N－苯基－2－嘧啶－胺衍生物的n－氧化物的制作方法

專利名稱：N－苯基－2－嘧啶－胺衍生物的n－氧化物的制作方法
技術領域：
本發明涉及其中至少一個氮原子帶有氧原子以形成相應N-氧化物的N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物、其制備方法、包含這些化合物的藥物組合物以及其在制備用于治療性治療包括人在內的溫血動物的藥物組合物中的用途。
本發明特別涉及式I化合物 其中R1為氫或羥基，R2為氫、低級烷基或羥基-低級烷基，A為-NR5R6、-CR5R6或-OR5R6，R5R6一起代表含有四個、五個或六個碳原子的亞烷基、含有一個氧原子和三個或四個碳原子的氧雜-低級亞烷基，或含有一個或兩個氮原子和兩個、三個或四個碳原子的氮雜-低級亞烷基，其中氮原子是未取代的或被低級烷基、羥基-低級烷基或乙酰基取代，且其中每種情況下的低級亞烷基可以是部分或完全不飽和的和/或當低級亞烷基不是完全不飽和時，低級亞烷基的碳原子可被低級烷基、羥基、低級烷氧基或氧代基取代，且其中至少一個氮原子帶有氧原子以形成相應的N-氧化物，或當沒有氮原子帶有氧原子時，A在環碳上被氧代基取代，或所述化合物的可藥用鹽。
優選A在環碳上被氧代基取代。
優選A為吡咯烷子基(pyrrolidino)、哌啶基、哌啶子基(pepridino)、哌嗪基、吡啶基、吡咯烷子基、吡咯烷基、嗎啉代、低級烷基哌嗪子基(piperazino)、N-甲基哌嗪子基、4-甲基-3-氧代-1-哌嗪基、3-氧代-1-哌嗪基、1H-咪唑基、1H-2-甲基咪唑基、1H-4-甲基咪唑基或1H-2，4-二甲基咪唑基、環己基或苯基，任選地在環碳上被氧取代；最優選“A”代表下式A’的哌嗪子基 其中R3代表氫、低級烷基或乙酰基。
優選這樣的式I化合物，其中R1為氫，R2為氫、甲基或羥甲基，A為A’，任選地在環碳上被氧取代，R3為甲基或氫，或所述化合物的鹽。
當“A”在環碳上被氧取代時，“A”優選選自低級烷基-氧代-哌嗪子基如4-甲基-3-氧代-1-哌嗪基或氧代-哌嗪子基如3-氧代-1-哌嗪基、氧代-吡咯烷子基、氧代-哌啶子基、氧代-哌啶基、氧代-嗎啉代、氧代-環己基、琥珀酰亞胺基或戊二酰亞胺基。
帶有氧原子以形成相應N-氧化物的氮原子優選位于嘧啶、氮茚基(pyrindinyl)、“A”或式A’的哌嗪子基上的環氮原子。
對于定義“R5R6一起”，申請人在列舉中未將NR5R6、CR5R6或OR5R6中提及的氮、氧或碳基團包括在內。
前綴“低級”表示含有不超過且包括最多7個、特別是不超過且包括最多4個碳原子的基團，所述基團為直鏈或具有單個或多個分支的支鏈。
低級烷基優選為含有1個且包括1個至不超過7個且包括7個、優選1個且包括1個至4個且包括4個碳原子的、直鏈或支鏈的烷基；優選地，低級烷基為丁基如正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、丙基如正丙基或異丙基、乙基或甲基。低級烷基優選為甲基、丙基或叔丁基。
羥基-低級烷基優選為羥甲基、2-羥乙基或2-羥基-2-丙基。
低級烷氧基特別地為甲氧基、乙氧基、異丙氧基或叔丁氧基。
在一個優選的方面，本發明涉及式II化合物 其中R1為氫或羥基，R2為低級烷基或羥基-低級烷基，R3為氫、甲基或乙酰基，且星號指示任選帶有氧原子以形成相應N-氧化物的氮原子，條件是如果R1為氫、R2為甲基且R3為氫或甲基，則用星號標記的三個氮原子中的至少一個帶有氧原子，或所述化合物的鹽。
任選地，2-嘧啶的氮原子也可以帶有一個或兩個氧原子以形成相應的N-氧化物。
優選地，式II化合物帶有至少一個氧原子以形成相應的N-氧化物。
