P3、P2、P1，如d-Bpa、d-Ser、d-Trp、d-Ser、d-Phe-2，3，4，5，6F、d-Cha(SEQ ID NO101)；和d-Tyr、d-Ser、d-Pro、d-Trp、d-Ser、d-Phe-2，3，4，5，6F、d-Cha(SEQ ID NO102)。另兩種特定實施方案中，不具有可協助跨越細胞膜的聚賴氨酸/精氨酸序列的最小序列包括，例如d-Bpa、d-Cys、d-Trp、d-Ser、d-Phe-2，3，4，5，6F、d-Cha、d-Cys(SEQ ID NO103)；和d-Tyr、d-Cys、d-Pro、d-Trp、d-Ser、d-Phe-2，3，4，5，6F、d-Cha、d-Cys(SEQ IDNO104)；Cys殘基為任選環化的。
如上所述，本發明的化合物本身具有抗細胞增殖活性或G2取消活性。通過將本發明的化合物與可直接或間接引起核酸損傷的治療結合，可提高其抗細胞增殖活性。也可通過將本發明的化合物與可抑制細胞增殖的治療結合，而無論該治療是否損傷核酸，從而提高其抗細胞增殖活性。因此本發明進一步提供了包含本發明化合物(如肽或肽模擬物序列)和核酸損傷劑的組合物，以及包含本發明化合物(如肽或肽模擬物序列)和抗增殖劑的組合物。
此處所用術語“取消細胞周期G2關卡”、“破壞細胞周期G2關卡”、“損傷細胞周期G2關卡”及其文法變換均指抑制細胞以使細胞周期于G2關卡處停滯。細胞周期G2關卡已取消的細胞表現為處于G2關卡的時間長度縮短，這一時間段的范圍可以從完全缺乏G2關卡到適當條件下G2關卡在數分鐘、數小時、數天、數周或更長的時間段上有所縮短。因此，與本發明的化合物接觸的細胞同正常地處于缺乏該化合物情況下的細胞相比，前者所具有的G2關卡時間段長度短于后者。例如，G2關卡時間段長度的縮減可能意味著當可處于G2期持續某一時間段，如4小時的細胞與本發明的化合物接觸時，其處于G2期的時間段便短于4小時，如3.5、3、2.5、2、1或更短時間。
此處所用術語“凋亡”指程序性細胞死亡，并如本領域技術人員所知，在細胞生理學，如核酸斷裂、caspase激活等方面的相關變化。術語“突變(catasrtophe)”指有絲分裂過程中出現的錯誤所導致的細胞死亡。突變情況中出現的特征少于凋亡的特征，如caspase激活、染色體濃縮等。
此處所用術語“肽”、“多肽”和“蛋白質”可互換采用，指通過一個酰胺鍵或非酰胺的等效物共價連接的兩個或多個氨基酸。本發明的肽可為任意長度。例如，該肽在長度上可含有大約5-100個或更多殘基，諸如，5-12、12-15、15-18、18-25、25-50、50-75、75-100，或更長。本發明的肽包括l-和d-異構體，以及l-和d-異構體的組合。該肽可包括與蛋白質的翻譯后加工典型相關的修飾，例如，環化(如二硫鍵或酰胺鍵)、磷酸化、糖基化、羧化、遍在蛋白化、十四烷基化或脂化。
此處所公開的肽進一步包括具有氨基酸結構的化合物和功能性類似物，例如，具有合成或非天然氨基酸或氨基酸類似物的肽模擬物，只要該模擬物具有一種或多種功能或活性。因此本發明的化合物包括“模擬物”和“肽模擬物”形式。
此處所用術語“模擬物”和“肽模擬物”指基本上具有與本發明的肽相同的結構和/或功能特性的合成化學化合物。該模擬物可完全由合成、非天然氨基酸類似物組成，或者可以是包括一種或多種天然肽氨基酸，以及一種或多種非天然氨基酸類似物的嵌合分子。該模擬物也可以摻入任意數量的天然氨基酸保守性取代，只要該取代不破壞其活性即可。當本發明多肽為保守性變體時，可利用常規檢驗方法確定該模擬物是否具有必要的活性，如具有可檢測的細胞周期G2關卡取消活性。一種模擬物，當其施用于受試者或者接觸在細胞上，可檢測到G2細胞周期關卡被破壞時，便說明其具有G2關卡取消活性。
肽模擬物組合物可包含非天然結構成分的任意組合，該非天然結構成分典型地來自于三種結構基團a)天然酰胺鍵(“肽鍵”)連接外的殘基連接基團；b)代替天然存在的氨基酸殘基的非天然殘基；或c)誘導二級結構模擬的殘基，即誘導或穩定二級結構，如β旋轉、γ旋轉、β折疊、α螺旋構象等。例如，當通過除酰胺鍵外的化學方法將一個或多個殘基連接到一個多肽中時，便可表征該多肽為模擬物。可通過酰胺鍵、非天然和非酰胺化學鍵連接各個肽模擬物殘基，其它化學鍵或偶聯方式包括，例如戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙官能馬來酰亞胺、N，N’-二環己基碳二亞胺(DCC)或N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)。可代替酰胺鍵的連接基團包括，例如酮亞甲基(如-C(＝O)-CH2-代替-C(＝O)-NH-)、氨基亞甲基(CH2-NH)、乙烯、烯烴(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、retroamide、硫代酰胺或酯(見如Spatola(1983)在Chemistry and Biochemistry ofAmino Acids，Peptides and Proteins，Vol.7，pp267-357中的“Peptide and Backbone Modifications”，Marcel Decker，NY)。
如上所述，通過包含一個或多個非天然殘基以取代天然存在的氨基酸殘基的肽可以被表征為模擬物。非天然殘基是本領域技術人員已知的。可作為天然氨基酸殘基模擬物的非天然殘基的特定非限制性實例為芳香族氨基酸的模擬物，包括，D-或L-萘基丙氨酸；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2噻吩基丙氨酸；D-或L-1、-2、3-、或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-異丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯丙氨酸；D-p-氟-苯丙氨酸；D-或L-p-聯苯基苯基丙氨酸；K-或L-p-甲氧基-聯苯基苯基丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和D-或L-烷基胺，其中烷基可為已被取代或未被取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、sec-isotyl、異戊基或非酸性氨基酸。可被用于替代天然芳香環的非天然氨基酸的芳香環包括，例如，噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳香環。
通過取代以非羧化氨基酸，如(膦酰基)丙氨酸和硫酸化蘇氨酸。同時維持負電荷，可生成酸性氨基酸的模擬物。通過與包括例如l-環己基-3(2-嗎啉基-(4-乙基)碳二亞胺或l-乙基-3(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺在內的碳二亞胺(R’-N-C-N-R’)反應，也可以選擇性地修飾羧基側鏈基團(如天冬氨酰基或谷氨酰基)。通過與銨離子反應也可將天冬氨酰或谷氨酰基團轉化為天冬酰和谷氨酰胺酰基團。
通過取代以例如，賴氨酸和精氨酸，以及如鳥氨酸、瓜氨酸或(胍基)-乙酸、或(胍基)烷基-乙酸的氨基酸，可生成堿性氨基酸的模擬物，其中烷基可為已被取代或未被取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、sec-isotyl、異戊基或非酸性氨基酸。腈衍生物(如包含CN-部分代替COOH)可被取代為天冬酰胺或谷氨酰胺。天冬酰基和谷氨酰胺酰基殘基可脫氨基成對應的天冬氨酰基或谷氨酰基殘基。
精氨酸模擬物可通過使精氨酰基與一種或多種試劑，包括例如，苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-環己二酮或茚三酮，任選地于堿性條件下進行反應而生成。酪氨酸殘基模擬物可通過使酪氨酰基與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應而生成。N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷可被用于分別形成O-乙酰基酪氨酰基類和3-硝基衍生物。
賴氨酸模擬物可通過使賴氨酰基與琥珀酸或其它羧酸酐反應生成(并可改變氨基末端殘基)。賴氨酸及其它含α-氨基的殘基模擬物也可通過與亞氨基酯，如甲基吡啶酰胺化物、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2，4，戊二酮反應，并采用乙醛酸進行轉酰氨基酶催化反應而生成。
蛋氨酸模擬物可通過與蛋氨酸亞砜反應而生成。脯氨酸模擬物包括例如，哌可酸、噻唑啉羧酸、3-或4-羥基脯氨酸、脫氫脯氨酸、3-或4-甲基脯氨酸和3，3，-二甲基脯氨酸。組氨酸模擬物可通過使組氨酰基與二乙基焦碳酸酯或對溴化苯乙酮反應而生成。其它模擬物包括例如，通過脯氨酸和賴氨酸的羥基化作用，絲氨酰基或蘇氨酰基殘基的羥基團的磷酸化作用，賴氨酸、精氨酸和組氨酸的α-氨基的甲基化作用，N-末端胺的乙酰化作用，主鏈酰胺殘基的甲基化或取代以N-甲基氨基酸，或C末端羧基的酰胺化作用生成的模擬物。
一個或多個殘基也可被手性相反的氨基酸(或肽模擬物殘基)取代。因此，以L-構型(也可被稱為R或S，取決于該化學實體的結構)天然存在的任何氨基酸，可被相同但屬于相反手性的氨基酸或模擬物取代，這些相反手性的氨基酸或模擬物均被稱為D氨基酸，但也可被稱為R-或S-型。
本發明的肽和肽模擬物進一步包括此處所列序列的修飾形式，前提是的修飾形式保留了未修飾或參照肽或肽模擬物的至少一部分功能。例如，修飾肽或肽模擬物將保留至少一部分的細胞增殖抑制或G2取消活性，但仍可能具有相對于參照肽或肽模擬物而言提高或降低的細胞增殖抑制或G2取消活性。
修飾肽和肽模擬物中可以存在一個或多個被其它殘基取代、被添加至序列中或從序列中缺失的氨基酸殘基。一種實施方案中，修飾肽或肽模擬物存在一個或多個氨基酸的取代、添加或缺失(如1-3，3-5，5-10或更多)。一種情況中，取代氨基酸或模擬物的側鏈所占據空間與參照氨基酸或模擬物(被取代的氨基酸或模擬物)類似。還有另一種情況是用結構上類似于人類殘基的非人類氨基酸進行取代。一種特定情況中，取代為保守性氨基酸取代。
