用于抑制疼痛,炎癥和軟骨退化的溶液及方法
                            
            
                            
            文檔序號：1022677閱讀：1028來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：用于抑制疼痛,炎癥和軟骨退化的溶液及方法
            
相關申請的交叉參考
            
本申請要求2002年2月1日提交的美國臨時申請No.60/353,552的優先權，美國臨時申請No.60/353,552是2002年1月18日提交的美國申請No.10/031,546的繼續部分申請，美國申請No.10/031,546是2000年7月21日提交的指定美國的國際申請No.PCT/US00/19864的美國國家階段申請，國際申請No.PCT/US00/19864要求1999年7月21日提交的美國臨時申請No.60/144,904的優先權，美國臨時申請No.60/144,904是2001年4月20日提交的美國申請No.09/839,633的繼續部分申請，美國申請No.09/839,633是1999年11月5日提交的指定美國的國際申請No.PCT/US99/26330的繼續部分申請，國際申請No.PCT/US99/26330要求1998年11月5日提交的美國臨時申請No.60/107,256以及1999年10月20日提交的指定美國的國際申請No.PCT/US99/24625的優先權，國際申請No.PCT/US99/24625要求1998年10月20日提交的美國臨時申請No.60/105,026的優先權，在此根據35 USC 119(e)和120部分要求這些優先權的利益。
            
發明領域
            
本發明涉及用于保護關節軟骨的治療組合物和方法。
            
背景技術：
            導致關節內軟骨破壞的疾病和狀況引起了顯著的公共健康關注，特別是考慮到人口老齡化的人口統計學時更是如此。關節軟骨代表了許多不同分子的復雜系統。在關節炎，如類風濕關節炎(RA)和骨關節炎(OA)的關節軟骨退化中涉及多種機制。OA是一種非炎癥性關節炎，它是關節疾病的最常見形式，并且是僅次于心血管疾病的導致提前退休和殘疾的第二位的因素。一些個體在單個或有限數目的關節中表現出OA，例如可能是由于意外或手術的創傷性損傷。許多其它個體是由于衰老或長期的運動或職業活動相關的磨損和撕裂而經受多關節的OA。RA是炎癥性關節炎的最常見形式，影響了3％的女性和1％的男性。大多數RA患者具有多關節癥狀，特別是手、肘、腕和肩的小關節。
            
透明的關節軟骨的破壞是OA和致殘性RA的標志。盡管許多治療方法都可以提供癥狀的緩解，還沒有證明任何治療方案可以阻止關節軟骨退化的進展。關節軟骨的進展性破壞和丟失導致了關節運動的不可逆受損。關節軟骨的這些改變是骨關節炎(OA)和類風濕關節炎(RA)常見的最終病理事件。
            
軟骨破壞過程可能與關節的外科手術相關或由其起始。關節內窺鏡檢查是一種外科手術過程，其穿過覆蓋在上面的皮膚和關節囊中的一個小切口，將與遠端光源和視頻監視器相連的照相機插入解剖學上的關節(例如，膝，肩等)中。穿過相似的切口，還可將外科手術器械放在關節中，在關節內窺鏡造影的指導下使用。因為關節內窺鏡檢查技術人員水平的提高，越來越多曾經通過“開放式”外科手術技術進行的外科手術過程，現在可用關節內窺鏡檢查的方法來完成。這樣的操作包括，例如，膝關節的部分半月板切除術和韌帶重建，肩部的肩峰成形術和回旋肌套口清創術以及肘滑膜切除術。由于外科適應癥的擴大和小直徑關節內窺鏡的開發，腕和踝的關節內窺鏡檢查也已成為常規的檢查。
            
在每一次關節內窺鏡檢查的過程中，用生理灌洗液(例如生理鹽水或乳酸鹽林格氏溶液)連續灌洗關節，使關節囊擴張，除去手術碎片，從而提供更清晰的關節內造影。馬歇爾的美國專利4,504,493公開了一種等摩爾的甘油水溶液，其是一種用于關節內窺鏡檢查的非-傳導性且光學澄明的灌洗液。傳統的生理灌洗液不能提供鎮痛，抗炎或抗軟骨退化的作用。
            
發明概述
            
本發明提供一種用于減少或防止關節中關節軟骨破壞的方法和組合物，包括施用兩種或多種代謝活性的軟骨保護劑的組合。代謝活性劑包括，但不限于，直接或間接作用而調節或改變細胞的生物、生化或生物物理狀態的化合物，包括改變細胞質膜的電位的試劑，細胞受體的配體結合或酶活性，細胞內或細胞外定位的酶，蛋白-蛋白相互作用，RNA-蛋白相互作用，或DNA-蛋白相互作用。在本發明的一方面，提供了基于至少兩種同時作用于不同分子靶的試劑的組合的代謝活性軟骨保護劑的藥物組合物。
            
代表性軟骨保護劑包括，例如(1)白介素-1蛋白家族，包括，例如IL-1β，IL-17和IL-18的受體拮抗劑；(2)腫瘤壞死因子(TNF)受體家族，包括，例如，TNF-R1的拮抗劑；(3)白介素4，10和13受體的激動劑；(4)TGF-β受體超家族，包括，例如BMP-2，BMP-4和BMP-7的拮抗劑；(5)COX-2的抑制劑；(6)MAP激酶家族，包括，例如，p38 MAP激酶的抑制劑；(7)基質金屬蛋白酶(MMP)蛋白家族，包括，例如MMP-3和MMP-9的抑制劑；(8)NF-κB蛋白家族，包括，例如與IκB復合的p50/p65二聚體的抑制劑；(9)一氧化氮合酶(NOS)家族，包括，例如iNOS的抑制劑；(10)整聯蛋白受體的激動劑和拮抗劑，例如，αvβ3整聯蛋白的激動劑；(11)蛋白激酶C(PKC)家族的抑制劑；(12)蛋白酪氨酸激酶家族，包括，例如src亞家族的抑制劑；(13)蛋白酪氨酸磷酸酶的調節劑；和(14)蛋白src同源性2(SH2)結構域的抑制劑。其它的軟骨保護劑包括其它生長因子，如胰島素樣生長因子(如IGF-1)和成纖維生長因子(如bFGF)。
            
在一種優選實施方案中，至少一種試劑是直接提供抗炎活性和/或促進軟骨合成代謝過程的細胞因子或生長因子受體激動劑，此處也稱作“合成代謝劑”，至少一種第二試劑是抑制軟骨分解代謝過程并且也可以抑制促炎過程，此處也稱作“軟骨分解代謝抑制劑”或“分解代謝抑制劑”的受體拮抗劑或酶抑制劑。此處使用的術語“軟骨保護劑”包括合成代謝劑和軟骨分解代謝抑制劑。
            
在本發明的該實施方案中，至少一種軟骨保護劑是抗炎/合成代謝細胞因子，其功能是阻抑促炎細胞因子在關節中的作用，促進軟骨基質合成并且抑制基質降解。這些受體激動劑包括，例如，特異性的抗炎及合成代謝細胞因子，如白介素(IL)激動劑(例如，IL-4，IL-10和IL-13)及轉化生長因子-β超家族(例如，TGFβ和BMP-7)的特異性成員，胰島素樣生長因子(例如，IGF-1)和成纖維細胞生長因子(例如，bFGF)。至少第二種軟骨保護劑選自一類抑制和減少促炎分子靶活性或表達的受體拮抗劑或酶抑制劑(例如，IL-1受體拮抗劑，TNF-α受體拮抗劑，環加氧酶-2抑制劑，MAP激酶抑制劑，一氧化氮合酶(NOS)抑制劑，及核因子κB(NFκB)抑制劑)。第二種軟骨保護劑也可以選自抑制軟骨分解代謝的基質金屬蛋白酶，抑制軟骨分解代謝的細胞粘附分子，包括整聯蛋白激動劑和整聯蛋白拮抗劑，抑制軟骨分解代謝的細胞內信號傳遞抑制劑，包括蛋白激酶C抑制劑和蛋白酪氨酸激酶抑制劑，和抑制軟骨分解代謝的SH2結構域的抑制劑。
            
關節軟骨是一種特化的胞外基質，它是通過代謝活性的關節軟骨細胞產生和維持的。正常健康的胞外基質的維持反映生物合成速率和基質成分摻入間的動態平衡，及它們的退化速率和后來從軟骨到滑液中的損耗間的動態平衡。然而，還不十分清楚基質體內穩態的調節機制，它們在炎性關節疾病中很清楚地改變并應答關節創傷，以致基質的破壞速率超過新基質成分的合成速率。通常，認為基質的體內穩態代表了分解代謝的細胞因子與合成代謝的細胞因子(包括生長因子)作用間的動態平衡。用于軟骨保護的治療劑的最佳組合通過促進合成速率，同時抑制破壞速率而移動動態的基質平衡，從而使合成代謝的過程達到最大，并促進修復。
            
分解代謝的細胞因子，如IL-1β和TNF-α對軟骨細胞上的特異性受體起作用，以誘導MMPs產生，其中的MMPs可誘導基質的退化，而退化是由合成代謝的細胞因子，如TGF-β，BMP-2和IGF-1抑制的。因此，僅僅以抑制分解代謝過程(如MMP抑制劑和IL-1拮抗劑的組合)為基礎的治療方法對于軟骨修復來說不是最佳的，因為還需要合成代謝劑來誘導或促進基質產生成分的生物合成和組裝。第二，造成軟骨基質破壞的分解代謝細胞因子(IL-1，TNF，IL-17，IL-18，LIF)的多樣性顯示阻斷所有分解代謝細胞因子的活性是不現實的。相反，僅僅依靠使用合成代謝劑，如IGF-1，BMP-2或BMP-7的方法不是最佳的，這是因為它不能對抗分解代謝細胞因子的反調節作用。TGF-β，BMP-2和IGF-1也可以作用于特異性受體，以誘導軟骨細胞產生基質成分，其是由IL-1β，TNFα，IL-17和LIF抑制的。因此，用于軟骨保護的最佳治療組合是由至少一種合成代謝劑和一種軟骨分解代謝的抑制劑所組成。
            
在本發明的一方面，通過全身途徑給具有關節軟骨退化危險性的患者施用多種軟骨保護劑。全身性施用的多種試劑包括至少一種促進軟骨合成代謝活性的試劑和至少一種抑制軟骨分解代謝的試劑。每種試劑都是足量的，以便在將溶液送遞到患者的關節時，提供治療有效的組合，從而抑制軟骨分解代謝過程并且促進軟骨合成代謝過程。此外，可以與軟骨保護劑一起施用一種或多種抑制疼痛和/或炎癥的試劑。當患者同時在多個關節具有關節退化的危險性或患有退化性疾病時，多種軟骨保護劑的全身性施用是可以是優選的。
            
為了使不利或不需要的全身作用最小，在本發明的全身性遞送的實施方案的一個方面，一種治療策略是在導向于關節的載體或送遞載體中送遞試劑的組合。在一種優選的導向的實施方案中，至少一種合成代謝性軟骨保護劑和/或至少一種分解代謝抑制性軟骨保護劑，以及優選合成代謝性軟骨保護劑和分解代謝抑制性軟骨保護劑兩者，可以包封在送遞載體，如納米球內。導向抗體或抗體片段偶聯于納米球。抗體或抗體片段特異于位于關節內的被導向的抗原決定簇。本發明的一種治療方法包括給具有軟骨退化危險性的患者全身施用該被導向、包封的一種或多種軟骨保護劑的組合物，優選通過血管內、肌內、皮下或吸入施用。
            
在本發明的另一方面，提供了包含多種軟骨保護劑的用于全身性施用的組合物，其中包含至少一種促進軟骨合成代謝活性的試劑和至少一種抑制軟骨分解代謝的試劑。此外，抑制疼痛和/或炎癥的一種或多種試劑可以包含在組合物中。包含的所有試劑的劑量都足以在全身施用時在關節提供軟骨保護性治療作用。也提供了制備包含用于治療有軟骨退化危險性的患者的所述組合物的藥物的方法。
            
為了將所述全身性施用的組合物導向于關節，至少一種合成代謝性軟骨保護劑和/或至少一種分解代謝抑制性軟骨保護劑，以及優選合成代謝性軟骨保護劑和分解代謝抑制性軟骨保護劑兩者，被包封在送遞載體，如納米球內，所述納米球偶聯于位于關節內的抗原決定簇的特異性抗體或抗體片段。也提供了一種制備用于治療有軟骨退化危險性的患者的藥物的方法，所述藥物包含包封的軟骨保護劑，所述軟骨保護劑偶聯于抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段導向于位于關節內的抗原決定簇。
            
在本發明的不同方面，可以制備藥學有效載體中的包含一種或優選多種代謝活性軟骨保護劑以及一種或多種用于抑制疼痛、炎癥等的試劑，或更優選合成代謝劑和分解代謝抑制劑的多種試劑的組合，用于在關節內直接遞送至患者的關節。盡管本發明的軟骨保護性組合物的全身性送遞對于影響多個關節的疾病或狀況是優選的，在其它情況下，本發明的組合物的局部送遞可以是優選的。所述狀況可以包括治療患有僅僅影響單關節或少數關節的軟骨退化性狀況或疾病的患者，圍手術期施用與關節的手術或介入相關的程序，或當不需要的副作用可以與全身性施用相關的情況下。在本發明的該局部送遞方面，所述組合物是通過關節內注射(包括用于治療軟骨退化性疾病，如骨關節炎或類風濕性關節炎)或經輸注而局部送遞的，包括在外科關節內窺鏡程序的圍手術期(即，在手術前、手術中和/或手術后)施用。
            
本發明的該局部送遞方面提供了一種溶液，它構成在生理電解載體液中的低濃度的多種試劑的混合物，用于局部抑制疼痛、炎癥和軟骨退化的介質。本發明還提供了一種用于將含有這些試劑的灌洗溶液在圍手術期直接送遞到手術部位的方法，所述溶液在手術部位局部作用于受體和酶水平，以便在該部位限制疼痛、炎癥和軟骨退化。由于本發明的局部圍手術期送遞方法，可以以低于使用其它送遞方法(即，靜脈內、肌內、皮下和口服)的劑量的試劑達到所需療效。
            
溶液中的抗疼痛和/或抗炎劑和/或抗軟骨退化劑包括選自多種類型的受體拮抗劑和激動劑以及酶活化劑和抑制劑的試劑，每種類型是通過不同的疼痛和/或炎癥抑制和/或軟骨退化的分子基質起作用。
            
除了抗軟骨退化劑，本發明的組合物可以包含抗疼痛和/抗炎劑。用于抑制疼痛和/或炎癥的代表性試劑，包括，例如(1)5-羥色胺受體拮抗劑；(2)5-羥色胺受體激動劑；(3)組胺受體拮抗劑；(4)緩激肽受體拮抗劑；(5)激肽釋放酶抑制劑；(6)速激肽受體拮抗劑，包括神經激肽1和神經激肽2受體亞型拮抗劑；(7)降鈣素基因相關肽(CGRP)受體拮抗劑；(8)白介素受體拮抗劑；(9)在花生四烯酸代謝物的合成途徑中有活性的酶的抑制劑，包括(a)磷酸酯酶抑制劑，包括PLA2同工型抑制劑和PLC同工型抑制劑，(b)環加氧酶抑制劑，和(c)脂加氧酶抑制劑；(10)前列腺素類受體拮抗劑，包括類花生酸EP-1和EP-4受體亞型拮抗劑以及凝血噁烷受體亞型拮抗劑；(11)白三烯受體拮抗劑，包括白三烯B4受體亞型激動劑和白三烯D4受體亞型激動劑；(12)阿片樣物質受體激動劑，包括μ-，δ-和κ-阿片受體亞型激動劑；(13)P2嘌呤受體拮抗劑，包括P2X受體拮抗劑和P2Y受體拮抗劑；和(14)鈣通道拮抗劑。上述每一種試劑都作為抗炎劑和/或作為抗傷害(即抗疼痛或鎮痛)劑。從這些類型的化合物中選擇試劑需要根據特定的應用而調整。
            
本發明還提供一種制備藥物的方法，該藥物在本發明的一方面被混合配成稀釋灌洗液，供關節內窺鏡檢查操作期間，連續灌洗手術部位，特別是患者的關節部位使用。在本發明的該局部送遞實施方案中，該方法需要把至少一種抗軟骨退化劑和優選的一種或多種抗疼痛/抗炎劑溶解于生理電解質載體液中，對于某些抗軟骨退化劑的應用而言，每種試劑的濃度優選不超過約100,000nM，更優選不超過約25,000nM，且最優選不超過約10,000nM。
            
本發明局部送遞方面的方法可在抑制疼痛，炎癥和軟骨退化的治療或診斷過程期間，直接向傷口或手術部位提供多種受體拮抗劑和激動劑以及酶抑制劑和激活劑的稀釋組合的送遞。由于該溶液活性成分是以連續方式局部直接應用于手術組織的，因此與相同藥物在口服，肌內，皮下或靜脈內給藥時產生治療作用所需的劑量相比，這些藥物可以極低的劑量有效使用。這里所用的術語“局部”一詞包括藥物在傷口或其他手術部位內和周圍的應用，排除口服，皮下，靜脈內和肌內給藥。這里所用的術語“連續”包括以頻繁的間隔，不間斷地應用，反復應用，以及除短暫中斷施用以引入其它藥物或制劑或操作設備以外的不間斷施用，這樣，可在傷口或手術部位局部保持基本上恒定的預定濃度。
            
試劑低劑量施用的優點有三個。最重要的一點是沒有常常限制這些藥物應用的全身副作用。其次，本發明溶液中，為特殊應用而選擇的試劑對其賴以發揮作用的介質和介導靶具有高度特異性。這種特異性是依靠所用的低給試劑量得以保持的。最后一點，每個手術過程中的這些活性試劑的成本很低。
            
這些試劑經灌洗或其他流體方式局部給藥的優點是(1)局部給藥可保證靶部位的已知濃度，而不管病人之間代謝，血流等的變化性。(2)因為是直接送遞方式，可以立即獲得治療濃度，這樣，給試劑量的控制得到改善。(3)活性試劑局部直接施用于傷口或手術部位，可基本上減少這些藥物通過全身過程(如首過及二過代謝)所引起的降解，如果這些藥物以口服，靜脈內，皮下，或肌內途徑給藥，則可能會出現這種降解。這種情況對那些蛋白和肽類活性試劑尤其適用，這類試劑可被迅速代謝。因此，局部給藥可使用在治療上不能采用其他途徑給藥的化合物或試劑。例如，下列種類中的一些試劑是肽緩激肽受體拮抗劑；速激肽受體拮抗劑；阿片樣物質受體激動劑；CGRP受體拮抗劑；白介素受體拮抗劑；TNF受體拮抗劑；TGF-β受體激動劑；BMP-2和BMP-7受體激動劑；IL4，IL10和IL-13受體激動劑；和整聯蛋白受體激動劑和拮抗劑。盡管需要連續補充可能被降解的那部分試劑，以保證足以維持受體占有率或酶飽和的局部治療濃度在整個手術過程中始終得以保持，傷口或手術部位的局部連續送遞可使藥物的降解或代謝達到最小程度。
            
根據本發明的這方面，在整個外科手術過程中圍手術期局部施用該溶液可產生優先的鎮痛、抗炎及軟骨保護作用。這里使用的術語“圍手術期”一詞包括過程中應用，過程前和過程中聯合應用，過程中和過程后聯合應用，以及過程前，過程中和過程后聯合應用。為了最大程度地獲得優先的抗炎，鎮痛(對某些應用而言)，和軟骨保護(對某些應用而言)作用，最好在過程前，過程中和過程后均應用本發明的溶液。通過在出現明顯的局部手術創傷刺激之前，占據靶受體或使目標酶失活或激活，本發明溶液中的試劑可調節特殊的途徑，以優先抑制目標病理過程。如果在炎性介質和過程產生組織損害之前優先抑制它們，那么其優點與損傷開始后的給藥相比，更為顯著。
            
已經證明，通過應用本發明含多種試劑的溶液抑制一種以上的疼痛，炎癥或軟骨退化介質，能夠明顯減輕炎癥和疼痛的程度，而且理應提供軟骨保護作用。本發明的灌洗液包括藥物的組合，每種溶液均可作用于多種受體或酶。這樣，多種藥物可同時有效地對抗病理過程的組合，包括疼痛和炎癥，及軟骨平衡的喪失。一般認為這些試劑的作用是協同性的，這在于本發明的多種受體拮抗劑和抑制性激動劑以組合形式應用，提供與單一試劑的功效相比不成比例增加的功效。本發明幾個試劑的協同作用通過實施例加以討論，下面詳細描述那些試劑。
            
相對于目前使用的灌洗液，圍手術期使用本發明溶液應導致臨床上手術部位疼痛和炎癥，及軟骨退化的明顯減輕，由此減少患者手術后對鎮痛藥(如阿片制劑)的需求量，在適當的時候，可使患者的手術部位盡早活動。至于外科醫生和手術室工作人員方面，與傳統的灌洗液相比，并不需要額外的努力就可使用本發明的溶液。對于本發明這方面的最佳軟骨保護，在外科手術之前、期間和/或之后直接向關節施用本發明的溶液。
            
在本發明的另一方面，提供了用于保護軟骨的包含合成代謝促進劑和分解代謝抑制劑的組合物。這樣，所述組合導致了一種狀態，其特征在于等于或超過軟骨分解代謝活性的軟骨合成代謝活性；維持軟骨組織以便維持存在的，或增加軟骨體積；或者增加由關節軟骨合成軟骨基質并同時減少軟骨基質的降解。
            
附圖簡述
            
現在將通過實施例，并參考相應的附圖，更詳細地闡述本發明，其中
            

            

            
圖1是軟骨細胞的圖解概述，其顯示了導致炎性介質產生和軟骨代謝移動的分子靶和信號傳遞信息流。外部信號通過許多細胞表面受體家族，包括細胞因子受體，如白介素-1(IL-1)受體家族和腫瘤壞死因子(TNF)受體家族，TGF-β受體家族和整聯蛋白而進行的整合作用在包括主要蛋白分子組的共同胞內信號傳遞途徑上會聚，其中的蛋白分子是包括在本發明溶液中的藥物的治療靶(MAP激酶，PKC，酪氨酸激酶，SH2蛋白，COX，PLA2和NF-6B)。這些信號傳遞途徑的激活可控制許多誘導型基因產物的軟骨細胞表達，包括IL-1，TNF-α，IL-6，IL-8和溶基質素(MMP-3)，及其它介質(一氧化氮(NO)和PGE2)，其可導致炎癥和/或軟骨退化，或基質分子的合成和軟骨細胞的增殖。
            
圖2提供滑膜細胞的圖解概述，其顯示導致炎性介質產生和軟骨代謝改變的分子靶和信號傳遞信息流。外部信號通過許多細胞表面受體的家族，包括細胞因子受體，如白介素-1(IL-1)受體家族和腫瘤壞死因子(TNF)受體家族，G蛋白偶聯受體，如緩激肽，組胺和5-羥色胺亞型，和整聯蛋白而進行的整合作用在包括主要蛋白分子組的共同胞內信號傳遞途徑上會聚，其中的蛋白分子是包括在本發明溶液中的藥物的治療靶(MAP激酶，PKC，酪氨酸激酶，SH2蛋白，COX，PLA2和NF-6B)。這些信號傳遞途徑的激活可控制許多誘導型基因產物的滑膜細胞表達，包括IL-1，TNF-α，IL-6，IL-8和溶基質素(MMP-3)，其可導致炎癥和/或軟骨退化。
            
圖3是軟骨細胞和滑膜細胞的共同信號傳遞途徑圖，其包括負責導致炎癥和/或軟骨退化的，促炎細胞因子途徑與GPCR活化受體途徑間“交擾(crosstalk)”的重要信號蛋白。
            
圖4是軟骨細胞和滑膜細胞的共同信號傳遞途徑圖，其包括負責促炎細胞因子途徑與GPCR活化受體途徑間“交擾”的重要信號蛋白。鑒定了在本發明優選的軟骨細胞保護溶液中，某些藥物作用的特異性分子位點。
            
圖5是存在于軟骨細胞或滑膜細胞中分子靶的圖，其促進軟骨的合成代謝反應。鑒定了在本發明優選的軟骨保護溶液中，某些藥物作用的特異性位點。
            
圖6是存在于軟骨細胞或滑膜細胞的分子靶的圖，其促進軟骨的分解代謝反應。鑒定了在本發明優選的軟骨保護溶液中，某些藥物作用的特異性位點。
            
圖7是用白介素-1(IL-1，10U/ml)整夜激發后，通過G-蛋白調節激動劑在滑液培養物中產生的前列腺素E2的圖解表示法。用組胺(100μM，空心的柱)，或緩激肽(1μM，實心的柱)刺激該培養物指定的次數，按照實施例6所述測定釋放到培養物上清液中的前列腺素E2。所示的值是來源于代表性試驗的平均值±標準差，并相對于未受刺激的培養物所產生的基線前列腺素E2而校準。
            
圖8是通過酮洛芬抑制滑液培養物中前列腺素E2產生的圖解表示。在有(用■表示)或沒有(用“△”或“  ”表示)指定濃度的酮洛芬參與的情況下，用IL-1(10U/ml)整夜激發該培養物。一天之后，在用酮洛芬整夜處理的培養物上清液中測量前列腺素E2，清洗剩余的培養物，用指定濃度的酮洛芬培養10分鐘，然后在指定量酮洛芬的連續存在下，測量應答隨后用組胺(100μM，)或緩激肽(1μM，△)侵襲3分鐘所產生前列腺素E2，顯示的數據分別歸一化為獲自每一激動劑的最大化應答，表示為來自幾個不同細胞系的三個實驗的平均值±標準差。
            
圖9是在有指定濃度的IL-1和添加的G-蛋白偶聯受體配體參與的情況下，第16小時，酮洛芬對由滑液培養物產生的IL-6作用的圖解表示法。在有或沒有0.75μM酮洛芬參與情況下，在具有下列附加受體配體1)1.0μM激活環腺苷酸途徑的異丙基腎上腺素(ISO)，或2)100μM激活IP3/鈣途徑的組胺(HIS)之一的試驗生長介質中，用指定濃度(0.3，1.0和3.0pg/ml)的IL-1培養該培養物16小時。收集培養物上清液，每隔8小時用含相同激動劑添加物的新鮮介質等分試樣替換一次。接著進行處理，然后收集相當于每8-16小時處理一次的上清液介質，并分析IL-6。
            
優選實施方案的詳細描述
            
本發明提供用于保護軟骨的方法和組合物。在第一種實施方案中，提供了一種向關節中局部施用包含至少一種促進軟骨合成代謝活性的第一種試劑和至少一種抑制軟骨分解代謝的第二種試劑的組合物的方法。在本發明該實施方案的第一方面，所述組合物是通過向關節中注射該組合物而局部送遞，所述組合物包含一種持續釋放的送遞載體。在本發明該實施方案的第二方面，所述組合物包含液體灌洗載體，并且在手術或干預程序中在圍手術期局部送遞到關節中。
            
在本發明的第二種實施方案中，提供了一種給患者全身性施用包含至少一種促進軟骨合成代謝活性的第一種試劑和至少一種抑制軟骨分解代謝的第二種試劑的組合物的方法。
            
在本發明的第三種實施方案中，提供了一種給患者全身性施用包含至少一種促進軟骨合成代謝活性的第一種試劑和/或至少一種抑制軟骨分解代謝的第二種試劑的組合物的方法，其中所述試劑中的至少一種導向于關節。在詳細描述這些實施方案之前，不希望受到理論的限制，闡述了根據本發明的軟骨保護原理。
            
I.軟骨保護的基本原理
            
在對炎癥和軟骨破壞的生物化學和分子生物學理解中的最近進展暗示許多內源細胞因子的作用。在發炎的關節中參與產生軟骨喪失的多種促炎介質為細胞因子、TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8。在急性損傷的膝關節滑液中快速出現這些促炎細胞因子數目升高的水平，且該升高的水平在患者中持續至少4周(Cameron，M.L.等人，Synovialfluid cytokine concentrations as possible prognosticindicators in the ACL-deficient knee”，Knee Surg.SportsTraumatol.Arthroscopy 238-44(1994))。這些細胞因子局部地在關節中由幾種活化的細胞類型產生，包括滑膜成纖維細胞、滑膜巨噬細胞和軟骨細胞。局部產生的細胞因子介導急性和慢性炎癥狀況中的病理生理學活動，且是軟骨分解代謝的重要自分泌和旁分泌介質。這些細胞因子的作用特征在于它們對不同的細胞靶引起多重作用的能力和它們以正協同或負協同方式與其他細胞因子相互作用的能力。IL-1和TNF-α是特別重要的，因為它們也通過破壞正常代謝之間的平衡而起始軟骨破壞作用，并通過調節內源蛋白(如基質金屬蛋白酶(MMP))和金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)的活性而起始軟骨基質成分的破壞。軟骨穩態的細胞因子控制代表了對軟骨細胞起作用的活性介質之間的高度調控的平衡，這決定是發生基質降解還是發生修復。
            
關節損傷常產生關節間隙中累及滑膜組織的炎癥反應，且可導致關節軟骨的降解。人類膝的滑膜和軟骨代謝中的急劇改變已在關節損傷和關節內窺鏡手術中進行了描述(Cameron，M.L.等人，見上文(1994)；Cameron，M.L.等人，“The natural history of theanterior cruciate ligament-deficient kneeChanges insynovial fluid cytokine and keratan sulfate concentrations”，Am.J.Sports Med.25751-754(1997))。特定的促炎細胞因子水平在前交叉韌帶(ACL)破裂后所見的急性炎癥階段的膝關節滑液中急劇增加(達到2-4個數量級)。由于基質金屬蛋白酶(MMP)如膠原酶和溶基質素-1的超量產生在軟骨基質濃度中也發生顯著的改變，該濃度在急性創傷后患者的滑液中升高(Lohmander，L.S.等人，Temporal patterns of stromelysin-1 tissue inhibitor，andproteoglycan fragments in human knee joint fluid after injuryto the cruciate ligament or meniscus”，J.Orthopaedic Res.1221-28(1994))。與軟骨降解相關的細胞因子和軟骨基質標記(如蛋白聚糖)中的變化暫時是最大的，但可持續延長的時間段(3個月-1年)，緩緩降低并仍然高于損傷前的基線水平。
            
歸因于關節內窺鏡手術自身的創傷可導致顯著的術后炎癥，這反映了關節中細胞額外的炎癥性活化，包括環加氧酶-2和其他促炎細胞因子的上調。具有ACL破裂的顯著比例(60-90％)的患者在損傷后10-15年中顯示骨關節炎(OA)的膝指示中的放射顯影改變(Cameron，M.L.等人，見上文(1994))。因而，初始的關節損傷和手術創傷的組合作用可誘導持續的炎癥狀況和相關的軟骨基質代謝中的改變，這看來是導致隨后在關節軟骨中發展退化改變和骨關節炎早期發展的病因因素。該健康問題的量級是基本的，這是因為1996年僅在美國中進行的關節內窺鏡程序的總估計數目就是180萬，且具有約每年10％的估計增長率。因而，需要提供一種藥物方法以預防關節中關節軟骨的降解。
            
盡管術后痛苦和炎癥被認為是顯著的臨床問題，但目前的關節內窺鏡手術藥物學治療方案僅涉及急性術后鎮痛。現有的手術治療方式不解決術后誘導的慢性炎癥狀況和對抑制手術治療的關節的軟骨破壞的需要。因此，清楚地需要發展一種有效的整合藥物療法，該療法將解決痛苦和炎癥的急性和慢性方面，以及損傷的和手術治療的關節中軟骨代謝的病理學改變。
            