任選地，哌嗪基被氧代基取代，以形成低級烷基-氧代-哌嗪子基如4-甲基-3-氧代-1-哌嗪基或氧代-哌嗪子基如3-氧代-1-哌嗪基。
在式II化合物范圍內，術語“低級”表示含有不超過7個且包括7個、優選不超過4個且包括4個碳原子的基團。
當R1為羥基時，3-吡啶基部分在2、4、5或6位的環碳原子上被羥基取代。
低級烷基R2優選為甲基。
羥基-低級烷基R2優選為羥甲基。
鹽特別地為式I或II化合物的可藥用鹽。
所述鹽由含堿性氮原子的式I或II化合物形成，例如以酸加成鹽的形式，優選與有機酸或無機酸加成的鹽，特別是可藥用的鹽。
為了分離或純化目的，也可能使用不可藥用的鹽，例如苦味酸鹽或高氯酸鹽。只有可藥用鹽或游離化合物(如果需要，以藥物組合物形式)可實現治療用途，因此優選這些化合物。
鑒于游離形式的新化合物和其鹽形式之間的密切關系，上下文中任何對游離化合物的提及應理解為也提及相應的鹽為宜，所述的鹽包括那些例如在新化合物的純化或鑒別中可用作中間體的鹽。
式I或II的化合物具有有價值的藥理學性質，可例如用作抗腫瘤劑、用作治療動脈粥樣硬化的活性劑、用作治療再狹窄的活性劑、用作抗白血病劑以預防移植誘發的疾病如閉塞性細支氣管炎，和/或用于預防某些細菌如牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)侵入溫血動物細胞。
蛋白的磷酸化長期以來公知為細胞分化和分裂的必須步驟。磷酸化為蛋白激酶催化，蛋白激酶細分為絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶。酪氨酸激酶包括PDGF(血小板衍生的生長因子)受體酪氨酸激酶。
PDGF是非常常見的生長因子，其在正常生長和病理性細胞增殖中發揮重要作用，如在癌發生中和血管平滑肌細胞疾病例如動脈粥樣硬化和血栓形成中所見。
如E.Andrejauskas-Buchdunger和U.Regenass在Cancer Research52，5353-5358(1992)中所述，在A431細胞的PDGF受體免疫復合物中測定了對PDGF-刺激的受體酪氨酸激酶活性的體外抑制。式I或II化合物抑制PDGF-依賴性非細胞受體磷酸化。對PDGF受體酪氨酸激酶的抑制用微量滴定ELISA測定法進行測定(參見Trinks等人，J.Med.Chem.37，1015-27(1994)。
對PDGF受體酪氨酸激酶的抑制使得式I或II化合物還適用于治療腫瘤疾病，如神經膠質瘤、肉瘤、前列腺腫瘤以及結腸、乳腺和卵巢腫瘤。
式I或II化合物還可抑制涉及所謂的干細胞因子(SCF，也稱為c-Kit配體或青灰因子)的細胞過程，如SCF受體(Kit)自體磷酸化和SCF-刺激的MAPK激酶(促分裂原活化的蛋白激酶)的活化。
具體而言，式I或II的化合物抑制c-Kit的酪氨酸激酶活性。這可以在用c-Kit胞漿激酶域進行的酪氨酸激酶抑制試驗中顯示。所述試驗如下進行用桿狀病毒供體載體pFbacG01(GIBCO)產生表達人c-Kit胞漿激酶域的氨基酸區域氨基酸544-976的重組桿狀病毒。c-Kit胞漿域的編碼序列被來自人子宮c-DNA庫的PCR(Clontech)擴增。用BamH1和EcoRI消化以使擴增的DNA片斷和pFbacG01載體適于連接。這些DNA片斷的連接產生了桿狀病毒供體質粒c-Kit。病毒的產生、Sf9細胞中的蛋白表達以及GST-融合蛋白的純化如下進行病毒產生將含c-Kit激酶域的轉移載體(pFbacG01-c-Kit)轉染至DH10Bac細胞系(GIBCO)，并將轉染的細胞涂布至選擇性瓊脂板上。病毒基因組(被細菌攜帶)中未插入融合序列的菌落為藍色。將單一白色的菌落取出，并用標準質粒純化方法從細菌中分離病毒DNA(桿粒)。然后在25cm2的燒瓶中用Cellfectin試劑以病毒DNA轉染Sf9細胞或Sf21細胞(美國典型培養物保藏中心)。