此處所用術語“相似空間”指化學部分占據的三維空間在尺寸上近似于參照部分所占據的三維空間。占據相似空間的部分典型地在尺寸上與參照部分近似。“占據相似側鏈空間”的氨基酸或模擬物具有的側鏈所占據的三維空間在尺寸上近似于基準氨基酸或模擬物。d-(Phe-2，3，4，5，6-F)、l-(Phe-2，3，4，5，6-F)、d-(Phe-3，4，5F)、l-(Phe-3，4，5F)、d-(Phe-4CF3)或l-(Phe-4CF3)的特定實例為(l或d-Phe-2R1、3R2、4R3、5R4、6R5)，其中R1、R2、R3、R4、R5可為氯化物、溴化物、氟化物、碘化物、氫、氫氧化物或缺乏。對小分子而言，如尺寸大約為1埃的氟化物，相似空間可能缺乏一個部分。
術語“保守性取代”指一個在生物學、化學或結構上相似的殘基對一個氨基酸的取代。生物學上相似指該取代與生物學活性，如抗細胞增殖或G2取消活性相容。結構上相似指氨基酸的側鏈長度相似，如丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸，或者尺寸相似。化學上相似指殘基具有相同電荷或均為親水性或疏水性。特定實例包括由一個疏水殘基，諸如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸取代另一個疏水殘基，或者由一個極性殘基取代另一個極性殘基，如精氨酸取代賴氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺、絲氨酸取代蘇氨酸等。
因此，本發明的肽和肽模擬物包括序列與表1所列肽和肽模擬物序列不完全一致的肽和肽模擬物。一種實施方案中，肽或肽模擬物所具有的序列與表1所列序列有50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。一種情況中，該同一性超越了序列的定義范圍，如氨基或羧基末端3-5個殘基。
利用本領域已知的任何方法均可制備并分離獲得包括本發明的肽和肽模擬物的化合物。利用本領域已知的化學方法可完整或部分地合成肽(見如Caruthers(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.225-232；and Banga，A.K.，Therapeutic Peptides and Proteins，Formulation，Processing and Delivery Systems(1995)TechnomicPublishing Co.，Lancaster，PA)。利用多種固相技術可合成肽(見如Roberge(1995)Science 269202；Merrifield(1997)MethodsEnzymol.2893-13)，并且可實現自動合成，如利用ABI 431A肽合成儀(Perkin Elmer)并根據生產商的說明書。
利用本領域已知的多種操作和方法可合成摻入各個合成殘基和多肽的模擬物(見如Organic Syntheses Collective Volumes，Gilman，et al.(Eds)John Wiley & Sons，Inc.，NY)。利用組合方法學也可合成肽和肽模擬物。生成肽和肽模擬物庫所用的技術是本領域技術人員所熟知的，包括，例如multipion、tea bag和拆分-偶聯-混合技術(見例如al-Obeidi(1998)Mol.Biotechnol.9205-223；Hruby(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1114-119；Ostergaard(1997)Mol.Divers.317-27；和Ostresh(1996)Methods Enzymol.267220-234)。通過化學修飾方法可進一步獲得修飾肽(見例如，Belousov(1997)Nucleic Acids Res.253440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19373-380；和Blommers(1994)Biochemistry 337886-7896)。
為更容易地分離重組合成的肽，或鑒定并分離抗體或抗體表達B細胞，也可合成肽并使其作為融合蛋白表達，該融合蛋白上連接一個或多個可用于生成具有更多免疫原性的肽的其它結構域。有利于檢測和純化的結構域包括，例如金屬鰲合肽，如有助于在固定的金屬上進行純化的多組氨酸管和組氨酸-色氨酸組件；有助于在固定的免疫球蛋白上進行純化的蛋白質A結構域；用于FLAGS擴散/親和純化系統(Immunex Corp，Seattle WA)中的結構域。將可裂解接頭序列，如Factor Xa或腸激酶(Invitrogen，San Diego CA)包含在純化結構域與肽之間有助于肽的純化。例如，一個表達載體可包括一個被連接至6個組氨酸殘基，以及其后的硫氧還蛋白和腸激酶裂解位點的肽編碼核酸序列(見如Williams(1995)Biochemistry 341787-1797；Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12404-14)。組氨酸殘基有利于融合蛋白的檢測和純化，而腸激酶裂解位點則提供了一種從融合蛋白的其余部分純化肽的方法。適用于載體編碼融合蛋白的技術以及融合蛋白的應用是本領域已知的(見如Kroll(1993)DNA Cell.Bio.，12441-53)。
本發明進一步提供了編碼本發明肽的核酸。一些特定實施方案中的核酸編碼了長度大約為8-12、12-15、15-18、15-20、18-25、20-25、25-35、25-50或50-100個或更多氨基酸的本發明肽序列。
術語“核酸”和“多核苷酸”此處可互換使用，指所有形式的核酸，包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。該核酸可為雙、單鏈，或三鏈、線形或環形。核酸包括基因組DNA、cDNA和反義。RNA核酸可為已被剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA或反義(如RNAi)。本發明的核酸包括天然存在的、合成的，以及核苷酸類似物和衍生物。這種改變的或修飾的多聚核苷酸包括提供例如核酸酶抗性的類似物。核酸長度也可短于示范的肽序列。例如，任意一種肽序列的子序列均可編碼具有抗增殖或G2取消活性的肽。
利用多種本領域熟知的標準克隆和化學合成方法中的任意一種均可制備核酸，并可通過本領域技術人員已知的定點誘變或其它重組技術有意地對其進行改造。多核苷酸的純度可借助于測序、凝膠電泳等方法確定。
本發明核酸可被插入特定核酸構建體中，該構建體中核酸的表達受“表達控制元件”的影響或調節，該組合被稱為“表達盒”。術語“表達控制元件”指調節或影響與其可操作地連接的核酸序列的表達的一個或多個序列元件。與核酸序列可操作地連接的表達控制元件控制了該核酸序列的轉錄及適當的翻譯。
術語“可操作地聯結”指功能性并置，其中所描述的組分之間的關系可使其以各自的方式發揮功能。典型的表達控制元件于基因的5’或3’末端并置，但也可以是內含子。啟動子通常位于編碼序列的5’端。“啟動子”指足以引導轉錄的最小序列元件。
表達控制元件包括位于蛋白編碼基因之前的啟動子、增強子、轉錄終止子、基因沉默子、起始密碼子(如ATG)。表達控制元件激活了組成型轉錄、誘導型轉錄(即需要外部信號以激活)或去阻抑轉錄(即信號阻斷了轉錄；移除該信號便可激活轉錄)。表達盒也可包括足以使基因表達對特定細胞類型或組織而言是可控制的控制元件(即組織特異性控制元件)。
本發明的核酸可被插入質粒中用于在宿主細胞內進行繁殖，以及隨后的遺傳操作。該質粒為可于宿主細胞內穩定繁殖的核酸；為促使宿主細胞內偏碼肽的該核酸的表達，該質粒可任選含有表達控制元件。此處所用術語“載體”與質粒同義，也可包括在宿主細胞內用于表達的表達控制元件。質粒和載體通常包含至少一個用于在細胞內繁殖的復制起點和啟動子。因此，質粒和載體有助于編碼肽的核酸的遺傳操作，有助于肽的生成，也有助于例如在宿主細胞或整個生物體內表達該肽。
因此，利用組成型啟動子，如T7，或誘導型啟動子，如噬菌體λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜合啟動子)可于細菌體系內表達肽；在酵母體系內則利用組成型啟動子，如ADH或LEU2，或誘導型啟動子，如GAL(見如Ausubel et al.，InCurrent Protocols inMolecular Biology，Vol.2，Ch.13，ed.，Greene Publish..Assoc.& Wiley Interscience，1988；Grant et al.Methods in Enzymology，153516(1987)，eds.Wu & Grossman，BitterMethods inEnzymology，152673(1987)，eds.Berger & Kimmel，Acad.Press，N.Y.；和Strathern et al.，The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces(1982)eds.Cold Spring Harbor Press，Vols.Iand II；R.Rothstein InDNA Cloning，A Practical Approach，Vol.11，Ch.3，ed.D.M.Glover，IRL Press，Wash.，D.C.，1986)；在昆蟲細胞體系內則利用組成型或誘導型啟動子，如蛻皮激素；以及在哺乳動物細胞體系內利用組成型啟動子，如SV40，RSV，或來源自哺乳動物細胞基因組的誘導型啟動子，如金屬硫蛋白IIA啟動子、熱休克啟動子，或來源自哺乳動物病毒的啟動子，如腺病毒晚期啟動子，或可誘導的小鼠乳腺腫瘤病毒長末端重復序列。肽表達體系進一步包括設計用于體內的載體，包括腺病毒載體(U.S.Patent Nos.5,700,470和5,731,172)、腺伴隨病毒載體(U.S.Patent No.5,604,090)、單純皰疹病毒載體(U.S.Patent No.5,501,979)和逆轉錄病毒載體(U.S.Patent Nos.5,624,820、5,693,508和5,674,703和WIPO出版物WO92/05266和WO92/14829)。牛乳頭瘤病毒(BPV)也可應用于基因治療(U.S.Patent No.5,719,054)。這種基因治療載體也包括基于CMV的載體(U.S.Patent No.5,561,063)。
因此，本發明也提供了被插入宿主細胞內，并編碼了本發明肽的核酸。一種實施方案中的宿主細胞為原核細胞。另一種實施方案中的宿主細胞為真核細胞。多種情況中，該真核細胞為酵母或哺乳動物(如人類、靈長類等)細胞。
此處所用“宿主細胞”指其中導入有可被繁殖、轉錄或編碼所表達肽的核酸的細胞。該術語也包括該宿主細胞的任意子代。