根據本發明該方面的第一個實施方案，提供了一種通過直接向患者的關節施用關節內送遞的藥物有效載體中的組合物而減少或預防關節軟骨破壞的方法，該組合物包括一種或優選多種代謝活性的軟骨保護劑連同一種或多種抑制痛苦和/或炎癥的試劑，如前文所述的，或者優選地為兩種或多種代謝活性的軟骨保護劑的組合，該試劑的至少一種促進軟骨的合成代謝過程且該試劑的至少一種是軟骨分解代謝過程的抑制劑。代謝活性的試劑包括，但不局限于所有直接或間接調節或改變細胞的生物學、生物化學或生物物理學狀況的化合物，包括改變質膜電位、細胞受體的配體結合或酶活性、細胞內或細胞外定位的酶、蛋白-蛋白相互作用、RNA-蛋白相互作用或DNA-蛋白相互作用的試劑。例如，這種試劑可包括起始信號傳導級聯的受體激動劑、抑制信號傳導通路的受體拮抗劑、細胞內或細胞外酶的激活劑和抑制劑以及調節轉錄因子與DNA結合的試劑。
            
適當的軟骨保護劑包括如(1)白介素-1蛋白家族，包括，例如IL-1β，IL-17和IL-18的受體拮抗劑；(2)腫瘤壞死因子(TNF)受體家族，包括，例如，TNF-R1的拮抗劑；(3)白介素4，10和13受體的激動劑；(4)TGF-β受體超家族，包括，例如BMP-2，BMP-4和BMP-7的拮抗劑；(5)COX-2的抑制劑；(6)MAP激酶家族，包括，例如，p38MAP激酶的抑制劑；(7)基質金屬蛋白酶(MMP)蛋白家族，包括，例如MMP-3和MMP-9的抑制劑；(8)NF-κB蛋白家族，包括，例如與IκB復合的p50/p65二聚體的抑制劑；(9)一一氧化氮合酶(NOS)家族，包括，例如iNOS的抑制劑；(10)整聯蛋白受體的激動劑和拮抗劑，例如，αvβ3整聯蛋白的激動劑；(11)蛋白激酶C(PKC)家族的抑制劑；(12)蛋白酪氨酸激酶家族，包括，例如src亞家族的抑制劑；(13)蛋白酪氨酸磷酸酶的調節劑；和(14)蛋白src同源性2(SH2)結構域的抑制劑。用于本發明的其他適當的軟骨保護劑包括其它生長因子，如胰島素樣生長因子(如IGF-1)和成纖維生長因子(如bFGF)。
            
本發明的第一個實施方案提供了應用局部送遞的軟骨保護劑的組合治療損傷的或手術治療的關節的藥物學方法，以實現最大的治療益處。本發明的第二個實施方案提供了通過全身性施用軟骨保護劑的組合而提供治療的藥物學方法。軟骨保護劑組合的應用克服了現有的治療方法的局限性，該現有治療方法依賴于應用單個試劑以阻斷多因子的軟骨破壞過程，在該過程中已發生了有利于分解代謝的過程的合成和降解之間的改變。本發明的該方面唯一地利用組合同時對不同分子靶起作用的試劑的方法，以促進軟骨的合成代謝和抑制失調的或過度的軟骨分解代謝過程，以實現對炎癥過程的最大抑制和維持軟骨的穩態，從而實現關節中的軟骨保護作用。單個分子靶的抑制或已知可誘導軟骨破壞(分解代謝)的機制，如對白介素-1(IL-1)與IL-1受體結合的抑制，可能不是最適的，這是因為，例如，TNF-α通過其唯一的受體介導的作用與IL-1共享許多重疊的促炎和軟骨分解代謝功能，且TNF-α也被認為是關節中軟骨破壞的主要介質。類似地，在不存在抑制分解代謝過程時利用僅增強軟骨合成代謝過程的藥物試劑將不能最適地對抗存在于損傷關節中的分解代謝因子。
            
特定地，本發明的一個方面提供了代謝活性的軟骨保護劑藥物組合物，該組合物基于至少兩種同時對不同的分子靶起作用的試劑的組合。在一個代表性實施方案中，至少一種試劑是直接提供抗炎癥活性和/或促進軟骨合成代謝過程的細胞因子或生長因子受體激動劑，且至少第二種試劑是抑制促炎和/或軟骨分解代謝過程的受體拮抗劑或酶抑制劑。代表性藥物組合物包括至少一種取自抗炎癥/合成代謝細胞因子種類的試劑，該試劑在功能上抑制關節中促炎細胞因子的作用，促進軟骨基質合成和抑制基質降解。這些受體激動劑包括，但不局限于特定的抗炎癥和合成代謝細胞因子，如白介素(IL)激動劑(如IL-4、IL-10和IL-13)和轉化生長因子-β超家族的特定成員(如TGFβ和BMP-7)、胰島素樣生長因子(如IGF-1)和成纖維細胞生長因子(如bFGF)。第二種試劑的至少一種取自受體拮抗劑或酶抑制劑的種類，該受體拮抗劑或酶抑制劑抑制或減少促炎分子靶(如IL-1受體拮抗劑、TNF-α受體拮抗劑、環加氧酶-2抑制劑、MAP激酶抑制劑、一氧化氮合成酶(NOS)抑制劑和核因子κB(NFκB)抑制劑)的活性或表達。代謝活性的試劑包括位于細胞表面的受體的功能性激動劑和拮抗劑，以及膜結合的或細胞外分泌的酶(如溶基質素和膠原酶)的抑制劑。此外，許多試劑針對作為轉導和整合表面受體信號的細胞內定位的酶和轉錄因子的新靶，包括酶NOS、COX-2和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的抑制劑和蛋白-DNA相互作用如轉錄因子NFκB的抑制劑。該方法使得能夠通過同時促進細胞因子驅動的合成代謝過程和抑制分解代謝過程而維持軟骨的完整性。
            
本發明優選實施方案中的組合物通過組合多種對不同受體和/或酶分子靶起作用的藥物學試劑而構成了一種新的治療方法。迄今為止，藥物學策略集中于開發高特異性的藥物，該藥物對于介導對個別信號傳導神經遞質和激素的反應的個別受體亞型和酶同種型具有選擇性。
            
此外，盡管單個受體亞型或酶失活，但其他受體亞型或酶的活化和結果所得的信號傳導常可觸發級聯作用。這解釋了在應用單個受體特異性藥物以阻斷病理生理學過程中顯著的困難，在該過程中多種信號傳導介質(如細胞因子、生長因子或類二十烷酸)起作用。因此，僅導向于特定的個別受體亞型或同種型可能是無效的。
            
與藥物學治療的標準方法相反，本組合物的治療方法基于如下基本原理，即同時對不同的分子靶起作用的藥物的組合在抑制病理生理學狀況發展中全部范圍的活動中是高度有效的。此外，與僅導向于特定的受體亞型相反，組合物包括導向于在痛苦、炎癥和軟骨降解發展過程中包含的不同細胞生理學過程中起作用的普遍分子機制的藥物(參見圖1)。這樣，則可以使傷害、炎癥和軟骨降解途徑中額外受體和酶的級聯最小化。在這些病理生理學途徑中，組合物抑制“上游”和“下游”的級聯。
            
“上游”抑制的一個例子是在痛苦和炎癥恢復中的環加氧酶拮抗劑。環加氧酶(COX1和COX2)催化花生四烯酸向炎癥性和傷害性介質生物合成的中間物前列腺素H的轉變，該介質包括前列腺素、白三烯和血栓烷。環加氧酶抑制劑阻斷形成這些炎癥性和傷害性介質的“上游”。該策略排除了阻斷前列腺素類受體的7種描述的亞型與COX生物化學途徑的前列腺素類產物之間相互作用的需要。類似的“上游”抑制劑是抑酶肽，即一種激肽釋放酶抑制劑。激肽釋放酶是一種絲氨酸蛋白酶，切割血漿中高分子量的激肽原以產生緩激肽，即痛苦和炎癥的重要介質。通過抑制激肽釋放酶，抑酶肽有效地抑制了緩激肽的合成，從而提供了對這些炎癥介質的有效“上游”抑制。
            
本發明的組合物也可應用“下游”抑制劑以控制病理生理學途徑。在包含于漸進性關節軟骨退化中已用多種炎癥細胞因子(如IL-1β和TNFα)處理的滑膜細胞和軟骨細胞制劑中，MAP激酶抑制劑產生了軟骨保護性作用。p38 MAP激酶是多種分解代謝細胞因子的信號傳導途徑中的運輸點，且其抑制防止了多種介導軟骨降解的細胞產物的上調。因此，MAP激酶抑制劑通過提供“下游”軟骨保護性作用而在關節炎癥的恢復中提供了顯著的優點，該“下游”軟骨保護性作用不依賴于起始改變的軟骨穩態的細胞因子受體激動劑的生理學組合。
            
II.軟骨保護組合物的局部送遞
            
本發明用于軟骨保護和手術程序中的溶液的特定優選實施方案包括同時對不同分子靶起作用的試劑的組合，以促進軟骨的合成代謝和抑制失調的或過度的軟骨分解代謝過程，以實現對炎癥過程的最大抑制和維持軟骨的穩態，從而實現關節中的軟骨保護作用。
            
本發明一種實施方案的灌洗和注射型溶液是一種或優選多種軟骨保護劑和任選地一種或多種痛苦和/或炎癥抑制性試劑在生理學載體中的稀釋溶液。該載體是液體溶液，在此處用于包含生物適合性溶劑、懸浮液、聚合型和非聚合型凝膠、糊劑和軟膏，以及持續釋放的送遞載體，如由蛋白、脂質體、糖類、合成的有機化合物或無機化合物組成的微顆粒、小球體或納米顆粒。載體優選地是可包括生理學電解質的含水溶液，如正常的鹽水或乳酸化的林格液。
            
在本發明局部送遞實施方案的每一種手術溶液中，相對于全身性藥物施用方法以實現預期的治療效果所必須的濃度和劑量而言，試劑以低的濃度包括于液體或流體溶液中并以低的劑量進行局部送遞。如在此處所用的，“液體”或“流體”意欲包含藥學上可接受的生物適合性溶劑、懸浮液、聚合型和非聚合型凝膠、糊劑和軟膏。載體優選地是可包括生理學電解質的含水溶液，如正常的鹽水或乳酸化的林格液。通過其他藥物施用途徑(即靜脈內、皮下、肌內或口服)送遞相似劑量的試劑以獲得等同的治療效果是不可能或不實際的，這是因為全身性施用的藥物可進行首過及二過代謝。每一種試劑的濃度可部分地基于其受體解離常數Kd或酶抑制常數Ki進行確定。如在此處所用的，術語解離常數意欲包含對于其各自的激動劑-受體或拮抗劑-受體相互作用的平衡解離常數和對于其各自的激活劑-酶或抑制劑-酶相互作用的平衡抑制常數。優選地以0.1-10,000乘Kd或Ki的低濃度包括每一種試劑。優選地以1.0-1,000乘Kd或Ki的濃度包括每一種試劑，且最優選地約100乘Kd或Ki的濃度包括每一種試劑。在局部送遞位點不存在代謝轉化時，根據需要可對這些濃度進行調整以說明稀釋。選擇用于溶液中的準確試劑和試劑的濃度根據特定的應用而變化，如下文所述。
            
根據本發明的一個方面的溶液可包括單個或多種軟骨保護劑，優選地為多種軟骨保護劑，其中至少一種是合成代謝軟骨保護劑而至少一種是軟骨分解代謝抑制劑，或者包括低濃度的兩種軟骨保護劑與痛苦和/或炎癥抑制試劑的組合。然而，由于前述多種試劑的協同作用和廣泛抑制軟骨破壞及任選地阻斷痛苦和炎癥的需要，優選地應用多種試劑。
            
多種藥物組合可通過關節內注射或通過灌輸進行局部送遞，包括在手術關節內窺鏡程序中單獨或與術后持續的送遞偶聯的鄰近程序的送遞(即術前和/或術中和/或術后)，如通過調節的泵或應用持續釋放的送遞載體。持續釋放的送遞載體可包括，但不局限于由蛋白、脂質體、糖類、合成的有機化合物或無機化合物組成的微顆粒、小球體或納米顆粒。因而，在一些實施方案中，本發明提供了單獨或與鎮痛和/或抗炎癥試劑一起經注射或灌輸送遞的試劑組合。通過在損傷時或緊在其后(如圍手術期的)直接局部送遞軟骨保護劑實現的快速起始的作用具有在初始程序觸發隨后反應之前對其進行抑制的潛力，從而優先地限制了局部組織損傷和隨后軟骨的喪失。
            
本發明的優點包括1)在急性和/或慢性狀況中導向于軟骨破壞的多因子病因的組合藥物治療；2)軟骨保護劑組合可以與抗炎癥和鎮痛試劑組合；3)藥物組合(在可應用的)局部的送遞在關節中實現了軟骨保護劑的瞬時治療濃度；4)(在可應用的)鄰近程序應用灌洗液以關節內窺鏡手術程序中治療所需的范圍在關節中提供了藥物水平的持續維持；5)(對于本發明的該實施方案而言)局部送遞與全身性送遞相比允許總藥物劑量和服藥頻率中的減少；6)(對于本發明的該實施方案而言)向關節導向于局部位點的送遞避免了全身性毒性并降低了副作用；和7)(對于本發明的該實施方案而言)向關節的直接局部送遞使得能夠應用新的藥物活性的肽和蛋白，包括細胞因子和生長因子，該肽和蛋白如果限于全身性施用途徑則可能不是治療上有用的。
            
由于對這些軟骨保護劑所限定的作用的分子和細胞機制，當在灌洗液中(與其他軟骨保護劑組合或與此處所述的其他抗痛苦和抗炎癥試劑組合)進行圍手術期的應用或另外經過灌輸或注射直接施用于關節時，這些化合物預期可展示軟骨保護性作用。具體而言，這些試劑當在關節內窺鏡手術程序中通過灌洗液送遞時預期是有效的藥物。每一種代謝活性的軟骨保護劑均可優選地與一種或多種其他軟骨保護劑組合送遞到關節間隙中，包括小分子藥物、肽、蛋白、重組嵌合蛋白、抗體、寡核苷酸或基因治療載體(病毒的和非病毒的)。例如，一種藥物如MAPK抑制劑可對任何與關節的流體間隙相關的細胞和包含參與關節的正常功能或目前歸因于病理學狀況的關節的結構發揮作用。這些細胞和結構包括，但不局限于滑膜細胞，包括A型成纖維細胞和B型巨噬細胞；關節的軟骨成分如成軟骨細胞和軟骨細胞；與骨相關的細胞，包括骨膜細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞；炎癥細胞，包括淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞；和其他細胞，包括內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和神經細胞；以及上述的組合。
            
本發明的該方面也提供了活性治療劑的制劑，該活性治療劑可以在增強軟骨保護劑的送遞、攝入、穩定性或藥物代謝動力學的用于將藥物引入或施用于關節的制劑中進行送遞。這種制劑可包括，但不局限于由蛋白、脂質體、糖類、合成的有機化合物或無機化合物組成的微顆粒、小球體或納米顆粒。本發明提供了軟骨保護劑的組合或者一種或優選多種軟骨保護劑與一種或多種抗痛苦和/或抗炎癥試劑的送遞，它們作為均一載體中的多種藥物活性物質(如單個包封的小球體)或單個送遞載體中分立的混合物(如一組包封一種或多種試劑的小球體)存在。制劑分子的例子包括，但不局限于親水聚合物、聚陽離子(如魚精蛋白、亞精胺、聚賴氨酸)、能夠將材料導向于特定細胞類型的肽或合成的配體和抗體、凝膠、緩慢釋放性基質(即持續送遞的載體、可溶性和不溶性顆粒)以及未列出的制劑成分。
            
在一方面，本發明提供了兩種或多種軟骨保護劑的組合、或者一種或優選多種軟骨保護劑與一種或多種抗痛苦和/或抗炎癥試劑的組合、單獨地或與一種或多種抗痛苦和/或抗炎癥試劑的組合通過灌洗液和含有藥物的浸劑的局部送遞，該灌洗液和浸劑以治療有效的低濃度存在且使得藥物能夠直接送遞到患病的組織或關節。含有藥物的浸劑或灌洗液可在術前和/或術中和/或術后與手術程序一起應用，或可在與手術程序無關的其他時間施用。藥物送遞的全身性方法(如肌內、靜脈內、皮下)需要將較高濃度的藥物(和較高的總劑量)施用于患者以在靶關節中實現顯著的治療濃度。全身性施用也可在除靶關節之外的組織中導致高濃度，這是非預期的，且依賴于劑量可導致有害的副作用。這些全身性方法使藥物進行二過代謝和快速降解，從而限制了有效治療濃度的持續時間。因為軟骨保護劑組合(具有或不具有一種或多種抗痛苦和/或抗炎癥試劑)直接通過灌輸或灌洗施用于關節，所以無需血管灌注以將藥物帶到靶組織。該顯著的優點使得能夠進行多種軟骨保護劑的較低治療有效總劑量的局部送遞。
            
A.局部送遞方法
            
技術領域：
            本發明的溶液可應用于多種手術/干涉程序，包括手術、診斷和治療技術。本發明軟骨保護劑的組合可通過注射或灌洗施用。對于注射溶液，可以與載體材料組合以產生單個劑量形式的活性成分的量將依賴于要治療的患者、溶液中活性試劑的特性和特定的施用方式而變化。然而，可以理解對于任何特定患者的特定劑量水平將依賴于多種因素，包括所應用的特定化合物的活性，患者的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食，施用的時間，施用的途徑，藥物組合排泄的速率和進行治療的特定疾病的嚴重性。
            
注射型制劑如無菌注射型含水或含油懸浮液可根據公知的技術應用適當的分散劑或潤濕劑和懸浮劑制備。無菌注射型制劑也可為非毒性的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射型溶液或懸浮液，如丙二醇中的溶液。在可應用的可接受載體和溶劑中的有水、林格液和等滲的氯化鈉溶液。此外，無菌的固定油常規地用作溶劑或懸浮介質。為此目的，可應用任何生物適合的油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸也可用于注射劑的制備中。
            
本發明的注射液可與關節內窺鏡手術一起施用，或者可在指導患者護理的醫生確定為需要的任何時間施用。
            
本發明的灌洗液可在解剖學關節的關節內窺鏡手術中圍手術期應用。如在此處所用的，術語“圍手術期”包含程序中的應用、程序前和程序中的應用、程序中和程序后的應用以及程序前、程序中和程序后的應用。該溶液優選地在程序前和/或程序后以及程序中應用。這種程序常規地利用生理學灌洗流體，如正常的鹽水或乳酸化的林格液，該流體通過本領域技術人員眾所周知的技術應用到手術位點。本發明的方法包含用本發明的抗痛苦/抗炎癥/軟骨保護性灌洗液替代常規應用的灌洗流體。灌洗液在程序起始之前應用于傷口或手術位點，優選地在組織創傷之前，并連續地貫穿程序的持續期，以優先地阻斷痛苦和炎癥及軟骨降解。如此處普遍所用的，術語“灌洗”意指用液體流灌洗傷口或解剖學結構。術語“應用”意欲包含灌洗和其他局部引入本發明的溶液的方法，如將凝膠形式的溶液引入到手術位點，然后使凝膠溶液在整個程序中保持在該位點。如此處普遍所用的，術語“連續地”也意欲包括如下狀況，其中有以足以維持所用試劑的預定治療性局部濃度的頻率重復和頻繁的灌洗傷口，且包括如下應用，其中有手術技術必需的灌洗流體流動的間歇性停止。
            
上文對本發明溶液中每一種試劑所列的濃度是在不存在代謝轉化時向手術位點局部送遞的試劑濃度，以實現手術位點上預定的作用水平。可以理解需要對給定溶液中的藥物濃度進行調節以說明送遞時的稀釋。未對上述實施方案中的溶液濃度進行調節以說明代謝轉化或由總身體分布的稀釋，這是因為與口服、靜脈內、皮下或肌內應用相反，局部送遞避免了這些情況。
            
可采用本發明的溶液的關節內窺鏡技術以非限制性的例子包括膝中部分半月板和韌帶的重構、肩峰成形術、轉子套清創術、肘滑膜切除術和腕和踝關節內窺鏡。灌洗液以足以使關節囊膨脹的流速連續地在術中應用于關節，以去除手術的殘渣并使得能看到未阻塞的關節內。
            
在這種關節內窺鏡技術中抑制軟骨降解和控制痛苦和炎癥的適當關節內窺鏡灌洗液在下文的實施例1-3中提供。
            
在本發明意欲局部送遞的每一種溶液中，相對于全身性藥物施用方法以實現預期的治療效果所必須的濃度和劑量而言，試劑以低的濃度包括在溶液中并以低的劑量進行局部送遞。通過其他藥物施用途徑(即靜脈內、皮下、肌內或口服)送遞相似劑量的試劑以獲得等同的治療效果是不可能的，這是因為全身性施用的藥物可進行首過和二過代謝，且常快速從全身性循環中清除。
            
在完成關節內窺鏡或“開放的”關節(如膝、肩等)程序時，應將本發明的實踐與阿片制劑和局部麻醉劑的常規關節內注射進行區分。本發明該方面的溶液用于貫穿手術程序的連續灌輸以提供對痛苦和炎癥的優先抑制。相反，以目前應用的局部麻醉劑的持續灌輸實現治療功效所必需的高濃度可導致深的全身毒性。
            
在完成本發明的程序后，可能需要應用注射或另外應用更高濃度的與用于手術位點的灌洗液中相同的軟骨保護劑和/或痛苦和/或炎癥抑制劑，以作為阿片制劑的替代或補充。可能也需要在手術程序后向關節送遞有效量的溶液，從而使大團溶液在手術程序后保持在患者的滑膜囊中。
            
如前文所述，本發明的組合物也可適合于直接注射入解剖學關節中，該組合物包括多種軟骨保護劑，包括優選地至少一種分解代謝抑制劑和至少一種合成代謝促進劑。該試劑是優選選擇的，且以足夠的量包括每一種試劑，以在溶液局部送遞入患者關節中時提供治療有效的組合物，以抑制軟骨分解代謝過程并促進軟骨合成代謝過程。這種組合物可進行局部注射以向患者提供軟骨保護性作用，該患者患有慢性狀況如骨關節炎或類風濕關節炎，或患有急性狀況如來自手術或偶發損傷的創傷。局部注射的一種適當的組合物在下文表4中提供。
            
III.軟骨保護組合物的全身性施用
            
本發明的實施方案迄今已在軟骨保護組合物的局部送遞方面進行了描述，如通過關節內注射。局部注射描述為具有幾個優于全身性施用的優點，包括全身性副作用的避免。盡管本發明組合物的局部送遞在許多例子中是優選的，但它對于一些軟骨退化狀況是不實際的。這對于患有慢性軟骨退化疾病的患者尤其如此，在該疾病中多個位點同時處于軟骨退化的危險中，該疾病如類風濕關節炎、多關節性骨關節炎和其他多關節病。對于這種患者，向其每一個或大多數患病位點(如關節)注射軟骨保護組合物是痛苦的、不實際的、昂貴的或另外治療禁止的。上述用于局部送遞的軟骨保護組合物可根據本發明的另一個方面適合于通過全身性途徑施用。本發明組合物的全身性送遞適合于，但不局限于治療具有多個處于軟骨退化危險中的位點的患者。除在下文中進一步討論的多關節性骨關節炎和類風濕關節炎之外，本發明的該方面可用于治療其他非炎癥和炎癥關節炎疹，包括，但不局限于神經病性關節病、急性風濕熱、褐黃癥、系統性紅斑狼瘡、少年風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎和其他脊椎關節病和晶狀關節病。
            
A.關節炎機制
            
理解風濕病學關節病(如類風濕關節炎(RA)和骨關節炎(OA))的關節軟骨降解中包含的機制后，可對本發明的該方面有更好的理解。RA是最常見形式的炎癥性關節炎，影響約3％的女性和1％的男性。大多數患者具有多重的且通常對稱的關節累及，尤其是手、肘、腕和肩的小關節。OA是最常見形式的關節病，且是僅次于心血管疾病的導致提前退休和殘疾的原因。透明關節軟骨的破壞是OA和致殘性RA的特點。
            
盡管各種治療方法可緩解癥狀，但沒有治療已證明可減緩關節軟骨破壞的進展。在OA中，可存在正常軟骨細胞功能的抑制或這些細胞的組成型無能力，以使基質的修復速率與增加的降解速率匹配。各種細胞因子和炎癥介質已顯示可形成軟骨細胞合成功能中的不平衡，或者可選擇地通過上調各種降解基質的酶而增加軟骨基質的分解代謝，該酶包括基質金屬蛋白酶(包括膠原酶)。
            
為了最優化地治療包含軟骨退化的疾病，預期需要可刺激合成代謝過程同時抑制軟骨分解代謝的治療方案。因而，前文所述用于抑制關節病中的軟骨破壞的治療方法可用于治療關節炎狀況，如OA和RA，該治療方法基于軟骨合成代謝試劑和軟骨分解代謝抑制劑的組合。如上文所述，實踐的考慮要求通過全身性施用這些治療劑而對這種同時影響身體中多個位點的疾病進行最好的治療。
            
B.試劑的組合
            
本發明的該方面因而提供了包括軟骨保護劑組合的組合物和全身性施用這種組合物的方法。如前文所述，將導向于不同的受體或分子靶的試劑用于多因子的方法中。本發明的治療組合物優選地包括至少一種促進軟骨合成代謝活性的軟骨保護劑和至少一種抑制軟骨分解代謝的試劑。該組合預期使穩態條件最優化，且預期優于僅解決軟骨損壞的常規治療和最近開發僅解決軟骨合成的藥物的研究。用于局部施用的適當合成代謝促進劑和分解代謝抑制劑已在上文進行描述，并預期也可用于本全身性組合物中。可以理解本發明上述關于局部送遞的組合物的方面和優點也在可應用的程度上適用于本發明的全身性實施方案。
            
本發明的軟骨保護組合物可適當地包括一種或多種下述合成代謝促進劑，以作為非限制性的例子白介素(IL)激動劑(如IL-4、IL-10、IL-13激動劑)；轉化生長因子-β超家族的成員，包括TGF-β激動劑(如TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)和骨形態發生蛋白激動劑(如BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7)；胰島素樣生長因子(如IGF-1)和成纖維細胞生長因子(如bFGF)；及保持這些天然存在的試劑的生物學特征的片段、缺失、添加、氨基酸取代、突變和修飾。
            
本發明的軟骨保護組合物可適當地包括一種或多種下述軟骨分解代謝抑制劑，以作為非限制性的例子IL-1受體拮抗劑、TNF-α受體拮抗劑、環加氧酶-2特異性抑制劑、MAP激酶抑制劑、一氧化氮合成酶抑制劑、核因子κB抑制劑、基質金屬蛋白酶抑制劑、抑制軟骨分解代謝的細胞粘附分子(包括整聯蛋白激動劑和整聯蛋白拮抗劑)、抑制軟骨分解代謝的細胞內信號傳導抑制劑(包括蛋白激酶C抑制劑和蛋白酪氨酸激酶抑制劑)以及抑制軟骨分解代謝的SH2結構域抑制劑。
            
如關于前述實施方案所描述的，全身性合成代謝試劑/分解代謝抑制劑組合中的至少一種軟骨分解代謝抑制劑可為抑制軟骨分解代謝的可溶性受體，如可溶性IL-1受體或可溶性腫瘤壞死因子受體。特定的例子包括重組可溶性的人類IL-1受體、可溶性腫瘤壞死因子受體和嵌合的rhTNFR:Fc。用于本發明中整合的可溶性腫瘤壞死因子受體的例子包括公開于授予Jacobs等人的美國專利號5,605,690中的功能性TNF-α拮抗劑，而用于本發明中的可溶性人類IL-1受體的例子包括那些公開于授予Thompson等人的美國專利號6,159,460中的，在此處將該公開內容清楚地引入作為參考。根據本發明的該方面用于與全身性送遞的合成代謝試劑組合的特別有希望的分解代謝抑制劑包括IL-1ra、TNFR1-IgG1融合蛋白和基質金屬蛋白酶的抑制劑。
            
如下文進一步描述的，軟骨保護組合物也可包括一種或多種痛苦和/或炎癥抑制劑或其他治療劑。適用于全身性送遞的軟骨保護組合物的例子在下文實施例5-20中提供。
            
C.全身性送遞
            
本發明的該方面需要軟骨保護劑和潛在的抗炎癥和/或鎮痛劑或其他治療劑的全身性送遞，以在多個關節位點提供治療作用。如在此處所用的，術語“全身性送遞”和“全身性施用”意欲包括，但不局限于口服、肌內、皮下、靜脈內、吸入、舌下、口的、局部的、經皮膚的、鼻的和其他施用方式，這些方式可有效地導致送遞的試劑分散到需要治療作用的一個或多個位點。本組合物的優選全身性送遞途徑為靜脈內、肌內、皮下和吸入。可以理解選擇用于本發明特定組合物中的試劑的準確全身性施用途徑將部分考慮該試劑對與給定施用途徑相關的代謝轉化途徑的敏感性而進行確定。例如，肽能試劑最適合于通過除口服之外的途徑施用。
            
本發明的組合物可在周期性的基礎上以確定的間隔進行全身性施用，以維持預期水平的治療作用。例如，組合物可在每2-4周通過如皮下注射施用。劑量方案將通過醫生考慮可影響試劑組合物作用的各種因素而確定。這些因素包括意欲進行治療的軟骨位點，關節的大小(如果適當)，要治療的軟骨組織的量，軟骨損害的位點，治療時損害的軟骨的狀況，患者的年齡、性別和體重，和其他臨床因素。每一種單獨試劑的劑量將作為包括組合物中的其他合成代謝和分解代謝抑制劑以及任何藥物送遞載體(如持續適當的送遞載體)的存在和特性的函數而進行變化。此外，可調節劑量以說明施用頻率和送遞的試劑的藥物代謝動力學特性中的變化。在個體治療中的進展可通過本領域技術人員公知的多種方法進行監控，包括臨床估計、放射顯影和磁共振成像、計算層析X射線照相術、生物化學標記和關節內窺鏡估計。
            
D.送遞載體和導向
            
使各種全身性施用途徑的組合物進行復合的方法適合用于本組合物中。軟骨保護劑和如果包括的炎癥和痛苦抑制劑或其他治療劑適當地在生理學載體或送遞載體中復合，以作為適用于給定的全身性施用途徑的，如前文所述的。在本發明的一個方面，這些試劑的組合物或其任一成分或多種成分的全身性送遞可摻入藥物送遞載體中或與該藥物送遞載體組合，如持續釋放的送遞載體和/或貯存物。
            
如在此處所用的，術語“送遞載體”意欲包括所有含有、偶聯或攜帶有治療劑的結構，如納米球和其他納米顆粒、小球體和其他微顆粒、微團和脂質體，包括由蛋白、脂質、糖類、合成的有機化合物或無機化合物形成的載體。在下文進一步描述的用于本發明導向的全身性組合物的優選送遞載體是“顆粒”，該“顆粒”意欲包括納米球和其他納米顆粒、小球體和其他微顆粒、微團和其他載體，但不包括也在下文描述的較不優選的脂質體。術語“送遞系統”意指送遞載體和一種或多種含有或偶聯的治療劑。
            
術語“持續釋放的系統”意指一種送遞系統，該送遞系統提供任何或所有摻入試劑的長期的、增強的或調節的送遞、持續時間或可用性。持續釋放系統的例子包括，但不局限于含有藥物的微顆粒、小球體、納米顆粒、蛋白、脂質體、糖類、合成的有機化合物、無機化合物和注射型水凝膠，如由Jun Li等人的美國專利申請序列號09/861,182所描述的，在此處將其清楚地引入作為參考。其他藥物適當的持續釋放的系統是已知的，且根據本發明可適用于在相對一致的治療水平送遞軟骨保護劑，從而當與試劑的大團全身性送遞相比時，可降低副作用，并提供更長的持續作用時間。
            