Sf9細胞中小規模蛋白表達的測定由轉染的細胞培養物中收集含病毒的培養基，并用于感染以增加其滴度。將兩輪感染后獲得的含病毒的培養基用于大規模的蛋白表達。對于大規模的蛋白表達，將100cm2圓形組織培養板接種，5×107個細胞/板，并用1ml含病毒的培養基(約5MOI)感染。3天后，將細胞從板上刮離并在500rpm下離心5分鐘。將來自10-20個100cm2板的細胞沉淀重新懸浮于50ml冰冷的裂解緩沖液(25mM Tris-HCl，pH7.5，2mM EDTA，1％NP-40，1mM DTT，1mM PMSF)中。將細胞于冰上攪拌15分鐘，然后在5000rpm下離心20分鐘。
GST-標記蛋白的純化將離心后的細胞裂解產物加載于2ml谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia)上，并用10ml的25mM Tris-HCl，pH7.5、2mMEDTA、1mM DTT、200mM NaCl洗滌三次。GST-標記的蛋白經10次(每次1ml)25mM Tris-HCl，pH7.5、10mM還原的谷胱甘肽、100mM NaCl、1mM DTT、10％甘油洗提，并在-70℃下貯藏。
激酶測定對純化GST-c-Kit進行酪氨酸蛋白激酶測定，終體積30μl，含有200-1800ng酶蛋白(取決于比活性)、20mM Tris-HCl，pH7.6、3mMMnCl2、3mM MgCl2、1mM DTT、10μM Na3VO4、5μg/ml聚(Glu，Tyr)4∶1、1％DMSO、1.0μM ATP和0.1μCi[γ33P]ATP。通過對33P自[γ33P]ATP向聚(Glu，Tyr)4∶1底物的摻入進行測定，測定了在抑制劑存在或不存在下的活性。在下述條件下，該測定(30μl)在室溫下于96孔板中進行20分鐘，通過加入20μl 125mM EDTA終止測定。之后，將40μl反應混合物轉移至Immobilon-PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，美國)上，該膜預先用甲醇浸泡5分鐘，用水洗滌，然后用0.5％H3PO4浸泡5分鐘并安裝在與真空源斷開的真空歧管上。點入所有樣品后，連接真空并用200μl 0.5％H3PO4洗滌每個孔。將膜取出，用1.0％H3PO4在振蕩器上洗滌4次，并用乙醇洗滌一次。將膜在環境溫度下干燥后，安放在Packard TopCount 96-孔框中并加入10μl/孔 Microscint TM(Packard)進行計數。通過對每個化合物一式兩份在四個濃度(通常為0.01、0.1、1和10μM)的抑制百分數進行線性回歸分析計算IC50值。一單位蛋白激酶活性定義為在37℃下每毫克蛋白每分鐘由[γ33P]ATP向底物蛋白轉移1nmole33P ATP。
式I或II的化合物還抑制SCF-受體(和c-Kit，原癌基因)的自體磷酸化。對SCF受體的自體磷酸化的抑制可以用例如MO7e細胞測定，其為依賴SCF增殖的人早幼粒細胞白血病細胞系。它們由美國的Grover Bagby，Oregon Health Sciences大學獲得。將所述細胞在補充有10 FBS和2.5ng/mlGC-CMF的RPMI 1649培養基中進行培養。GM-SCF和SCF市售可得。制備除去血清的MO7e細胞并在37℃下用供試物質培養90分鐘，然后在37℃下用重組SCF刺激10分鐘。用抗磷酸酪氨酸抗體通過蛋白質印跡分析相同量的細胞裂解產物(Buchdunger等人，Proc.Natl.Acad.Sci(美國)92，2558-62(1995))。用Amersham的ECL蛋白質印跡系統(Amersham，英國)檢測免疫修飾蛋白。