宿主細胞包括但不僅限于微生物，如細菌或酵母；植物、昆蟲和哺乳動物細胞。例如，提供了由重組噬菌體核酸、質粒核酸或粘粒核酸表達載體轉化的細菌；由重組酵母表達載體轉化的酵母；由重組病毒表達載體(如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染，或由重組質粒表達載體(如Ti質粒)轉化的植物細胞體系；由重組病毒表達載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞體系；或由重組病毒表達載體(如逆轉錄病毒、腺病毒、牛痘病毒)感染的動物細胞體系，或經工程改造用于穩定表達的轉化動物細胞體系。
表達載體也可包含編碼了選擇標記或可識別標記(如β半乳糖苷酶)的核酸，其中該標記可賦予其對選擇壓力的抗性，從而使具有該載體的細胞可被識別、生長并擴增。可選地，選擇標記可位于第二個載體之上，該載體是與含本發明多核苷酸的第一個載體一起被共轉染進宿主細胞內。可利用大量的選擇體系，包括但不僅限于單純皰疹病毒胸苷激酶基因(Wigler et al.，Cell 11223(1977))、次黃嘌呤-鳥氨酸磷酸核糖基轉移酶基因(Szybalska et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026(1962))和腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowyet al.，Cell 22817(1980))基因，上述基因均可分別應用于tk-、hgprt-或aprt-細胞。抗代謝物抗性可作為選擇下列基因的基礎，即賦予氨甲喋呤抗性的dhfr(O’Hare et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527(1981))；賦予霉酚酸抗性的gpt基因(Mulligan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072(1981))；賦予氨基糖苷G-418抗性的新霉素基因(Colberre-Garapin et al.，J.Mol.Biol.1501(1981))；以及賦予潮霉素抗性的潮霉素基因(Santerre et al.，Gene 30147(1984))。其它可選擇基因包括可使細胞在色氨酸環境中利用吲哚的trpB基因；可使細胞在組氨酸環境中利用組胺的hisD基因(Hartman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858047(1988))；以及可賦予鳥氨酸脫氫酶抑制物2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸，DFMO抗性的ODC(鳥氨酸脫氫酶)基因(McConlogue(1987)InCurrent Communications in Molecular Biology，Cold SpringHarbor Laboratory)。
此處所用術語“核酸損傷療法”和“核酸損傷劑”指直接或間接損傷核酸(如DNA、cDNA、基因組DNA、mRNA、tRNA或rRNA)的任何治療方案。這類藥劑的特定實例包括烷化劑、亞硝基脲、抗代謝物、植物堿、植物浸出液和放射性同位素。特定實例也包括核酸損傷藥物，例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱、S-1(替加氟，5-氯-2，4-二羥基嘧啶和氧嗪酸)、5-乙炔尿嘧啶、阿糖胞嘧啶(ara-C)、5-氮雜胞苷(5-AC)、2’，2’-二氟-2’-脫氧胞苷(dFdC)、嘌呤抗代謝物(巰基嘌呤、硝基咪唑硫嘌呤、硫鳥嘌呤)、鹽酸吉西他濱(Gemzar)、噴司他丁、別嘌呤醇、2-氟-阿糖腺嘌呤(2F-ara-A)、羥基脲、硫芥子氣(雙氯乙基硫醚)、氮芥、美法侖、苯丁酸氮芥、環磷酰胺、異環磷酰胺、噻替派、AZQ、絲裂霉素C、去水衛矛醇、二溴衛矛醇、烷基磺酸鹽(白消安)、亞硝基脲(BCNU、CCNU、4甲基CCNU或ACNU)、甲基芐肼、氮烯咪唑胺、雷別卡霉素、蒽環類抗生素，諸如阿霉素(亞德里亞霉素；ADR)、柔紅霉素(Cerubicine)、伊達比星(Idamycin)和表柔比星(Ellence)、蒽環類抗生素類似物，諸如米托蒽醌、放射菌素D，非嵌入拓撲異構酶抑制劑，諸如表鬼臼毒素(依托泊苷＝VP16、替尼泊甙＝VM-26)、鬼臼毒素，博萊霉素(Bleo)、培洛霉素、與核酸形成加合物的化合物，包括鉑衍生物(如順鉑(CDDP)、順鉑的反式類似物、卡鉑、異丙鉑、四鉑和奧沙利鉑)，喜樹堿、拓撲替康、伊力替康(CPT-11)和SN-38。核酸損傷療法的特定實例包括放射法(如紫外線(UV)、紅外線(IR)或α-、β-或γ-射線)和環境沖擊(如體溫過高)。
此處所用術語“抗增殖療法”和“抗增殖劑”指直接或間接抑制細胞、病毒、細菌或其它單細胞或多細胞生物體的增殖，而無論該療法或藥劑是否損傷核酸的任何治療方案。抗增殖劑的特定實例為可抑制細胞增殖，或病毒增殖或復制的抗腫瘤和抗病毒藥物。特定實例還包括，環磷酰胺、硫唑嘌呤、環孢菌素A、脫氫皮甾醇、美法侖、苯丁酸氮芥、氮芥、白消安、氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、紫杉醇、長春花堿、長春新堿、阿霉素、放射菌素D、光輝霉素，卡氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、鏈脲菌素、羥基脲、順鉑、米托坦、甲基芐肼、氮烯咪唑胺和二溴甘露醇。引起核酸復制錯誤或抑制核酸復制的抗增殖劑如核苷和核苷酸類似物(如AZT或5-AZC)。
本發明的肽和肽模擬物也可增強微管穩定劑或破壞穩定劑，如長春花生物堿(長春花堿＝VLB、長春新堿＝VCR、長春瑞賓＝VRLB、長春氟寧＝VFL)和紫杉烷類藥物(紫杉醇和多烯紫杉醇＝taxotare)的抗細胞增殖活性。因此，本發明的組合物可進一步地包括這類藥劑，并將其應用于本發明方法中。
利用本發明的化合物可治療的細胞包括，任何被希望抑制或避免其體外、離體或體內增殖的細胞。特定靶細胞表現為細胞周期G1關卡時間短于正常細胞，或者具有受損的細胞周期G1關卡，從而使該細胞遠是否在轉而完成核酸修復之前便已退出G1關卡。因此候選細胞包括快速增殖的細胞，而無論該細胞是否正常或異常。特定實例為良性或腫瘤性、轉移性或非遷轉性的細胞。其它候選細胞可通過測定其增殖速率或其停留于G1期的時間長度識別。也可通過使實驗細胞與本發明的化合物單獨接觸，或聯合核酸損傷療法，確定已接觸細胞是否表現為增殖減少或細胞死亡或凋亡/突變增多，從而識別候選細胞。
因此，本發明的化合物有助于抑制細胞于體外、離體及體內的增殖。同樣，可單純利用本發明的化合物，或聯合可直接或間接損傷核酸的療法或抗增殖療法，對患有或處于患有以異常、不良或有害的細胞增殖或細胞存活，或異常或缺乏的細胞分化為特征的病癥或生理狀況危險的受試者進行治療。
因此，根據本發明，提供了抑制細胞增殖的方法、提高細胞對核酸損傷劑或療法的敏感性的方法，以及增加對體外、離體和體內細胞的核酸損傷的方法。一種實施方案中的方法包括使細胞(如培養細胞或存在于受試者體內的細胞)與一定量足以抑制該細胞增殖的本發明肽或肽模擬物接觸。另一種實施方案中的方法包括使細胞與一定量足以提高細胞對核酸損傷劑或療法敏感性的本發明肽或肽模擬物接觸。還有一種實施方案中的方法包括使細胞與一定量足以增加對該細胞的核酸損傷的本發明肽或肽模擬物接觸。多種情況中的方法進一步包括使細胞與核酸損傷劑接觸，或者使細胞暴露于核酸損傷療法。
本發明進一步提供了治療受試者體內細胞增殖異常或分化異常的方法，這些狀況包括以不良或有害的細胞增殖或細胞存活為特征的狀況、以缺乏或異常凋亡為特征的狀況、以異常或缺乏細胞存活為特征的狀況，也包括以異常或缺乏細胞分化為特征的狀況。一種實施方案中的方法包括對患有細胞增殖異常或處于患有細胞增殖異常危險的受試者施用一定量可有效治療細胞增殖異常的本發明肽或肽模擬物。一種情況中，該用量足以改善受試者的狀況。一些特定情況中，該改善包括在至少一部分的靶細胞(如異常增殖細胞)中出現細胞增殖減少、細胞數量減少、細胞數量的增加受抑制、凋亡增加或存活減少。還有一種情況，在對受試者施用可抑制細胞增殖的療法之前、同時或之后施用本發明的化合物。其它特定情況中，至少一部分增殖異常的細胞位于血液、乳腺、肺、甲狀腺、頭或頸、腦、淋巴、胃腸道、生殖性泌尿道、腎、胰腺、肝臟、骨、肌肉或皮膚中。
另一種實施方案中的方法包括對受試者施用一定量的本發明化合物以治療實體瘤。還有一種實施方案中的方法包括對受試者施用一定量的本發明化合物以治療液態瘤。多種情況中，是在對荷瘤受試者施用其它抗腫瘤療法之前、同時或之后施用本發明的化合物。
此處所用術語“增殖異常”和“增殖狀況”指以異常或不良增殖(如細胞、病毒、細菌、真菌等的增殖)為特征的任何病理性或非病理性的生理狀況。術語“細胞增殖異常”和“細胞增殖狀況”指以異常或不良細胞增殖為特征的任何病理性或非病理性的生理狀況，也包括以不良或有害細胞增殖或細胞存活(如由于缺乏凋亡)為特征的狀況、以缺乏或異常凋亡為特征的狀況，和以異常、不良或有害細胞存活為特征的狀況。術語“分化異常”指以異常或缺乏分化為特征的任何病理性或非病理性的生理狀況。
適用于本發明療法的增殖或分化異常包括以異常或不良的細胞數量、細胞生長或細胞存活為特征的疾病和非病理性生理狀況，包括良性的和瘤性的。因此這種異常或狀況可能構成疾病狀態，并包括所有類型的癌生長或致瘤過程、轉移組織或惡性轉化細胞、組織或器官，或者可能是非病理性的，即正常的偏離，但并不與疾病典型相關。根據本發明可治療的非病理性狀況包括源于創傷修復的組織再生長，而該創傷修復可致使疤痕形成。
存在增生或分化異常的細胞可聚集成一個細胞群或者處于分散狀態。術語“實體瘤”指典型地聚集在一起并形成群體的瘤形成或轉移。特定實例包括內臟瘤，如胃或結腸癌、肝細胞瘤、腎癌、肺和腦腫瘤/癌。“液態瘤”指造血系統的瘤形成，如淋巴瘤、骨髓瘤和白血病，或者是由于未典型地形成實體瘤而實際上處于擴散狀態的瘤形成。白血病的特定實例包括急性和慢性成淋巴細胞的白血病、成髓細胞的白血病及多發性骨髓瘤。
這類異常包括可實際影響任何細胞或組織類型的贅生物或癌癥，如癌、肉瘤、黑素瘤、轉移異常或造血性瘤形成異常。轉移瘤可來源自許多初生腫瘤類型，包括但不僅限于乳腺、肺、甲狀腺、頭和頸、腦、淋巴、胃腸(口、食道、胃、小腸、結腸、直腸)、生殖性泌尿道(子宮、卵巢、子宮頸、膀胱、睪丸、陰莖、前列腺)、腎、胰腺、肝臟、骨、肌肉、皮膚等。
癌指上皮或內分泌組織的惡性腫瘤，包括呼吸系統癌、胃腸系統癌、生殖泌尿系統癌、睪丸癌、乳癌、前列腺癌、內分泌系統癌及黑素瘤。典型的癌包括形成自子宮頸、肺、前列腺、乳腺、頭和頸、結腸、肝和卵巢的癌。該術語也包括癌肉瘤，例如包括由癌性和肉瘤性組織構成的惡性腫瘤。腺癌包括腺組織的癌，或內部形成腺狀結構的腫瘤。