如在此處所用的，術語“貯存物”意指一種在需要作用的位點或遠離需要作用的位點送遞的藥物送遞系統，該系統提供了用于持續釋放的治療劑的貯備。
            
單個試劑可在均質混合物中復合，可為單獨的微顆粒、小球體等的混合或施用，或者可同時和單獨施用。
            
為了使有害和不需要的全身性作用最小化，在本發明的一個方面，一種治療策略是在送遞載體中送遞試劑組合物，該送遞載體優選地導向于身體中含有軟骨的位點或多個位點，特別是關節。如在此處所用的，“導向的送遞載體”是可用于藥物全身性送遞的且進行改變的送遞載體，從而到達關節或所需的局部作用位點的藥物量比應用非改變的送遞載體或在不存在送遞載體時到達關節或所需的局部作用位點的藥物量更大(即，因為導向的送遞載體優選地與關節的分子、細胞或解剖結構相關，所以藥物優選地定位于關節)。類似地，“導向的送遞系統”是含有一種或多種治療藥物的導向的送遞載體。“導向的藥物”意指直接與靶結構連接或偶聯的治療劑。如在此處所用的，在關節或所需的局部作用位點具有“優先作用”的全身性施用的藥物在關節或所需的局部作用位點比在身體中大多數其他位點展示更大的藥物學活性。
            
1.導向的基本原理
            
在OA中，可存在正常軟骨細胞功能的抑制或這些細胞的組成型無能力，以使基質的修復速率與增加的降解速率匹配。各種細胞因子和炎癥介質已顯示可形成軟骨細胞合成功能中的不平衡，或者可選擇地通過上調各種降解基質的酶而增加軟骨基質的分解代謝，該酶包括基質金屬蛋白酶(包括膠原酶)。因而，軟骨細胞外基質(CEM)完整性的喪失是軟骨合成代謝過程的合成活性和導致降解的分解代謝活性之間的動態不平衡的結果。
            
細胞因子、生長因子和其他生物活性分子的全身性施用常與嚴重的副作用相關。例如，病理學作用與全身性的TGF-β1施用和其他因素相關。此外，未保護的(裸露的)多肽的全身性送遞常受到由于循環中治療性蛋白的快速降解和失活的蛋白試劑穩定性問題的限制，該未保護的多肽對于前文所述的多關節性關節病常為優選的。
            
OA和RA中關節軟骨的損壞可能與關節微環境中分解代謝因子的合成和釋放相關。以前的研究已證明促炎細胞因子(如IL-1)和誘導型基因(如NO合成酶、COX-2、MMP)在炎癥性關節炎疹患者的滑膜中高度表達。類似地，這些介質和基因常表達于OA-影響的軟骨細胞中。在兩種情形中，正是特化的關節微環境限定了決定性地影響關節軟骨狀況的病理生理學環境。為此，期望對治療分子進行導向，以使其優選地進行定位并對其在關節間隙中的預期靶發揮作用。本發明的該方面提供了為了關節的軟骨保護將全身性施用的合成代謝軟骨保護劑和/或全身性施用的分解代謝抑制性軟骨保護劑及優選地兩者導向于關節的機制。
            
因而，優選送遞途徑是將這些蛋白因子導向于關節的作用位點。為了實現臨床應用，需要以持續和局部化的方式將這些試劑送遞入患者關節中的安全方法。也需要一種生物降解性藥物載體，該藥物載體當在關節外時可保護和穩定全身性施用的合成代謝因子和/或分解代謝抑制因子，同時提供將藥物送遞載體導向于關節的唯一方法。
            
軟骨合成代謝生長因子是以微小的量在關節中由身體局部分泌的有力介質，以在關節軟骨中引起局部的生物學反應。在正常的生理學條件下，由軟骨中的軟骨細胞和其他關節結構中的滑膜細胞產生適當的合成代謝生長因子，以通過影響軟骨基質代謝而充當維持健康穩定狀態的軟骨的必需信號。
            
2.抗體導向的送遞載體
            
本發明優選導向的軟骨保護組合物包括包含于導向的送遞載體中的至少一種合成代謝促進性軟骨保護劑和/或至少一種分解代謝抑制性軟骨保護劑，及優選地為合成代謝促進性軟骨保護劑和分解代謝抑制性軟骨保護劑兩者。導向的送遞載體優選地包含顆粒，且最優選地包含納米顆粒，該顆粒和最優選的納米顆粒包封至少一種且優選地為全部軟骨保護劑。顆粒通過與該顆粒偶聯的導向性抗體或抗體片段導向于關節，該抗體或片段對于定位于關節中(即相對于身體中的大多數其他位置優選地表達于關節中，優選地高度表達于關節中，且最優選地限定于關節中的表達)的抗原性決定簇是特異性的。在此處也稱為“導向的免疫顆粒”的抗體導向的顆粒和在此處包封的軟骨保護劑是全身性施用的。部分導向的組合物由關節攝取。剩余的組合物被排泄和/或代謝。在關節中，導向性抗體或片段與靶抗原結合。隨著時間的過去，顆粒在關節中降解，從而以在預定時間段中持續釋放的方式在關節中局部送遞治療濃度的軟骨保護劑，以對要調節的細胞(如關節的初級細胞)進行局部的作用，該細胞包括滑膜細胞和軟骨細胞。治療劑可進行擴散或釋放到滑液中，以隨后結合于關節結構的細胞表面，進行攝取或進入關節結構的細胞中，或直接對存在于滑液中的細胞因子和/或蛋白酶產生作用。
            
本發明該方面導向的組合物可根據本發明導向于患者的關節中，而無需知道導致關節病的特定分子病理學。導向性抗體分子確保包封的試劑優選地定位于關節中，且更優選地定位于關節軟骨成分的鄰近處或與該成分結合。
            
因而，本發明的該方面提供了通過施用一種藥物制劑治療患炎癥性、非炎癥性或其他累及一個或多個關節的關節病的患者的方法，該藥物制劑包括導向的藥物送遞載體，優選地含有軟骨合成代謝試劑和抗分解代謝試劑兩者。這種患者可患有OA、RA或其他關節病，如非炎癥性和炎癥性關節炎疹，包括，但不局限于神經病性關節病、急性風濕熱、褐黃癥、系統性紅斑狼瘡、少年風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎和其他脊椎關節病和晶狀關節病。本發明該方面導向的治療方法和組合物特別適合于患骨關節炎的患者。導向于關節的載體中試劑組合的全身性送遞使得能夠治療這種狀況，而使有害和不需要的全身性作用最小化。
            
A.關節中靶的特征和鑒定
            
本發明提供了將藥物導向于關節的方法和組合物，并詳細說明了關節中的優選靶，該靶包括與關節軟骨和其他關節結構的分子、細胞和組織相關的抗原決定簇。這種靶的例子選自膠原，包括II型膠原和次要的V、VI、IX、X和XI型膠原；蛋白聚糖，包括大的聚集性蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、纖調蛋白和lumican；軟骨寡聚的基質蛋白，糖蛋白-39；蛋白聚糖硫酸軟骨素和糖胺聚糖；巨噬細胞滑膜細胞和成纖維細胞滑膜細胞；軟骨細胞。
            
在一個優選的實施方案中，導向的免疫顆粒不可逆地進行作用、以可逆的方式進行結合或與關節中關節軟骨(也已知為透明軟骨)的特定成分結合。關節中的其他分子靶可包括關節軟骨細胞外基質的成分，如軟骨特異性膠原，包括II、V、VI、IX、X和XI型膠原，聚集蛋白聚糖和其他小的富含亮氨酸的蛋白聚糖，包括核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、纖調蛋白和lumican。蛋白聚糖是蛋白和多糖的高分子量復合物，且遍及脊椎動物的結構組織中，但也存在于細胞表面上。蛋白聚糖中的多糖單元糖胺聚糖(GAG)是含有氨基糖葡糖胺或半乳糖胺的衍生物的酸性二糖聚合物，且是有用的靶。軟骨寡聚的基質蛋白(COMP)和也稱為YKL-40的糖蛋白-39(HC-gp39)同樣是有用的靶。
            
關節軟骨含有幾種遺傳上不同類型的膠原，該膠原在本發明中可用作分子標記，免疫顆粒包括相應的抗體可以與該標記附著，從而使得包封的治療劑能夠送遞到抗體結合位點。關節軟骨的主要膠原即II型膠原占關節或透明軟骨總膠原含量的90％-95％，并形成由電子顯微鏡表明的交叉條帶的纖維性結構。II型膠原也是透明軟骨的唯一和特異性的標記。Hollander等人，J.Clin.Invest.931722(1994)；Freed，L等人，Exp.Cell Res.24058(1998)。發生于原纖維形成后的膠原分子的主要細胞外修飾是共價的原纖維間交聯的發展。已描述了與II型膠原特異性表位結合的抗體。Kafienah，W.等人，Tissue Engineering 8817-826(2002)；Kolettas，E等人，Rheumatology 401146-1156(2001)。II型膠原及其在關節軟骨中的相關表位代表了本發明的優選靶。
            
例如，命名為克隆6B3的II型膠原單克隆抗體同種型IgG1(Linsenmayer，T.F.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.92(2)440-6(1980))識別具有相同一級結構的α1(II)和α3(XI)鏈。在蛋白印跡中，該mAb與用哺乳動物膠原酶消化后的山黧豆中毒的II型膠原TCA片段反應。它也與胃蛋白酶消化的II型膠原反應。其表位定位于II型膠原的三股螺旋，并顯示與I型和III型膠原無交叉反應。II型膠原的溴化氰(CNBr)肽免疫印跡顯示該mAb與CB11片段反應，該片段是完整的II型分子上免疫原性表位的位點。
            
在另一個實施方案中，應用人類軟骨特異性CNBr-切割的II型膠原作為免疫原開發了II型膠原的單克隆抗體(同種型IgG1)(Miller，E.J.，Biochemistry 114903-4909(1972)；Glant，T.T.等人，Histochemistry 82149-158(1985a)；British Journal ofHaematology 90757-766(1995))。該mAb在商業上可購自ChemiconInternational(Temecula，CA)，與胃蛋白酶溶解的和CNBr-切割的人類和牛II型膠原反應。未觀察到與I、III、V和IX型膠原的交叉反應。在本發明一個優選實施方案中，II型膠原的抗體以范圍為0.1-10nM的解離常數與靶表位結合。
            
量上次要的關節軟骨膠原也對基質的結構有貢獻，并充當本發明的有用靶。例如，一種短的非原纖維膠原即IX型膠原(含有糖胺聚糖鏈，因而也認為是蛋白聚糖)與II型膠原原纖維共價結合，并有助于原纖維的相互連接或使原纖維與其他基質分子結合。XI型膠原是一種次要的原纖維膠原，可參與控制II型原纖維的直徑。其他膠原包括V型和VI型也可形成部分基質。這些關節軟骨的次要膠原也可發揮作為抗體指導的免疫顆粒靶的功能，該免疫顆粒與適當的抗體結合。
            
在本發明另一個實施方案中，包含于關節軟骨中的不同類型的蛋白聚糖可用于本發明中以作為結合免疫顆粒的分子標記，從而使得治療劑能夠送遞到抗體結合的位點。在關節軟骨中，蛋白聚糖組成了固相中的第二大部分，占凈重的5％-10％。軟骨基質的蛋白聚糖主要由大的聚集性(50％-85％)和大的非聚集性(10％-40％)蛋白聚糖組成。也存在不同的小蛋白聚糖。
            
最顯著地對組織的材料性質有貢獻的軟骨的蛋白聚糖是大的高分子量單體(分子量1-4×106)。大的蛋白聚糖在結構上由具有幾個不同區域的延伸的蛋白核心組成具有2個球形結構域(G1和G2)的N-末端區域，富含硫酸角質素的結構域；較長的富含硫酸軟骨素的結構域，該結構域也含有一些散在的硫酸角質素和中性的寡糖鏈；和C-末端的球形結構域G3。聚集體通過在G1球形結構域與透明質酸鹽鏈結合的許多蛋白聚糖單體形成。每一個蛋白聚糖-透明質酸鹽鍵由單獨的球形連接蛋白(分子量41,000-48,000)穩定。硫酸軟骨素蛋白聚糖聚集體中富含硫酸軟骨素的區域的較大大小(200-400nm)和鏈的豐度使其成為本發明該方面導向的免疫顆粒的優選靶。
            
與本發明的免疫顆粒偶聯的抗體或其片段的額外靶由HC gp-39提供。在關節中，具有適當的抗原性性質的HC gp-39片段也足以對藥物送遞載體進行導向。
            
免疫顆粒可以用抗體或其片段進行導向，以與關節滑膜的特定結構不可逆的進行反應、以可逆的方式結合(最常見的)或結合。作為優選靶的特化關節細胞包括2種主要滑膜細胞類型，即巨噬細胞滑膜細胞(A型)和成纖維細胞滑膜細胞(B型)。
            
與本發明的免疫顆粒偶聯的抗體或其片段的額外靶是軟骨細胞。這些細胞已知表達多種存在于細胞表面且可充當細胞導向的表位的蛋白。
            
在本發明的另一個實施方案中，與關節軟骨相關的硫酸軟骨素蛋白聚糖代表導向的藥物送遞系統的優選靶。已描述了與硫酸軟骨素蛋白聚糖特異性的表位結合的用于本發明的單克隆抗體。Morgan Jr.，A.等人，Hybridoma 127-36(1981)；Schrappe，M.等人，Cancer Res.523838-3844(1992)；Schrappe，M.等人，Cancer Res.514986-93(1991)。一種這樣的例子是小鼠抗人類的硫酸軟骨素蛋白聚糖單克隆抗體，命名為克隆9.2.27(IgG2a同種型)。9.2.27抗體識別成熟的250kDa的硫酸軟骨素蛋白聚糖核心糖蛋白以及210、220和240kDa的前體多肽。小鼠抗人類的聚集蛋白聚糖單克隆抗體即克隆2A2.1也適合于本發明，且商業上可購自United States Biological(Swampscott，MA)。該抗體不與硫酸軟骨素連接區域反應。透射電子顯微鏡顯示它結合于硫酸軟骨素附著區域的N-末端部分中。
            
B.與軟骨退化相關的新表位的導向
            
在正常成體軟骨中不存在或以非常低的水平存在，但在RA或OA的某些階段升高或更高表達的軟骨生物分子成分也可充當本發明導向的藥物送遞系統的靶。與軟骨退化狀況相關的優選靶是出現于診斷為OA、RA或其他退化性關節病患者的關節軟骨上的新表位，如聚集蛋白聚糖或其他軟骨蛋白聚糖的新表位，且尤其是免疫定位于這種患者關節軟骨淺層的新表位。
            
在本發明的一個方面，導向性抗體或抗體片段與II型膠原或II型膠原片段的新表位或切割位點特異性結合，特別是由基質金屬蛋白酶(MMP)-1、3、8或13，或MMP蛋白家族的其他成員，或具有血小板反應蛋白基元的脫整聯蛋白和金屬蛋白酶(ADMATS)蛋白家族的成員單獨或組合作用生成的新表位或切割位點。ADMATS進一步描述于專利申請WO 00/04917、EP 0 823 478和美國專利5,811,535及Tang，B.等人，FEBS Lett.445(2-3)223-225(1999)中。
            
導向于由II型膠原結構的特定區域限定的特定表位的抗體可用于本發明的導向性組合物中。這些結構區域部分在由發生于OA和RA中的II型膠原退化影響的軟骨中是重要的。II型膠原的退化導致膠原蛋白的片段，該片段從軟骨基質中釋放并出現于滑液中，移動到循環中，并通過尿清除。為具有最大的效用，本發明的組合物導向于仍然與軟骨基質物理相關而不是釋放的片段上的表位。
            
每一種膠原酶、MMP-1(EC 3.4.24.7)、MMP-8(EC 3.4.24.34)和MMP-13(EC 3.4.24.-)均具有切割三股螺旋的原纖維形成性II型膠原的能力，從而產生大的(3/4-長度)氨基末端片段和較小的(1/4-長度)羧基末端片段。Kafienah，W.等人，Biochem.J.331727-732(1998)。它們均最初切割特定的Gly-Leu/Ile鍵以生成特征性的3/4和1/4片段。特定的膠原酶同種型與軟骨的病理學喪失有關。Billinghurst，R.等人，J.Clin.Invest.991534-1545(1997)。例如，在一個OA動物模型中，膠原酶1和膠原酶3的焦點區域定位于膝關節中OA損傷位點的細胞外基質，與3/4-1/4的膠原切割符合。膠原酶3蛋白也富含于在患病關節的中脛骨軟骨中。Huebner，J.等人，Arthritis & Rheumatism 41877-890(1998)。
            
在來自患RA和OA的人中的滑膜、滑液和軟骨樣品中已探測到膠原酶1(MMP-1)。膠原酶3(MMP-13(以比膠原酶1快5-10倍的速度切割II型膠原。值得注目的是，已在患RA和OA的人中的滑膜以及人類OA軟骨中鑒定了MMP-13。
            
原纖維膠原可通過螺旋切割進行破壞而導致變性，或者通過端肽切割進行破壞而導致交聯的去除。兩個研究已通過對II型膠原螺旋區域中隱藏的表位和由膠原酶生成的膠原新表位特異性的多克隆抗血清證實了軟骨中活性膠原酶的存在，該隱藏的表位在由于膠原酶的切割而使膠原解旋后得到暴露。這些發現顯示膠原酶1、膠原酶3或兩者均參與與各種關節炎疹相關的軟骨降解。因而，來自膠原酶切割的特定II型膠原降解生成了可用于對本發明的特定導向方面有用的抗體導向性的新表位。這些表位定位于α1(II)鏈的N-末端3/4片段序列中，已知該序列含有對AH12L3和CB11B的表位(由抗體COL2-3/4m識別)。
            
在關節炎疹中，軟骨蛋白聚糖聚集蛋白聚糖增加的分解代謝是導致關節軟骨退化的主要病理學過程。隨后硫酸化的糖胺聚糖的喪失危及軟骨基質的功能和結構完整性，該硫酸化的糖胺聚糖是聚集蛋白聚糖分子的內在成分。在一段時間后，該過程導致軟骨降解。聚集蛋白聚糖的原位降解是包含在位于核心蛋白中特定肽鍵的切割的蛋白水解過程。對該過程有貢獻的最充分表征的酶活性是金屬蛋白酶特定作用的結果。通過基質金屬蛋白酶(MMP)的原位聚集蛋白聚糖水解已得到廣泛研究。然而，目前已充分認識到負責關節軟骨中聚集蛋白聚糖原位降解的主要蛋白酶是聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase)，其兩種最近鑒定的同種型是具有血小板反應蛋白基元的脫整聯蛋白和金屬蛋白酶(ADisintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondinmotif(ADAMTS))基因家族的成員。存在鑒定聚集蛋白聚糖或聚集蛋白聚糖降解產物上的新表位的單克隆抗體技術。此外，本發明的另一個方面是應用與聚集蛋白聚糖或聚集蛋白聚糖片段上的新表位結合的單克隆抗體或其片段，以導向于含有合成代謝促進劑和分解代謝抑制劑的組合的納米顆粒。
            
暫時的研究已確定聚集蛋白聚糖酶主要負責關節炎性關節病早期階段中關節軟骨的聚集蛋白聚糖的分解代謝和喪失。盡管是連續的，但該過程極可能在膠原分解代謝之前。在疾病過程的晚期階段，當發生膠原分解代謝時，存在小比例軟骨中剩余的聚集蛋白聚糖的MMP-介導的降解的證據。
            
已可能開發和應用鑒定蛋白水解降解產物上分解代謝性新表位的單克隆抗體技術，以鑒定對于不同基質降解性酶家族唯一且特征性的特定切割位點。在這些研究中，表征了幾種特定地鑒定分解代謝性新表位(作為蛋白水解切割產物的N-或C-末端氨基酸序列生成的新表位)的單克隆抗體，該新表位由活性聚集蛋白聚糖酶(或MMP)對聚集蛋白聚糖的小球間(IGD)結構域的作用生成。這些抗體已用于監控聚集蛋白聚糖和連接蛋白的蛋白酶解。此外，本領域技術人員將認識到如下抗體可用于將免疫顆粒導向于關節，而不背離本發明的范圍，該抗體識別在軟骨分解代謝過程中生成的基質蛋白降解產物上的新表位。
            
在本發明的另一個方面中，導向性抗體或抗體片段特異性地與軟骨中的聚集蛋白聚糖或聚集蛋白聚糖片段的新表位或切割位點結合，特別是由MMP-1、3、8或13，或MMP蛋白家族的其他成員，或ADMATS蛋白家族的成員單獨或組合作用生成的新表位或切割位點。識別聚集蛋白聚糖或聚集蛋白聚糖片段中不同結構表位或新表位的單克隆抗體的例子為8-A-4或BC-3。MAb 2-B-6已用于探測大量聚集蛋白聚糖降解產物，該產物由在沿聚集蛋白聚糖的核心蛋白的許多位點的聚集蛋白聚糖酶、MMP或其他蛋白水解活性生成。MAb 2-B-6識別與這些核心蛋白片段附著的4-硫酸化的不飽和硫酸軟骨素二糖。相關的抗體MAb3-8-3也已用于鑒定含有6-硫酸化的硫酸軟骨素寡糖的不同去糖基化的聚集蛋白聚糖代謝物。MAb BC-3識別由氨基酸序列丙氨酸-精氨酸，甘氨酸(ARGxx...)限定的N-末端新表位序列，該序列由聚集蛋白聚糖的IGD結構域中的聚集蛋白聚糖酶分解代謝生成。
            
ADAMTS-4基因(Genbank NM-005099)和ADAMTS-5基因(Genbank007038)編碼具有血小板反應蛋白基元-4和5的脫整聯蛋白和金屬蛋白酶，該酶是ADAMTS蛋白家族的成員。家族的成員共有幾個不同的蛋白構件，包括前肽區域、金屬蛋白酶結構域、脫整聯蛋白樣結構域和血小板反應蛋白1型(TS)基元。該家族的單個成員在C-末端的TS基元數目中有差異，且一些具有獨特的C-末端結構域。由ADAMTS-4基因編碼的酶缺乏C-末端TS基元。由ADAMTS-5基因編碼的酶含有2個C-末端TS基元，并發揮聚集蛋白聚糖酶的功能以切割聚集蛋白聚糖，即一種主要的軟骨蛋白聚糖。因而，這兩種酶均負責聚集蛋白聚糖的降解和聚集蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖片段上新表位的生成(Tortorella，M.等人，J.Biol.Chem.275(33)25791-25797(2000)；Tortorella，M.等人，J.Biol.Chem.275(24)18566-18573(2000)；Abbaszade，I.等人，J.Biol.Chem.274(33)23443-23450(1999))。
            
在本發明治療OA情形中的人類軟骨的另一個實施方案中，應用導向于稱為3-B-3(-)的OA早期生物化學新表位標記的抗體。3-B-3(-)表位是聚集蛋白聚糖的硫酸軟骨素(糖胺聚糖)鏈末端的OA-相關的表型改變。
            
C.導向性抗體特征
            
如在此處所用的，術語“抗體”意欲包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學活性部分(即含有與抗體特異性結合或免疫反應的抗原結合位點的分子)。該術語描述了免疫球蛋白，不管它是天然地還是合成制備的。包含抗體的蛋白可源自天然來源，或部分或全部合成制備。抗體的例子包括所有免疫球蛋白亞型和Fab和F(ab’)2、scFv、Fv、dAb、Fd片段以及公開于美國專利5,534,254中的片段。ScFv指免疫球蛋白分子的單鏈最小結合結構域。術語“抗體”也意指如下抗體，該抗體在細胞外間隙、在細胞的質膜或在細胞的細胞內區域(如胞質或核)中發揮功能，以調節一種或多種調節軟骨代謝的基因的表達或活性。用于本發明的優選抗體包括人源化的、嵌合的和人類單克隆抗體。
            
在抗體的情形中，術語“片段”指任何上述導向的多肽部分的任何氨基酸序列，該序列為了本發明導向的目的而具有與完整抗原相當的來源、結構和機制和功能的共同的相關成分。組合物中抗體的召集和此處描述的方法也意欲包括這種抗體片段的應用。
            
本發明優選的實施方案應用共價附著于納米球或其他顆粒表面上的人源化或人類抗體或其片段，在該納米球或其他顆粒中包封了本發明治療性的軟骨保護劑。抗體或其片段優選地作為顆粒表面上的導向性分子，在該顆粒中包封了治療性的軟骨保護劑，這是因為它們在體內必需足夠穩定，并展示最小的被含有細胞外流體蛋白的血清從顆粒表面去除的潛力。預期完全的人類單克隆抗體或人源化的鼠抗體是最有用的指導施用于人類患者的治療劑送遞的關節導向性抗體類型，其中該抗體與軟骨細胞外基質的任何分子或關節的細胞結合，這是因為該患者在施用后不生成免疫反應。
            
例如，鼠單克隆抗體可通過將編碼鼠Fv區域的核苷酸序列(即含有抗原結合位點的)與編碼人類恒定結構域區域和Fc區域的核苷酸序列進行遺傳重組而進行嵌合。一些鼠的殘基也保留于人類可變區構架結構域中以確保正確的靶位點結合性特征。可以認識到用于導向中的人源化抗體具有降低宿主受體中抗體或多肽的免疫反應性的優點，且可用于增加體內的半衰期和降低對納米顆粒或其他包封性顆粒表面上綴合抗體的有害免疫反應。
            
應用具有完全人類特征的抗體或其類似物以治療人類患者是極其有利的。可采用與那些公開于美國專利6,075,181、6,235,883和6,492,160和專利申請EP 1 167 537 A1中的相似的方法，在此處將其公開內容清楚地引入作為參考。這種方法以前已用于生成多種抗人類IL-8和表皮生長因子受體的完全人類抗體。在本發明最優選的實施方案中，抗體或抗體片段以范圍為0.1-10納摩爾的解離常數與靶表位結合。
            
盡管完全的人類抗體或人源化的抗體優選地用于本發明中以治療人類患者，但也應理解本發明的方法和組合物也用于獸醫應用中以治療易患關節退化的其他哺乳動物(如馬和狗)。
            
D.用于導向的送遞的軟骨保護劑
            
本發明導向的實施方案的優選方面將包括至少一種在納米顆粒或其他送遞載體中包封或包含的軟骨保護劑，在該納米顆粒或其他送遞載體上附著了導向性抗體、抗體片段或其他導向性結構。包封的或包含的試劑可為任何一種在此處公開的合成代謝性軟骨保護劑或分解代謝抑制劑，該試劑具有使其能夠在選擇的納米顆粒或其他送遞載體中包封或包含的化學或結構特征。此外，其他全身性施用時高度易被代謝降解的(如蛋白和肽)或如果不進行導向而全身性施用則導致有害副作用的試劑是優選用于導向的。例如，在下文中公開的每一類合成代謝性軟骨保護劑(包括轉化生長因子(TGF)-β超家族的成員，包括TGF-β激動劑和骨形態發生蛋白激動劑，胰島素樣生長因子和成纖維細胞生長因子)和下文中公開的某些分解代謝抑制劑(白介素-1受體拮抗劑和TNF-α受體拮抗劑)是蛋白，且同樣非常適合于以導向的包封形式進行送遞。
            
本發明最優選導向的包封組合物包括在相同導向的免疫顆粒(或其他導向的顆粒)中包封的合成代謝性軟骨保護劑或分解代謝抑制性軟骨保護劑，兩者試劑優選地為蛋白。可選擇地，每一種試劑可單獨進行包封，且可施用兩種(或超過兩種)類型導向的顆粒的混合物，或者較不優選地同時或依次單獨送遞兩種或多種導向的試劑，以導致在關節中同時存在該試劑。
            
在一些例子中，僅僅合成代謝性軟骨保護劑或分解代謝抑制劑能夠進行包封，或者一種試劑不與不想要的全身性副作用相關。在這種例子中，一種試劑可以以包封導向的形式送遞，而另一種試劑以非導向的非包封形式送遞，它們或者以混合物的相同劑量形式一起送遞或者單獨送遞。
            
假設由上述組合提供的所有優點，盡管在導向于定位于關節中的抗原的免疫顆粒中包封的單個軟骨保護劑(合成代謝促進性或分解代謝抑制性)的送遞不如同時施用合成代謝性試劑和分解代謝抑制劑優選，但也是可能的。
            
E.試劑的包封
            
物質的大小是確定它是否可以透過滑膜毛細管壁并從全身性循環移動到關節的主要因素。通常認為可經過滑膜毛細管壁移動的顆粒的最大直徑是50納米。然而，一些對滑膜毛細管通透性的研究顯示直徑高達240納米的卵磷脂包被的聚苯乙烯顆粒可通過轉胞吞作用進行轉運。本發明通過優選地采用一類大小分布有限制的包封的顆粒(如納米顆粒(優選地為納米球))克服了滑膜通透性屏障施加的限制。
            
本發明持續釋放的劑量形式可包含具有在其中分散的治療劑的的微顆粒和/或納米顆粒，或者可包含純的優選晶狀固體形式的治療劑。
            
本發明該方面的治療性劑量形式可具有任何適合于持續釋放的構型。
            
本發明優選的持續釋放治療劑量形式具有如下的大小、生物降解和生物適合性特征。
            
本發明導向的送遞系統優選地利用大小限于直徑為約5納米-約750納米的納米顆粒，約10-約500納米是更優選的，而最優選的是約20-約200納米。如果證實可導致疾病狀態中足夠的通透性，那么作為替代的有用但較不優選的是大小為直徑約1-約100微米的微顆粒，約1-約25微米是更優選的，最優選的是約1-約10微米。
            
優選的顆粒是可進行生物降解并優選地在約1-約150日的時間段中以治療性水平釋放裝載的藥物的生物降解性結構，該時間段優選地為約7-約60日，而約14-約30日是最優選的。本領域技術人員可以理解藥物從納米顆粒和微顆粒的釋放可通過包括但不局限于擴散和降解的物理過程的組合而發生，且可通過復雜的動力學過程進行描述，該動力學過程對于每一種載體制劑和合成代謝和抗分解代謝治療劑是唯一的。
            
優選的顆粒是與施用劑量形式的關節靶組織和局部生理學環境生物適合性的，包括產生生物適合性的生物降解產物。適當的組合物包括從天然聚合物制備的生物降解性顆粒，包括透明質素(hyaluronan)、脫乙酰殼多糖、膠原、明膠和藻酸鹽。這些天然聚合物可以與其他聚合物組合以生成由如脫乙酰殼多糖和明膠組成的共聚物顆粒。合成的生物降解性聚(α-羥基酯)如聚乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)和共聚物PLGA已成功用于制備摻入蛋白治療劑如人類生長激素的微顆粒。適用于制備本發明導向的顆粒的另一種生物降解性聚合物的例子是兩親的ABA三嵌段共聚物，如聚環氧乙烷聚(3-羥基丁酸)聚環氧乙烷。
            
在選擇本發明所選的軟骨保護劑應用的聚合物納米顆粒系統時，確保包封藥物的適當生物活性也是重要的。
            
導向的生物降解性聚合物納米球的應用具有對于包封的治療劑提供選擇的不同釋放特征的優點。對于一些藥物組合，最適的釋放動力學由雙重釋放過程組成，其中每一種活性成分展示不同的持續釋放特征以在關節中提供最適的藥物代謝動力學。本領域技術人員基于此處的公開內容將認識到，從納米顆粒或微顆粒的最適釋放動力學對于每一種單獨的藥物將是不同的，且也將是在制備中加載于顆粒中的藥物量、顆粒大小和其他由顆粒組成確定的生理化學性質的函數。可對每一種藥物從關節中的包封顆粒中的定量釋放速率進行調節以獲得滑液和關節內間隙中最適的治療性濃度，以實現所需的治療性濃度。例如，可進行體外研究以表征持續釋放的制劑的雙重釋放動力學，其中每一種成分(如合成代謝藥物和分解代謝抑制劑)在7-30日的期間內展示持續的釋放。對每一種藥物釋放入滑液中的量進行定量的方法是本領域技術人員眾所周知的，且包括對放射性標記藥物的測量。可選擇地，可能附著熒光或其他光學報道分子以制備標記的藥物。本領域技術人員可認識到存在許多間接的定量方法，如ELISA或質譜分析法，該方法對于每一種試劑均是特異性的。
            