基于上述性質，式I或II的化合物不僅可用作抑制腫瘤的物質，例如在小細胞肺癌中用作抑制腫瘤的物質，而且可用作治療非惡性增殖性疾病如動脈粥樣硬化、血栓形成、銀屑病、硬皮病和纖維變性的活性劑，以及用于保護干細胞例如對抗化療劑如5-氟尿嘧啶的血中毒作用和用于哮喘。它特別可用于治療對抑制PDGF受體激酶響應的疾病。
另外，式I或II化合物可預防用其它化療劑的癌癥治療中的多藥耐藥性的發生，或消除預先存在的對其它化療劑的耐藥性。除了上文所述的作用外，式I或II化合物還可以有利地與其它抗腫瘤劑如特別是其它c-Kit抑制劑和血管內皮生長因子(VEGF)受體或c-Scr活性抑制劑聯用。
Abl激酶、特別是v-Abl激酶也被式I或II的化合物抑制。通過N.Lydon等人，Oncogene Research 5，161-173(1990)和J.F.Geissler等人，Cancer Research52，4492-8(1992)的方法測定了對v-Abl酪氨酸激酶的抑制作用。在這些方法中，使用[Val5]-血管緊張素II和[γ-32P]ATP作為底物。
通過類推，式I或II化合物還可抑制Bcr-Abl激酶(參見NatureMedicine2，561-566(1996))，因此適合用于治療Bcr-Abl-陽性癌和腫瘤疾病，如白血病(特別是慢性粒細胞白血病和急性淋巴細胞白血病，其中特別是發現了凋亡作用機制)，還可表現對白血病干細胞亞型的作用以及在取出所述細胞(例如取出骨髓)后對這些細胞進行體外純化并且一旦它們被清除了癌細胞再將所述細胞植入(例如純化的骨髓細胞再植入)的潛能。
抗c-Abl蛋白酪氨酸激酶的活性試驗。所述試驗以下述的濾膜結合試驗進行如Bhat等人，J.Biol.Chem.272，16170-5(1997)所述，將c-Abl的His-標記的激酶域克隆并在桿狀病毒/Sf9系統中表達。以鈷金屬螯合物柱、繼之以陰離子交換柱的兩步操作純化37kD的蛋白(c-Abl激酶)，產率為1-2mg/L Sf9細胞。
考馬斯藍染色后經SDS-PAGE判斷，c-Abl激酶的純度＞90％。檢測物含有c-Abl激酶(50ng)、20mM Tris HCl，pH7.5、10mM MgCl2、10μmNa3VO4、1mM DTT和0.06μCi/檢測[γ33P]-ATP(5μm ATP)，使用30μg/ml聚-Ala，Glu，Lys，Tyr-6∶2∶5∶1(Poly-AEKY，Sigma P1152)，含有1％DMSO，總體積為30μl。通過加入10μl 250mM EDTA終止反應，將30μl反應混合物轉移至Immoblin-PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，美國)上，所述膜預先用甲醇浸泡5分鐘、用水洗滌，然后用0.5％H3PO4浸泡5分鐘并安裝在與真空源斷開的真空歧管上。點入所有樣品后，連接真空并用200μl 0.5％H3PO4洗滌每個孔。將膜取出，用0.5％H3PO4在振蕩器上洗滌(4次)，并用乙醇洗滌一次。將膜在環境溫度下干燥后安放在Packard TopCount 96-孔框中并加入10μl/孔 Microscint TM(Packard)進行計數。