肉瘤指間質細胞來源的惡性腫瘤。典型肉瘤包括例如，淋巴肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤和纖維肉瘤。
此處所用術語“造血性增殖異常”指涉及增生性/贅生性造血起源細胞的疾病，如來源自骨髓、淋巴或紅細胞系，或其前體細胞。典型的這類疾病起因于分化不足的急性白血病，如成紅血細胞白血病和急性成巨核細胞白血病。骨髓異常的其它實例包括但不僅限于急性前髓細胞白血病(APML)、急性髓細胞白血病(AML)及慢性髓細胞白血病(CML)；淋巴惡性腫瘤包括但不僅限于包括B細胞系ALL和T細胞系ALL的急性成淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、前淋巴細胞白血病(PLL)、毛細胞白血病(HLL)和Waldenstrom’s巨球蛋白癥(WM)。其它惡性淋巴瘤包括但不僅限于非Hodgkin淋巴瘤及其變體、外周T細胞淋巴瘤、成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、大顆粒淋巴細胞白血病(LGF)、Hodgkin’s病和Reed-Sternberg病。
與本發明的化合物聯合應用的療法包括此處公開或本領域已知的任何抗增殖、核酸損傷或抗腫瘤療法。例如，抗細胞增殖或抗腫瘤療法可能包括放射療法或外科切除，并任意聯合藥物療法。該療法可能包括施用化學物質，如放射性同位素、諸如化療劑的藥物，或者包括遺傳療法，諸如抗致癌基因(如Rb、DCC、p53等)、顯性失活致癌基因或反義致癌基因。該化合物可于其它治療方案實施之前、同時或之后施用。例如，對有待于進行抗細胞增殖療法(如放射療法、化學療法、基因療法、外科切除術等)的候選受試者而言，可于開始實施抗細胞增殖療法之前施用本發明的化合物。因此，本發明提供了預防性治療方法。
術語“受試者”指動物，典型的為哺乳動物，如靈長類(人類、猿、長臂猿、黑猩猩、猩猩、短尾猿)、家畜(狗和貓)、農場動物(馬、牛、山羊、綿羊、豬)及實驗動物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。受試者包括動物疾病模型(如攜帶瘤的小鼠)。
適合接受治療的受試者包括當前正經歷或候選接受針對增生或分化異常的治療(如抗腫瘤療法)的受試者。其它候選受試者包括例如，處于細胞增殖異常發展中危險的受試者。因此，本發明方法可應用于治療處于細胞增殖異常發展中危險，但還未表現出該異常的明顯癥狀的受試者。具有可發展細胞增殖異常的遺傳性素質或家族史的受試者被認為是處于危險的受試者。例如，以具有活性致癌基因，或腫瘤抑制基因突變或缺失的受試者為候選受試者。因此，可利用常規遺傳篩選確定是否存在遺傳性損害，或詢問受試者的家族史，以確定其是否處于該類異常的危險中，從而鑒定處于危險的受試者。處于危險的受試者的一個特定實例是具有家族史，或其它顯示出易患癌癥素質的遺傳特征的受試者，該受試者體內的贅生性或抗藥贅生性細胞表達CD40。遺傳性疾病的一個具體特定實例是由于缺乏Rb腫瘤抑制基因而導致的眼癌。
給藥量典型地為“有效量”或“足夠量”，即足以產生預期效果的量。因此，有效量包括可獲得下述一種或多種效果的量至少一部分包含增殖細胞的細胞(如至少一部分靶細胞)增殖減少、細胞數量減少、增多的增殖受抑制、增加的細胞數量受抑制、凋亡增加或存活減少。因此，例如，當希望細胞增殖受抑制時，有效量為可檢測到細胞增殖或增殖細胞數量減少，或者細胞凋亡增加或細胞存活減少現象的量。因此該量足以降低靶細胞數量、穩定靶細胞數量或抑制靶細胞數量的增加。例如，當異常包括實體瘤時，腫瘤尺寸縮減、穩定，或阻斷至少一部分腫瘤的進一步生長(如抑制包含腫瘤團塊的5-10％，或10-20％或更多細胞的生長)即為令人滿意的臨床性指標。當異常包括液態瘤時，則腫瘤細胞數量減少、穩定，或抑制了至少一個亞群的腫瘤細胞數量的進一步增加(如抑制5-10％或10-20％或更多細胞的生長)為令人滿意的臨床性指標。
此外，被認為有效的量應可預防或抑制疾病狀況或異常的發展。例如，某些腫瘤隨著發展日益具有侵略性，包括進展為轉移瘤形式。因此，可減少或預防腫瘤日益具有侵略性或轉移現象的量也被認為是有效量。相應的，抑制或預防異常或疾病狀況的惡化，即疾病狀況穩定也是另一項令人滿意的臨床性指標。
檢查含液態瘤的生物樣本(如血液或組織樣本)，可確定腫瘤細胞團塊或數量是否已縮減，或者腫瘤細胞增殖的抑制是否已出現。對實體瘤而言，侵入性和非侵入性成像方法可探知腫瘤尺寸減少，或腫瘤尺寸的增加受抑制的情況。受體陽性腫瘤的受體量減少可被用于評估腫瘤細胞增殖的減少或抑制情況。激素生成瘤，如胸、睪丸或卵巢癌的激素量可被用于評估腫瘤增殖的減少或抑制情況。
有效量也可在客觀或主觀上減低或減少與異常或疾病相關癥狀的嚴重程度或發作頻率。例如，本發明化合物可緩解疼痛、嘔吐或其它不適癥狀，或增進食欲或自覺良好的量即為令人滿意的臨床性指標。
有效量也包括采用其它方案治療的用量(如劑量)或頻率的減少，這也被認為是令人滿意的臨床性指標。例如，采用本發明化合物治療的癌癥患者可能需要較少的核酸損傷療法以抑制癌癥細胞增殖。該實例中，有效量包括與未經本發明化合物治療的受試者相比，可減少對經本發明化合物治療的受試者所施用核酸損傷劑的給藥頻率或用量的量。
可改善受試者的疾病狀況或治療效果的本發明方法在持續時間上相對較短，例如，改善可能持續若干小時、天或周，或延續更長的一段時間，如數月或年。有效量并不一定能完全根除疾病狀況或異常情況的任意或所有癥狀。因此，當采用任何適用于確定異常或疾病狀況的上述標準或本領域已知的其它標準，以確定受試者狀況隨著短或長的時間段，出現主觀或客觀上的改善時，便實現了對應于有效量的令人滿意的臨床性指標。正如此處所描述或本領域已知的，一定量可有效提供一種或多種有利效果的情況被稱為受試者疾病狀況的“改善”或對受試者有“治療有益”。
基于動物研究或任選的人類臨床試驗中的結果，可確定本發明化合物的有效量。本領域技術人員將意識到可能影響治療特定受試者所需劑量或時機的多種因素，如一般健康狀況、年齡或受試者的性別、異常或狀況的嚴重程度或階段、之前的治療、對不良副作用的易感性、預期的臨床效果及其它異常或疾病狀況的存在情況。這些因素可能影響提供對治療效果而言的充分量所需的劑量和時機。給藥方案也考慮到藥物代謝動力學，即藥物組合物的吸收速率、生物利用率、新陳代謝及清除(見如Egleton(1997)“Bioavailability and transport ofpeptides and peptide drugs into the brain”Peptides181431-1439；和Langer(1990)Science 2491527-1533)。此外，對劑量或治療方案可特定地進行調整或基于藥物基因組數據進行改動以適應特定受試者。
因此，根據任何可實現預期效果的方案或途徑，可全身性、區域(如直接針對器官或組織，如通過注射進入門靜脈以治療肝臟的細胞增殖異常)或局部地(如直接進入腫瘤團塊)單獨施用本發明的化合物，或將其作為藥物組合物施用。可將該化合物和藥物組合物作為每天單劑或多劑(如以低劑量)，或間斷地(如以較高劑量每隔一天、一周一次等)施用。該化合物和藥物組成可借助于吸入(如氣管內)、口服、靜脈內、動脈內、脈管內、鞘內、腹膜內、肌肉內、皮下、腔內、經皮(如局部)、經粘膜(如頰、膀胱、陰道、子宮、直腸或鼻部)方式通過多次給藥、持續釋放(如隨著時間逐漸灌注)或單個藥團而得以施用。施用藥物所需的可植入裝置，包括微型加工裝置是本領域所熟知的，并且也可用于將本發明的化合物送遞給受試者。
靜脈(IV)給藥的化合物應于若干小時(典型的1、3或6小時)內，隨時間以大約0.01mg/hr到大約1.0mg/hr的速率施用，該方式可間斷周期性地重復一周或數周。當將藥物施用于隱蔽位點，且不進入血流，如進入體腔或器官內腔，如腦脊髓液(CSF)中時，可特定地采用更大的劑量(如直至大約10mg/ml)。
因此，本發明進一步提供了若干藥物組合物。這些藥物組合物有助于對受試者進行的體內或體外給藥，也有助于，例如采用本發明的化合物治療受試者。
此處所用術語“藥學可接受的”和“生理學可接受的”包括適合藥物施用的溶劑(水性或非水性)、溶液、乳劑、分散介質、包衣、等滲和吸收促進或延遲劑。因此，“藥物組合物”或“藥物配方”指適合在受試者體內發揮藥物用途的組合物。該藥物組合物和配方包括一定量的本發明化合物，例如，有效量的本發明的肽或肽模擬物、編碼相同肽或肽模擬物的核酸、載體或細胞，以及藥學或生理學可接受載體。
藥物組合物可被配制得適合特定給藥途徑，全身或局部的。因此，藥物組合物包括適合通過多種途徑給藥的載體、稀釋劑或賦形劑。
腸內(口服)給藥的配方可包含于片劑(有包衣或無包衣)、膠囊(硬或軟)、微球、乳劑、粉末、顆粒、晶體、懸液、糖漿或酏劑中。包括例如，藥品級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂的常規無毒性固體載體也可用于制備固體配方。輔助性的活性化合物(如防腐劑、抗菌劑、抗病毒和抗真菌劑)也可被摻入配方中。液體配方也可用于腸內給藥。載體可選自多種油，包括石油、動物油、植物油或合成油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油。合適的藥物賦形劑包括例如淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、天然碳酸鈣、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油硬脂酸酯、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇。
腸內、胃腸外或經粘膜送遞方式所用的藥物組合物包括例如，水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、Hank’s溶液、Ringer’s溶液、右旋糖/鹽水和葡萄糖溶液。配方可含有近似于生理條件的輔助性物質，如緩沖劑、有效滲透壓當量調整劑、潤濕劑、去污劑等。添加劑也可包括其它活性成分，如殺菌劑或穩定劑。例如，溶液可含有乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸失水山梨醇酯或三乙醇胺油酸鹽。Bai(1997)J.Neuroimmunol.8065-75；Warren(1997)J.Neurol.Sci.15231-38；以及Tonegawa(1997)J.Exp.Med.186507-515中描述了其它胃腸外配方和方法。胃腸外制劑可被封入安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多次劑量小瓶內。