由于實際的原因，對于兩種大小基本不同的藥物難以實現相似的釋放動力學，許多合成代謝和分解代謝的組合也如此。例如，在本發明一個優選的實施方案中，預期送遞特征在于分子量為200-500的分解代謝抑制劑如p38 MAP激酶抑制劑(例如，SB203580，MW＝377)及長度為160個氨基酸且具有約18Kda的MW的合成代謝試劑如人類IL-10。對每一種試劑持續釋放速率的單獨控制可通過改變顆粒的結構組成和/或生成兩種或多種免疫顆粒混合物而實現。在混合物中，一組顆粒關于包封的合成代謝試劑是均質的，而不同組的顆粒關于包封的分解代謝抑制劑是均質的。兩組混合的顆粒在其各自的大小和聚合物組成中有變化，但如果適當，則特征在于其活性試劑相似的釋放速率，或在于一致的釋放速率，從而分別使每一種包封試劑的局部治療作用最優化。
            
脂質體不是用于導向的全身性送遞根據本發明軟骨保護劑的優選送遞載體。與納米球和其他持續釋放的顆粒送遞系統相比，脂質體在循環系統中具有短的半衰期。脂質體藥物綴合物可被截留于肝和脾中，從而導致脂質體破壞和活性試劑的釋放。試劑因而以活性狀態全身性分布，而不是在定位于關節中之前受到保護。試劑從導向的脂質體送遞系統的釋放不是高度持續的，且具有比導向的免疫顆粒送遞系統更低的局部化。由于這些原因，顆粒(如納米球)的應用相對于脂質體的應用是高度優選的。雖然如此，但是對于全身性送遞的合成代謝軟骨保護劑或包括合成代謝試劑的軟骨保護劑組合，其中高度需要進行導向，導向的脂質體證明是適當的，且提供了相對于裸露的藥物送遞的優點。
            
F.抗體與包封試劑的偶聯
            
使導向性抗體與持續釋放的納米顆粒通過共價或非共價鍵連接的代表性“偶聯”方法包括化學交聯劑和異雙功能交聯化合物(即“連接體”)，該交聯劑和化合物進行反應以在導向性抗體的反應性基團(如羥基、氨基、酰氨基或巰基)和存在于納米顆粒或其他導向性載體表面上的其他反應性基團(具有相似的化學特性)之間形成鍵。在導向性抗體和顆粒或其他送遞載體之間形成的鍵可包括，但不局限于如下的肽鍵、二硫鍵、硫酯鍵、酰胺鍵和硫醚鍵。
            
持續釋放劑量形式與導向性蛋白(抗體)的直接綴合可通過修飾的導向性抗體破壞導向的分子或細胞的識別。配體夾層附著技術是實現持續釋放劑量形式與導向性結合性蛋白(抗體)的附著的有用替代方法。這些技術可包括應用不結合靶細胞群體的蛋白形成一級肽或蛋白殼。然后使結合性蛋白與一級肽或蛋白殼結合，以提供具有功能性結合性蛋白/肽的結果顆粒。一種示例性的配體夾層方法包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白通過上文關于“直接”結合方法所述的功能基團與顆粒共價附著。結合性蛋白是通過功能化的生物素(如通過活化酯、酰肼、碘乙醛縮二乙醇、馬來酰亞氨基或類似官能團)衍生化的，優選地為最低限度的。配體(即結合性肽或蛋白/功能化的生物素)與抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白一級蛋白殼的附著通過應用飽和量的生物素化的蛋白/肽而發生。
            
3.可選擇的導向性和優先效果性送遞方法
            
對本發明中的軟骨保護劑及其組合進行導向，或在關節中實現這種試劑或組合物相對于其他位點優先的效力的其他方法也在本發明范圍內。例如，已知兩種主要的滑膜細胞類型即巨噬細胞滑膜細胞(A型)和成纖維細胞滑膜細胞(B型)和軟骨細胞可表達多種獨特的蛋白，該蛋白存在于這些細胞表面，且可充當特定細胞導向性的表位。選擇導向于在關節中優先表達的蛋白的或優先表達于炎癥或患病關節中的試劑可優先地增加局部作用，而使不需要的全身性作用最小化，且該試劑優選地為合成代謝促進劑和分解代謝抑制劑的組合。
            
如上所述，關節中的分子靶可包括軟骨細胞外基質的成分，如軟骨特異性膠原，包括II、IX、X、XI型膠原，聚集蛋白聚糖和其他小的富含亮氨酸的蛋白聚糖(如核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、纖調蛋白和lumican)。同樣包括以作為靶的是軟骨寡聚的基質蛋白(COMP)和也稱為YKL-40的糖蛋白-39(HC-gp39)。用于本發明該方面中的預期目標是生物化學軟骨標記，該標記不存在于正常成體軟骨中，或僅以非常低的水平存在，但存在于RA或OA的某些階段中。類似地，軟骨保護劑的選擇也可優先地相對于身體其他區域增加局部作用，且該試劑優選地為對在患病或炎癥狀況中上調的受體特異性的合成代謝促進劑和分解代謝抑制劑的組合。
            
如上所述，可通過使包封的試劑與相應的導向性抗體(或抗體片段)偶聯而將包封的試劑或多種試劑導向于關節中的一種或多種結構。這種抗體潛在地也可應用在關節局部環境中切割的鍵與裸露的藥物本身偶聯，以實現全身性施用的藥物向關節的導向和送遞。類似地，可對包括于本發明的合成代謝促進性和分解代謝抑制性組合物中的軟骨保護劑進行選擇，以使其相對于身體的剩余部分優先地在關節中的位點進行作用，從而優先地發揮它們對滑膜細胞和/或軟骨細胞和/或細胞外基質成分的作用。
            
E.選擇送遞載體和劑量的方法
            
根據本發明用于送遞選擇的試劑的特定納米球系統和導向性抗體或片段，及在導向的組合物中包括的治療劑的精確加載或劑量可根據本發明進行分析確定。分析方法包括向需要這種診斷試驗的患者施用含有包封治療劑的抗體標記納米球(或其他導向的顆粒)，及使患者進行成像分析以確定含有藥物的納米球的位置。然后，患者關節中沉積作用的程度可通過應用成像分析進行確定。成像分析是醫學領域中眾所周知的，且無限制地包括x-射線分析、磁共振成像(MRI)或計算層析X射線照相術(CT)。在一個優選的實施方案中，關節導向性抗體可用能夠在患者中成像的可探測性試劑進行標記。例如，導向性抗體可用對照試劑如鋇進行標記，該試劑可用于x-射線分析，或者用磁性對照試劑如釓螯合物進行標記，該試劑可應用MRI或CT進行探測。其他標記性試劑無限制地包括放射性同位素如99Tc。除成像分析之外，可從患者中獲得活體解剖以確定關節(如滑膜組織)中顆粒的存在和濃度。
            
本發明的局部送遞實施方案在局部送遞時適當的治療劑濃度方面進行了描述，該濃度足以在局部送遞位點(如關節)提供預定水平的抑制性或治療性作用。當全身性送遞時，將需要施用更高的試劑濃度或劑量。該全身性劑量和/或濃度是在任何代謝轉化過程后導致在潛在的軟骨降解所需位點提供足夠的活性試劑所必需的，該位點需要實現所需水平的局部治療作用。特別地，全身性劑量和/或濃度的適當治療性和優選水平是導致以如下濃度水平在局部位點(如關節)提供活性試劑的，該濃度水平分別在前述局部送遞的治療性和優選濃度范圍內。
            
對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包括足夠的試劑劑量或加載，以導致在關節或作用位點中能夠在所需持續釋放期間中實現所需治療作用水平的預定持續釋放期間中的局部濃度。因而，包括足夠的試劑劑量或加載，以導致由關節攝取的預定量的包封試劑，從而說明包封試劑在到達關節或關節的局部環境之前的代謝轉化。到達關節的該預定量的包封試劑將根據在此處包含的公開內容，從而當納米球或其他包封送遞系統降解時，試劑在局部作用位點釋放，以在所需的持續釋放期間(如在1日-4周的期間，更優選地為1日-2周)提供在該試劑治療性濃度范圍內的局部濃度。
            
IV.用于抑制軟骨退化的試劑
            
以下是適用于本發明的組合物中的軟骨保護劑的示例性類別，每一類中的示例性藥物。盡管不希望受到理論的限制，認為各類試劑的選擇理由使得起作用的試劑得到了闡明。
            
1.白介素-1(IL-1)受體拮抗劑
            
白介素IL-1以兩種形式存在，IL-1α和IL-1β，其是來源于分離基因產物的多肽，該分離基因產物共有一個相似的免疫調節和促炎功能譜。IL-1是一種17kD的多肽，其可作用于或由關節中的許多細胞類型產生，包括滑膜成纖維細胞和巨噬細胞，軟骨細胞，內皮細胞和單核細胞及巨噬細胞。有證據顯示，IL-1在損傷關節中出現的關節炎癥和關節軟骨的病理生理學損傷中起重要的作用。
            
這兩種形式軟骨損壞細胞因子的作用是通過兩種IL-1受體(IL-1R)，I型IL-1或II型IL-1受體的其中一個介導的。IL-1受體在結構上是清楚的，且屬于以免疫球蛋白結合域的存在為特征的分離超家族。這些受體具有與含免疫球蛋白域的其它受體類似的氨基酸同源物。較大的I型IL-1受體在T細胞中和成纖維細胞中表達，而較小的II型IL-1受體在B細胞，單核細胞，嗜中性白細胞，和骨髓細胞中表達。
            
II型IL-1受體可與高親和力的IL-1β結合，但Il-1β的結合不能引發胞內信號轉導，這是因為它與I型IL-1受體結合。相反，II型受體可作為可溶性IL-1結合因子的前體起作用，其已經從細胞中脫落出來，且此可溶性受體作為生理學的IL1β拮抗劑起作用。天然存在的IL-1結合蛋白已經被描述過了，其與可溶性II型受體的外部相對應。
            
已經克隆并測序了與IL-1受體結合的，天然存在的分泌可溶性配體，其被選擇性地稱為IL-1受體拮抗劑(sIL-1RA，IL-1Ra，IL-1ra)，且發現該配體編碼至少22kD的蛋白。IL-1Ra競爭性地抑制IL-1α和IL-1β與I和II型IL-1受體的結合。Il-1Ra是一種純的受體拮抗劑，因為它與受體的結合不能激活與IL-1受體相關的膜細胞信號轉導機制。雖然此蛋白與IL-1Rs的結合親和力較高，但仍需要過量的，10-100倍的摩爾數來抑制表達I型IL-1R細胞的IL-1生物應答。已知的，產生IL-1Ra的細胞包括單核細胞，嗜中性白細胞，巨噬細胞，滑膜細胞和軟骨細胞。已經證實，IL-1Ra可抑制PGE2的合成，促炎細胞因子和MMPs的誘導，及氧化氮的產生。分泌型IL-1R是在試驗性誘導的炎癥期間體內釋放的。重要地，IL-1Ra是在滑膜組織中表達的，并存在于正常人的滑液中。在膝部損傷的患者中，滑液中IL-1Ra的水平在損傷后的急性階段突然增加，隨后降低至比亞-急性和慢性狀態中的正常水平還要低。從而證明IL-1Ra在關節損傷的應答中起生理學的作用。
            
通常認為IL-1是起支配作用的軟骨損壞細胞因子，由于其通過軟骨細胞和滑膜細胞刺激降解酶和促炎細胞因子產生的能力，它可在關節的損壞中發揮作用。而且，IL-1β還是一種有效的抑制軟骨細胞合成蛋白多糖和膠原的抑制劑。在細胞水平，IL-1β誘導的滑膜成纖維細胞的應答包括PGE2的，膠原酶和其它中性蛋白酶產物的增加，及促炎細胞因子，IL-6和IL-8的上調。
            
IL-1，其存在于關節病患者的關節液中，刺激軟骨細胞1)使酶，如溶基質素，成纖維細胞和嗜中性膠原酶，及纖溶酶原激活劑的合成量提高，2)抑制纖溶酶原激活劑的抑制劑-1和TIMP的合成。而且，IL-1β還是一種有效的，基質成分如II型膠原及蛋白多糖合成的抑制劑，其中的II型膠原是關節軟骨中的主要膠原形式。蛋白酶和抑制劑水平間的不平衡導致活性蛋白酶量的增加。這種增加，與基質生物合成的抑制相結合，導致軟骨退化。在動物研究中，將IL-1注射到兔膝關節中可引起蛋白多糖從關節軟骨中排除。
            
因為IL-1是一種重要的，涉及慢性滑膜炎和軟骨退化發病機理的細胞因子，因此減少它的產生或阻斷它的作用是一種用于減輕滑膜炎癥并提供軟骨保護作用的新的適宜治療方法。可利用各種拮抗激動劑IL-1與其天然膜結合受體間相互作用的治療方法，這些方法包括1)天然存在的，特異性的IL-1受體抑制劑，包括IL-1Ra及可溶性IL-1受體；2)抗IL-1 Abs；3)小分子拮抗劑，其可以是肽的或非肽的。
            
阻斷此重要細胞因子作用的能力可作用于關節中的多種細胞類型(例如，滑膜成纖維細胞和軟骨細胞)，從而抑制隨后的病理作用，如炎性細胞滲透到關節中，滑膜增生，滑膜細胞活化，和軟骨損害及軟骨基質合成的抑制。IL-1受體拮抗劑應阻斷IL-1炎癥應答的增殖，由此干擾疾病過程。許多IL-1受體拮抗劑的治療有效性已經通過炎癥和關節炎(RA和OA)的動物模型得到證實。在皮下注射Il-1Ra或關節內注射可溶性I型IL-1R后，RA患者的臨床病癥得到改善。
            
IL-1β和IL-1Ra的效果取決于它們各自的局部濃度。在RA滑膜片的上清液中，IL-1β的水平比IL-1Ra的水平高三倍。因此，局部IL-1Ra自發性的產生不足以抑制IL-1β的作用，這是因為要有過量的(10-100倍)，較大摩爾數的Il-1Ra分子才能抑制細胞中IL-1誘導的生物反應，其中所述的細胞表達I型的IL-1R。因此，已經將高劑量的IL-1Ra用于體內阻斷患RA的人類志愿者中的IL-1。局部存在于滑膜中的IL-1Ra提供一種負信號，其下調滑膜炎中的至少部分IL-1介導的過程，如白細胞在發炎組織中的積聚，滑膜細胞產生的膠原酶和PGE2。將IL-1Ra直接注射到犬科動物ACL模型的關節中，并使用以將IL-1Ra的基因轉染到人滑膜成纖維細胞中為基礎的基因治療方法，可證實IL-1Ra的軟骨保護作用。
            
本發明公開了IL-1可溶性受體蛋白的局部和全身送遞，所述IL-1可溶性受體蛋白是由IL-1R的胞外域組成的，且能夠結合溶液中的IL-1細胞因子分子。特別是，通過實施例，在美國專利US5,319,071和US5,726,148中公開了含氨基酸序列1-312的可溶性人IL-1受體(shuIL-1R)多肽，其可與一種或多種選自抗炎類，抗疼痛類，或軟骨保護類的藥物組合。選擇性地，如美國專利US5,319,071中公開的，由sIL-1R結合域多肽組成的融合蛋白的局部或全身送遞可促進軟骨保護作用。此外，還公開了美國專利5,817,306中公開的IL-1受體拮抗劑的局部或全身送遞，以用于本發明。已經證明，shuIL-1R可溶性受體可結合具有毫微親和力的IL-1。當在各種炎癥或病理生理條件下將藥物局部用于關節組織時，治療有效濃度的IL-1R可溶性受體，如shuIL-1R的局部送遞可通過將其直接注射到關節中進行，或以灌洗液(例如，在關節內窺鏡外科手術過程期間)的形式進行，該灌洗可與此處公開用作軟骨保護劑的一種或多種軟骨保護藥物，抗炎藥物，或抗疼痛藥物組合使用。這種治療優先抑制膠原酶-1和溶基質素-1產生的IL-1刺激。使用完全不同的方法，該方法是以用于局部產生IL-1和/或TNF-α的1型可溶性受體的基因傳遞為基礎的，人們已經發現，這些細胞因子可溶性受體的存在可在抗原誘導的關節炎急性炎癥階段，為兔的膝關節提供保護。
            
以高親和力與人I型IL-1受體特異性結合的IL-1受體拮抗劑肽(11-15個氨基酸)適于用作本發明的軟骨保護劑。這些小肽與較大的重組IL-1可溶性受體或重組IL-1ra相比，可提供更多的有利之處，包括合成的難易和成本，及滲透生物屏障的能力。基于體外效果的兩種最有效肽是Ac-FEWTPGWYQJYALPL-NH2(AF12198，IC50＝0.5-2nM)Ac-FEWTPGWYQJYNH2(AF11567)。AF11567是AF12198的截短譯本，其缺少4C-端殘基，且相對于I型IL-1受體的親和力稍低，但其具有類似的2.3-2.6小時的血漿半衰期。當經由靜脈內輸注全身給藥時，較差的溶解性和快速的代謝似乎抑制了AF12198的功效。通過直接的局部送遞方法，如注射到關節內的關節間隙中，或使其包括在適于本發明所述外科灌洗液或其它輸注液中，則可部分克服這些限制。適于本發明IL-1受體拮抗劑的實施例如下所示。對于所有局部送遞(即，注射，輸注和灌洗)和全身送遞(包括通過使用導向的遞送系統)方式來說，各適宜試劑的最佳給試劑量和/或濃度是治療有效的。作為一個實施例，對于各所列試劑來說，提供了含所列試劑的灌洗液的優選和最優選濃度，期望這種濃度是治療有效的。所述濃度預期是治療有效的。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
  表1
            
   白介素-1受體拮抗劑的治療和優選濃度
            
2.腫瘤壞死因子(TNF)受體拮抗劑
            
TNF-α，一種主要由活化巨噬細胞產生的細胞因子，具有多種生物作用，包括一些由特異性TNF受體介導的基因的轉錄調節，和免疫調節活性。最初，克隆了兩種被稱作TNF-R1和TNF-2的不同受體，且發現它是作為可溶性受體產生的。
            
此家族中的受體是單個跨膜蛋白，在它們的胞外域具有很多同源物，而它們相對較短的胞內域則具有非常少的序列同源物。TNF的作用是由與細胞表面受體結合的因子而產生的，事實上，其存在于所有已經研究過的細胞類型中。人們已經鑒定并克隆了兩個受體。其中一個受體類型，被稱作TNFR-II(或A型或75kDa)，編碼439個氨基酸的跨膜蛋白，并具有75kDa的分子量。第二個受體類型，被稱作TNFR-I(或B型或55kDa)，具有55kDa的分子量，且編碼426個氨基酸的跨膜蛋白。TNFR1包括一個胞內域，其可以通過NF-κB途徑激發信號。
            
TNF的兩個受體均顯示了結合TNFα的高親和力。人們已經分離了可溶性TNF受體(sTNFR)，且證實其是由于膜結合受體胞外域的脫落而出現的。人們已經鑒定了兩種類型的TNFRs，并將其命名為sTNFRI(TNF BPI)和sTNFRII(TNF BPII)。且已經證明，這這些可溶性受體的形式均可代表上述兩種TNFR類型的截短形式。
            
TNFα在炎癥應答和軟骨損壞的細胞序列和分子事件中起重要的作用。TNFα的許多作用與IL-1的促炎作用相重疊。TNFα的促炎作用是刺激促炎細胞因子，包括IL-1，IL-6和IL-8的釋放。TNF-α還可誘導基質金屬蛋白酶從嗜中性白細胞，成纖維細胞和軟骨細胞中釋放，從而使軟骨退化，部分是通過膠原酶的刺激進行的。此外，TNF-α還可上調正常人關節軟骨細胞和滑膜成纖維細胞中的COX-2，導致PGE2產物的增加。
            
此細胞因子和IL-1被認為激發及產生關節軟骨的病理作用，包括白細胞滲透，滑膜增生，滑膜細胞活化，軟骨損害和軟骨基質合成的抑制。特別是，在滑膜炎癥期間，可見到關節滑膜液中TNF-α水平的增加，及滑膜細胞產生的TNFα的增加。因此，全身送遞，包括導向的送遞系統，或局部送遞的灌洗液，輸注液或注射液中的可溶性TNFα受體可結合游離的TNFα，并作為周圍組織中TNF受體的拮抗劑而起作用，從而提供軟骨保護效果。
            
本發明描述了功能性TNF-α拮抗劑的用途，其可通過有效游離配體的清除，或與受體自身直接的，競爭性的相互作用而胞外阻斷配體與其相關膜受體的相互作用，單獨使用或與其它試劑組合提供軟骨保護作用。還可利用各種治療方法來拮抗激動劑，TNF-α，與其天然膜結合受體間的相互作用，這些方法包括1)天然存在的特異性TNF-α活性抑制劑，包括可溶性TNF-α受體的使用；2)抗TNF-α抗體的使用；3)小分子拮抗劑的使用，該拮抗劑可以是肽的或非肽的。
            
本發明公開了嵌合可溶性受體(CSR)蛋白的用途，其中TNF受體的胞外域，其具有結合TNF分子的活性，是共價連接到IgG分子的一個域上的。特別是，通過第一個實施例，如美國專利US5,447,851中公開的，可使用含TNF受體胞外多肽的胞外域的嵌合多肽(重組嵌合體)，其中的胞外多肽與小鼠IgG1重鏈多肽的CH2和CH3區連接。已經證明該嵌合的TNF可溶性受體(在美國專利US5,447,851中也稱其為“嵌合TNF抑制劑”)可與高親和力的TNF-α結合，且其作為TNF-α生物活性的抑制劑是非常有效的。
            
此外，第二實施例是嵌合融合構造，它是由TNF受體的配體結合域和Fc抗體(也稱作Fc融合可溶性受體)部分組成的，相對于TNF-α受體其已經被制造出來。本發明還公開了美國專利US5,605,690所述的可溶性TNF受體Fc融合蛋白，或任一修飾形式的用途。現有研究證實了這種可溶性TNF受體Fc融合蛋白保持有對TNFα的高結合親和力。
            
在用作藥理學拮抗劑的可溶性受體范圍內，術語可溶性受體包括，但不限制于(1)與天然(內源)產生的氨基酸序列或其可溶性片段相對應的可溶性受體，該氨基酸序列或其片段是由全長的膜受體胞外域組成的，(2)重組可溶性受體，其是全長的，天然存在的受體氨基酸序列的截短或部分序列，其保留結合相關配體的能力，保留生物活性及其類似物，(3)嵌合可溶性受體，其是由截短或部分序列組成的重組可溶性受體，該序列與全長受體氨基酸序列胞外結合域的一部分相對應，而全長受體氨基酸序列是通過低聚物(例如，氨基酸)附著在與IgG多肽(例如，IgG鉸合部和Fc域)的一部分相對應的序列上的，其保留生物活性及結合相關配體的能力。
            
可溶性的，細胞因子受體的胞外配體結合域天然存在于體液中，并涉及細胞因子生物活性的調節。已經報道過許多造血細胞因子受體(Il-1R，IL-4R，IL-6R，TNFR)的可溶性截短形式的天然存在狀態。例如，可溶性TNFR以約1-2ng/ml的濃度存在于健康受試者的尿液和血清中。因為缺少信號轉導功能，這些細胞因子結合蛋白是由于完全受體序列(膜-結合形式)mRNA的選擇性剪接，或是由于受體膜結合形式的蛋白酶剪切和釋放而產生的。雖然這些可溶性截短受體的體內作用還未被完全證實，但它們可作為其互補內源性細胞因子的生理拮抗劑而發揮作用。這種拮抗的發生是由于(1)游離配體的清除，這種清除是通過與其相關可溶性受體的結合而進行的，降低了膜結合受體的有效游離濃度，(2)細胞因子的作用是在與細胞表面受體結合之后才產生的。
            
TNF-α可溶性受體是作為TNF-R1和TNF-R2的天然拮抗劑，通過與游離配體共同集合體的這些細胞表面受體相互競爭而發揮作用的。藥學上的，TNF可溶性受體可作為拮抗劑，通過其降低游離配體生物可利用率的能力而發揮作用，而不是通過競爭抑制機制(即，與膜受體上共同結合位點的內源性配體競爭)發揮作用。將治療有效量的TNF可溶性受體加入到關節中可有效地中和配體的生物活性。體內給予重組可溶性受體的試驗已經證實了其抑制炎癥應答的能力，并可作為拮抗劑起作用。
            
在本發明中，適于用作軟骨保護劑，并與其它軟骨保護劑，抗疼痛和/或抗炎劑組合，從而抑制軟骨損壞的試劑包括可溶性TNFR，人嵌合多肽(重組嵌合體)，其包含與人IgG1的Fc部分相連的TNF-α受體(p80)的胞外域，及抗TNF-α抗體。對于所有局部送遞(即，注射，輸注和灌洗)形式而言，各適宜試劑的最佳給試劑量和/或濃度是治療有效的。作為一個實施例，對于各個所列試劑來說，提供了含所列試劑的灌洗液的優選和最優選濃度，期望這種濃度是治療有效的。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表2
            
TNF-受體拮抗劑的治療和優選濃度
            
3.白介素受體激動劑
            
某些細胞因子是信號糖蛋白，其是滑膜炎和軟骨損壞的重要介質。近來對軟骨損害機制的分析表明，不僅促炎主要細胞因子IL-1的絕對水平在決定軟骨損傷中非常重要，而且軟骨體內穩態的細胞因子控制也是由分解代謝及合成代謝的調節細胞因子，及合成代謝生長因子間的平衡支配的。如果IL-1β和IL-1Ra產物的平衡在有利于IL-1β的炎癥狀態中改變，那么它將有助于慢性炎癥和軟骨損壞的發病，如在膝關節外科手術后發生。能夠抑制關節炎癥部位促炎細胞因子產生的有效治療試劑包括抗炎細胞因子，IL-4，IL-10和IL-13。這些細胞因子可顯著減輕體內和體外的關節軟骨損壞，這一點是通過它們對各種途徑發揮作用而實現的，所述途徑指的是減輕IL-1沖擊的途徑。因此，抗炎細胞因子如IL-4，IL-10和IL-13可通過下列方法有效地減輕炎癥，1)減少促炎細胞因子的產生，2)減少天然抗炎細胞因子，如IL-1Ra的產生，近來，IL-4已經在體內加以證實。
            
IL-4可減輕類風濕關節炎(RA)患者滑膜中的炎性過程。在類風濕性滑膜中，IL-4可抑制由滑膜片導致的促炎細胞因子的產生，從而抑制滑膜細胞的增殖并減少骨的再吸收。IL-4還可以通過抑制人關節軟骨細胞中基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)的合成而促進直接的軟骨保護作用。將應用人關節軟骨細胞的細胞培養系統用于評估IL-4對IL-1誘導的MMP-3的產生及金屬蛋白酶-1(TIMP-1)所起的作用。人們發現，IL-4可抑制IL-1刺激的MMP-3蛋白和酶的活性。此外，IL-4還抑制IL-1誘導的MMP-3 mRNA。iNOS的誘導可由IL-4，IL-10和IL-3來抑制。因此，在炎性關節疾病中，可見到IL-4作為一種關節損壞的保護介質而起作用。
            
此外，IL-4對IL-1調節細胞因子水平的平衡所起的作用支持了軟骨保護的作用。IL-4和IL-10均可抑制由新制備的類風濕性滑膜細胞所產生的炎性細胞因子。雖然各白介素的單獨使用均有效果，不過IL-4和IL-10的組合可協同抑制IL-1和TNF-α刺激的IL-6和IL-8的產生，而對細胞的生存力沒有影響。將IL-4加入到滑膜培養物中可增加IL-1Ra的產生，并減少IL-1β的產生。近來已經報道過用IL-4進行體內治療，其通過區別作用于IL-1β/IL-1Ra的平衡而促進大鼠試驗性關節炎癥狀的減輕。另一種細胞因子IL-13與IL-4共有許多特性，其也誘導RA滑膜中的IL-1Ra。因此，IL-4和IL-13組合物的全身或局部送遞可提供協同的治療價值。
            
IL-10具有許多特性，這表明它是一種抑制軟骨損壞的良好侯選物質。它抑制IL-1和TNF-α的釋放，并刺激TIMP-1的產生，同時抑制MMP-2。近來已經報道過IL-10在RA滑膜中的產生，并描述了IL-10抗炎作用的特性。IL-10可抑制離體RA模型中使用滑膜片所產生的IL-1β，但其比IL-4的抑制程度要小。
            
在使用非-局部方法送遞細胞因子的關節炎動物模型中，已經發現了IL-4和IL-10對軟骨損壞的保護效果。在鼠科動物膠原誘導的關節炎模型中，IL-4和IL-10組合治療可產生巨大的改善。除了肉眼可見炎癥的抑制之外，用IL-4和IL-10組合治療還可以減輕滑膜組織中的細胞浸潤，并引起對軟骨損壞的顯著保護效果。此外，TNF-α和IL-1的mRNA水平可在滑膜組織和關節軟骨中被高度抑制。相反地，IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)的mRNA水平則繼續升高，其暗示保護機制可能與TNF-α和IL-1的抑制產生有關，并伴有IL-1Ra/IL-1平衡的上調。這些數據與IL-10在炎癥應答和關節軟骨損壞的內源性抑制中的主要作用一致，IL-4與Il-10的組合治療顯示了潛在的治療價值。
            
內源性IL-4和IL-10的作用和這些細胞因子對關節炎癥和軟骨損壞的治療效果已經在巨噬細胞依賴的鼠科動物鏈球菌細胞壁(SCW)關節炎模型的早期階段中被研究過。且已經證實內源性IL-10在SCW關節炎的調節中起作用。外源性IL-10的加入進一步擴大了內源性IL-10的抑制效果。使用IL-4和IL-10的組合物可發現一更顯著的效果。這種組合可使腫脹減輕，并使軟骨細胞蛋白多糖的合成增加。用IL-4和IL-10的組合物治療，可基本上減少TNF-α的水平，就像用IL-10單獨治療那樣，但也導致滑膜中IL-1β水平的顯著降低，一種附加的潛在臨床作用。總的說來，該數據與IL-4和IL-10作為軟骨保護劑被全身或局部送遞到關節從而防止軟骨損壞的作用相一致，并顯示含IL-4和IL-10的組合物可提供比單獨使用一種試劑更大的有效治療價值。
            
將重度聯合免疫缺陷(SCID)小鼠用作模型來評估將IL-4或IL-10體內注射到人類風濕性滑膜中時，對軟骨退化和單核細胞(MNC)募集反應的作用。用重組的人IL-4(rhIL-4，100ng；rhIL-10，100ng)，IL-4和IL-10的組合物，或TNF-α(1000U)，或磷酸鹽緩沖鹽水每周兩次，共四周注射到來源于五個類風濕關節炎患者的人類風濕性滑膜和軟骨中。人們發現，人IL-4和IL-10的組合物可抑制人滑膜組織的發病和軟骨退化，證明這些白介素激動劑具有軟骨保護作用。
            
已經克隆并測序了人IL-13，且其擁有IL-4的許多特性。IL-13與IL-4的同源性大約為25％。像IL-4一樣，IL-13可減少由滑液單核細胞產生的促炎細胞因子，包括IL-1和TNF-α。IL-13顯示了體內抗炎作用，因而在關節軟骨損傷的治療中具有治療有效性。
            