抗Bcr-Abl活性試驗。用p210 Bcr-Abl表達載體pGDp210Bcr/Abl(32D-bcr/abl)轉染的鼠骨髓祖細胞系32Dcl3得自J.Griffin(Dana FaberCancer Institute，波士頓，MA，美國)。該細胞表達具有組成性活性Abl激酶的融合Bcr-Abl蛋白并獨立地增殖生長因子。將細胞在RPMI1640(AMIMED)、10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺(Gibco)(“完全培養基”)中擴增，通過在冰凍培養基(95％FCS，5％DMSO(SIGMA))中冰凍每瓶2×106個細胞的等分試樣制備工作儲備液。解凍后，將最多10-12次傳代的細胞用于試驗。
對于細胞檢測，將化合物溶于DMSO中并用完全培養基稀釋至起始濃度為10μM，然后用完全培養基制備連續3倍稀釋液。在96孔圓底組織培養板中每孔接種50μl完全培養基中的200’000 32D-Bcr/Abl細胞。一式三份地將每孔50μl受試化合物的連續3倍稀釋液加入細胞。未處理的細胞用作對照。將化合物與細胞一起在37℃、5％CO2下培養90分鐘，然后在1300rpm(Beckman GRP離心機)上離心組織培養板，并小心地吸除上清液，注意不要除去任何沉淀細胞。細胞沉淀通過加入150μl裂解緩沖液(50mM Tris/HCl，pH7.4、150mM氯化鈉、5mM EDTA、1mM EGTA、1％NP-40、2mM正釩酸鈉、1mM PMSF、50μg/mL抑肽酶和80μg/mL亮抑肽酶)裂解并且立即進行ELISA或者于-20℃冷凍于板中保存待用。
將黑色ELISA板(Packard HTRF-96黑色板)在4℃用50ng/孔50μlPBS中的來自Upstate的兔多克隆抗abl-SH3域Ab 06-466預覆過夜。用含有0.05％ Tween20(PBST)和0.5％TopBlock(Juro)的200μl/孔PBS洗滌三次后，剩余的蛋白結合位點用200μl/孔PBST，3％TopBlock在室溫下封閉4h，然后用50μl未處理的裂解物或化合物處理的細胞(每孔20μg總蛋白)在4℃下培養3-4h。洗滌3次后，以50μl/孔加入用封閉緩沖液稀釋至0.2μg/mL的用堿性磷酸酶(Zymed)標記的抗磷酸酪氨酸Ab PY20(AP)并過夜培養(4℃)。在所有培養步驟中，平板均用板蓋(Costar)覆蓋。最后，將各平板用洗滌緩沖液再洗滌3次并用去離子水洗滌1次后，加入90μl/孔含有Emerald II的AP-底物CDPStar RTU。此時將用Packard TopSealTM-A板蓋封閉的平板在黑暗中于室溫下培養45分鐘，并用Packard Top Count微孔板閃爍計數器(Top Count)測量每秒計數(CPS)以定量發光。計算用未處理的32D-Bcr/Abl細胞裂解物得到的ELISA-讀數(CPS)與分析背景(所有組分，但沒有細胞裂解物)讀數的差異并將其作為100％，其反應了這些細胞中存在的組成性磷酸化Bcr-Abl蛋白。化合物對Bcr-Abl激酶活性的活性表達為Bcr-Abl磷酸化的降低百分數。從劑量效應曲線通過圖像外推法確定IC50和IC90值。
抗突變Bcr-Abl活性試驗如上評估化合物對M351T突變體Bcr-Abl激酶活性的活性，不同的是用突變Bcr-Abl轉染的32Dcl3細胞代替p210Bcr-Abl。