皮內或皮下給藥所用的藥物組合物可包括無菌稀釋劑，如水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或甲基對羥基苯甲酸酯類；抗氧化劑，如抗壞血酸、谷胱甘肽或亞硫酸氫鈉；鰲合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖劑，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及調整有效滲透壓當量所用的物質，如氯化鈉或右旋糖。
注射所用的藥物組合物包括水性溶液(水溶的)或分散體系，以及用于臨時制備無菌可注射溶液或分散體系的無菌粉末。對靜脈內給藥而言，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。載體可為含有例如，水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液態聚乙二醇等)及以上物質的合適混合物的溶劑或分散介質。流動性可通過利用涂層，如卵磷脂，通過在分散體系情況中維持必需的顆粒尺寸，以及通過利用表面活性劑維持。抗菌和抗真菌劑包括例如，對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸和硫柳汞。組合物可包括等滲劑，如糖，諸如甘露醇、山梨糖醇的多元醇，氯化鈉。為便于應用，可將相應的溶液包裝，或將其凍干，給藥前，將凍干制劑與無菌溶液組合使用。
藥物可接受載體可含有使吸收或清除穩定、提高或延遲的化合物。這種化合物包括例如，碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖或右旋糖；低分子量蛋白質；可降低肽的清除或水解程度的組合物；賦形劑或其它穩定劑和/或緩沖劑。可延遲吸收的物質包括例如，單硬脂酸鋁和明膠。去污劑也可用于穩定、提高或降低藥物組合物的吸收程度，包括脂質體載體。為避免化合物被消化，可將其與某些組合物復合，以使其具有抗酸性和酶水解性，或者將該化合物復合進合適的抗性載體，如脂質體內。保護化合物不被消化的方法是本領域已知的(見如Fix(1996)Pharm Res.131760-1764；Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.48119-135；以及U.S.Patent 5,391,377，描述了口服送遞治療藥劑所用的脂質組合物)。
對經粘膜或經皮給藥而言，配方中采用了有助于載體滲透的滲透劑。這種滲透劑通常是本領域已知的，包括例如，對經粘膜給藥而言的去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經粘膜給藥可借助于鼻部噴霧劑或栓劑(見如Sayani(1996)“Systemic delivery of peptides andproteins across absorptive mucosae”Crit.Rev.Ther.DrugCarrier Syst.1385-184)。對經皮給藥而言，可配制進軟膏、油膏、凝膠或乳膏中的活性化合物通常是本領域已知的。經皮送遞體系也可利用藥膏實現。
對吸入送遞而言，藥物配方可以氣溶膠或霧劑形式施用。對氣溶膠給藥而言，配方可以精細分割形式連同表面活性劑和推進劑一起應用。另一種實施方案中，將配方送遞至呼吸組織所用的裝置內可使配方氣化。本領域已知的其它送遞體系包括干粉氣溶膠、液體送遞體系、吸入器、噴氣式噴霧器及推進系統(見如Patton(1998)Biotechniques 16141-143；Dura Pharmaceuticals，San Diego，CA；Aradigm，Hayward，CA；Aerogen，Santa Clara，CA；以及InhaleTherapeutic Systems，San Carlos，CA)。
生物可降解、生物相容的聚合物也可利用，如乙烯醋酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這種配方的制備方法是本領域技術人員已知的。原料也可通過商業渠道獲自AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals，Inc。脂質體懸液(包括利用抗體或病毒外殼蛋白導向于細胞或組織的脂質體)也可被用作藥物可接受載體。根據本領域已知方法可制備上述物質，例如，U.S.PatentNos.4,235,871；4,501,728；4,522,811；4,837,028；6,110,490；6,096,716；5,283,185；5,279,833；Akimaru(1995)Cytokines Mol.Ther.1197-210；Alving(1995)Immunol.Rev.1455-31；以及Szoka(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467中描述的方法。可持續送遞包括肽在內的小分子的生物可降解微球或膠囊，或其它生物可降解聚合物構型是本領域已知的(見如Putney(1998)Nat.Biotechnol.16153-157)。本發明的化合物可被摻入微團內(見如Suntres(1994)J.Pharm.Pharmacol.4623-28；Woodle(1992)Pharm.Res.9260-265)。肽可附著在脂質單層或雙層表面上。例如，肽可附著在含酰肼-PEG-(二硬脂酰基磷脂酰基)乙醇胺的脂質體上(見如Zalipsky(1995)Bioconjug.Chem.6705-708)。可選地，可采用任何形式的脂質膜，如平面脂質膜或完整細胞，如紅血球的細胞膜。可通過任何方式送遞脂質體和含脂質配方，包括例如，靜脈內、經皮(見如Vutla(1996)J.Pharm.Sci.855-8)、經粘膜或口服給藥。
藥物可接受配方可含大約1％-99.9％的活性成分(如肽或肽模擬物)。藥物組合物可通過常規、熟知的滅菌技術進行滅菌，或通過過濾方式除菌。
其它藥物配方及送遞體系是本領域所已知的，也可適用于本發明的方法和組合物(見如Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA；The Merck Index(1996)12th ed.，Merck Publishing Group，Whitehouse，NJ；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms，TechnonicPublishing Co.，Inc.，Lancaster，Pa.，(1993)；以及Poznanskyet al.，Drug Delivery Systems，R.L.Juliano，ed.，Oxford，N.Y.(1980)，pp.253-315)。
藥物配方可以單位劑量形式包裝以便于給藥和劑量均勻。此處所用的“單位劑量形式”指適合對待治療的受試者施用的物理分離的單位劑量；每一單位均含有預定量、與藥物載體或賦形劑組合可產生預期效果的化合物。
本發明進一步提供了包含本發明化合物及其藥物配方的試劑盒，該試劑盒可被任選地包裝在合適的包裝材料中。試劑盒典型地包括描述了其內含組分體外、體內或離體使用的標簽或包裝插頁使用說明書。試劑盒可容納這些組分的集合，如兩種或以上本發明化合物，或與核酸損傷劑或抗增殖劑聯合的本發明化合物。
術語“包裝材料”指容納試劑盒各組分的物理結構。該包裝時料可維持組分無菌狀態，并可由通常用于此類用途的材料制成(如紙、瓦楞紙、玻璃、塑料、金屬箔、安瓿等)。標簽或包裝插頁可包括適當的印刷說明。因此，本發明的試劑盒可另外包括描述以本發明的任何方法使用該試劑盒組分的標簽或說明書。說明書可包括針對實踐此處所描述的本發明任何方法的說明，包括治療、檢測、監測或診斷方法。因此，例如，試劑盒可包括與針對在本發明的治療方法中施用化合物的說明書一起被放置于同一包裝或分配器內的本發明化合物。說明書可另外包括對令人滿意的臨床終點或任何可能出現的不良癥狀的指示，或管理機構，如食品及藥物管理局所要求的針對人類受試者用途的其它信息。
說明書可印在“印刷品”上，如試劑盒內置或帖附的紙或紙板上，或是試劑盒或包裝材料帖附的標簽上，或是容納試劑盒各組分的小瓶或試管帖附的標簽上。說明書可另外存儲于計算機可讀媒介上，如磁盤(軟盤或硬盤)、光學CD，如CD-或DVD-ROM/RAM、磁帶、電存儲介質，如RAM和ROM、IC tip及以上介質的混合，如磁/光學存儲介質。
本發明試劑盒可另外包括藥物配方中的緩沖劑、保護劑或穩定劑。試劑盒中的各組分均可被封入單個容器內，且所有容器均容納于同一包裝內。本發明試劑盒可被設計為適合冷藏。
下列內容為此處所用的縮寫詞Cha環己基-丙氨酸Phe-2，3，4，5，6-F氟位于苯丙氨酸的苯基殘基上的2，3，4，5，6位F氟Bpa苯酰基-苯丙氨酸Nal(2)2-萘基-丙氨酰基Ala(3-Bzt)(3-苯并噻吩基)-丙氨酸Nal(1)l-萘基-丙氨酰基Dph二苯基-丙氨酸Ala(tBu)叔丁基-丙氨酰基Cys(tBu)叔丁基-半胱氨酸Phe-3，4，5-F氟位于苯丙氨酸的苯基上的3，4，5位Phe-4CF3CF3位于苯丙氨酸的苯基殘基上的4位Phe-3Br，4Cl，5Br溴位于苯丙氨酸的苯基上的3位，氯位于4位，另一個溴位于5位Phe-4Cl氯位于苯丙氨酸的苯基上的4位P1，P2，P3，P4，P5，P6等和(P1，P2，P3，P4，P5，P6等)；以及P7，P8，P9，P10，P11，P12等和(P7，P8，P9，P10，P11，P12等)分別為P1，P2，P3，P4，P5，P6等，和P7，P8，P9，P10，P11，P12的連續序列。
如無另外指明，此處所用的所有技術性和科學性術語均與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的意義相同。盡管類似或等效于此處所描述內容的方法和材料也可應用于本發明的實踐或試驗中，此處僅描述了合適的方法和材料。
此處提及的全部出版物、專利及其它參考文獻均被引入，以供全面參考。出現沖突的情況下，以包括定義的本說明書為標準。
如上下文未另外指明，此處所用的單數形式“一種”、“一個”、“該”和“是”包括復數對象。因此，例如涉及的“化合物”包括復數的化合物，涉及的“殘基”或“氨基酸”包括一個或多個殘基和氨基酸。
此處描述了本發明的大量實施方案。但應當理解對這些實施方案可作出多種改動，而不偏離本發明的精神實質和范疇。相應地，下述實施例僅用于例證，對權利要求所描述的本發明范疇不構成限制。