作為IL-4，IL-10和IL-13激動劑有效的化合物包括天然存在的人IL-4，IL-10和IL-13，人重組IL-4(rhIL-4)，rhIL-10，和rhIL-13及其部分序列，或肽序列，其已經通過使用重組DNA技術而被構造，以識別IL-4，IL-10和IL-13受體，且能夠激活細胞表面上的這些受體。其特別包括由抗Fc受體部分和抗IL-4，抗-IL-10，及抗IL-13受體部分組成的多特異性分子，其中至少一部分是使用重組DNA技術構造的。在用白介素激動劑作為藥物激動劑的情況下，術語白介素激動劑包括，但不限制于(1)肽序列，其與天然(內源性的)產生的氨基酸序列或其片段相對應，(2)重組白介素，其是全長天然存在的白介素氨基酸序列的截短或部分序列，其保留結合相關受體的能力，并保留生物活性，及其類似物，(3)嵌合白介素，一種重組多肽，其是由與全長氨基酸序列的一部分相對應的截短或部分序列組成的，其中全長氨基酸序列是通過低聚物(例如，氨基酸)附著在與IgG多肽(例如，IgG鉸合區和Fc域)的一部分相對應的序列上的，其保留結合相關受體的能力，并保留生物活性。
            
適于本發明的白介素激動劑的實施例列在下面。對于所有局部送遞(例如，注射，輸注和灌洗)形式來說，各個適宜試劑的最佳給試劑量和/或濃度是治療有效的。作為一個實施例，對于各所列試劑來說，提供了含所列試劑的灌洗液的優選及最優選濃度，期望這種濃度是治療有效的。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表3
            
白介素激動劑的治療和優選濃度
            
4.轉化生長因子-β超家族激動劑
            
轉化生長因子-β(TGF-β)超家族成員是25kD的，能夠影響各種細胞功能的多效多功能蛋白，已知其涉及組織的修復和重塑。在許多情況中，它可提高細胞與胞外基質(ECM)的相互作用，并通過刺激ECM蛋白和蛋白酶抑制劑的分泌和產生而增加ECM的積聚。TGF-β與其它細胞因子具有協同的相互作用，通常顯示抗炎活性。人們已經鑒定了TGF-β的多種同工型，其共有類似的氨基酸序列同源性。在人的組織中已經發現了TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3，雖然它們的結合親和力不同，但它們均在哺乳動物細胞中發揮作用。
            
TGF-β超家族成員是軟骨細胞增殖，分化和胞外基質積聚的有效調節劑。在軟骨器官培養物中，TGF-β1可調節蛋白多糖的代謝并通過兔關節軟骨細胞刺激膠原和糖胺聚糖的合成。此外，TGF-β1可增加TIMP在人關節軟骨細胞中的表達，并下調IL-1受體在關節軟骨中的表達。
            
骨形態發生蛋白(BMPs)是細胞生長，分化和編程性細胞死亡的多功能調節劑，其屬于轉化生長因子(TGF-β)超家族。已經鑒定了超過一打的哺乳動物BMP蛋白家族成員，其中可根據它們的結構將其亞分類為許多組。BMP-2和BMP-4彼此非常相似。BMP-5，BMP-6，成骨蛋白(OP)-1(也稱BMP-7)，和OP-2/BMP-8在彼此結構上相似。生長變異因子(GDF)-5(也稱軟骨衍生的形態發生蛋白-1)，GDF-6(也稱軟骨衍生的形態發生蛋白-2)，和GDF-7形成另一相關組。與BMP-2，BMP-4，BMP-6和OP-1/BMP-7形成對照，其誘導體內骨和軟骨的形成，GDF-5，GDF-6和GDF-7可更有效地誘導軟骨和腱-樣結構(Wolfman等，1997)。
            
TGF-β超家族成員通過與兩種類型的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結合而發揮它們的作用，這兩者對于信號轉導而言均很重要(Massague，1998)。II型受體是組成活性激酶，其使配體結合的I型受體進行轉磷酸化作用。I型受體激活胞內底物，如Smad蛋白，且它是通過此胞內信號轉導特異性的機制而發生的。已經分離出哺乳動物七種不同的I型受體，最初其被稱為活化素受體樣激酶(ALK)-1-ALK7。IA型BMP受體(BMPR-IA或ALK-3)和IB型BMP受體(BMPR-IB或ALK-6)在結構上彼此類似，且特異性地結合BMPs和II型受體。已經證明ALK-2可結合活化素，但最新的數據顯示，它是確定的BMPs，例如，OP-1/BMP-7的I型受體(Macias-Silva等，1998)。ALK-1在結構上與ALK-2非常相似，但還不知道它的生理配體。ALK-5和ALK-4分別是TGF-β(TβR-I)和活化素(ActR-IB)的I型受體。ALK-7與ALK-4和ALK-5在結構上非常相似，但仍然沒有確定它的配體。
            
適于本發明軟骨保護溶液的，天然存在的TGF-β和BMP激動劑及合成的或人重組(rh)的激動劑可與上述任一BMP受體相互作用。這里使用的術語“TGF-β和BMP激動劑”包括其片段，缺失，加成，氨基酸置換，突變和修飾，其保留了天然存在的TGF-β和BMP激動劑配體的生物特性。TGF-β或BMP激動劑可單獨使用，或作為合成代謝的軟骨試劑(成軟骨的或促進軟骨基質的修復)與其它TGF-β超家族成員協同組合使用，或與阻斷軟骨分解代謝的抑制劑組合使用。
            
I型受體可起II型受體下游成分的作用。I型受體胞內信號的特異性是由絲氨酸/蘇氨酸激酶域中的特異性區確定的，其被稱為L45環。因此，BMPR-IA/ALK-3和BMPR-IB/ALK-6(BMPR-I組)的L45環的結構彼此相同，且它們可轉導相似的細胞信號。同樣，TβR-1/ALK-5，ActR-IB/ALK-4，和ALK-7(TβR-I組)的L45環彼此相同，且它們可激活相似的底物(Chen等，1998)。ALK-1和ALK-2(ALK-1組)的L45環與其它的I型受體明顯不同，但它們可激活與BMPR-1組的I型受體相似的底物(Armes等，1999)。
            
各種蛋白可從TGF-β和BMP絲氨酸/蘇氨酸激酶受體轉導信號。它們之中，被深入研究過的分子是Smad家族的蛋白。已經鑒定了哺乳動物中多個不同的Smad蛋白，并將這些蛋白分成三個亞組，即，受體-調節的Smads(R-Smads)，共同配偶體Smads(Co-Smads)，和抑制Smads。R-Smads來源于具有Co-Smads的復合體，由I型受體直接激活的，并轉移到核中。Smad異聚體直接或通過其它DNA-結合蛋白與DNA結合，從而調節靶基因的轉錄。Smad1，Smad5和Smad8是由BMPs激活的，Smad2和Smad3是由TGF-β激活的。例如，與Smad4組合，作為Co-Smad發揮作用的Smad2被轉移到核中，它在其中激活介導TGF生物作用的基因的轉錄。Smad6和Smad7在結構上與其它Smads無關，并起抑制Smads的作用。已經證明BMPs可誘導體外和體內新的軟骨和骨的形成，并調節軟骨細胞的生長和分化。而且，這些蛋白還涉及軟骨修復過程。各種研究已經證實BMPs還可促進和保持成軟骨的表型，其是通過它們在小雞肢芽細胞培養物和胎兒大鼠成軟骨細胞，及兔和牛關節軟骨細胞中刺激蛋白多糖合成的能力表示的。BMPs對于軟骨和骨形成的重要性已經通過轉基因方法加以證實，其中研究了特異性BMP基因的剔除。
            
BMP家族的一個成員，成骨蛋白(OP-1或BMP-7)對于正常和病理條件下，如軟骨修復期間的軟骨體內穩態似乎特別重要。OP-1似乎是BMP家族的唯一成員，與由成人關節軟骨細胞表達的軟骨衍生的形態發生蛋白一起。(Chubinskaya，S.，J.Histochemistry andCytochemistry 48239-50(2000))。OP-1最初是從骨基質中純化的，并可誘導軟骨和骨的形成。已經克隆出人的OP-1基因，并制備出生物活性的重組OP-1同二聚體。人重組OP-1可通過體外人關節軟骨細胞來刺激聚集蛋白聚糖和II型膠原的合成。它還可以阻礙IL-1對這些軟骨細胞代謝的有害作用，并阻斷纖連蛋白片段介導的牛軟骨損傷。這種作用可通過研究重組人OP-1對人關節軟骨細胞的蛋白多糖，前列腺素E2，和IL-1受體拮抗劑產生的作用加以證實，其中人關節軟骨細胞是在有白介素-1β參與的情況下培養的。用OP-1處理人關節軟骨細胞可有效的克服低劑量IL-1β誘導的蛋白多糖合成的下調。而且，研究發現，OP-1可刺激hyaluronan和CD44人軟骨細胞的基質集合要求其它分子的合成。對OP-1在人成熟軟骨中調節和表達的研究證明了OP-1在軟骨保護和修復中的作用，且可將OP-1用作促進軟骨合成代謝和人關節軟骨修復的治療劑。
            
當被植入到體內的骨骼內或骨骼外部位時，OP-1(BMP-7)誘導軟骨和骨的形成。OP-1愈合全層皮關節軟骨損傷的作用是通過下列方法研究的，即穿過兔膝關節的關節軟骨鉆兩個相鄰的孔。OP-1引起關節軟骨的愈合及關節表面的再生，其包括類似成熟關節軟骨細胞的細胞。
            
這些資料顯示，為了在外科手術創傷后防止人軟骨退化并保持關節軟骨的生物體內穩態，本發明實踐所用溶液的優選實施方案包括TGF-β超家族成員的全身或局部應用，優選TGFβ2，BMP-7(OP-1)或BMP-2，或通過相同受體發揮作用的等效激動劑，其被這些配體所用。全身或局部送遞可與一種或多種藥物組合而進行，其中該藥物是軟骨分解代謝過程的抑制劑(例如，MAP激酶抑制劑，MMP抑制劑或一氧化氮合酶抑制劑)和/或其它用于抑制疼痛和炎癥的試劑。
            
在使用TGF-β和BMP激動劑作為藥物激動劑的情況中，術語TGF-β和BMP激動劑包括，但不限制于(1)肽序列，其與天然(內源性)產生的氨基酸序列或其片段相對應，(2)重組TGF-βs和BMPs，其是全長的，天然存在的TGF-β和BMP氨基酸序列的截短或部分序列，其保留結合它們各自受體的能力，并保留有生物活性及其類似物，(3)嵌合的TGF-βs和BMPs，其是由截短或部分序列組成的重組多肽，該截短或部分序列與全長氨基酸序列的一部分相對應，該全長氨基酸序列通過低聚物(例如，氨基酸)附著于與IgG多肽(例如，IgG鉸合區和Fc域)的一部分相對應的序列上，其保留有結合相關受體的能力和生物活性。
            
適于本發明的TGF-β和BMP激動劑的實施例列在下面。對于所有局部送遞(即，注射，輸注和灌洗)形式來說，各個適宜試劑的最佳給試劑量和/或濃度是治療有效的。作為一個實施例，對于各所列試劑來說，提供了含所列試劑的灌洗液的優選和最優選濃度，期望此濃度是治療有效的。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
用于送遞到關節的外科手術溶液治療濃度的范圍可從其相關受體的各配體的解離(Kd)常數值來評估。而對于特殊的細胞類型和組織來說，這些值是不同的，下面是BMP-4的實施例。具有125I-BMP-4的結合試驗揭示了特異性，高親和力結合位點的存在，其具有110pM的解離常數，且每個細胞具有約6000個受體。因此，在11nM BMP-4時，配體的結合達到最大，且有效的受體被完全占據(飽和)。BMP-4功能性受體在原代關節軟骨細胞中的存在已經被證實。
            
表4
            
TGF-β和BMP-受體激動劑的治療及優選濃度
            
5.環加氧酶-2(Cox-2)抑制劑
            
雖然非類固醇類抗炎藥物(NSAIDs)被廣泛地用作抗炎劑，但還沒有特別研究過其用作軟骨保護劑的治療用途。NSAID藥物直接的分子靶是前列腺素合成途徑中的第一個酶，其被稱作前列腺素內過氧化物合成酶或脂肪酸環加氧酶。已經描述過環加氧酶的兩種相關形式，環加氧酶-1或1型(COX-1)和環加氧酶-2(COX-2)的特性。這些同工酶作為前列腺素G/H合成酶(PGHS)-1和PGSH-2是已知的。這兩種酶均可催化前列腺素類形成中的限速步驟，其中前列腺素類的形成是花生四烯酸到前列腺素H2的轉化。COX-1存在于血小板和內皮細胞中，并具有基本活性。比較起來，已經在關節的內皮細胞，巨噬細胞，成纖維細胞和其它細胞中鑒定了COX-2，且它的表達是由促炎細胞因子，如IL-1和TNF-α誘導的。
            
在發炎的關節中，COX-2的表達被上調，且COX-2的活性隨著其上調而增加，導致前列腺素的合成增加，其中的前列腺素存在于炎性關節病患者的滑液中。關節中前列腺素(PGs)的細胞源包括活化的軟骨細胞，A和B型滑膜細胞及浸潤性巨噬細胞。由PGs調節的關節代謝中重要的細胞功能包括基因表達，胞外基質的合成和增殖。因為COX-2是在發炎關節組織中，或在暴露于炎癥(例如，由損傷或外科創傷引起的)介質之后表達的，因此期望COX-2抑制劑的使用可提供抗炎和軟骨保護活性。
            
關節損傷和關節內窺鏡外科手術過程可激發炎性關節病的軟骨損壞。軟骨細胞是關節軟骨中僅有的細胞類型，并通過內源炎性介質，包括PGs的釋放而參與它們自身基質的損壞。研究證明正常人關節軟骨細胞中的COX-2基因表達，蛋白合成和PG釋放是由細胞因子，包括IL-1，TNF-α和IL-6迅速誘導的。mRNA的水平可在細胞因子誘導后2小時被較早地檢測出來，在6小時的時候達到較高水平，并具有至少72小時的非常長的表達持續時間。同樣，人滑膜細胞IL-1α和TNF-α活化的細胞培養研究顯示COX-2的表達及前列腺素E2(PGE2)的產物顯著增加。使用各種NSAIDS，如酮洛芬治療可消滅誘導的PGE2應答。在軟骨細胞培養系統中，特異性的COX-2抑制劑化合物NS-398可防止由細胞因子誘導的PGE2產物的增加，而COX-1的水平則保持穩定(Morisset，S.，1998，J.Rheumatol.251146-53)。因而，推斷出通過激活軟骨細胞而阻斷PG產生可提供軟骨保護作用，其中的軟骨細胞與COX-2的表達有關。
            
NSAIDS通常被用于骨關節炎或類風濕關節炎患者的治療，但它們對這些關節炎疾病中關節軟骨代謝的作用則還有爭議。例如，用NSAIDs臨床治療類風濕關節炎和骨關節炎對于減輕炎癥是成功的。然而，某些對COX-2沒有選擇性的NSAIDs，主要是水楊酸鹽和消心痛，可通過損害軟骨細胞合成的蛋白多糖而促進骨關節的軟骨損壞，而其它NSAIDs則通過刺激軟骨修復而具有某些軟骨保護作用。許多研究均已證實，NSAIDS對軟骨的作用很小或沒有作用。由于目前用于治療創傷性關節損傷和外科手術創傷后的滑膜和軟骨損傷的藥物很少，因而需要建立各NSAID作用于導致軟骨損壞的病理生理機制的獨特性能。
            
因為這兩種COX同工酶的藥理學不同，因而研制了用于抗炎治療的同工酶-特異性(選擇性)環加氧酶抑制劑，且已經在關節炎癥模型中試驗了這些相同COX-2抑制劑的一部分。然而，COX-2抑制劑對軟骨蛋白多糖的合成和退化，及滑膜中IL-1，IL-6，IL-8和前列腺素類的產生的體外作用顯示，某些NSAIDs對體內軟骨和滑膜中白介素和類花生酸產生的作用可發生顯著的變化，這些參數的綜合作用可影響COX-2抑制劑對軟骨完整性的作用。例如，某些NSAIDS由于提高促炎細胞因子的產生或抑制軟骨蛋白多糖的合成而加速類風濕關節炎的關節損傷。然而，盡管COX-2特異性抑制劑的臨床效果可能發生變化，但COX-2的抑制典型地減輕滑膜炎，并減輕軟骨損壞的危險。
            
已經開展了各種生物化學，細胞，及動物試驗，以評估COX-1和COX-2同型抑制劑的相對選擇性。通常，定義選擇性的標準是相對于給定的生物化學或細胞試驗系統得到的COX-1/COX-2抑制常數(或COX-2/COX-1)的比值。該選擇性的比值可用于說明不同的酶活性抑制的絕對IC50值，其是在微粒體和細胞試驗系統間得到的(例如，穩定表達重組人COX同工酶的血小板和巨噬細胞系)。而且，COX-2的抑制模擬由軟骨保護(抑制)細胞因子，如IL-4激發的抑制作用，其下調胞內COX-2的合成。多于45個NSAIDs和COX-2抑制劑的選擇性對比顯示了COX-2對COX-1相對選擇性的排列順序DuP697＞SC-58451＝celecoxib＞nimesulide＝meloxicam＝piroxicam＝NS-398＝RS-57067＞SC-57666＞SC-58125＞flosulide＞etodolac＞L-745，337＞DFU-T-614，具有7nM-17μM的IC50值。
            
根據選擇性COX-2抑制劑，如celecoxib和rotecoxib的分子和細胞作用機制，并根據動物研究，期望當將這些化合物以灌洗液或注射液形式圍手術期直接用于關節時，這些化合物可顯示軟骨保護作用。特別是，期望COX-2抑制劑是這樣一種有效的藥物，其在關節內窺鏡手術期間以灌洗液的形式送遞，或在外科手術過程或其它關節損傷之前，之中或之后，被直接注射到關節中。
            
適于本發明的COX-2抑制劑的實施例在下面列出。對于所有局部送遞(例如，注射，輸注和灌洗)形式來說，各適宜試劑的最佳給試劑量和/或濃度是治療有效的。作為一個實施例，對于各所列試劑來說，提供了含所列試劑的灌洗液的優選和最優選濃度，期望這種濃度是治療有效的。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表5
            
環加氧酶-2抑制劑的治療和優選濃度
            
6.MAP激酶抑制劑
            
促細胞分裂劑-激活的蛋白(MAP)激酶是一組蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，其是在應答各種胞外刺激物，并發揮從細胞表面轉導信號至核的作用時被激活的。該MAP激酶級聯是一種主要的胞內信號傳遞途徑，其從生長因子，激素和炎性細胞因子發射信號至中早期基因。與其它信號傳遞途徑結合，這些活化的促細胞分裂劑-激活蛋白-激酶(MAPKs)分別改變轉錄因子的活性和磷酸化狀態，并最終調節細胞的增殖，變異和與細胞對環境應激的應答。例如，MAPK家族的成員(p38)從潛在的促炎細胞因子，IL-1和TNF-α介導主要的生物化學信號傳遞途徑，從而通過涉及COX-2基因轉錄調節的順式作用因子誘導受刺激巨噬細胞中的環加氧酶-2(COX-2)。
            
MAP激酶類試劑的成員是由至少三個家族組成，已知它們的序列，活化環的大小，及通過胞外刺激物的激活均不同，且它們參與不同的信號轉導途徑。MAP激酶家族中的主要成員包括胞外信號調節激酶(ERKs)，ERK1和ERK2(分別是p44MAPK和p42MAPK)；應激激活的蛋白激酶1(SAPK1)家族，其也被稱作JNK或jun N-端激酶家族；和p38MAP激酶家族，其還被稱為應激激活的激酶2/3(SAPK-2/3)。P38激酶是通過應激激活的，是最著名的促炎細胞因子。在p38家族中，至少有四個不同的同源物(同工型或同工酶)，其標準的名稱分別為SAPK2a，SAPK2b，SAPK2d，SAPK3，或p38α，β，δ(SAPK4)和γ。用于本發明的MAP激酶抑制劑可與上述任一MAP激酶或其組合相互作用。對于特異性MAP激酶抑制劑來說，通過體外酶純化的試驗方法和細胞試驗方法表征的抑制常數可在較寬的濃度范圍內變化，并證明了其在此應用中的功用。p38 MAP激酶的活化是由蘇氨酸和絲氨酸殘基的雙重磷酸化作用介導的。已經證明用TNFα和IL-1處理細胞均可迅速(5分鐘內)增加磷酸化作用并激活p38 MAP激酶。
            
先前工作已經證實小分子抑制劑可特異性地抑制p38 MAP激酶(Lee，J.等，Nature 372739-746(1994)并在各種動物模型中產生生物化學水平的抗炎作用。Cuenda和合作者(Cuenda，A.等，FEBSLett.264229(1995))證明，化合物，SB203580[4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞硫酰基苯基)-5-(4-吡啶基)咪唑]體外抑制p38(IC50＝0.6μM)，抑制激活蛋白激酶-2的MAPK的活化，并阻止熱激蛋白(hsp)27在應答IL-1和細胞應激時的體內磷酸化作用。可抑制p38的SB203580的激酶選擇性是通過對至少15個其它蛋白激酶，包括PKC，PKA，src和受體絲氨酸激酶家族體外的微弱抑制或抑制的失敗加以證實的(Lee，J.Pharmacol.Ther.82389-397(1999))。在細胞研究中，預先用SB203580培養可阻斷IL-1和TNF-α誘導的酶磷酸化作用及后來IL-8的產生。其支持在外科手術過程期間送遞抑制劑的優選作用。
            
已經使用特異性抑制該酶的SB203580研究p38促細胞分裂原-激活的蛋白激酶(MAPK)在導致軟骨損壞的生物化學炎癥應答中的作用。IL-1，其是由p38 MAPK選擇性控制的，的作用是調節前列腺素H合成酶-2(COX-2)，金屬蛋白酶，和IL-6(Ridley，S等，1997，J.Immunol.1583165-73)。在人成纖維細胞和血管內皮細胞中，SB203850抑制(IC50＝0.5μM)IL-1誘導的成纖維細胞中hsp 27(一種p38 MAPK活性的指示物)的磷酸化作用，而不會影響其它已知的IL-1激活的蛋白激酶途徑(p42/44 MAPK，p54 MAPK/c-Jun N-端激酶)。此外，SB203580可顯著抑制IL-1刺激的IL-6(1μM時，約30-50％)，而沒有IL-8從人成纖維細胞和內皮細胞產生。
            
重要地，SB203580強烈地抑制IL-1激發的，成纖維細胞和人內皮細胞的前列腺素產生。其與COX-2蛋白和mRNA誘導的抑制有關。PGE2有助于增加基質金屬蛋白酶的表達，所述基質金屬蛋白酶是軟骨退化的重要介質。當被細胞因子和胞外刺激物激活時，滑膜成纖維細胞和軟骨細胞均可高水平地表達COX-2基因。MAPK抑制劑由于其對MAP激酶的抑制活性而提供軟骨保護活性，其中該MAP激酶是在這些和其它細胞類型中表達的。
            
當全身性或局部用于各種炎性或病理生理疾病的關節組織時，期望MAPK抑制劑作為軟骨保護劑是有效的。在許多體內藥理模型中均已經描述過SB203580的特性，且證明在口服給藥時，其具有長期的活性。SB203580可抑制IL-1產生的膠原酶-1和溶基質素-1的刺激，而不影響TIMP-1的合成。此外，SB203580可防止IL-1-激發的膠原酶-1和溶基質素mRNA的增加。在軟骨損壞模型中，短期IL-1激發的蛋白多糖重吸收和蛋白多糖合成的抑制不受SB203580影響，但可防止長期的膠原損害。此外，SB203580可有效抑制IL-1誘導的牛關節軟骨外植體和軟骨細胞中一氧化氮的產生(Badger 1998)。這些體外觀察為MAP激酶抑制劑的軟骨保護活性提供了依據，其中該可被MAP激酶全身性或直接或局部給予到這些關節組織中。
            
p38 MAP激酶涉及TNF-誘導的細胞因子表達，且作為p38 MAP激酶活性抑制劑而發揮作用的該藥物可阻斷促炎細胞因子的產生(Beyaert，R.等，EMBO J.151914-23(1996))。用TNFα處理細胞可激活p38 MAPK途徑，這是通過p38 MAPK自身磷酸化作用的增加及其底物蛋白的活化加以證實的。用SB203580預處理細胞可完全阻斷TNFα誘導的激活蛋白激酶-2的MAPK的激活及hsp27的磷酸化作用。在相同條件下，SB203580還可完全抑制TNFα誘導的IL-6合成及報道基因的表達，其是由含兩種NF-6B因子的最小啟動子驅動的。因此，這些研究及對其它p38抑制劑的相關研究證明了抑制劑，如SB203580和FR133605對p38 MAPK作用的選擇性，其選擇性地阻礙TNF-α和IL-1誘導的，與軟骨退化有關的蛋白的活化。因此，通過抑制受體下游的激酶來選擇性抑制這些重要促炎細胞因子的MAP激酶信號傳遞途徑證明了MAP激酶抑制劑可提供軟骨保護作用。
            
已經在很多細胞因子抑制和炎癥疾病的動物模型中評估了SB203580。證實了它是一種有效的，具有15-25mg/kg IC50值的大鼠和小鼠體內炎性細胞因子產生的抑制劑。50mg/kg給試劑量的SB203580在DBA/LACJ小鼠的膠原誘導關節炎中具有治療活性，其可顯著抑制爪的炎癥。當以30和60mg/kg/天的劑量p.o.給予SB203580時，可在Lewis大鼠輔劑誘導的關節炎中觀察到抗關節炎的活性。附加的證據是相對于具有0.6μM IC50的骨重吸收有益效果得到的。
            
總之，各種生物化學，細胞和動物研究顯示p38 MAPK在調節對IL-1和TNF-α的應答中起重要的作用，且其涉及某些炎性應答基因，如COX-2 mRNA水平的調節。p38抑制劑可阻斷促炎細胞因子的制備并抑制MMPs的產生，且已證實可抑制軟骨外植體中膠原的損壞。
            
MAPK抑制劑阻斷重要的促炎細胞因子，如IL-1和TNF-α作用的用途對于關節中的許多細胞類型，包括滑膜成纖維細胞，巨噬細胞，和軟骨細胞均有有益的作用，從而抑制后來的病理作用，如炎性細胞到關節的浸潤，滑膜的增殖，滑膜細胞的活化，和軟骨的損傷。因此，MAPK抑制劑應通過前述細胞因子阻斷炎癥應答的增殖，由此干擾疾病過程。
            
適于本發明的MAPK抑制劑的實施例列在下面。對于所有局部送遞(即，注射，輸注和灌洗)形式來說，各適宜試劑的最佳給試劑量和/或濃度是治療有效的。作為一個實施例，對于所列試劑來說，提供了含所列試劑的灌洗液的優選和最優選濃度，期望這種濃度是治療有效的。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表6
            
MAP激酶抑制劑的治療和優選濃度
            
7.基質金屬蛋白酶的抑制劑
            
關節軟骨損傷是關節疾病，如骨關節炎和類風濕關節炎中的一個共同特征，但也發生在關節損傷之后。病理生理學地，可觀察到蛋白多糖和膠原的結構損壞，其損害軟骨的生物活性特性。正常健康的胞外基質的維持可反映基質組分摻入及生物合成速率間的平衡，它們的退化速率和隨后從軟骨到滑液中的損耗。各種蛋白酶均有使軟骨裂開的潛力，且其涉及退化過程，特別是基質金屬蛋白酶。
            
基質金屬蛋白酶(MMPs)，或matrixins，是一族至少15個的鋅內肽酶，其在胞外發揮作用，并在組織病理退化中起重要的作用。表23提供了MMP成員目前的命名及選擇性名稱。很多MMPs均被高度調節，且很多均不是在正常組織中基本表達。然而，促炎細胞因子，如IL-1和TNF-α，激發轉錄和表達。由使組織退化的MMPs的激活和上調所產生的不平衡是慢性炎癥疾病和關節損傷后持續的滑膜炎癥應答過程中，軟骨損壞過程的主要成因因素。已經在膝部半月板損傷或先前交叉韌帶斷裂的患者中研究了軟骨基質的代謝。溶基質素-1(MMP-3)，膠原酶，金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)和蛋白多糖片段的濃度在創傷性膝損傷后的人膝部滑液中增加。暫時地，這些值立即增加，超過參考水平，并在一年以上的時間內顯著地保持升高(10倍增加)。這些變化可能促進蛋白多糖片段濃度的增加，其是在膝部韌帶損傷后，在滑液中觀察到的。
            
表7
            
基質金屬蛋白酶
            
MMP家族的酶是從人軟骨細胞和滑膜細胞，如滑膜成纖維細胞中分泌的。此外，使用原位雜交，人滑膜可合成溶基質素-1和膠原酶。溶基質素-1(MMP-3)能夠使軟骨基質的所有組分退化。有證據證明軟骨細胞通過使基質退化的酶，膠原酶-3的釋放，而有助于軟骨退化。MMPs以潛伏形式的細胞中分泌，在胞外被激活，并被金屬蛋白酶(TIMPs)的組織抑制劑所抑制。MMPs和TIMPs活性間的平衡對于完整軟骨基質的保持是非常重要的。在病理條件，如骨關節炎和類風濕關節炎的條件下，許多研究均已經證明MMPs量的升高，其導致MMPs和TIMPs間的不平衡，這種不平衡被認為是所觀察到軟骨損壞的原因。
            
MMPs是由細胞因子，如白介素-1(IL-1)，和生長因子調節的，其作用于軟骨細胞和滑膜細胞，從而提高它們蛋白酶的產生。其它促炎細胞因子，如IL-6，IL-8和TNF-α2也可上調基質-退化酶的產生。
            
其導致軟骨損壞，其通常是由硫酸化糖胺聚糖(GAGs)的損耗和膠原的分裂來評估的。IL-1，其存在于關節病患者的關節液中，刺激軟骨細胞合成的酶，如溶基質素，成纖維細胞和嗜中性膠原酶，及纖溶酶原激活劑的量增加。此外，IL-1抑制纖溶酶原激活劑的抑制劑-1和TIMP的合成，還抑制基質組分如膠原的合成。抑制劑和酶水平間的不平衡導致活性蛋白酶的量增加，并與基質生物合成的抑制相結合，導致軟骨退化。
            
使用軟骨切片作為體外模型，已經證實了膠原酶抑制劑可通過類風濕性滑膜成纖維細胞(RSF)抑制IL-1或IL-8激發的關節軟骨損害。膠原酶抑制劑，1，10-鄰-菲酮和膦酰二肽，基本上抑制了10-150μM濃度RSF細胞以濃度依賴的方式滲透進軟骨中。細胞因子對蛋白酶分泌的選擇性作用證明了滑膜成纖維樣細胞介導的關節退化是一種高度調節的過程。因此，期望局部抑制關節中的蛋白酶活性及有關的關節基質退化的能力能夠抑制軟骨損壞過程。抑制劑在有限的體外系統中的作用表明，全身局部送遞具有適宜藥代動力學的合成MMP抑制劑的治療干預作為軟骨保護劑是有效的。
            
適于本發明的MMP抑制劑的實施例包括U-24522((R，S)-N-[2-[2-(羥基氨基)-2-氧乙基]-4-甲基-1-氧戊基]-L-亮氨酰-L-phenylalaniamid)，肽如MMP抑制劑I和MMP-3抑制劑，和較大的蛋白，如TIMP-1或其片段，并將其列在下面的表中對于所有局部送遞(即，注射，輸注和灌洗)形式來說，各適宜試劑的最佳給試劑量和/或濃度是治療有效的。作為一個實施例，對于各個所列試劑來說，提供了含所列試劑灌洗液的優選和最優選濃度，期望這種濃度是治療有效的。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表8
            