c-Raf-1蛋白激酶試驗通過GST-c-Raf-1重組桿狀病毒和活性c-Raf-1激酶生成所需的v-Src和v-Ras重組桿狀病毒三重感染Sf21細胞得到重組c-Raf-1蛋白(Williams等人，PNAS 1992；892922-6)。需要活性Ras(v-Ras)將c-Raf-1募集到細胞膜，需要v-Src將c-Raf-1磷酸化以完全將其活化。將細胞以2.5×107個細胞/150mm盤接種并允許在室溫下附著于150mm盤達1小時。吸取培養基(含有10％FBS的SF900II)并分別以MOI 3.0、2.5和2.5、總體積4-5mL加入重組桿狀病毒GST-c-Raf-1、v-Ras和v-Src。將細胞室溫下培養1小時后加入15mL培養基。感染的細胞在27℃培養48-72小時。刮除感染的Sf2細胞并收集至50mL管中并在Sorvall離心機中以1100g在4℃下離心10分鐘。用冰冷的PBS洗滌細胞沉淀并用0.6mL裂解緩沖液/2.5×107個細胞裂解。在冰上10分鐘、伴偶爾吹吸后，使細胞達到完全裂解。在具有SS-34旋轉子的Sorvall離心機中以14,500g在4℃下離心細胞裂解物10分鐘，將上清液轉移到新管中并保存于-80℃。每2.5×107個細胞使用100μl在冰冷的PBS中平衡的填裝谷胱甘肽-瓊脂糖4B珠從細胞裂解物純化c-Raf-1。搖動下使GST-c-Raf-1在4℃下與珠結合1小時。將與珠結合的GST-c-Raf-1轉移到柱子。該柱用裂解緩沖液洗滌1次并用冰冷的Tris緩沖液洗滌2次。加入冰冷的洗脫緩沖液并中止柱流以允許游離谷胱甘肽破壞GST-c-Raf-1與谷胱甘肽瓊脂糖珠的相互作用。收集級分(1mL)至預冷的管中。每管含有10％甘油(終濃度)以在冷凍融解循環中保持激酶活性。將純化的GST-c-Raf-1激酶蛋白級分保存于-80℃下。
IκB用作c-Raf-1激酶的底物。IκB在細菌中表達為His-標記的蛋白BL21。使含有IκB質粒的LysS細菌在LB培養基中生長至OD600 0.6，然后用IPTG(終濃度1mM)在37℃誘導3小時使細菌表達IκB，然后通過在超聲緩沖液(50mM Tris pH8.0、1mM DTT、1mM EDTA)中超聲(microtip設定每次1分鐘，共3次)溶菌并以10,000g離心15分鐘。將上清液與硫酸銨混合得到終濃度30％。將該混合物在4℃搖動15分鐘然后以10,000g旋轉15分鐘。將沉淀重新懸浮于含有10mM BSA的結合緩沖液(Novagen)中。按照Novagen手冊該溶液加載于Ni-瓊脂糖(Novagen)并洗滌。用洗脫緩沖液(0.4M咪唑、0.2M NaCl、8mM Tris pH7.9)自柱中洗脫IκB。將含有蛋白質的級分在50mM Tris pH8，1mM DTT中裂解。通過測量33P自[γ33P]ATP向IκB中的摻入，測定在抑制劑存在或不存在時的c-Raf-1蛋白激酶的活性。該分析在96孔板中于室溫下進行60分鐘。其含有(總體積30μl)c-Raf-1激酶(400ng)、25mM Tris.HCl，pH7.5、5mMMgCl2、5mM MnCl2、10μM Na3VO4、1mM DTT和0.3μCi/檢測[γ33P]-ATP(10μM ATP)，使用600ng IκB，含有1％DMSO。通過加入10μl250mM EDTA終止反應并將30μl反應混合物轉移至Immobilon-PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，美國)上，所述膜預先用甲醇浸泡5分鐘、用水洗滌，然后用0.5％H3PO4浸泡5分鐘并安裝在與真空源斷開的真空歧管上。點完所有樣品后，連接真空并用200μl 0.5％H3PO4洗滌每個孔。除去膜并在振蕩器上用0.5％H3PO4洗滌4次，用乙醇洗滌1次。室溫干燥后，將其安裝在Packard TopCount 96孔框中，并加入10μl/孔MicroscintTM(Packard)，對膜進行計數。