實施例實施例1該實例描述了材料和若干方法。也描述了所分析的肽/肽模擬物的序列。
化學藥品及試劑博萊霉素購自Wako Pure Chemical Co.(Osaka，Japan)，并溶解于蒸餾水中至10mg/ml濃度。碘化丙啶(PI)和阿霉素購自Sigma(St.Louis，MO)。
細胞培養于37℃/5％CO2條件下，在補充有10％胎牛血清(IBLImmuno-Biological Laboratories，Gunma，Japan)的RPMI 1640(Sigma)中培養人類T細胞白血病來源的細胞系，Jurkat。于37℃/5％CO2條件下，在補充有10％胎牛血清的DMEM中培養人類胰腺癌來源的細胞系，MIAPaCa2。
細胞周期分析如Kawabe(1997)Nature 385454-458所描述的方法，通過流式細胞儀分析經博萊霉素或阿霉素處理后的細胞的細胞周期狀況。簡言之，4℃下，將2百萬個細胞重新懸浮于200μlKrishan’s溶液(0.1％檸檬酸鈉、50μg/ml PI、20μg/ml RNase A及0.5％NP-40)中并培養1小時，利用流式細胞儀FACScanTM(BecktonDickinson，Mountain View，CA)和程序CELLQuestTM(BecktonDickinson)分析。
表1.典型肽/多肽模擬物的序列及相應的代碼名稱

表1.典型肽/多肽模擬物的序列及相應的代碼名稱

實施例2該實施例描述了說明多種肽的G2取消活性的數據，及多種序列排列對活性的影響，包括縮短序列長度對活性的影響。
采用人類白血病來源的Jurkat細胞系進行G2關卡取消的流式細胞儀分析。簡言之，采用多種劑量的肽/肽模擬物，和40μg/ml的博萊霉素處理培養細胞24小時。采用碘化丙啶染色細胞的DNA，并利用流式細胞儀分析。結果參見表2。
針對經博萊霉素處理的Jurkat細胞，采用各種肽/肽模擬物的劑量反應曲線如圖1、5、6、7、8、11和12所示；Y軸指示處理后24小時Jurkat細胞的％G2/M值。
采用經秋水仙堿(5μg/ml或0.5μg/ml)和多個劑量的肽/肽模擬物處理24小時后的人類T細胞白血病Jurkat細胞系，對通過本發明化合物作用獲得的M期關卡取消進行流式細胞儀分析(圖12)。染色細胞的DNA，并如上所述利用流式細胞儀分析。結果也參見表2。
針對經秋水仙堿處理的Jurkat細胞，采用各種肽/肽模擬物的劑量反應曲線如圖2和14所示；Y軸指示處理后24小時Jurkat細胞的％G2/M值。
表2.誘導G2關卡取消或副作用的化合物的劑量單獨應用時副作用G2取消劑量 采用秋水仙堿時的出現 副作用的出現代號 (μM) (μM)(μM)

“單獨應用時副作用的出現”表示出現Jurkat細胞周期受干擾現象的肽/肽模擬物劑量，即出現了大量的SubG1細胞(死細胞)或每個細胞DNA含量變化多于通常量的細胞。例如，G1細胞通常在FACS分析中表現出一個尖峰，但經處理后，細胞周期被擾亂時，該尖峰變寬變低，說明出現了不正確的細胞周期進展或細胞死亡的開始。“G2取消劑量”表示連同40μg/ml博萊霉素一起處理24小時后，產生可檢測的G2關卡取消活性的肽/肽模擬物劑量。“采用秋水仙堿時副作用的出現”表示連同5μg/ml秋水仙堿一起處理24小時后，出現Jurkat細胞周期受干擾現象的肽/肽模擬物劑量。
在多種細胞系中研究當CBP501與順鉑聯合應用時的G2關卡取消活性。簡言之，將順鉑(3μg/ml)和CBP501(0.4、2和10μM)同時添加至已于37℃，5％CO2條件下培養3小時的細胞培養物中。吸出培養基，添加不含上述化合物的新鮮培養基，繼續培養細胞45小時。采用胰蛋白酶-EDTA溶液收獲包括懸浮細胞在內的細胞，以Krishan’s溶液進行培養，并如上所述利用流式細胞儀分析DNA含量。結果參見表3。除HUVEC外，陰影加強表示顯著喪失G2群體，且subG1群體增多的細胞系，說明經CBP501處理后，出現了G2關卡取消現象，并提高了細胞對順鉑的敏感性。觀察結果是至少直至50μM CBP501時，具有正常G1關卡的HUVEC細胞才具有對順鉑的敏感性，說明CBP501對G2關卡具有特異性，而不是非特異性的。
表3.CBP501針對多種細胞系的G2關卡取消劑量

研究不同劑量的多種化合物在經博萊霉素(Bleo)或阿霉素(ADR)處理的人類胰腺癌來源細胞系MIAPaCa2上表現出的G2關卡取消活性。簡言之，采用本發明化合物和博萊霉素(10μg/ml)或阿霉素(1μg/ml)培養細胞3小時。更換培養基并繼續培養21小時。采用碘化丙啶對收獲的細胞進行DNA染色，并如上所述利用流式細胞儀分析。圖3中，sub-G1細胞群體的百分數被表示為死細胞。結果說明CBP501以劑量依賴方式使MIAPaCa2易對博萊霉素和阿霉素敏感。
圖4A和4C總結了采用若干對特定肽所獲G2關卡取消活性的結果，其中該特定肽對之間存在一個氨基酸殘基的差異。如上所述，采用經博萊霉素處理的Jurkat細胞分析這些肽的G2關卡取消活性。圖4B總結了采用若干對特定肽所獲M關卡取消活性和/或非特異性毒性分析結果，其中該特定肽對之間存在一個氨基酸殘基的差異。如上所述，采用經秋水仙堿處理的Jurkat細胞分析這些肽的M關卡取消活性和/或非特異性毒性。
研究不同劑量的多種富精氨酸序列在經博萊霉素處理的細胞上表現出的G2關卡取消活性。簡言之，將濃度分別為0.2μg/ml、0.39μg/ml、0.78μg/ml、1.56μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml的肽添加至含有經博萊霉素(40μg/ml)處理的Jurkat細胞的培養基中。24小時后收獲細胞，采用Krishan’s溶液染色，并如上所述利用流式細胞儀分析。圖5中，用％G2/M細胞值(Y軸)對肽劑量(X軸)作圖。數據說明與具有較少或較多數量殘基的序列相比，“(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO137)”富堿性殘基序列是可獲得最令人滿意結果的序列。
研究不同劑量無(D-Bpa)的肽在經博萊霉素處理的細胞上表現出的G2關卡取消活性。簡言之，將濃度分別為0.2μg/ml、0.39μg/ml、0.78μg/ml、1.56μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml的肽添加至含有經博萊霉素(40μg/ml)處理的Jurkat細胞的培養基中。如上所述，收獲細胞并利用流式細胞儀分析。圖6中，用％G2/M細胞值(Y軸)對肽劑量(X軸)作圖。數據說明序列(Tyr)(Ser)(Pro)(Trp)(Ser)(Phe-2，3，4，5，6F)(Cha)(SEQ IDNO138)與序列(Bpa)(Ser)(Trp)(Ser)(Phe-2，3，4，5，6F)(Cha)(SEQ ID NO139)的G2關卡取消活性是可比較的。
研究不同劑量的富精氨酸和富賴氨酸序列在經博萊霉素處理的細胞上所表現出的G2關卡取消活性。簡言之，將指示劑量(X軸)的肽添加至含有經博萊霉素(40μg/ml)處理的Jurkat細胞的培養基中。如上所述，收獲細胞并利用流式細胞儀分析。圖7中，用％G2/M細胞值(Y軸)對肽劑量(X軸)作圖。結果說明對富堿性氨基酸序列而言，Arg序列似乎比Lys序列所表現出的活性更高，并且對序列的功能而言，Gln并非必需。
研究富精氨酸區位置變換序列的G2關卡取消活性。簡言之，將指示劑量(X軸)的肽添加至含有經博萊霉素(40μg/ml)處理的Jurkat細胞的培養基中。如上所述，收獲細胞并利用流式細胞儀分析。圖8中，用％G2/M細胞值(Y軸)對肽劑量作圖。
數據說明富精氨酸區位置的變換并不顯著改變肽的G2取消活性。此外，CBP501溶于水，而CBP511則不溶。由于某些體系優選的是水溶性化合物，因此這一差異對特定的藥物送遞體系而言是有利的。
圖9總結了采用多個肽對所獲得的分析結果，這些肽對之間僅存在一個氨基酸殘基的差異。如上所述，采用經博萊霉素處理的Jurkat細胞分析這些肽的G2關卡取消活性。
每個氨基酸的大小、電荷及疏水性決定了序列適合靶分子的有效程度。肽或肽模擬物的側鏈可自由移動，因此甚至當具有一個或兩個不利的側鏈時，該肽或肽模擬物也可適合靶分子的袋或溝。結果說明每條側鏈均存在一個優選尺寸，即對應每條側鏈的靶蛋白的結合區(袋或溝)尺寸。例如，具有環狀結構，如苯、吲哚和環己胺的側鏈決定了G2取消或M取消的強度和/或非特異性毒性；見圖9和4，其中成員數量多于5個的環狀結構影響G2取消活性(P1和P2的中等大小提高了G2取消活性)，反之，過大的結構(P1、P5和P6)則提高了M取消活性和/或非特異性毒性。
無環狀結構的側鏈似乎是中性的。因此，為獲得更高的活性，P1、P2、P4和P6處應具有正確大小的環狀結構，而P3和P5處均應無環狀結構，或者環狀結構少于6個成員。對P1、P2和P6而言，正確的環狀結構可為1-6員環，直至5或6員的兩個環融合而成的環狀結構。對P4而言，正確大小的環為5或6員的兩個環的融合結構。因此，對P1而言，Cha或Nal(2)似乎最合適；對P2而言，Phe-2，3，4，5，6F、Phe-3，4，5F或Phe-CF3似乎最合適。這些側鏈大小說明在靶分子中該區域起作用的位點存在兩個袋或一個較大的袋。對P3和P5而言，可接受小側鏈，如Ser或Pro，也可接受較大側鏈，如Arg，說明靶分子的這一區域內不存在結合區，因此側鏈可恰好與靶分子反向。不過，環狀結構有可能會使肽或肽模擬物與其它分子(即除了靶分子以外)相互作用，從而依次增加副作用。對P6而言，Bpa或Ser-Tyr似乎優于單個的Tyr或較小的側鏈，說明在靶分子中存在處于水平的較深的溝。基于對應于P4的殘基大小，也可能在靶分子中存在對應于P4的一個淺而寬的袋。
如上所述，利用Jurkat細胞和博萊霉素分析下列肽。肽序列如下CBP501，(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ IDNO80)；CBP700，(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO96)；CBP701，(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO97)；CBP702，(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO98)；和CBP703，(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO99).