基質金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑的治療和優選濃度
            
8.核因子κB(NFκB)的抑制劑
            
促炎和軟骨損傷的細胞途徑是由胞外和胞內信號機理調節的，其是新的治療性局部和全身藥物送遞的靶。通過促炎細胞因子白介素-1(IL-1)利用的，可激活轉錄因子，核因子κB(NFκB)的完全分子信號機制被較差地定義。然而，與基因轉錄水平的胞內信號有關的重要分子是促炎轉錄因子，(NFκB)。NFκB的活性是由一族轉錄因子亞單位所介導的，其可與同二聚體或異二聚體形式的DNA相結合。由于被稱作IκB的抑制亞單位的結合，這些亞單位典型地是以非活性形式存在于細胞胞質內的。IL-1受體和其它胞外信號的激活可導致IκB的降解及伴生的NFκB從抑制劑上的分離，然后轉移到核中。NFκB，涉及IL-1誘導的表達，且能夠增加促炎COX-2蛋白在RA滑膜成纖維細胞中的表達。
            
NFκB作為重要分子靶的鑒定是以其作為共同下游信號因子的作用為基礎的，該共同下游信號因子可調節許多與關節炎癥和軟骨損害途徑有關的重要炎性介質的基因表達。許多基因(COX-2，膠原酶，IL-6，IL-8)的應答均是由啟動子支配的，該啟動子包含NFκB啟動子因子。NFκB的激活可介導滑膜細胞中，許多對于炎癥過程非常重要的蛋白的誘導，如細胞因子，細胞-粘附分子，金屬蛋白酶和其它參與滑膜細胞中前列腺素和白三烯(COX-2)產生的蛋白。因而，此轉錄因子代表一種生理上非常重要的靶，其在治療中直接對準人滑膜成纖維細胞，人關節軟骨細胞，及其它關節細胞對損傷的應答。
            
特別是，已經證明人類風濕性滑膜成纖維細胞(RSF)在白介素1β(IL-1β)上的暴露導致85kD的磷脂酶A2(PLA2)和誘導型環加氧酶(COX-2)的共同上調。這兩個酶均可促進隨后PGE2，關節中一種主要的炎性介質的生物合成。將寡核苷酸誘捕器和反義用于證實NFκB參與了前列腺素類代謝酶的調節。使用反義寡核苷酸拮抗NFκB的mRNA，可導致與COX基因啟動子結合的減少。
            
Hymenialdisine，一種天然的海產品，近來已經證明了它是NFκB的激活，及IL-1刺激的RSF抑制的PGE2產物以濃度依賴方式(IC50＝1μM)暴露的抑制劑。分子靶的特異性是通過使用類似物，aldisine，和蛋白激酶C抑制劑，RO32-0432，其是非活性的，證明的。Hymenialdisine對IL-1誘導的NFκB激活的直接作用是通過與典型κB共有序列基序相結合的NFκB的顯著減少，及對受刺激的p65從所處理細胞的細胞溶膠遷移的抑制加以證實的。像所期望的一種NFκB轉錄調節的抑制劑一樣，hymenialdisine-處理的RSF不能轉錄應答IL-1的COX-2或PLA2的mRNA。因此，可觀察到這些酶誘導的蛋白水平的下降和產生PGE2的誘導能力的降低。此外，IL-1-刺激的白介素-8(IL-8)產物，已知其是一種NFκB-調節事件，也是由hymenialdisine抑制的，而IL-1誘導的血管內皮生長因子，一種非-NFκB-調節的基因，的產生不受暴露于hemenialdisine的影響。因此，hymenialdisine可通過其對NFκB激活的抑制作用來抑制IL-1-刺激的滑膜成纖維細胞中PGE2的形成。其為定義它作為新的抑制劑，阻斷NFκB在關節炎癥和軟骨損傷中的作用提供了基礎。
            
適于本發明的NFκB抑制劑的實施例列在下面。對于所有局部送遞(即，注射，輸注和灌洗)形式來說，各適宜試劑的最佳給試劑量和/或濃度是治療有效的。作為一個實施例，對于所列各試劑來說，提供了含所列試劑的灌洗液的優選和最優選濃度，期望這種濃度是治療有效的。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表9
            
NFκB抑制劑的治療和優選濃度
            
9.一氧化氮合酶抑制劑
            
一氧化氮(NO)是一種廣泛分布于胞內和胞外的介質，其涉及某些相關組織疾病的病理生理機制。NO是通過一族酶，NO合酶從L-精氨酸形成的，該酶是胞內定位的。已經克隆可測序了NO合酶的三種同工型。內皮細胞NO合酶(ecNOS)和腦NO合酶(bNOS)基本上是活性的。NO合酶不同的同工型，誘導型NOS(iNOS)，可在多種細胞類型，包括軟骨細胞中找到。它在基礎條件下很少，但它在應答促炎介質如IL-1β和TNF-α時被上調。近來的發現表明IL-1是一種非常有效的軟骨細胞NO合酶的刺激劑，且IL-1通過其上調iNOS的水平而發揮作用。在關節內，軟骨細胞是NO的主要源，且由促炎細胞因子誘導的軟骨細胞iNOS被認為可介導炎性關節病中IL-1的多種作用。
            
特異性抑制軟骨細胞誘導型NO合酶(iNOS)的藥物具有防止因關節損傷(例如，關節的外科手術過程)產生的軟骨損傷的治療作用。支持這種有益治療效果的證據是以許多基本研究為基礎的，這種基本研究評估了各種iNOS抑制所培養軟骨細胞及骨關節炎患者軟骨外植體中的誘導型NO合酶活性的能力。一類化合物，被稱為S-取代的異硫脲，是一種有效的，軟骨中NO生物合成的抑制劑。S-甲基異硫脲和S-(氨基乙基)異硫脲的有效性比NG-單甲基-L精氨酸高2-4倍，比氨基胍高5-10倍，比Nω-硝基-L-精氨酸及Nω-硝基-L-精氨酸甲基酯高300多倍。這些異硫脲化合物可提供一種有效的，對軟骨中的iNOS具有相對特異性的抑制劑，從而適于本發明的全身或局部送遞(Jang，D.，1996，Eur.J.Pharmacol.312-341347)。
            
使用體外系統，如分離的軟骨細胞定義對軟骨基質的作用，從而可評估NO合酶抑制劑的軟骨保護的治療有效性。通過NG-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA)，一種已經公開的NO合酶抑制劑，抑制內源性NO的產生，可抑制由IL-1β-刺激的軟骨細胞所產生的明膠酶，膠原酶和溶基質素。抑制NO的產生還可部分降低乳酸鹽產物的增加，其中乳酸鹽產物是從軟骨細胞在IL-1β上的暴露而出現的。用L-NMMA處理軟骨片段，可使IL-1β抑制糖胺聚糖合成的作用逆轉，抑制IL-1β刺激的MMP活性，增加IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)的產生。NO還可通過減少TGF-β1的產生而間接調節蛋白多糖的合成，其中TGF β1是由于軟骨細胞在IL-1β上的暴露而產生的。它還可防止自分泌-刺激的TGF β1的增加，從而消除此軟骨中的細胞因子的合成代謝作用。
            
一個研究已經比較了新的氨基胍，S-甲基異硫脲(SMT)，S-氨基乙基異硫脲(AETU)，L-NMMA和N-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME)NOS抑制劑對重組人IL-1β應答蛋白多糖合成和NO產生時的抑制作用的有效性。不同的培養系統是以濃度依賴方式應答IL-1β侵襲的，其中NO產物大大增加，且蛋白多糖的合成被顯著地抑制。上述NOS抑制劑(1-1000μM)抑制了用IL-1β處理的軟骨細胞所產生的NO，且其對恢復軟骨細胞中蛋白多糖的合成具有顯著的作用。因此，如果使用治療有效濃度和劑量可阻斷NO的產生，那么可以防止IL-1β抑制蛋白多糖的合成。
            
NO合酶是在從關節炎病患者關節中得到的軟骨中表達的。在類風濕關節炎或骨關節炎患者中，可觀察到滑液中亞硝酸鹽的水平增加，且證明了這些患者中NO產物的重要的源是得自關節軟骨。此外，L-NIL，一種有效的iNOS抑制劑的持續全身送遞可減輕狗試驗性OA(是由ACL的解剖誘導的)的發展，并引起IL-1β，PGE2，NO和MMP產物的基本下降。這些發現暗示了NO是一種有效的，IL-1β作用的調節劑，并有助于關節疾病的病理生理學。
            
因此，這些體外和體內結果表明特異性的NO合酶抑制劑是臨床治療滑膜炎的有效的新藥物，且當將其與一種或多種藥物組合全身或局部送遞時，可提供軟骨保護作用，其中的一種或多種藥物選自用于治療外科手術處理過的關節或其它損傷的關節的抗炎，軟骨保護，和抗疼痛類藥物。
            
適于本發明的NO合酶抑制劑的實施例列在下面。對于所有局部送遞(即，注射，輸注和灌洗)形式來說，各適宜試劑的最佳給試劑量和/或濃度是治療有效的。作為一個實施例，對于所列的各個試劑來說，提供了含所列試劑的灌洗液的優選濃度和最優選濃度，期望這種濃度是治療有效的。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。在一個實施方案中，用于本發明溶液中的優選NO合酶抑制劑是1400W((N-3-(氨基甲基)芐基)乙脒)，一種選擇性的，緩慢的，緊密結合的iNOS抑制劑，diphenyleneiodinium和1，3-PBIT。
            
表10
            
一氧化氮合酶抑制劑的治療和優選濃度
            
10.細胞粘附分子
            
10a整聯蛋白的激動劑和拮抗劑
            
整聯蛋白是位于質膜上的異二聚體，其包含結合配體的α和β亞單位，該配體是胞外基質(ECM)成分或可以是其它大的蛋白，如膠原，層連蛋白，玻連蛋白，骨連蛋白(OPN)和纖連蛋白(FN)。軟骨基質的退化是根據這些細胞與ECM相互作用的機制，由軟骨細胞調節的。軟骨細胞基因的表達是，部分地，通過細胞接觸而控制的，這種細胞結合包括整聯蛋白與軟骨細胞周圍環境中的ECM成分的相互作用。因此，軟骨細胞上的整聯蛋白涉及軟骨體內穩態的控制，且此族受體代表一類可防止軟骨退化的治療的靶。
            
人軟骨細胞可表達一系列由不同的α和β亞單位，包括α1β1，α5β1，αVβ1和其它量較少的亞單位組成的整聯蛋白受體。其中特別重要的是αVβ3整聯蛋白，已知其結合OPN。阻斷單克隆抗體(mAb)LM609的αVβ3復合體-特異性功能作為與配體OPN相似形式的激動劑起作用。它可減少很多促炎和軟骨損壞介質，如IL-1，NO和PGE2的產生。因此，激動劑mAb LM609有適于本發明使用。
            
此外，已經在II期臨床中研究了兩種肽模擬物，MK-383(Merck)和RO-4483(Hoffmann-LaRoche)。因為這些均是小分子，因此他們的半衰期較短，效能較高。然而，似乎它們與其它密切相關的整聯蛋白相互作用的特異性較小。這些肽模擬物也適于本發明。
            
表11
            
整聯蛋白的治療和優選濃度
            
11.抗-趨化劑
            
抗趨化劑可防止炎性細胞的趨化性。可發揮作用的抗趨化靶的代表性實施例包括，但不限制于，F-Met-Leu-Phe受體，IL-8受體，MCP-1受體，和MIP-1-I/RANTES受體。很早就已經研究了此類試劑中的藥物，但它們適用于本發明的情況還未被理論化。
            
12.胞內信號抑制劑
            
12a.蛋白激酶抑制劑
            
i.蛋白激酶(PKC)抑制劑
            
蛋白激酶C(PKC)在許多生理過程中的細胞表面信號轉導中起重要的作用。PKC同工酶可作為下游靶被激活，該靶是由G蛋白偶聯受體(例如，5-羥色胺，緩激肽等)或促炎細胞因子的最初活化所引起的。這些受體種類均在介導軟骨退化中起重要的作用。
            
分子克隆分析顯示，PKC作為由至少8個亞種(同工酶)組成的一大族而存在。這些同工酶的結構及連接受體活化與特異性細胞增殖應答的變化的機制基本不同。特異性同工酶可在各種細胞類型表達，包括滑膜細胞，軟骨細胞，嗜中性白細胞，骨髓細胞，和平滑肌細胞。因此PKC的抑制劑很可能影響多種細胞類型的信號傳遞途徑，除非該抑制劑具有同工酶特異性。因此，可預測PKC的抑制劑對于阻斷滑膜細胞和軟骨細胞的激活是有效的，且可能具有阻斷嗜中性白細胞激活及隨后附著的抗炎作用。已經描述了很多抑制劑，最初的報道表明，50μM的IC50可用于抑制鈣感光蛋白C的活性。G-603(也叫Go 6976)是一種新的，有效的PKC抑制劑，其對于某些具有2-10μM IC50值的PKC同工型具有高度的選擇性。下面列出這些和其它藥物的濃度，GF109203X，也叫Go 6850或雙吲哚基馬來酰亞胺(從Warner-Lambert購得)，相信它們適用于本發明。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表12
            
軟骨損壞抑制劑的治療濃度和優選濃度
            
ii.蛋白酪氨酸激酶的抑制劑
            
雖然很多受體酪氨酸激酶(RTK)家族成員間存在著巨大的差異，但這些受體的信號機制共有許多共同的特征。生物化學和分子遺傳研究顯示配體與RTK胞外域的結合可迅速激活胞內域內在酪氨酸激酶的催化活性(見圖5)。活性增加導致許多胞內底物的酪氨酸特異性磷酸化作用，其中的胞內底物包括一個共有序列基序。因此，其引起很多“下游”信號分子和胞內途徑級聯的激活，其中該胞內途徑級聯可調節磷脂代謝，花生四烯酸酯代謝，蛋白磷酸化作用(包含除蛋白激酶之外的機制)，鈣活動化和轉錄活化(見圖2)。RTK胞質域的生長因子依賴性酪氨酸激酶的活性是胞內信號產生的主要機制，其導致細胞增殖。因此，抑制劑具有阻斷此信號的有效性，并由此防止滑膜細胞和軟骨細胞的活化。
            
各種酪氨酸磷酸化抑制作用化合物的任意一種作為酪氨酸激酶活性(0.5-1.0μM范圍內的體外IC50)的特異性抑制劑均具有有效性，這是因為它們對其它蛋白激酶和其它信號轉導系統幾乎沒有作用。僅有一小部分酪氨酸磷酸化抑制作用化合物可從商業上得到，用于本發明的這些試劑的適宜濃度在下面列出。此外，已經報道過星形孢菌素，并證實了其對src超家族許多蛋白酪氨酸激酶的潛在抑制作用，用于本發明的此試劑的適宜濃度在下面列出。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表13
            
抑制劑的治療和優選濃度
            
12b.胞內蛋白酪氨酸磷酸酶的調節劑
            
含src-同源物2 SH2域的非-跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPases)是已知的，根據命名法稱它們為SH-PTP1和SH-PTP2。此外，SH-PTP1被認為是PTP1C，HCP或SHP。SH-PTP2被認為是PTP1D或PTP2C。同樣，SH-PTP1在所有譜系的造血細胞中和所有變異階段中均以高水平表達，且已經鑒定SH-PTP1基因負責motheaten(me)小鼠的表型，并提供預測抑制劑作用的基礎，該抑制劑可阻斷其與細胞底物的相互作用。用趨化肽刺激嗜中性白細胞可導致酪氨酸激酶的激活，該酪氨酸激酶可介導嗜中性應答(Cui，et al.，1994 J.Immunol)和PTPase的活性，并通過逆轉在最初細胞刺激階段激活的酪氨酸激酶的作用而調節激動劑誘導的活性。能夠刺激PTPase活性的試劑作為抗炎介質具有潛在的治療應用。
            
這些相同的PTPase還可以調節某些RTKs的活性。它們似乎反向平衡活化受體激酶的作用，因而可代表重要藥物的靶。體外試驗證實，注射PTPase可阻斷胰島素刺激的，內源蛋白上酪氨酰殘基的磷酸化作用。因此，PTPase活性的激活劑可反向激活RTK受體在再狹窄中的作用，相信可將它用于本發明的溶液。此外，與那些細胞粘附分子相似，受體-連接PTPase還可作為胞外配體起作用。配體與胞外域結合的功能性結果還未被定義，但這種結合可調節細胞內磷酸酶活性的假設是合理的(Fashena和Zinn，1995，Current Biology，5，1367-1369)。這種作用可阻斷由其它細胞表面粘附分子(NCAM)介導的粘附，并提供一種抗炎作用。至今還未研制出用于這些用途的藥物。
            
12c.SH2域(src同源物2域)的抑制劑
            
SH2域，最初是在蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的src亞族中鑒定的，是非催化的蛋白序列，并由在各種信號轉導蛋白中保存的約100個氨基酸組成(Cohen等，1995)。SH2域作為磷酸酪氨酸-結合分子發揮作用，并由此介導細胞內信號轉導途徑中決定性的蛋白-蛋白締合(Pawson，Nature，573-580，1995)。特別是，已經清楚地定義了SH2域的作用對于受體酪氨酸激酶(RTK)介導的信號非常重要，如在血小板衍生的生長因子(PDGF)受體的情況下。自磷酸化RTKs上含磷酸酪氨酸的位點可起SH2-蛋白結合位點的作用，并由此介導生物化學信號傳遞途徑的激活(見圖2)(Carpenter，G.，FASEB J.63283-3289，1992；Sierke，S.和Koland，J.Biochem.3210102-10108，1993)。SH2域可負責將活化的生長因子受體偶聯到細胞應答上，這種細胞應答包括基因表達的改變，和最終的細胞增殖。因此，預測了選擇性地阻斷在滑膜細胞表面上表達的特異性RTKs(排除IGFR和FGFR)激活作用的抑制劑可在關節內窺鏡檢查過程后，有效的阻斷軟骨退化。
            
已經鑒定了至少20個胞質蛋白，其包括SH2域并在胞內信號中發揮作用。SH2域的分布沒有被限制在一個特殊的蛋白族，但可在多類蛋白，蛋白激酶，脂類激酶，蛋白磷酸酶，磷脂酶，控制Ras的蛋白和某些轉錄因子中找到。許多含SH2的蛋白均具有已知的酶活性，而其它(Grb2和Crk)則起細胞表面受體和“下游”效應分子間“連接體”和“接合體”的作用(Marengere，L.，等，Nature 369502-505，1994)。含SH2域，具有酶活性，并在信號轉導中被激活的蛋白的實施例包括，但不限制于，蛋白酪氨酸激酶的src亞家族(src(pp60c-src)，abl，lck，fyn，fgr和其它)，磷脂酶Cγ(PLCγ)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3-激酶)，p21-ras GTPase，其激活蛋白(GAP)及含SH2蛋白酪氨酸磷酸酶(SH-PTPases)(Songyang等，Cell 72，767-778，1993)。由于這些不同的SH2-蛋白具有從活化細胞表面受體發射信號到附加分子相互作用的級聯中的重要作用，其最終定義細胞應答，因此阻斷特異性SH2蛋白結合，例如c-src的抑制劑在軟骨保護中具有潛在的治療用途。
            
此外，許多免疫/炎癥應答的調節是通過受體介導的，該受體通過含SH2域的非受體酪氨酸激酶傳輸信號。通過抗原特異性T-細胞受體(TCR)而激活T-細胞，可激發導致淋巴因子分泌和T-細胞增殖的信號轉導級聯。TCR激活后最早的一個生物化學應答是酪氨酸激酶活性的增加。特別是，嗜中性白細胞的激活部分是通過細胞表面免疫球蛋白G受體的應答而控制的。這些受體的激活可介導未鑒定過的，具有SH2域的酪氨酸激酶的激活。附加的證據顯示許多src-家族激酶(lck，blk，fyn)均參與從細胞因子和整聯蛋白受體引導的信號轉導途徑，因此可整合從許多獨立受體結構得到的刺激物。因此，特異性SH2域的抑制劑具有阻斷多種嗜中性白細胞功能的潛力，并起抗炎介質的作用。
            
研制對準SH2域的藥物的工作是在體外的生物化學和細胞水平進行的。這種努力應當是成功的，最終的藥物在本發明的實踐中理應有效。
            
V.其它試劑
            
除了上述軟骨保護劑，本發明的局部或全身遞送的組合物還可以包含其它治療劑。例如，可以包含一種或多種抗炎或鎮痛劑(此處也稱作抗疼痛劑)。抗炎和/或鎮痛劑的適當例子在下文中有詳細描述。作為另一個例子，本發明的組合物可以包含一種或多種緩解病情的抗風濕藥物(DMARDs)，如氨甲喋呤、柳氮磺胺吡啶、金化合物，如口服金、金蘋果酸鈉和金硫葡萄糖、硫唑嘌呤、環孢霉素、抗瘧藥、甾體類、秋水仙堿、環磷酰胺、硫酸羥基氯喹、來氟米特、米諾環素和青霉胺。抗炎、鎮痛和/或DMARD劑可以包含在本發明的組合物中，或可以同時或序貫地分開施用。
            
涉及前面針對的與軟骨保護劑相關的局部施用、導向的全身施用和多種試劑的施用的益處的本發明的許多方面也適用于其它試劑的施用。緩解手術后患者的疼痛和痛苦是臨床醫學中，特別是在每年進行的門診病人手術數量不斷增長的情況中一個特殊的焦點區。最廣泛使用的全身試劑，環加氧酶抑制劑(例如，布洛芬)和阿片樣物質(例如，嗎啡，芬太尼)具有顯著的副作用，包括胃腸刺激/出血及呼吸抑制。在手術后的一段時期內，與阿片樣物質有關的惡心和嘔吐的高發生率更是一個難題。以治療手術后疼痛從而避免有害副作用為目的的治療試劑并不容易研制，原因是這些試劑的分子靶遍布于全身，并介導不同的生理作用。盡管抑制疼痛，炎癥及軟骨退化的臨床需要顯而易見，但還是未能研制出以有效的給試劑量傳遞疼痛、炎癥和軟骨退化的抑制劑，同時使不利的全身副作用達到最小的方法。作為舉例，以治療劑量頻繁給予阿片制劑的常規(即，靜脈內，口服，皮下或肌肉內)方法，常常與顯著的不利副作用，包括嚴重的呼吸抑制，情緒改變，精神模糊及深度的惡心嘔吐有關。
            
以往的研究已經證實了某些內源性試劑，如5-羥色胺(5-羥基色胺，在此處有時稱其為“5-HT”)，緩激肽和組胺產生疼痛和炎癥的能力。Sicuteri，F.等，5-羥色胺-舒緩激肽對人痛覺受體的增強作用，生命科學(Life Sci)4，pp.309-316(1965)；Rosenthal，S.R.，組胺作為皮膚痛覺的化學介質，皮膚研究雜志(J.Invest.Dermat.)69，pp.98-105(1977)；Richardson，B.P.等，5-羥色胺M-受體亞型的鑒定以及一類新藥物對其特異性的阻斷作用，自然(Nature)316，pp.126-131(1985)；Whalley，E.T.等，激肽激動劑和拮抗劑的作用，Naunyn-Schmiedeb藥理學文獻(Naunyn-Schmiedeb Arch.Pharmacol.)36，pp.652-57(1987)；Lang，E.等，在體外自大鼠皮膚精細傳入的化學敏感性。神經生理學雜志(J.Neurophysiol)63，pp.887-901(1990)。
            
例如，已經證實了用于人水皰(剝脫性皮膚)的5-HT可引起被5-HT3受體拮抗劑抑制的疼痛，Richardson等.，(1985)。同樣，外周應用舒緩激肽可產生被舒緩激肽受體拮抗劑阻斷的疼痛。Sicuteri等，1965；Whalley等，1987；Dray，A.，等，舒緩激肽和炎性疼痛，神經科學動向(Trends Neurosci.16，pp.99-104(1993))。外周應用組胺可產生被組胺受體拮抗劑抑制的血管擴張，瘙癢和疼痛。Rosenthal，1977；Douglas，W.W.，“組胺和5-羥基色胺(5-羥色胺)及其拮抗劑”，在Goodman，L.S.，等，ed.，治療的藥理學基礎(The Pharmacologycal Basis of Thorapeutics)，MacMillan Publishing Company，New York，pp.605-638(1985)；Rumore，M.M.，et.al.，抗組胺藥物的鎮痛作用，生命科學(LifeSci)36，pp.403-416(1985)。已經證明，這三種激動劑(5-HT，緩激肽和組胺)聯合應用可顯示一種引起疼痛的協同作用，產生一種持久強烈的疼痛信號。Sicuteri等，1965；Richardson等，1985；Kessler，W.，等，炎性介質體外聯合應用引起的皮膚傳入神經終端的激動以及P物質的調制作用。實驗性大腦研究，(Exp.Brain Res.)91，pp.467-476(1992)。
            
在體內，5-HT位于血小板和中樞神經元中，組胺位于肥大細胞中，緩激肽則是在組織創傷，pH改變和溫度改變期間，自較大的前體分子產生的。因為5-HT可以從組織損傷部位的血小板中大量釋放出來，導致血漿5-HT的水平比靜止水平高20倍(Ashton，J.H.等，5-羥色胺作為患血管狹窄癥狗冠狀動脈中循環流速變化的介質，循環(Circulation)73，pp.572-578(1986))，內源性5-HT可能在產生手術后疼痛，痛覺過敏和炎癥方面中起作用。事實上，血小板的活化可導致體外外周傷害感受器的刺激。Ringkamp，M.，等，活化的人血漿血小板在體外刺激大鼠皮膚傷害感受器，神經科學通訊(Neurosci.Lett.)170，pp.103-106(1994)。同樣，組胺和緩激肽也可在創傷期間釋放到組織中。Kimura，E.等，實驗性冠狀動脈阻塞后冠狀竇血中緩激肽水平的變化，美國心臟病雜志(Am Heart J.)85，pp.635-647(1973)；Douglas，1985；Dray等.(1993)。
            
此外，已知前列腺素也可引起疼痛和炎癥。環加氧酶抑制劑如布洛芬通常用于非-外科手術和手術后的環境，以阻斷前列腺素的產生，由此減少前列腺素介導的疼痛和炎癥。Flower，R.J.，等，鎮痛解熱藥和抗炎藥；痛風治療中所用的藥物，見Goodman，L.S.，等主編，治療的藥理學基礎(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，MacMillan Publishing Company，New York，pp.674-715(1985)。環加氧酶抑制劑按常規方法使用時，與某些不利的全身副作用有關。例如，吲哚美辛或酮咯酸具有公認的胃腸和腎的不利副作用。
            
正如所討論的，5-HT，組胺，緩激肽和前列腺素可引起疼痛和炎癥。在過去的二十年中，人們已經了解并討論了這些物質介導其對周圍組織的作用時所借助的各種受體。大多數研究已在大鼠或其他動物模型上進行過。但是，人和動物之間在藥理學和受體序列方面均存在著差別。
            
此外，目前已經將這些介質的拮抗劑用于手術后的疼痛治療。一類稱作5-HT和去甲腎上腺素攝取拮抗劑，包括阿米替林的藥物已經進行口服，獲得了治療慢性疼痛狀況的一些成功。但是，慢性與急性疼痛狀態的機制被認為具有很大的不同。實際上，在圍手術期使用阿米替林的急性疼痛狀態的兩項研究中，已經證明阿米替林沒有緩解疼痛的作用。Levine，J.D.et al.，″Desipramine Enhances OpiatePostoperative Analgesia，Pain 2745-49(1986)；Kerrick，J.M.et al.，″Low-Dose Amitriptyline as an Adjunct to Opioids forPostoperative Orthopedic Paina Placebo-ControlledTrialPeriod，″Pain 52325-30(1993)。在這兩項研究中，都是口服給藥。第二項研究注意到了口服阿米替林實際上在術后的患者中產生了較低的總體舒適感，這可能是因為藥物對腦中多種胺受體的親和力。
            
阿米替林除能阻斷5-HT和去甲腎上腺素的吸收外，還是一個有效的5-HT受體拮抗劑。所以，前面提到的研究中，在減輕手術后疼痛方面缺乏療效這一點似乎與急性疼痛中內源性5-HT所起作用的提法相矛盾。有幾個理由可以解釋在這兩項研究中所發現的阿米替林不能減輕急性疼痛的原因。(1).第一項研究(Levine，等，1986)中阿米替林在手術前一周開始使用，直到手術前一天晚上結束，而在第二項研究(Kerrick，等，1993)中，阿米替林僅僅在手術后使用。所以在實際的組織損傷期，也就是在5-HT將要釋放出來的時期，存在于手術部位組織中的阿米替林的水平還不清楚。(2)阿米替林是由肝臟廣泛代謝的。采用口服給予的方法，手術部位組織中阿米替林的濃度在相當長的時間內，也許不能保持在足夠高的水平來抑制在第二項研究中手術后所釋放的5-HT的活性。(3)鑒于存在多種炎癥介質，且研究已證明了炎癥介質間的協同作用，因此只阻斷一種試劑(5-HT)并不足以抑制應答組織損傷的炎癥反應。
            
有幾項研究已經證實，極高濃度(1％-3％溶液-即10-30mg/ml)的組胺1(H1)受體拮抗劑具有充當外科手術過程局麻劑的作用。這種麻醉作用并不是經由H1受體介導的，而是由于與神經元膜鈉通道(與利多卡因的作用相似)非特異性相互作用的原因。由于可產生與這些高“麻醉”濃度的組胺受體拮抗劑有關的副作用(例如鎮靜作用)，目前還未將組胺受體拮抗劑局部應用于圍術期環境下。
            
A.抗疼痛和/或抗炎試劑與軟骨保護劑的治療組合的協同作用
            
鑒于與關節內窺鏡治療過程后，炎癥和軟骨體內穩態損耗有關的疾病過程的復雜性，和涉及單分子靶阻斷或抑制的分子靶的多重性，不可能提供防止軟骨退化和骨關節炎發展的適當效果。事實上，許多目標指向不同分子受體和/或酶的動物研究還沒有證明在動物模型中有效，或還沒有在臨床試驗中產生效果。因此，對不同分子靶起作用并局部送遞的藥物的治療組合物在軟骨保護的治療方法中是臨床有效的。像下面所描述的，這種協同性分子靶療法的原理是從近年在了解基本的生化機制方面所取得的進展推論出來的，根據這種機制，在關節內窺鏡過程中，滑膜和軟骨中的滑膜細胞和軟骨細胞可傳輸并整合暴露于其上的刺激物。
            
傳統上，將負責細胞信號的分子開關分成主要的分離信號傳遞途徑，每個均包含一組不同的蛋白家族，其作為一組特殊胞外刺激物的轉導物起作用，并介導不同的細胞應答。這種途徑中的其中一個通過G-蛋白偶聯受體(GPCRs)從神經遞質和激素轉導信號，以產生收縮性應答，這種應答包括炎性介質，如PGE2的產生。GPCRs通過三聚G蛋白的激活而與胞內靶偶聯(見圖2)。涉及通過GPCR途徑激活滑膜細胞和軟骨細胞的信號分子實施例是組胺，緩激肽，5-羥色胺和ATP。第二個主要途徑通過激酶級聯和NF-6B從促炎細胞因子，如IL-1轉導信號，以調節基因表達和分解代謝的細胞因子及其它分解代謝因子，包括NO的產生。
            