結果說明，盡管CBP700、701、702、703短于其它示例肽，但仍保留了可與其它具有顯著G2關卡取消活性的肽相比較的G2關卡取消活性(圖11)。
利用CBP501比較G2關卡取消活性和非特異性毒性(M關卡取消)之間的差異。簡言之，分別采用經40μg/ml博萊霉素或0.5μg/ml秋水仙堿處理的Jurkat細胞檢驗G2關卡取消活性和非特異性毒性。如上所述，利用流式細胞儀分析兩種方式處理的細胞的DNA含量。數據說明CBP501是以劑量依賴方式取消G2關卡，而非特異性毒性則始終缺乏，直至50μM的肽時才出現，與通過M期停滯細胞未變化的百分比所確定的結果一致。
實施例3該實例描述了肽/肽模擬物激酶抑制活性，以及對多種肽的血清穩定性分析。
由于Chk1和Chk2這兩種激酶對G2關卡機制而言是重要的，因此對這兩種酶進行激酶抑制分析。除采用已純化的CHK2激酶代替PKC外，體外激酶抑制分析利用了“PepTag(R)非放射性蛋白激酶分析”，Promega，并依照說明書進行實驗。已純化的PKC購自UpstateBiotechnology，Inc.。結果如表4A所示。
表4A本發明化合物的激酶抑制分析

體外激酶抑制分析是由CycLex，Co.Ltd.，Nagano，Japan進行的。簡言之，以桿狀病毒來源、具有組氨酸標記的重組人類全長Chk1，或大腸桿菌來源、與GST融合的重組人類全長Chk2為激酶。以大腸桿菌來源的重組GST-Cdc25C(氨基酸167-267)為底物。反應條件為20mMHepes-KOH(pH7.5)、1mM DTT、80μg/ml BSA、10mM MgC12和50mM ATP，30℃持續60分鐘。利用抗-Cdc25C-磷酸化的S216抗體，并結合酶聯免疫實驗檢測GST-Cdc25C上的絲氨酸216的磷酸化作用。結果如表4B所示。
表4B本發明肽的激酶抑制分析

數據說明Chk1和Chk2的劑量高于G2取消劑量(通過CBP500、501、505、506、603獲得的G2取消的IC50均低于1μM)時均出現了激酶抑制現象。結果說明這些肽具有除抑制Chk1/2分子外的作用機制。可選地，本發明的肽可能累積于細胞內，從而使其在細胞內的濃度高于周圍培養基中的濃度。
進行血清分析以確定本發明的肽在小鼠和人類血清中的穩定性。簡言之，于37℃采用新鮮制備的人類血清培養肽(10mM或2.5mM)1小時。于37℃采用新鮮制備的小鼠血清培養CBP501(10mM)1小時。Jurkat細胞經血清處理，再采用或不采用肽和博萊霉素(40μg/ml)

奧沙利鉑對正常細胞的細胞毒性活性。因此，本發明肽似乎對經歷核酸損傷療法的正常細胞并未表現出G2取消活性，而對易感于核酸損傷療法的增生細胞，如癌癥細胞則表現出G2取消活性。結果說明本發明肽在使增殖細胞，而不使正常細胞易感于核酸損傷療法方面具有特異性。
表6采用AlamarBlue進行的MIAPaCa2的生長抑制分析

進行AlamarBlue分析實驗，在有和無順鉑的條件下分析CBP501的生長抑制活性。簡言之，于96孔培養板中，將密度為2500個細胞/孔的MIAPaCa2細胞暴露于1、3、10、30、100μM的順鉑，或是含有或無10μM順鉑的0.22、0.67、2、6和18μM的CBP501，平行實驗持續3小時。更換培養基并繼續培養24、48或72小時。培養結束后，將20μl AlamarBlue 90％試劑添加至各孔內，繼續培養6小時，利用熒光強度檢測細胞活力。熒光強度是利用激發波長530nm、發射波長590nm的Spectrafluor Plus讀板儀進行測定的。計算IC50(表6)。
該研究說明單獨應用CBP501抑制細胞生長的效果優于摩爾劑量的順鉑。將CBP501與近似治療癌癥所用劑量的10μM順鉑聯合應用時，其抑制細胞生長的劑量水平相當低。此外，CBP501的生長抑制活性長于順鉑；采用CBP501時，72小時的IC50遠高于采用順鉑時的結果。
通過定量腹膜內注射CBP501(40mg/kg)1、3和6小時后，小鼠血清中的CBP501含量，確定CBP501的體內半衰期。采用乙醇處理法除去取自注射小鼠的血清中的蛋白質，利用HPLC確定殘余完整CBP501的量(表7)。
參考例2丙烯酸橡膠的制備(B)丙烯酸橡膠(B)的制法與參考實例1相同，不同的是，480g的丙烯酸甲氧乙酯、480g的丙烯酸乙酯、480g的丙烯酸丁酯、160g的丙烯腈和8g的甲基丙烯酸烯丙酯被用來取代參考例1中使用的單體混合物。各組分的用量見表1。
參考例3丙烯酸橡膠的制備(C)丙烯酸橡膠(C)的制法與參考例1相同，不同的是，1440g的丙烯酸乙酯、160g的丙烯腈和8g的甲基丙烯酸烯丙酯被用來取代參考例1中使用的單體混合物。各組分的用量見表1。
參考例4丙烯酸橡膠的制備(D)丙烯酸橡膠(D)的制法與參考例1相同，不同的是，320g的丙烯酸甲氧乙酯、1200g的丙烯酸乙酯、80g的丙烯腈被用來取代參考例1中使用的單體混合物。各組分的用量見表1。
表1

參考例5接枝預聚體的制備(a)在容積為5l的不銹鋼高壓釜中加入2,000g純水。接著，2.5g聚乙烯醇作為懸浮劑溶解于其中。700g聚丙烯A(嵌段共聚物，粒徑3mm，乙烯含量5.9wt％)加入水中，并在攪拌作用下分散；由1.2g過氧化苯甲酰(自由基聚合引發劑，NOF公司生產，商品名Nyper B)、6g叔丁基過氧化甲基丙烯酰氧乙基碳酸酯(可自由基聚合有機過氧化物)、300g乙烯基單體混合物組成的單體混合物加入到釜中并攪拌。乙烯基單體混合物由100g苯乙烯、100g丙烯酸丁酯、100g甲基丙烯酸羥丙酯組成。
權利要求
1.一種連續的肽或肽模擬物序列，包含下列結構P1、P2、P3、P4、P5、P6(SEQ ID NO1)或P6、P5、P4、P3、P2、P1(SEQ ID NO2)；其中P1為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)，一個占據相似側鏈空間的氨基酸，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；其中P2為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2，一個占據相似側鏈空間的氨基酸，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；其中P3、P4、P5為任意氨基酸，或三者中的一個或以上為簡單碳鏈，從而使P2與P6之間的距離大約等同于P3、P4、P5均為氨基酸時的距離；其中P6為Bpa、Phe4NO2、任意氨基酸連同Tyr、任意氨基酸連同Phe、任意氨基酸或無任何基團。
2.權利要求1的肽或肽模擬物序列，其中具有簡單碳鏈的氨基酸為11-氨基十一酸、10-氨基癸酸、9-氨基壬酸、8-氨基辛酸、7-氨基庚酸、6-氨基己酸，或具有一個或多個不飽和碳鍵的相似結構。
3.權利要求1的肽或肽模擬物序列，其中任意氨基酸為Ser。
4.權利要求1的肽或肽模擬物序列，其中P4為Trp。
5.權利要求1的肽或肽模擬物序列，其中占據相似側鏈空間的氨基酸為Tyr或Phe。
6.一種連續的肽或肽模擬物序列，包含下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO3)；P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO4)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO5)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO6)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO7)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ IDNO8)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO9)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO10)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO11)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO12)；P12，P11，P6，P9，P8，P7，P2，P1(SEQ ID NO13)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO14)；P1，P2，P7，P8，P9，P6，P11，P12(SEQ IDNO15)；or P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO16)；其中P1為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2，一個占據相似側鏈空間的氨基酸(如d-或1-Tyr、d-或1-Phe)，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；其中P2為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)，一個占據相似側鏈空間的氨基酸，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；其中P3、P4、P5為任意氨基酸，或三者中的一個或以上為簡單碳鏈，從而使P2與P6之間的距離大約等同于P3、P4、P5均為氨基酸時的距離；其中P6為Bpa、Phe4NO2、任意氨基酸連同Tyr、任意氨基酸連同Phe；并且其中P7、P8、P9、P10、P11、P12中的至少三個為堿性氨基酸，其余則為任意氨基酸或缺乏。
7.權利要求6的肽或肽模擬物序列，其中具有簡單碳鏈的氨基酸為11-氨基十一酸、10-氨基癸酸、9-氨基壬酸、8-氨基辛酸、7-氨基庚酸、6-氨基己酸，或具有一個或多個不飽和碳鍵的相似結構。
8.權利要求6的肽或肽模擬物序列，其中任意氨基酸為Ser。
9.權利要求6的肽或肽模擬物序列，其中P4為Trp。
10.權利要求6的肽或肽模擬物序列，其中占據相似側鏈空間的氨基酸為Tyr或Phe。
11.一種連續的肽或肽模擬物序列，包含下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO17)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO18)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO19)；or P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO20)；其中P1為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2，一個占據相似側鏈空間的氨基酸，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；其中P2為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)，一個占據相似側鏈空間的氨基酸，或任何具有一個或兩個芳香、吡啶、吡嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉或嘧啶基團，或者側鏈具有一個吲哚、并環戊二烯、茚、萘、苯并呋喃、苯并噻吩、喹啉、二氫吲哚、苯并二氫呋喃、喹喔啉或喹唑啉基團的氨基酸；其中P3、P4、P5為任意氨基酸，或三者中的一個或以上為簡單碳鏈，從而使P2與P6之間的距離大約等同于P3、P4、P5均為氨基酸時的距離；其中P6為Bpa、Phe4NO2、任意氨基酸連同Tyr、任意氨基酸連同Phe、任意氨基酸或無任何基團；并且其中P7、P8、P9、P10、P11、P12中的至少三個為堿性氨基酸，其余則為任意氨基酸或缺乏。
12.權利要求11的肽或肽模擬物序列，其中具有簡單碳鏈的氨基酸為氨基十一酸或8-氨基辛酸。
13.權利要求11的肽或肽模擬物序列，其中任意氨基酸為Ser。
14.權利要求11的肽或肽模擬物序列，其中P4為Trp。
15.權利要求11的肽或肽模擬物序列，其中占據相似側鏈空間的氨基酸為Tyr或Phe。
16.一種連續的肽或肽模擬物序列，包含下列結構P1、P2、P3、P4、P5、P6(SEQ ID NO21)或P6、P5、P4、P3、P2、P1(SEQ ID NO22)；其中P1為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2、Tyr或Phe；其中P2為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2、Tyr或Phe；其中P3為Ser、Arg、Cys、Pro或Asn；其中P4為Trp；其中P5為Ser、Arg或Asn；或者其中P3、P4、P5為單個氨基十一酸或單個8-氨基辛酸；并且其中P6為Bpa、Phe4NO2、(Ser-Tyr)或(Ser-Phe)。
17.一種連續的肽或肽模擬物序列，包含下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO23)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO24)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO25)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO26)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO27)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO28)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO29)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO30)；P12，P11，P6，P9，P8，P7，P2，P1(SEQ ID NO31)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO32)；P1，P2，P7，P8，P9，P6，P11，P12(SEQ ID NO33)；or P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO34)；其中P1為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2、Tyr或Phe；其中P2為Cha、Nal(2)、(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)、Bpa、Phe4NO2、Tyr或Phe；其中P3為Ser、Arg、Cys、Pro或Asn；其中P4為Trp；其中P5為Ser、Arg或Asn；或者其中P3、P4、P5為單個氨基十一酸或單個8-氨基辛酸；其中P6為Bpa、Phe4NO2、(d-Ser-d-Tyr)或(d-Ser-d-Phe)；并且其中P7、P8、P9、P10、P11、P12中的至少三個為Arg或Lys，其余則為任意氨基酸或缺乏。
18.一種連續的肽或肽模擬物序列，包含下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO35)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO36)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO37)；or P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO38)；其中P1為Cha或Nal(2)；其中P2為(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5 F)、(Phe-4CF3)；其中P3為Ser；其中P4為Trp；其中P5為Ser或Asn；其中P6為Bpa、Phe4NO2、(Ser-Tyr)或(Ser-Phe)；并且其中P7、P8、P9、P10、P11、P12中至少三個為Arg，其余則為任意氨基酸或缺乏。
19.一種連續的肽或肽模擬物序列，包含下列結構P1、P2、P3、P4、P5、P6(SEQ ID NO39)或P6、P5、P4、P3、P2、P1(SEQ IDNO40)；其中P1為Cha或Nal(2)；其中P2為(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)、(Phe-4CF3)；其中P3為Ser；其中P4為Trp；其中P5為Ser；并且其中P6為Bpa或(Ser-Tyr)。
20.一種連續的肽或肽模擬物序列，包含下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO41)；P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO42)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO43)；P1，P2，P3，P4，P5，P6，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ ID NO44)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO45)；P6，P5，P4，P3，P2，P1，P12，P11，P10，P9，P8，P7(SEQ IDNO46)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO47)；P7，P8，P9，P10，P11，P12，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO48)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P1，P2，P3，P4，P5，P6(SEQ ID NO49)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO50)；P12，P11，P6，P9，P8，P7，P2，P1(SEQ ID NO51)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO52)；P1，P2，P7，P8，P9，P6，P11，P12(SEQID NO53)；或P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO54)；其中P1為Cha或Nal(2)；其中P2為(Phe-2，3，4，5，6-F)、(Phe-3，4，5F)或(Phe-4CF3)；其中P3為任意氨基酸；其中P4為d-或1-Trp；其中P5為任意氨基酸；其中P6為Bpa或(Ser-Tyr)；其中P7為Arg；其中P8為Arg；其中P9為Arg；其中P10為Gln或Arg；其中P11為Arg；以及其中P12為d-或1-Arg。
21.權利要求20的肽或肽模擬物序列，其中任意氨基酸為Ser或Pro。
22.一種連續的肽或肽模擬物序列，包含下列結構P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12(SEQ ID NO55)；P12，P11，P10，P9，P8，P7，P6，P5，P4，P3，P2，P1(SEQ ID NO56)；P12，P11，P10，P6，P9，P4，P7，P2，P1(SEQ ID NO57)；or P1，P2，P7，P4，P9，P6，P10，P11，P12(SEQ ID NO58)；其中P1為Cha或Nal(2)；其中P2為(Phe-2，3，4，5，6-F)；其中P3為Ser；其中P4為Trp；其中P5為Ser；其中P6為Bpa或(Ser-Tyr)；其中P7為Arg；其中P8為Arg；其中P9為Arg；其中P10為Gln或Arg；其中P11為Arg；以及其中P12為Arg。
23.一種連續的肽或肽模擬物序列，包含下列結構(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO99)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ IDNO100)；(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO59)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ IDNO60)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO61)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ IDNO62)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO63)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ IDNO64)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO65)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ IDNO66)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO67)；(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO68)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO69)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO70)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO71)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ IDNO72)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO73)；(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO74)；(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(SEQ IDNO75)；or(d-Cha)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO76).
24.一種連續的肽或肽模擬物序列，包含下列結構(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2，3，4，5，6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO77)。
25.權利要求1、6、11、16-20或22中的任意一項的肽或肽模擬物序列，其中一個或多個殘基為l-型。
26.權利要求1、6、11、16-20或22中的任意一項的肽或肽模擬物序列，其中一個或多個殘基為d-型。
27.權利要求23或24的肽或肽模擬物序列，其中一個d-殘基被l-殘基取代。
28.權利要求1、6、11、16-20和22-24中的任意一項的肽或肽模擬物序列，其中該序列抑制了細胞增殖。
29.權利要求1、6、11、16-20和22-24中的任意一項的肽或肽模擬物序列，其中該序列取消了細胞的細胞周期G2關卡。
30.權利要求1、6、11、16-20和22-24中的任意一項的肽或肽模擬物序列，其中該序列的長度為大約6到大約12、10到大約20、18到大約25、25到大約100、25到大約200，或者50到大約300個殘基。
31.一種包含權利要求1、6、11、16-20和22-24中的任意一項的肽或肽模擬物序列，以及一種核酸損傷劑的組合物。
32.一種包含權利要求1、6、11、16-20和22-24中的任意一項的肽或肽模擬物序列，以及一種抗增殖劑的組合物。
33.一種包含權利要求1、6、11、16-20和22-24中的任意一項的肽或肽模擬物序列的藥物組合物。
34.一種包含權利要求1、6、11、16-20和22-24中的任意一項的肽或肽模擬物序列，以及一種核酸損傷劑或抗增殖劑的藥物組合物。
35.一種包含權利要求1、6、11、16-20和22-24中的任意一項的肽或肽模擬物序列，以及使用說明書的試劑盒。
36.權利要求35的試劑盒，其中使用說明書包括針對聯合一種核酸損傷療法抑制細胞增殖的說明書。
37.權利要求35的試劑盒，進一步包含一種核酸損傷劑。
38.權利要求35的試劑盒，進一步包含一種抗增殖劑。
39.一種抑制細胞增殖的方法，包括使細胞與一定量足以抑制細胞增殖的，權利要求1、6、11、16-20和22-24中的任意一項的肽或肽模擬物接觸。
40.權利要求39的方法，進一步包括使細胞與核酸損傷劑接觸，或者使細胞暴露于核酸損傷療法。
41.權利要求40的方法，其中細胞為培養的細胞，或存在于受試者體內的細胞。
42.一種提高細胞對核酸損傷劑或核酸損傷療法的敏感性的方法，包括使細胞與一定量足以提高細胞對核酸損傷劑或核酸損傷療法的敏感性的權利要求1、6、11、16-20和22-24中的任意一項的肽或肽模擬物接觸。
43.權利要求42的方法，進一步包括使細胞與核酸損傷劑接觸，或者使細胞暴露于核酸損傷療法。
44.權利要求57的方法，其中細胞為培養的細胞，或存在于受試者體內的細胞。
45.一種使細胞的核酸損傷增加的方法，包括使細胞與一定量足以增加細胞的核酸損傷的權利要求1、6、11、16-20和22-24中的任意一項的肽或肽模擬物接觸。
46.權利要求45的方法，進一步包括使細胞與核酸損傷劑接觸，或者使細胞暴露于核酸損傷療法。
47.權利要求45的方法，其中細胞為培養的細胞，或存在于受試者體內的細胞。
48.一種治療細胞增殖異常的方法，包括對患有或處于患有細胞增殖異常的危險中的受試者施用一定量可有效治療細胞增殖異常的權利要求1、6、11、16-20和22-24中的任意一項的肽或肽模擬物。
49.權利要求48的方法，其中至少一部分包括細胞增殖異常的細胞位于血液、乳腺、肺、甲狀腺、頭或頸、腦、淋巴、胃腸道、鼻咽、生殖器泌尿道、膀胱、腎、胰腺、肝臟、骨、肌肉或皮膚。
50.權利要求48的方法，其中肽或肽模擬物是局部、區域或全身性地施用。
51.權利要求48的方法，其中細胞增殖異常包括良性或惡性的實體瘤或液態瘤。
52.權利要求51的方法，其中腫瘤為轉移性或非轉移性的。
53.權利要求51的方法，其中實體瘤包括肉瘤或癌。
54.權利要求51的方法，其中液態瘤包括造血性癌癥。
55.權利要求54的方法，其中造血性癌癥包括骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
56.權利要求51的方法，其中治療改善了受試者的狀況。
57.權利要求56的方法，其中改善包括至少一部分包含細胞增殖異常的細胞表現為細胞增殖減少、細胞數量減少、增強的細胞增殖受抑制、細胞數量的增加受抑制、凋亡增加，或者存活減少。
58.權利要求54的方法，進一步包括對受試者施用核酸損傷劑、核酸損傷療法、抗增殖劑，或抗增殖療法。
59.權利要求58的方法，其中試劑或療法包括藥物、放射、放射性同位素、環境沖擊。
60.權利要求59的方法，其中藥物包括化學治療藥。
61.權利要求58的方法，其中藥物包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、雷別卡霉素、阿霉素(ADR)、博萊霉素(Bleo)、培洛霉素，順鉑衍生物或喜樹堿(CPT)。
62.權利要求61的方法，其中順鉑衍生物包括順鉑(CDDP)或奧沙利鉑。
63.權利要求59的方法，其中放射性同位素包括I131、I125、90Y、177Lu、213Bi或211At。
64.權利要求59的方法，其中放射包括UV放射、IR放射，或α-、β-或γ-放射。
65.權利要求59的方法，其中環境沖擊包括體溫過高。
全文摘要
本發明提供了包括肽和肽模擬物的化合物，該肽和肽模擬物可用于治療細胞增殖異常，如與良性和惡性腫瘤細胞相關的細胞增殖異常。雖然本發明不受限于任何特定機制，本發明的化合物仍似乎至少部分地通過抑制G2細胞周期關卡而發揮作用。因此，可單獨采用本發明的化合物，或聯合核酸損傷療法以抑制細胞生長。
文檔編號A61K38/55GK1642978SQ03806256
公開日2005年7月20日 申請日期2003年1月17日 優先權日2002年1月17日
發明者T·卡瓦貝, H·科巴亞斯 申請人:坎巴斯有限公司