從神經遞質和激素傳輸的信號可刺激兩類受體中的一類GPCRs，由七-螺旋跨膜區，或配體-門控的離子通道組成。來源于兩種受體的“下游”信號在控制胞質Ca2+濃度上趨同(見圖3)。各GPCR跨膜受體可激活一類特異性的三聚G蛋白，包括Gq，Gi或其它。Gq亞單位可激活磷酸酶Cγ，其導致蛋白激酶C(PKC)的活化和胞質鈣水平的增加(見圖3)。依次，胞內鈣的升高導致cPLA2的活化，和花生四烯酸(AA)的產生。AA作為滑膜細胞和軟骨細胞中COX的底物起作用，其導致PGE2的產生。PKC的活化還可導致MAP激酶的活化，該MAP激酶可導致細胞和組織中NF-B的活化，這種活化是通過暴露于促炎細胞因子上而激發的，并可調節涉及軟骨分解代謝的蛋白基因表達的增加。
            
通過不同的相關受體，由IL-1和TNF-α介導的促炎細胞因子信號也在調節細胞基因表達上趨同。這些不同受體所采用的信號轉導途徑，使用不同的激酶，該激酶與受體而不是信號傳遞途徑相鄰，在MAP激酶水平趨同(圖3和4)。信號轉導取決于激酶級聯中殘基的磷酸化作用，其中的激酶包括“下游”酶，如p38 MAP激酶。IL-1受體和TNF-受體的活化還導致刺激MAP激酶，與Gq偶聯的GPCRs共有的共同步驟(見圖3)。現在認識到，配體依賴性“交擾”可轉激活激酶途徑，該激酶途徑應答特異性GPCRs和細胞因子，如IL-1的共同刺激，導致系統的細胞應答(見圖3)。因此，導致促炎細胞因子，iNOS，COX-2和MMPs基因表達的增加的選擇性抑制劑的組合，其阻斷共有信號傳遞途徑的轉激活(如圖1和2所示)協同發揮作用，從而防止關節內窺鏡手術過程后的炎癥和軟骨退化。
            
B.抗炎和抗疼痛劑
            
用于本發明的組合物和方法中的適當類型的抗炎和/或抗疼痛劑包括(1)5-羥色胺受體拮抗劑；(2)5-羥色胺受體激動劑；(3)組胺受體拮抗劑；(4)緩激肽受體拮抗劑；(5)激肽釋放酶抑制劑；(6)速激肽受體拮抗劑，包括神經激肽1和神經激肽2受體亞型拮抗劑；(7)降鈣素基因相關肽(CGRP)受體拮抗劑；(8)白介素受體拮抗劑；(9)在花生四烯酸代謝物的合成途徑中有活性的酶的抑制劑，包括(a)磷酸酯酶抑制劑，包括PLA2同工型抑制劑和PLC同工型抑制劑，(b)環加氧酶抑制劑，和(c)脂加氧酶抑制劑；(10)前列腺素類受體拮抗劑，包括類花生酸EP-1和EP-4受體亞型拮抗劑以及凝血噁烷受體亞型拮抗劑；(11)白三烯受體拮抗劑，包括白三烯B4受體亞型激動劑和白三烯D4受體亞型激動劑；(12)阿片樣物質受體激動劑，包括μ-，δ-和κ-阿片受體亞型激動劑；(13)P2嘌呤受體拮抗劑，包括P2X受體拮抗劑和P2Y受體拮抗劑；和(14)鈣通道拮抗劑。
            
以下是本發明的意欲局部送遞的屬于前述每種抗炎/抗疼痛劑類型的適當藥物的描述，以及用于溶液中的適當濃度。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。盡管不希望受到理論的限制，認為各類試劑的選擇理由使得起作用的試劑得到了闡明。
            
除環加氧酶抑制劑由于所選擇的特定抑制劑，可能需要較高濃度外，每種藥物最好以0.1-10,000倍于Kd或Ki的低濃度包括在溶液中。優選地，每種藥物以1.0～1000倍于Kd或Ki的濃度，最優選以100倍于Kd或Ki的濃度包括在溶液中。按照需要調整這些濃度，以在局部送遞位點沒有代謝轉化時，用于稀釋。正如下面所闡明的，可根據特定應用的變化而選擇用于溶液中的確切試劑，及試劑的濃度。
            
1.5-羥色胺受體拮抗劑
            
據認為，5-羥色胺(5-HT)是通過刺激外周傷害感受性神經元上的5-羥色胺2(5-HT2)和/或5-羥色胺3(5-HT3)受體而產生疼痛的。大多數研究人員同意外周傷害感受器上的5-HT受體介導由5-HT產生的直接痛覺(Richardson等，1985)。除抑制5-HT引起的疼痛外，5-HT受體拮抗劑還可通過抑制傷害感受器的激活而抑制神經原性炎癥。Barnes P.J.等，神經原性炎癥的調節，藥理學科動向，11，pp.185-189(1990)。但是，在大鼠踝關節的研究中則聲稱5-HT2受體是造成由5-HT引起的傷害感受器激活的原因。Grubb，B.D.，等，與定位于正常的和炎性大鼠踝關節的傳入神經有關的5-HT受體的研究，藥物作用(Agents Action)25，pp.216-18(1988)。因此，5-HT2受體的激活也可能在外周性疼痛和神經原性炎癥中發揮作用。
            
本發明溶液的目的之一是要阻斷疼痛和多種炎癥過程。因此，正如后面將要論述的，在本發明的溶液中適當地采用了5-HT2和5-HT3受體拮抗劑，或單獨使用或組合使用。阿米替林(ElavilTM)是一種用于本發明的合適的5-HT受體拮抗劑。阿米替林作為一種鎮靜劑在臨床上已使用多年，并發現它對某些慢性疼痛病人也有好的作用，胃復安(ReglanTM)臨床上作為抗嘔吐藥使用，但它對5-HT3受體顯示中等程度的親和力，并能抑制5-HT對該受體的作用，故可能抑制由于5-HT從血小板釋放所引起的疼痛。因此它也適合用于本發明中。
            
其他合適的5-HT2受體拮抗劑包括丙咪嗪，曲唑酮，去郁敏和酮色林。酮色林的抗高血壓作用已用于臨床。Hedner，T.，等，新型5-羥色胺拮抗劑酮色林對實驗性和臨床高血壓的作用，美國高血壓雜志(Am J.Hypertension，pp.317s-23s(Jul.1988))。其他合適的5-HT3受體拮抗劑包括西沙必利和昂丹司瓊。適合的5-羥色胺1B受體拮抗劑包括育享賓，N-[甲氧基-3-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基]-2′-甲基-4′-(5-甲基)-1，2，4-噁二唑-3-基)[1，1-聯苯基]-4-羧酰胺(“GR 127935)和甲硫噻庚嗪。本發明溶液中這些藥物所用的治療濃度和優選濃度列于表14。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表14
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療濃度和優選濃度
            
2.5-羥色胺受體激動劑
            
已知5-HT1A，5-HT1B和5-HT1D受體可抑制腺苷酸環化酶活性。因此，包括低劑量5-羥色胺1A，5-羥色胺1B和5-羥色胺1D受體激動劑的本發明溶液應當可以抑制介導疼痛和炎癥的神經元。期望從5-羥色胺1E和5-羥色胺1F受體激動劑獲得相同的作用，因為這些受體也可抑制腺苷酸環化酶。
            
丁螺環酮是一種供本發明應用的適宜的1A受體激動劑。Sumatriptan則是適宜的1A，1B，1D和1F受體激動劑。適宜的1B和1D受體激動劑是二氫麥角胺。適宜的1E受體激動劑是麥角新堿。這些受體激動劑的治療濃度和優選濃度列于表15。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表15
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
3.組胺受體拮抗劑
            
組胺受體通常分為組胺1(H1)和組胺2(H2)亞型。外周給予組胺所引起的典型炎癥反應是經由H1受體介導的。Douglas，1985。所以，本發明溶液優選包括組胺H1受體拮抗劑。異丙嗪(商品名PhenerganTM)是一種有效阻斷H1受體的常用抗嘔吐劑，因而適用于本發明。有趣的是，已經證明該藥還具有局部麻醉作用，只不過產生這種作用所需的濃度比阻斷H1受體所需的濃度要大幾個數量級，因此認為所述作用是由不同機制產生的。本發明溶液中的組胺受體拮抗劑濃度足以抑制涉及傷害感受器激活的H1受體，但不能獲得“局麻”作用，從而消除某些有關的全身副作用。
            
其他適宜的H1受體拮抗劑包括特非那定，苯海拉明，阿米替林，美吡拉敏和tripolidine。因為阿米替林作為一種5-羥色胺2受體拮抗劑也是有效的，故其在本發明中具有雙重功能。這些H1受體拮抗劑中每一種的適宜治療濃度和優選濃度列于表16。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表16
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
4.緩激肽受體拮抗劑
            
緩激肽受體通常分為緩激肽1(B1)和緩激肽2(B2)亞型。研究證明，由緩激肽產生的急性外周性疼痛和炎癥是由B2亞型介導的，而在慢性炎癥中，緩激肽產生的疼痛則是經由B1亞型介導的。Peikins，M.N.等，在大鼠二種持久性痛覺過敏模型上緩激肽B1和B2受體拮抗劑des-Arg9，[Leu8]-BK和HOE 140的抗感受傷害活性。疼痛(Pain)53，pp.191-97(1993)；Dray，A.，等，緩激肽和炎性疼痛、神經科學動向(Trends Neurosci)16，pp.99-104(1993)，這二篇文獻均引入本文作為參考。
            
目前緩激肽受體拮抗劑尚未用于臨床。這些藥物中的一些是肽，因此不能口服給予，因為它們可能會被消化。B2受體拮抗劑阻斷緩激肽引起的急性疼痛和炎癥。Dray等，1993，在慢性炎癥條件下B1受體拮抗劑抑制疼痛。等，1993；Dray et.al.，1993。所以，根據應用，本發明溶液優先包括B1和B2受體拮抗劑中的一種或兩種。例如，急性和慢性關節病均要做關節內窺鏡檢查，因而用于關節內窺鏡檢查的灌洗液應包括B1和B2兩種受體拮抗劑。
            
用于本發明的適宜緩激肽受體拮抗劑包括下列緩激肽1受體拮抗劑D-Arg-(Hyp3-Thi5-D-Tic7-Oic8)-BK的[des-Arg10]衍生物(HOE 140的[des-Arg10]衍生物，可從Hoechst制藥廠購得)；以及[Leu8]des-Arg9-BK。適宜的緩激肽2受體拮抗劑包括[D-Phe7]-BK；D-Arg-(Hyp3-Thi5，8-D-Phe7)-BK(“NPC 349”)；D-Arg-(Hyp3-D-Phe7)-BK(“NPC 567”)；和D-Arg-(Hyp3-Thi5-D-Tic7-Oic8)-BK(“HOE 140”)。這些化合物在前面引入的Perkins等(1993)和Dray等(1993)的文獻中得到更充分的描述。適宜的治療及優選的濃度示于表17。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表17
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療濃度和優選濃度
            
5.激肽釋放酶抑制劑
            
正如前面所指出的，肽緩激肽是疼痛和炎癥的重要介質。緩激肽作為一種裂解產物，是由激肽釋放酶作用于血漿中高分子量的激肽原而產生的。因此有人認為激肽釋放酶在抑制緩激肽產生以及由此產生的疼痛和炎癥方面具有治療價值。適于本發明應用的激肽釋放酶抑制劑是抑肽酶。供本發明溶液使用的該藥的適宜濃度列于下面的表18。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表18
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療濃度和優選濃度
            
6.速激肽受體拮抗劑
            
速激肽(TKs)是一族結構上相關聯的肽，包括P物質，神經激肽A(NKA)和神經激肽B(NKB)。神經元是外周TKs的主要來源。TKs一個重要的全身性作用是神經元刺激，而其它作用包括上皮依賴的血管擴張，血漿蛋白外滲，肥大細胞脫顆粒和復原以及炎癥細胞的刺激。Maggi，C.A.，一般藥理學(Gen.Pharmacol.)22，pp.1-24(1991)。鑒于由TK受體活化所介導的上述生理作用組合，把TK受體作為目標，促進止痛和治療神經性炎癥的方法是合理的。
            
6a.神經激肽1受體亞型拮抗劑
            
P物質激活被稱為NK1的神經激肽受體亞型。P物質是一種存在于感覺神經末端的十一肽。已知P物質具有在C-纖維活化后，產生外周性炎癥和疼痛的多種作用，包括血管擴張，血漿外滲和肥大細胞脫顆粒。Levine，J.D.，等，肽和原始傳入傷害感受器，神經科學雜志(J.Neurosci)13，p.2273(1993)。一種適宜的P物質拮抗劑是([D-Pro9[spiro-gamma-lactam]Leu10，Trp11]physalaemin-(1-11))(“GR 82334”)。其他適用于本發明，作用于NK1受體的拮抗劑有1-亞氨基-2-(2-甲氧-苯基)-乙基)-7，7聯苯-4-全氫異吲哚酮(3aR，7aR)(“RP 67580”)；以及2s，3s-順式-3-(2-甲氧芐基氨基)-2-二苯甲基奎寧環(benzhydrylquinuclidine)(“CP 96，345”)。這些試劑的適宜濃度列于表19中。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表19
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
6b.神經激肽2受體亞型拮抗劑
            
神經激肽A是一種肽，其與P物質一起集聚于感覺神經元中，它也能促進炎癥和痛覺。神經激肽A活化被稱之為NK2的特異神經激肽受體。Edmonds-Alt，S.，等，一種有效的選擇性非肽神經激肽A(NK2)受體拮抗劑，生命科學(Life Sci)50PL 101(1992)。適宜的NK2拮抗劑的實施例包括((S)-N-甲基-N-[4-(4-乙酰胺基-4-苯哌啶子基)-2-(3，4-二氯苯)苯酰胺(“(±)-SR 48968”)；Met-Asp-Trp-Phe-Dap-Leu(“MEN 10，627”)；以及cyc(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-Met)(“L 659，877”)。這些試劑的適宜濃度列于表20。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表20
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
7.CGRP受體拮抗劑
            
降鈣素基因相關肽(CGRP)也是一種與P物質一起集聚于感覺神經元中的肽，其作為血管擴張劑而發揮作用，并可增強P物質的作用。Brain，S.D.，等，降鈣素基因相關肽(CGRP)和增高血管通透性的介導物的協同效應所引起的炎性水腫。英國藥理學雜志(Br.J.Pharmacol.)99，p.202(1985)。適宜的CGRP受體拮抗劑的實施例是I-CGRP-(8-37)，CGRP的截短形式。這種多肽抑制CGRP受體的激活。該試劑的適合濃度列于表21。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表21
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
8.白介素受體拮抗劑
            
白介素是一族歸入細胞因子的肽，是由白細胞和其它應答炎性介質的細胞產生的。白介素(IL)可能是有效的外周痛覺過敏劑。Ferriera，S.H.，等，白介素1β作為可被一種三肽類似物對抗的強有力的痛覺過敏劑，自然(Nature)334，p.698(1988)。一種適宜的IL-1β受體拮抗劑的實施例是Lys-D-Pro-Thr，它是IL-1β截短形式。該三肽抑制IL-1β受體的激活。該試劑的適宜濃度列于表22。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表22
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
9.作用于花生四烯酸代謝物合成途徑中的酶抑制劑
            
9a.磷脂酶抑制劑
            
由磷脂酶A2(PLA2)酶(cPLA2，iPLA2，sPLA2)和磷酸酶C(PLC)產生的花生四烯酸導致級聯反應，其產生多種炎性介質，稱為類花生酸。在整個途徑中，許多階段都可受到抑制，從而減少這些炎性介質的產生。在這些不同階段抑制的實施例列舉如下。
            
酶PLA2同工型的抑制作用抑制從細胞膜釋放花生四烯酸，所以也就抑制前列腺素和白細胞三烯的生成，從而導致炎癥和疼痛的減輕。Glaser，K.B.，磷脂酶A2諸酶的調控選擇性抑制劑及其藥理學增強作用，藥理學進展(Adv.Pharmacol.32，p.31(1995))。一種適宜的PLA2同型酶激動劑的實施例是Manoalide。該試劑適宜的使用濃度列于表23。PLCγ同工型磷酸酶的抑制作用也會造成前列腺素類和白細胞三烯的生成減少，所以也會導致疼痛和炎癥減輕。PLCγ同工型酶抑制劑的實施例是1-[6-((17β-3-甲氧雌甾-1，3，5(10)-三烯-17-基)氨基)己基]-1H-吡咯-2，5-二酮。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表23
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
9b.環加氧酶抑制劑
            
非甾體抗炎藥(NSAIDs)廣泛用作抗炎，抗發熱，抗血栓和鎮痛藥。Lewis，R.A.，前列腺素和白細胞三烯，見風濕病學教科書，第三版(Kelley W，N.，等主編)p.258(1989)。這些藥物的靶分子是I型和II型環加氧酶(COX-1和COX-2)。這些酶也稱為前列腺素H合成酶(PGHS)-1(組成型)和-2(誘導型)，可催化花生四烯酸轉化為前列腺素H，后者是前列腺素和凝血従烷生物合成中的中間體。COX-2酶在內皮細胞，巨噬細胞和成纖維細胞中已被鑒定。該酶由IL-1和TNF-α誘導，并在炎癥部位上調其表達。COX-1的組成活性和COX-2的誘導活性均可導致能產生疼痛和炎癥的前列腺素的合成。
            
目前在市場上銷售的許多NSAIDs(雙氯滅痛，萘普生，吲哚美辛和異丁苯丙酸等)通常是兩種同工型COX的非選擇性抑制劑，但對COX-1可能顯示出比COX-2更大的選擇性，雖然這種比率根據不同化合物而有所變化。與試圖阻斷天然配體與7種所述前列腺素類受體亞型的相互作用相比，用COX-1和2抑制劑阻斷前列腺素形成的做法代表一種較佳的治療策略。所報道的前列腺素類受體(EP-1，EP-2和EP-3)的拮抗劑十分罕見，只有特異性高親和力的凝血従烷A2受體拮抗劑被報道過。Wallace，J.和Cirino，G.藥理學動向(Trends inPharm.Sci)，15，pp.405-406(1994)。
            
溶液所用環加氧酶抑制劑的治療濃度和優選濃度列于表24。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表24
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
9c.脂加氧酶抑制劑
            
脂加氧酶的抑制，抑制了被認為是炎癥和疼痛重要介質的白細胞三烯，如白細胞三烯B4的生成。Lewis，R.A.，前列腺素和白細胞三烯，見風濕病學教科書，第三版(Kelley W.N.，等主編)，p.258(1989)。脂加氧酶拮抗劑的一個實施例是2，3，5-三甲基-6-(12-羥基-5，10-十二碳二炔基)-1，4-苯醌(AA 861)，其適宜的濃度列于表25。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表25
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
10.前列腺素類受體拮抗劑
            
作為花生四烯酸代謝產物而產生的特異性前列腺素類通過激活前列腺素類受體而介導它們的致炎作用。各類特異性前列腺素類拮抗劑的例子有類花生酸EP-1和EP-4受體亞型拮抗劑以及凝血噁烷受體亞型拮抗劑。一個適宜的前列腺素E2受體拮抗劑是8-氯二苯并[b，f][1，4]噁唑嗪(oxazepine)-10(11H)-羧酸，2-乙酰酰肼(“SC19220”)。一種適宜的凝血噁烷受體亞型拮抗劑是[15-[1α，2β(5Z)，3β，4α]-7-[3-[2-(苯氨基)-羰基]肼基]甲基]-7-氧代二環-[2，2，1]-庚-2-基]-5-庚酸(“SQ 29548”)。這些試劑的適宜濃度列于表26。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表26
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
11.白細胞三烯受體拮抗劑
            
白細胞三烯(LTB4，LTC4和LTD4)是花生四烯酸代謝中5-脂加氧酶途徑的產物，由酶作用產生，具有重要的生物學性質。白細胞三烯涉及包括炎癥在內的許多病理狀態。目前多家制藥公司都在尋找特異性拮抗劑，作為有效的治療手段干預這些病理狀態。Halushka，P.V.，等，藥理學和毒理學評論年鑒(Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.)29213-239(1989)；Ford-Hutchinson，A.免疫學鑒定評論(Crit.Rev.Immunol.101-12(1990))。在包括嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞在內的某些免疫細胞中發現有LTB4受體。LTB4與這些受體結合，導致趨化性和溶酶體釋放，從而引起炎癥過程。與LTB4受體活化有關的信號轉導過程包括G-蛋白介導的磷脂基(P1)代謝刺激以及胞內鈣水平的升高(見圖2)。
            
一個適宜的白細胞三烯B4受體拮抗劑的例子是SC(±)-(S)-7-(3-(2-環丙甲基)-3-甲氧基-4-[(甲氨基)-羰基]苯氧基)丙氧基)-3，4-二氫-8-丙基-2H-1-苯并吡喃-2-丙酸(“SC53228”)。適用于本發明的該試劑濃度列于表27。其他適宜的白細胞三烯B4受體拮抗劑包括[3-[-2(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基][3-二甲氨基-3-氧代丙基]硫基]甲基]硫基丙酸(“MK 0571”)以及藥物LY 66071和ICI 20，3219。MK 0571也可當作LTD4受體亞型拮抗劑。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表27
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
12.阿片樣物質受體激動劑
            
阿片樣物質受體的活化產生抗傷害感受作用，故這些受體的激動劑是人們所期望的。阿片樣物質受體包括μ-，δ-和κ-阿片受體亞型。μ受體定位于外周感覺神經元末端上，這些受體的活化抑制感覺神經元活性。Basbaum，A.I.，等，阿片制劑鎮痛劑外周靶是如何成為中心的(How Central is a Peripheral Target？，新英格蘭醫學雜志(N.Engl.J.Med)，3251168(1991)。δ-和κ-受體定位于交感神經的傳出末端，能抑制前列腺素的釋放從而抑制疼痛和炎癥。Taiwo，Y.O.等，κ和δ阿片制劑阻斷交感神經依賴的痛覺過敏，神經科學雜志(J.Neurosci)11卷，p.928(1991)。阿片樣物質受體亞型是G-蛋白偶聯受體超家族的成員。因此，所有阿片樣物質受體激動劑通過其有關聯的G-蛋白偶聯受體相互作用并觸發信號。適宜的μ-阿片樣物質受體激動劑的例子是芬太尼和Try-D-Ala-Gly-[N-MePhe]-NH(CH2)2OH(DAMGO)。適宜的δ-阿片樣物質受體激動劑的例子是[D-Pen2，D-Pen5]腦啡肽(“DPDPE”)。適宜的κ-阿片樣物質受體激動劑的例子是(反式)-3，4-二氯-N-甲基-N-[2-(1-吡咯烷基)環己基]-苯乙酰胺(“U 50，488”)。這些試劑每種的適宜濃度列于表28。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表28
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
13.嘌呤受體拮抗劑
            
胞外ATP通過與P2嘌呤受體的相互作用，起信號分子的作用。嘌呤受體的一個主要類型是P2X嘌呤受體，其是可滲透Na+，K+和Ca2+的內在離子通道的配體控制離子通道。在感覺神經元中發揮作用的P2X受體對原始傳入神經送遞和痛覺感受是重要的。已知ATP能使感覺神經元去極化，并在傷害感受器激活方面起作用，因為從受損細胞所釋放的ATP刺激P2X受體，導致受感傷害的神經纖維末端去極化。P2X受體具有高度嚴格的分布(Chen，C.C.，等.，自然(Nature)V.377，pp.428-431(1995)，因為這種受體在進入脊髓的感覺的C-纖維神經中被選擇性表達，已知這些C-纖維中許多均能攜帶疼痛刺激物的受體。因此，P2X3受體亞型的這種高度嚴格的定位表達使這些受體亞型成為鎮痛藥作用的極好的靶(見圖3和圖7)。
            
使鈣活動的嘌呤受體，其屬于G-蛋白受體超家族，已經在哺乳動物關節軟骨細胞的表面上被描述過了。人們發現，ATP在分化的原代軟骨細胞中，刺激給試劑量依賴性的，鈣離子濃度的瞬時升高。異源脫敏試驗證實，用ATP初步刺激后，軟骨細胞沒有應答UTP。這些結果與軟骨細胞的細胞表面P2Y受體的存在一致。在傳代軟骨細胞中，嘌呤誘導的鈣活動化顯示了關于激動劑敏感性的相同藥理學分布。ATP和UTP沒有改變軟骨基質的合成，這種合成是通過[35S]硫酸鹽通過軟骨外植體或初級軟骨細胞摻入到糖胺聚糖中的結合速率而測量的。通過從軟骨外植體釋放糖胺聚糖而測量的基質退化也沒有被任一激動劑所改變。功能性P2Y嘌呤受體在初級關節軟骨細胞表面的存在可使胞外嘌呤，如ATP的濃度激活軟骨細胞的代謝。
            
其它研究已經確定了人關節軟骨細胞P1和P2嘌呤受體基因的表達和描述了配體介導前列腺素E2的分布。P2Y2受體激動劑ATP和UTP刺激PGE2的少量釋放，在用人IL-1α預處理之后，PGE2水平協同性升高。在用IL-1預處理之后，應答ATP和UTP共同加入時的PGE2釋放可被佛波醇肉豆蔻乙酯模擬。P2Y2受體的功能是增加IL-1介導的PGE2釋放，由此促進關節內的疼痛和炎癥。因此，P2Y拮抗劑在本發明中的用途應可防止通過滑膜細胞和軟骨細胞產生的炎性介質的激活。
            
適合于本發明使用的P2X/ATP嘌呤受體拮抗劑包括蘇拉明和磷酸吡哆醛(pyridoxylphosphate)-6-偶氮苯-2，4-二磺酸(“PPADS”)。這些試劑的適宜濃度列于表29。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表29
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
14.Ca2+通道拮抗劑
            
鈣通道拮抗劑是一組可干擾鈣離子跨膜通量的不同藥物，而鈣離子是激活介導神經炎癥的細胞反應所需要的。鈣進入滑膜細胞和軟骨細胞是在這些細胞中介導活化反應的關鍵步驟。而且，緩激肽，組胺，5-羥色胺(SHT2)和神經激肽受體(NK1和NK2)在介導神經炎癥，信號轉導途徑中的作用包括胞內鈣的增加，從而導致漿膜上鈣通道的活化。在許多組織中，鈣通道拮抗劑如硝苯吡啶能減少由各種刺激物引起的花生四烯酸，前列腺素和白細胞三烯的釋放。Moncada，S.，Flower，R.和Vane，J.見Goodman和Gilman氏治療的藥理學基礎(第七版)MacMillan Publ.inc.pp.660-5(1995)。
            
最后，鈣通道拮抗劑和任一速激肽，組胺或緩激肽拮抗劑在抑制神經炎癥方面顯示協同的作用。神經激肽受體在介導神經炎癥方面的作用已得到確認。神經激肽1(NK1)和神經激肽2(NK2)受體(G蛋白偶聯超家族的成員)信號轉導途徑包括胞內鈣增高，從而導致漿膜上鈣通道的活化。同樣，緩激肽2(BK2)受體的活化與滑膜細胞和軟骨細胞中胞內鈣水平的增加有關。因此，鈣通道拮抗劑干擾涉及部分通過L型通道進入的胞內鈣水平升高的共同機制。這是鈣通道拮抗劑和對神經激肽，組胺，P2Y和緩激肽2受體拮抗劑間協同性相互作用的基礎。
            
適于本發明使用的鈣通道拮抗劑包括尼索地平，硝苯地平，尼莫地平，拉西地平，伊拉地平，氨氯地平。這些試劑的適宜濃度列于表30。相似地，根據本發明的全身性組合物將適于包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。對于導向的持續釋放送遞系統，在組合物中包含足夠劑量或載荷的試劑，以便在預定的持續釋放期間，在關節或作用位點得到所列治療范圍內的局部濃度。
            
表30
            
疼痛和/或炎癥抑制劑的治療和優選濃度
            
VI.實施例
            
下面是一些適于在某些手術程序中灌洗的本發明各方面一些制劑(實施例1-3)，以及用于全身送遞，如通過肌內或皮下注射(實施例4-11)的制劑，隨后是使用本發明的試劑的三項臨床研究的總結。
            
實施例1
            
關節內窺鏡檢查用灌洗液
            
下列組合物適用于關節內窺鏡檢查過程中解剖學關節的灌洗。與下面實施例所描述的其它灌洗液一樣，各種藥物均溶在含生理電解液，如生理鹽水或乳酸鹽林格氏液的載體液中。
            
實施例2
            
用于關節內窺鏡檢查的可選的灌洗液
            
下列組合物是在關節內窺鏡檢查過程期間，適用于解剖學關節灌洗的選擇性制劑。
            
實施例3
            
可選的灌洗液
            
生理載體液的溶液中的下列藥物及其濃度范圍適用于本發明。
            
實施例4
            
注射用軟骨保護溶液
            
下列組合物適于注射到解剖學的關節中。各藥物是在含生理電解液，如生理鹽水或乳酸鹽林格氏溶液的載體液中溶解的。適于將20ml給試劑量的溶液給予患者。
            
實施例5
            
用于全身性送遞的軟骨保護組合物
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過肌內或皮下施用而全身性送遞。各藥物以將在目的作用部位得到以下濃度的濃度包含在組合物中，并且溶解于生理載體液或送遞系統中。
            
實施例6
            
用于全身性送遞的可選的軟骨保護組合物
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過肌內或皮下施用而全身性送遞。各藥物以將在目的作用部位得到以下濃度的濃度包含在組合物中，并且溶解于生理載體液或送遞系統中。
            
實施例7
            
用于全身性送遞的可選的軟骨保護組合物
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過肌內或皮下施用而全身性送遞。各藥物以將在目的作用部位得到以下濃度的濃度包含在組合物中，并且溶解于生理載體液或送遞系統中。
            
實施例8
            
用于全身性送遞的可選的軟骨保護組合物
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過肌內或皮下施用而全身性送遞。各藥物以將在目的作用部位得到以下濃度的濃度包含在組合物中，并且溶解于生理載體液或送遞系統中。
            
實施例9
            
用于全身性送遞的可選的軟骨保護組合物
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過肌內或皮下施用而全身性送遞。各藥物以將在目的作用部位得到以下濃度的濃度包含在組合物中，并且溶解于生理載體液或送遞系統中。
            
實施例10
            
用于全身性送遞的可選的軟骨保護組合物
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過肌內或皮下施用而全身性送遞。各藥物以將在目的作用部位得到以下濃度的濃度包含在組合物中，并且溶解于生理載體液或送遞系統中。
            
實施例11
            
用于全身性送遞的可選的軟骨保護組合物
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過肌內或皮下施用而全身性送遞。各藥物以指出的劑量施用，并且溶解于生理載體液或送遞系統中。
            
實施例12
            
用于全身性送遞的可選的軟骨保護組合物
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過肌內或皮下施用而全身性送遞。各藥物以指出的劑量施用，并且溶解于生理載體液或送遞系統中。
            
實施例13
            
導向的軟骨保護藥物送遞系統
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過靜脈內、肌內、皮下或吸入施用而全身性送遞。藥物包封在DL-丙交酯/乙交酯共聚物(PLGA)納米球內，在該納米球上偶聯抗人II型膠原單克隆抗體。該抗體導向于關節軟骨中人II型膠原上的表位。在組合物中包含每種各藥物，其濃度足以在納米球降解時以及在持續釋放期間中試劑釋放時在目的作用位點得到以下濃度。
            
實施例14
            
導向的軟骨保護藥物送遞系統
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過靜脈內、肌內、皮下或吸入施用而全身性送遞。藥物包封在生物可降解的PLA/PLGA共聚物納米球內，在該納米球上偶聯抗人聚集蛋白聚糖單克隆抗體。該抗體導向于關節軟骨中人聚集蛋白聚糖上的新表位。在組合物中包含每種各藥物，其濃度足以在納米球降解時以及在持續釋放期間中試劑釋放時在目的作用位點得到以下濃度。
            
實施例15
            
導向的軟骨保護藥物送遞系統
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過靜脈內、肌內、皮下或吸入施用而全身性送遞。藥物包封在脫乙酰殼多糖/明膠納米球內，在該納米球上偶聯抗人II型膠原單克隆抗體。該抗體導向于關節軟骨中人II型膠原上的新表位。在組合物中包含每種各藥物，其濃度足以在納米球降解時以及在持續釋放期間中試劑釋放時在目的作用位點得到以下濃度。
            
實施例16
            
導向的軟骨保護藥物送遞系統
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過靜脈內、肌內、皮下或吸入施用而全身性送遞。藥物包封在白蛋白納米球內，在該納米球上偶聯抗人II型膠原單克隆抗體。該抗體導向于關節軟骨中人II型膠原上的新表位。在組合物中包含每種各藥物，其濃度足以在納米球降解時以及在持續釋放期間中試劑釋放時在目的作用位點得到以下濃度。
            
實施例17
            
導向的軟骨保護藥物送遞系統
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過靜脈內、肌內、皮下或吸入施用而全身性送遞。藥物包封在聚(丙交酯-共-乙交酯)/聚(乙二醇)共聚物納米球內，在該納米球上偶聯抗人II型膠原單克隆抗體。該抗體導向于關節軟骨中人II型膠原上的新表位。在組合物中包含每種各藥物，其濃度足以在納米球降解時以及在持續釋放期間中試劑釋放時在目的作用位點得到以下濃度。
            
實施例18
            
導向的軟骨保護藥物送遞系統
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過靜脈內、肌內、皮下或吸入施用而全身性送遞。BMP受體激動劑BMP-7包封在聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)納米球內，在該納米球上偶聯抗人II型膠原單克隆抗體。IGF受體激動劑IGF-1分開包封在軟骨素-6-硫酸/明膠納米球內，在該納米球上偶聯抗人聚集蛋白聚糖單克隆抗體。用于導向每種類型的納米球的抗體結合于關節軟骨中人II型膠原上的新表位和聚集蛋白聚糖上的新表位。在組合物中包含每種各藥物，其濃度足以在納米球降解時以及在持續釋放期間中試劑釋放時在目的作用位點得到以下濃度。
            
實施例19
            
導向的軟骨保護藥物送遞系統
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過靜脈內、肌內、皮下或吸入施用而全身性送遞。藥物包封在白蛋白納米球內，在該納米球上偶聯結合于II型膠原單克隆抗體的抗人F(ab’)2片段。該F(ab’)2片段導向于人II型膠原上的新表位。在組合物中包含每種各藥物，其濃度足以在納米球降解時以及在持續釋放期間中試劑釋放時在目的作用位點得到以下濃度。
            
實施例20
            
導向的軟骨保護藥物送遞系統
            
下列軟骨保護組合物適用于例如通過靜脈內、肌內、皮下或吸入施用而全身性送遞。藥物包封在白蛋白納米球內，在該納米球上偶聯結合于II型膠原單克隆抗體的免疫球蛋白分子的抗人單鏈最小結合域(scFv)。該scFv抗體導向于人II型膠原上的新表位。在組合物中包含每種各藥物，其濃度足以在納米球降解時以及在持續釋放期間中試劑釋放時在目的作用位點得到以下濃度。
            
研究1
            
暴露于IL-1和GPCR激動劑時快速PGE2爆發產生的協同刺激
            
成纖維樣滑膜細胞具有炎性細胞的特性，且似乎是關節炎癥和軟骨退化的重要調節劑。將滑膜細胞培養模型系統用于描述IL-1和非細胞因子炎癥介質間協同相互作用的特征，其對于介導關節組織的損壞，包括由于關節內窺鏡手術過程期間的組織損傷而出現的損壞非常重要。進行試驗以研究G-蛋白偶聯受體(GPCR)激動劑(組胺，緩激肽，異丙腎上腺素)對所培養的人滑膜成纖維細胞中的細胞因子和前列腺素產物的調節，并描述此系統中酮洛芬的活性。描述了應答白介素-1(IL-1)刺激的前列腺素E2(PGE2)，白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的誘導動力學。研究了在IL-1激發后，GPCR配體加強細胞因子產生的能力。
            
在研究1-3中，除非另有說明，使用下列試驗方法和材料。
            
1.細胞培養  滑膜組織是從經歷過Clinical Research Center，MacNeal Hospital關節置換手術的骨關節炎患者獲得的，并被送到實驗室的Dulbecco′s改良的Eagle′s培養基(DMEM)中，該培養基含青霉素(100單位/ml)，鏈霉素(100，ug/ml)，和兩性霉素B(0.25ug/ml)。用剪刀解剖并切碎滑膜，并將其作為外植體接種到培養基中，該培養基是由含L-谷氨酸鹽(2mM)，加熱滅活的胎牛血清(10％v/v)，加抗生素的DMEM組成的。37℃時，在5％CO2的潮濕空氣中保藏該培養物。2-3周內，粘附的滑膜細胞從外植體里面長出，并經過受胰蛋白酶作用。每周給種子培養物補料兩次，并匯合。試驗是在來源于通道3-8的細胞上進行的。將試驗培養物接種到35mm的皿上，其中2ml培養基中的密度為7.5×103細胞/cm2。培養物靠近試驗匯合處生長，并含有2.3±0.3×105個細胞(平均值±S.E.M.，n＝3)，及104±13μg的蛋白(n＝10)。該生長培養基每周換兩次。
            
2.試驗處理  在進行試驗處理開始前，將培養基換成試驗性生長培養基，其是由含2％熱-滅活胎兒小牛血清的DMEM，加上述L-谷氨酸鹽和抗生素組成的，以使細胞靜止。第二天，以12-24小時的間隔將特殊濃度的IL-1或其他配體加入到條件生長培養基中來激發培養物。在某些試驗中，為了進行分析，在用IL-1激發之后，收集條件生長培養基。急性試驗處理是在此激發間隔后進行的。從培養箱中除去培養物，用2ml Locke′s生理緩沖液(LB組合物mMNaCl，154；KCl，2.6；KH2PO4，2.15；K2HPO4，0.85；MgCl2，5；CaCl2，2；D-葡萄糖，10；HEPES，10；pH 7.4，BSA，0.1％w/v)的等分試樣清洗，然后在37℃的水浴中，用附加的含特殊配體的LB等分試樣平衡10分鐘。通過吸引術除去此溶液，并在37℃時，用含指定配體的新鮮緩沖液等分試樣置換一定的時間間隔。典型地，在10分鐘的培養前間隔過程中，加入藥物抑制劑，且激動劑加特殊抑制劑均存在于3分鐘的侵襲間隔過程中。
            
3.前列腺素E2的測量.在指定處理方案進行之后，收集培養物上清液的等分試樣(1ml)，并在液氮中迅速冷凍。在-80℃存儲樣品直到進行處理。使用與前列腺素E2和E1具有等價反應活性的抗體，通過制造者(Sigma Chemical Co.)指定的競爭性結合放射免疫測定法分析培養物上清液的等分試樣。為了量化，使用固定濃度的[3H]前列腺素E2和濃度逐漸增加的，可靠的競爭前列腺素E2繪制各測定法的標準曲線。
            
4.IL-6的測量.細胞因子IL-6的產物也是在上清液培養基的等分試樣中測量的，該培養基在-80℃冷凍保存。IL-6是通過夾層ELISA，用上述制造者(Pharmingen)描述的堿性磷酸酶檢測測量的，并使用各純的重組人細胞因子制備的標準曲線定量。試驗測定是在復制的培養物上進行的。
            
  研究2
            
[3H]胸腺嘧啶核苷摻入和MTT的試驗方法
            
滑膜細胞系通常是相對于擴增應答IL-1的能力而評估的，其是以[3H]胸腺嘧啶核苷摻入而測量的(Kimball & Fisher，1988)。與保持在2％血清中的靜止培養物相比，在此試劑中，IL-1最有效的濃度可刺激10-20倍[3H]胸腺嘧啶核苷的摻入(沒有標出數據)。
            
1.數據分析.免疫測定法通常是在各培養物的復制等分試樣中進行的。試驗測定法是在兩倍或三倍的培養物上進行的。各試驗在至少兩種細胞系中重復進行。使用Graph-PAD Prism軟件(San Diego，CA)進行非線性回歸曲線和統計分析。
            
2.材料.細胞培養細胞培養培養基是從Sigma或Gibco/BRL得到的。胎兒小牛血清來源于Atlanta Biologicals Inc.(Norcross，GA)。藥物重組人白介素-1是從Genzyme(Cambridge，MA)得到的。酮洛芬是由Omeros Medical Systems，Inc.(Seattle，WA)提供的。阿米替林，白喉素，5-羥色胺，異丙腎上腺素，緩激肽，組胺，和前列腺素E2均來源于Sigma。放射性化學物質[3H]前列腺素E2，是從American Radiolabeled Chemicals，Inc.(St.Louis，MO)得到的。所有其它的試劑是以最高純度從標準商業供應商處購買的。
            
GPCR激動劑，組胺和緩激肽對人滑膜細胞中PGE2產生的作用是在刺激或沒刺激IL-1之前測量的，以評估激動劑之間的功能性相互作用，該激動劑通過不同種類的受體介導共同的藥物作用。將所培養的人滑膜成纖維細胞整夜暴露于IL-10(10U/ml)，導致延遲的(4小時)和持續的PGE2產物的大量升高，其可以通過放射免疫法測定培養物上清液中PGE2的增加而測量。在延長的IL-1處理過程(16-24小時)中，PGE2產物的逐漸增加是由于cPLA2和COX-2的協調的，被上調的表達(Crofford，1984，Hulkower等，1984)。已經通過整夜暴露于IL-1而被激發的培養物應答隨后最大有效濃度的組胺(100μM)或緩激肽(1，μM)的侵襲，其具有附加的快速(分鐘)和粗壯的PGE2的產生。應答組胺或緩激肽刺激的PGE2產生時間過程的代表性數據在圖7中列出。在這些條件下，與沒有接收GPCR激動劑加入量的IL-1激發的細胞相比，組胺激發5-10倍PGE2的增長。緩激肽激發10-15倍的增長。在簡單的2分鐘激動劑侵襲方法過程中產生的PGE2產物的絕對量超過在整個18小時IL-1激發間隔過程中累積產生的量。在圖7中可很明顯地看出，在PGE2制備中，最大多數組胺激發的裂解出現在最初的2分鐘內，因為最小的附加積累是在60分鐘后觀察到的。緩激肽-刺激的PGE2應答在超過相同時間的周期內繼續增加(2-倍)。在沒有IL-1激發的條件下，天然的滑膜細胞顯示，沒有可檢測的PGE2產物應答單獨用GPCR激動劑的刺激。在IL-1激發的條件下，組胺和緩激肽協同地加強PGE2的釋放。
            
使用來源于骨關節炎患者的培養滑膜成纖維細胞，我們發現促炎細胞因子，IL-1和生理相關的G-蛋白偶聯受體間的時間依賴性協同相互作用對PGE2產生的作用，并評估了靶治療劑的作用。GPCR激動劑通過內源滑膜受體起作用，該受體被偶聯以增加胞內的鈣和肌醇磷酸鹽，且PKC信號傳遞途徑迅速突然地擴大細胞中PGE2的產物，該細胞預先用IL-1激發。COX抑制劑有效地減弱激動劑引起的快速爆發和PGE2的長期累積。因此，用于胞內信號轉導的不同GPCR和IL-1途徑協同作用，產生快速或緩慢的，PGE2應答的長期調節。
            
產生快速的PGE2爆發的，滑膜細胞中IL-1和鈣-調節GPCRs間的協同作用部分是通過花生四烯酸釋放的快速增長，cPLA2在許多細胞類型中的活化測量值來說明的。除了誘導COX-2的表達外，，IL-1還可增加cPLA2的表達(Hulkower等，1994)。這兩個蛋白共同提供COX-2的游離花生四烯酸底物。IL-1誘導的重要的類二十烷酸代謝酶的上調，GPCR配體激活花生四烯酸鹽釋放的能力結合，因此預測其可通過前列腺素的合成而增加整個底物的流出。cPLA2是唯一已知的PLA2，其具有指示受體調節的功能性性能，且可能涉及二十烷酸的產生和胞內信號。因為cPLA2是為了全部的活，增加鈣濃度而被激活的，且緩激肽B2和組胺H1受體的活化與胞內鈣的活動有關，這可能是調節PGE2產物中快速激動劑刺激的爆發的重要因素。最終，非常快速和瞬間的胞質鈣的增加是由B2或H1受體的激活而激發的，其與cPLA2激活，花生四烯酸釋放和觀察到的PGE2爆發的動力學相似。
            
   研究3
            
  通過環加氧酶抑制劑抑制PGE2裂解的形成
            
酮洛芬，一種環加氧酶抑制劑減弱PGE2形成的作用是通過在延長暴露期間，與IL-1共同培養而測定的；如圖8所示，在隨后的GPCR激動劑侵襲間隔之前，進行簡單的前培養。在用IL-1激發過夜過程中，特殊濃度酮洛芬的加入消滅了PGE2的形成，具有通過非線性回歸分析確定的IC50＝4.5±0.8nM(平均值±SEM，n＝4滑膜細胞系)。相似的測定(未標出數據)是用環加氧酶抑制劑依托度酸(IC50＝15.2±4.6nM，n＝4)，ketorolac(2.2±0.4nM，n＝4)，和吲哚美辛(3.2±1.5nM，n＝2)進行的。
            
圖8還顯示了激動劑-激發PGE2裂解的酮洛芬濃度依賴性抑制，其中PGE2裂解應答IL-1(10U/ml)過夜激發的滑膜細胞中100μM組胺(IC50＝3.4±0.2nM，n＝3)or 1μM綏激肽(IC50＝9.5±2.0nM，n＝3)的侵襲。將這些值與在PGE2過夜IL-1誘導期間觀察的酮洛芬抑制值比較。這個結果證明通過COX抑制劑的抑制開始出現在GPCR激動劑加入前的10分鐘預處理間隔內，與COX活性的直接可逆抑制相一致，而不是由于與前列腺素調節酶表達水平變化有關的機制。此立即的抑制作用還為在關節內窺鏡外科手術期間，以灌洗液形式局部送遞到關節內時，此藥物的立即有效性提供了基礎。
            
 研究4
            
由IL-1和GPCR激動劑產生的IL-6的誘導和酮洛芬的抑制
            
描述了應答IL-1刺激的白介素-6的誘導動力學。將滑膜細胞培養物暴露，用IL-1加組胺處理以通過肌醇三磷酸鹽(InsP3)/蛋白激酶C途徑激活信號，或加異丙腎上腺素激活胞內cAMP的增加。PGE2，IL-6，和IL-8的產生是在處理1，2，4，6，和24小時后，在培養物上清液中測量的。在此試驗中，各個處理的間隔是在分離的培養物中進行的。在上述處理情況中，IL-6的產物是在24小時暴露后，由IL-1強烈增加的，但在最初的6小時間隔內沒有檢測到IL-6。應答IL-1的IL-6產物不是通過加入組胺而被進一步擴增的，且組胺不能刺激IL-6的產生。IL-1還可使IL-8顯著增加(2000pg/ml)，其是在處理的第6個小時首次測量的。IL-8產物在暴露于IL-1的第24小時，持續顯著地增加。
            
檢測酮洛芬對IL-1產生的細胞因子的誘導及GPCR激動劑的作用。該方案還可測試IL-1對IL-6穩定狀態誘導的濃度依賴性作用。將滑膜細胞培養物暴露于指定濃度的IL-1和GPCR激動劑中。收集培養物上清液，每8小時用含相同激動劑添加物的新鮮培養基等分試樣替換。測定上清液中的PGE2，IL-6，和IL-8。
            
IL-6產物的數據在圖9中列出，其在有指定濃度的IL-1和附加配體存在的情況下，第16小時(相當于8-16小時的處理間隔)產出IL-6。與單獨的IL-1相比，組胺或異丙腎上腺素的加入不能提高IL-6的產生。在1.0pg/ml IL-1時，酮洛芬引起局部(＜50％)IL-1激發的IL-6制備的抑制。此外，酮洛芬可抑制在組胺或異丙腎上腺素/IL-1共同刺激的樣品中IL-6的產生。
            
將滑膜細胞培養模型系統用于描述IL-1和非細胞因子炎性介質間的協同作用的特征，其對于調節關節組織的損傷非常重要，所述損傷包括在關節內窺鏡手術過程中出現的組織損傷。結果概括如下(1)IL-1導致所培養滑膜細胞中PGE2，IL-6，和IL-8的大大增加，而靜止培養物不能產生可檢測量的這些介質，(2)PGE2的誘導迅速出現，并導致在第4小時PGE2釋放到培養物上清液中，IL-8在第6小時釋放，IL-6以更長的間隔釋放，和(3)在24小時的IL-1暴露后，所有這三個介質在培養物上清液中均保持升高。
            
與它們對PGE2制備的作用相比，GPCR激動劑不能提高IL-1誘導的IL-8或IL-6，且不能在用IL-1激發后，增加IL-8和IL-6的釋放。IL-1誘導的IL-8和IL-6似乎可通過伴隨的PGE2的誘導而被加強，因為酮洛芬減少了應答IL-1的這些細胞因子的產生。此結果表明當在手術過程中將酮洛芬送遞到關節時，其可提供治療性的軟骨保護作用。
            
這些結果證實，特異性G-偶聯受體信號傳遞途徑和通過IL-1促炎刺激產生的滑膜細胞激活間的相互作用。期望相似的機制在軟骨細胞中是可操作的。這些相互作用提供了一種整合和調節滑膜細胞和軟骨細胞促炎應答的方法，其取決于從關節內的其它內分泌物或神經遞質受體系統的輸入。這些發現強調了治療干預的潛在臨床益處和原理，這種治療干預直指G-蛋白偶聯受體的抑制，該受體可通過鈣活動化，磷酸肌醇水解和PKC活化而介導信號，且與關節內窺鏡手術中PGE2產物的增加有關。這些作用于滑膜細胞和軟骨細胞上的受體包括組胺H1，緩激肽，物質P，5HT2和多能P2Y受體。
            
盡管已經說明和描述了本發明的優選實施方案，應該理解，可以對所公開的方案和方法進行多種改變而不離開本發明的精神和范圍。例如，可以發現能夠增強或替代所公開的試劑，此處的公開內容所包括的導向抗體和送遞載體的其它軟骨保護劑、導向抗體和送遞載體。因此，授權的專利的范圍僅僅受到所附權利要求的限制。
            
權利要求
            
1.一種用于保護軟骨的導向的藥物送遞系統，包含多種包含在送遞載體中的軟骨保護劑，所述送遞載體偶聯于位于關節內的抗原決定簇的特異性抗體或抗體片段，所述多種軟骨保護劑包括至少一種合成代謝軟骨保護劑和至少一種軟骨分解代謝抑制劑，每一種都以治療有效量存在，以便所述多種軟骨保護劑既抑制軟骨分解代謝，又促進軟骨合成代謝。
            
2.一種用于保護軟骨的導向的藥物送遞系統，包含多種軟骨保護劑，其中至少一種軟骨保護劑包含在導向于關節的送遞載體中，所述多種軟骨保護劑包括至少一種合成代謝軟骨保護劑和至少一種軟骨分解代謝抑制劑，所述多種軟骨保護劑中的每一種都以治療有效量存在，以便所述多種軟骨保護劑既抑制軟骨分解代謝，又促進軟骨合成代謝。
            
3.權利要求2的導向的藥物送遞系統，其中所述導向的送遞載體偶聯于位于關節內的抗原決定簇的特異性抗體或抗體片段。
            
4.權利要求3的導向的藥物送遞系統，其中所導向的抗原決定簇在關節軟骨上或關節軟骨內。
            
5.權利要求4的導向的藥物送遞系統，其中所導向的抗原決定簇在關節軟骨的II型膠原上。
            
6.權利要求3的導向的藥物送遞系統，其中所導向的抗原決定簇在軟骨膠原上或軟骨蛋白聚糖上。
            
7.權利要求3的導向的藥物送遞系統，其中所導向的抗原決定簇在選自下組的細胞、分子或結構上或選自下組的細胞、分子或結構內膠原，包括II型膠原和次要的V、VI、IX、X和XI型膠原；蛋白聚糖，包括大的聚集性蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、纖調蛋白和lumican；軟骨寡聚基質蛋白，糖蛋白-39；蛋白聚糖硫酸軟骨素和糖胺聚糖；巨噬細胞滑膜細胞和成纖維細胞滑膜細胞；和軟骨細胞。
            
8.權利要求3的導向的藥物送遞系統，其中所導向的抗原決定簇在滑膜上或滑膜內。
            
9.權利要求3的導向的藥物送遞系統，其中所導向的抗原決定簇是與關節軟骨退化相關的表位或新表位。
            
10.權利要求9的導向的藥物送遞系統，其中所導向的表位或新表位免疫定位于診斷患有骨關節炎、類風濕關節炎或其它退化性關節疾病的患者的關節軟骨淺層。
            
11.權利要求9的導向的藥物送遞系統，其中所導向的抗原決定簇是關節軟骨的II型膠原或II型膠原片段上的新表位。
            
12.權利要求11的導向的藥物送遞系統，其中所導向的新表位免疫定位于通過選自下組的酶的單獨或組合作用生成的切割位點基質金屬蛋白酶(MMP)-1，MMP-3，MMP-8和MMP-13，以及MMP家族的其它成員。
            
13.權利要求9的導向的藥物送遞系統，其中所導向的表位或新表位在關節軟骨的聚集蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖或核心蛋白聚糖上。
            
14.權利要求9的導向的藥物送遞系統，其中所導向的表位或新表位在關節軟骨的聚集蛋白聚糖或聚集蛋白聚糖片段上。
            
15.權利要求14的導向的藥物送遞系統，其中所導向的新表位免疫定位于通過屬于具有血小板反應蛋白基元的脫整聯蛋白和金屬蛋白酶(ADAMTS)家族和/或MMP家族的酶的作用生成的切割位點。
            
16.權利要求15的導向的藥物送遞系統，其中所導向的新表位免疫定位于通過ADAMTS-4和/或ADAMTS-5/11酶的單獨或組合作用生成的切割位點。
            
17.權利要求3的導向的藥物送遞系統，其中導向性抗體或抗體片段是人源化的、嵌合的或人單克隆抗體。
            
18.權利要求2的導向的藥物送遞系統，其中合成代謝軟骨保護劑包含在導向的送遞載體內。
            
19.權利要求2的導向的藥物送遞系統，其中合成代謝軟骨保護劑選自促進軟骨合成代謝的白介素(IL)激動劑；促進軟骨合成代謝的轉化生長因子-β超家族的成員，包括TGF-β激動劑和骨形態發生蛋白(BMP)激動劑；促進軟骨合成代謝的胰島素樣生長因子和促進軟骨合成代謝的成纖維細胞生長因子。
            
20.權利要求2的導向的藥物送遞系統，其中合成代謝軟骨保護劑選自IL-4，IL-10，IL-13，TGFβ1，TGFβ2，TGFβ3，BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，IGF-1，bFGF和保持天然存在的試劑的生物學特征的片段、缺失、添加、氨基酸取代、突變和修飾。
            
21.權利要求2的導向的藥物送遞系統，其中合成代謝軟骨保護劑選自促進軟骨合成代謝的轉化生長因子-β超家族的成員，包括TGF-β激動劑和骨形態發生蛋白(BMP)激動劑；促進軟骨合成代謝的胰島素樣生長因子和促進軟骨合成代謝的成纖維細胞生長因子。
            
22.權利要求2的導向的藥物送遞系統，其中軟骨分解代謝的抑制劑包含在導向的送遞載體內。
            
23.權利要求2的導向的藥物送遞系統，其中軟骨分解代謝抑制劑選自抑制軟骨分解代謝的IL-1受體拮抗劑，抑制軟骨分解代謝的TNF-α受體拮抗劑，抑制軟骨分解代謝的環加氧酶-2特異性抑制劑，抑制軟骨分解代謝的MAP激酶抑制劑，抑制軟骨分解代謝的一氧化氮合酶抑制劑，和抑制軟骨分解代謝的核因子κB抑制劑。
            
24.權利要求2的導向的藥物送遞系統，其中軟骨分解代謝抑制劑選自抑制軟骨分解代謝的基質金屬蛋白酶；抑制軟骨分解代謝的細胞粘附分子，包括整聯蛋白激動劑和整聯蛋白拮抗劑；抑制軟骨分解代謝的細胞內信號傳遞抑制劑，包括蛋白激酶C抑制劑和蛋白酪氨酸激酶抑制劑；和抑制軟骨分解代謝的SH2結構域的抑制劑。
            
25.權利要求2的導向的藥物送遞系統，其中軟骨分解代謝抑制劑包括選自抑制軟骨分解代謝的IL-1受體拮抗劑和抑制軟骨分解代謝的TNF-α受體拮抗劑的試劑。
            
26.權利要求2的導向的藥物送遞系統，其中合成代謝軟骨保護劑和軟骨分解代謝抑制劑都包括蛋白。
            
27.權利要求2的導向的藥物送遞系統，其中合成代謝軟骨保護劑和軟骨分解代謝抑制劑都包含在導向的送遞載體內。
            
28.權利要求2的導向的藥物送遞系統，包含多個導向的送遞載體，其中合成代謝軟骨保護劑和軟骨分解代謝抑制劑分開包含在多個導向的送遞載體中的第一和第二個內。
            
29.權利要求28的導向的藥物送遞系統，其中選擇第一和第二個導向的送遞載體，以便得到對于所包含的合成代謝軟骨保護劑和所包含的軟骨分解代謝抑制劑來說在時間上不同的釋放動力學。
            
30.權利要求2的導向的藥物送遞系統，其中導向的送遞載體包括導向的免疫顆粒。
            
31.權利要求30的導向的送遞系統，其中導向的免疫顆粒包括納米顆粒。
            
32.權利要求31的導向的送遞系統，其中納米顆粒的直徑為5納米至750納米。
            
33.權利要求31的導向的送遞系統，其中納米顆粒的直徑為10納米至500納米。
            
34.權利要求31的導向的送遞系統，其中納米顆粒的直徑為20納米至200納米。
            
35.權利要求31的導向的送遞系統，其中納米顆粒由選自下組的聚合物形成透明質素、脫乙酰殼多糖、膠原、明膠、藻酸鹽、聚乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)和PLGA。
            
36.權利要求31的導向的送遞系統，其中納米顆粒在1日-4周期間提供軟骨保護劑的持續釋放。
            
37.權利要求2的導向的送遞系統，進一步包含適用于靜脈內、肌內、皮下或吸入施用的載體。
            
38.權利要求2的導向的送遞系統，進一步包含一種或多種其它的治療劑。
            
39.權利要求2的導向的送遞系統，進一步包含一種或多種疼痛或炎癥抑制劑。
            
40.權利要求39的導向的送遞系統，其中疼痛或炎癥抑制劑選自5-羥色胺受體拮抗劑，5-羥色胺受體激動劑，組胺受體拮抗劑，緩激肽受體拮抗劑，激肽釋放酶抑制劑，速激肽受體拮抗劑，降鈣素基因相關肽(CGRP)受體拮抗劑，白介素受體拮抗劑，在花生四烯酸代謝物的合成途徑中有活性的酶的抑制劑，環加氧酶抑制劑，，脂加氧酶抑制劑，前列腺素類受體拮抗劑，白三烯受體拮抗劑，阿片樣物質受體激動劑，嘌呤受體拮抗劑，三磷酸腺苷(ATP)敏感性鉀通道開放劑和鈣通道拮抗劑。
            
41.一種用于保護軟骨的導向的藥物送遞系統，包含多種軟骨保護劑，其中至少一種軟骨保護劑包含在導向于透明軟骨的分子、細胞或結構的送遞載體中，所述多種軟骨保護劑包括至少一種合成代謝軟骨保護劑和至少一種軟骨分解代謝抑制劑，所述多種軟骨保護劑中的每一種都以治療有效量存在，以便所述多種軟骨保護劑既抑制軟骨分解代謝，又促進軟骨合成代謝。
            
42.一種用于保護軟骨的導向的藥物送遞系統，包含治療有效量的至少一種軟骨保護劑，所述軟骨保護劑是合成代謝軟骨保護劑或軟骨分解代謝抑制劑，它包含在導向的免疫顆粒內，所述顆粒偶聯于位于關節內的抗原決定簇的特異性抗體或抗體片段。
            
43.一種用于保護軟骨的導向的藥物送遞系統，包含治療有效量的合成代謝軟骨保護劑，所述合成代謝軟骨保護劑包含在導向于關節的送遞載體內。
            
44.一種用于保護軟骨的導向的藥物送遞系統，包含治療有效量的合成代謝軟骨保護劑，所述合成代謝軟骨保護劑包含在導向于透明軟骨的分子、細胞或結構的送遞載體內。
            
45.一種用于保護患者的軟骨的方法，包括
            
向有需要的患者送遞導向的藥物送遞系統，該藥物送遞系統包含多種包含在送遞載體中的軟骨保護劑，所述送遞載體偶聯于位于關節內的抗原決定簇的特異性抗體或抗體片段，所述多種軟骨保護劑包括至少一種合成代謝軟骨保護劑和至少一種軟骨分解代謝抑制劑，每一種都以治療有效量存在，以便所述多種軟骨保護劑既抑制軟骨分解代謝，又促進軟骨合成代謝。
            
46.一種用于保護患者的軟骨的方法，包括
            
同時給有需要的患者施用多種軟骨保護劑，其中至少一種軟骨保護劑包含在導向于關節的送遞載體中，所述多種軟骨保護劑包括至少一種合成代謝軟骨保護劑和至少一種軟骨分解代謝抑制劑，所述多種軟骨保護劑中的每一種都以治療有效量存在，以便所述多種軟骨保護劑既抑制軟骨分解代謝，又促進軟骨合成代謝。
            
47.一種用于保護患者的軟骨的方法，包括
            
同時給有需要的患者施用多種軟骨保護劑，其中至少一種軟骨保護劑包含在導向于與關節軟骨退化相關的新表位的送遞載體中，所述多種軟骨保護劑包括至少一種合成代謝軟骨保護劑和至少一種軟骨分解代謝抑制劑，所述多種軟骨保護劑中的每一種都以治療有效量存在，以便所述多種軟骨保護劑既抑制軟骨分解代謝，又促進軟骨合成代謝。
            
48.一種用于保護患者的軟骨的方法，包括
            
同時給有需要的患者施用多種軟骨保護劑，其中至少一種軟骨保護劑包含在導向于透明軟骨的分子、細胞或結構的送遞載體中，所述多種軟骨保護劑包括至少一種合成代謝軟骨保護劑和至少一種軟骨分解代謝抑制劑，所述多種軟骨保護劑中的每一種都以治療有效量存在，以便所述多種軟骨保護劑既抑制軟骨分解代謝，又促進軟骨合成代謝。
            
全文摘要
            
本發明公開了用于抑制關節軟骨退化的方法和組合物。該組合物優選包含多種軟骨保護劑，包括至少一種促進軟骨合成代謝活性的試劑和至少一種抑制軟骨分解代謝的試劑。該組合物還可以包含一種或多種疼痛和炎癥抑制劑。該組合物可以全身性施用，如治療具有多關節軟骨退化的危險性的患者，并且可以適當地配制在導向于關節的載體或送遞載體中。或者，所述組合物可以直接注射或輸注到關節中。
            
文檔編號A61K47/48GK1697647SQ0380313
            
公開日2005年11月16日 申請日期2003年1月31日 優先權日2002年2月1日
            
發明者G·A·德莫普洛斯, P·P·帕爾默, J·M·赫爾茲 申請人:奧默羅斯公司
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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