現已驚訝地發現由于在細胞特別是在腫瘤細胞和在大腦中的生物還原作用(脫氧)，我們的式I或II化合物具有出乎意料的潛能，可用作缺氧-選擇性產品。缺氧激活的前體藥物可特別用于癌癥治療，因為在實體瘤或大腦中發生嚴重缺氧。缺氧細胞可用于非毒性、缺氧激活的前體藥物的治療。因此，由于N-氧化物部分的凈還原作用，在腫瘤或大腦中存在式I或II化合物的較高攝入，并且在腫瘤或大腦中存在還原形式的式I或II化合物的蓄積。
式I或II化合物的另一優勢是相對于化合物A對載體介導的外流(通過可飽和的系統，可能是P-gp)具有優異的作用。該不明顯的外流的結果是-更多的吸收；-在大腦中更高的藥物水平和-在腫瘤中更高的藥物水平。
對P-gp的作用和轉運機制可證實如下用在聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)濾器(Falcon TM)上生長21-25天的Caco-2細胞單層進行轉運實驗。在存在或不存在強外流泵抑制劑CsA和維拉帕米的條件下，分別測定化合物通過生長在PET濾器上的Caco-2細胞單層以及通過無Caco-2細胞的單獨的PET濾器(用于系統驗證)的流出，方法如下在轉運實驗之前，用預先在37℃培養的接收溶液(HBSS，需要時含有目標抑制劑)代替接受池中的培養基(頂側0.2ml，底側1.0ml)。為了啟動實驗，用預先在37℃培養的供體溶液(處于HBSS中的化合物，需要時含有目標抑制劑)代替供體池中的培養基(頂部0.35ml，底側1.15ml)。約1和120分鐘后從供體和受體側取150μl等分試樣。在37℃下、于未經振搖的培養箱內、一式三份地進行頂側-至-底側和底側-至-頂側兩個方向的轉運實驗。
此外，式I或II化合物的血漿蛋白結合在游離部分和/或與血漿蛋白(例如白蛋白、α-1-酸性糖蛋白(AAG))的締合方面要優于用化合物A所觀察到的。與AAG較低程度的締合導致N-氧化物的游離部分的可變性較不顯著并且也對游離部分的化合物A有影響。在400mg日劑量的臨床相關劑量(濃度為900-2600ng/mL的化合物A)下，化合物A的游離部分為4-5％。使用紅血球分配，發現化合物A主要與白蛋白和α-1-酸性糖蛋白(AAG)締合。與脂蛋白和γ球蛋白締合的部分小于5％。降低的式I或II化合物的血漿蛋白結合通過下面的實施例顯示。
通過超離心方法確定式I或II化合物的游離(或未結合)部分，該方法也用于化合物A(見2000年12月22日提交的歐洲專利申請No.1250140或國際專利申請WO 01/47507)。將用含有0.9％NaCl(w/v)的Soerensen緩沖液(pH7.4)制備人血清白蛋白(40g/L)和α-1-酸性糖蛋白(1g/L)溶液。將30μl式I或II化合物的儲備液直接加到3mL蛋白溶液中以得到期望的終濃度，即300-5000ng/mL式I或II化合物(乙醇終濃度0.5％，系數1∶200)。在恒定的輕微攪動下于37℃培養30分鐘，所加的蛋白樣品(n＝3/4)在37℃下使用厚壁聚碳酸酯離心管以200,000g離心至少5小時(帶有固定角度旋轉子的離心機)。不經制動使旋轉停止。測定培養后(離心前)和離心后在上清液中的式I或II化合物的濃度。
式I或II化合物的藥物動力學在Cmax(觀察到的以質量/體積為單位的血漿最高濃度)、半衰期(指施用藥物后觀察到所測量的藥理學應答減小一半的時間；一方面，當半衰期增加至少50％時，半衰期被延長)或者作為一種轉運機制(例如P-gp)的血漿AUC(隨時間變化的血漿濃度，定義為曲線下面積(AUC)，以質量-時間/體積為單位)要優于化合物A。通過對動物(例如大鼠)施用單劑量的式I或II化合物(一組動物靜脈內處理，一組動物經口服處理)可證明該有利的藥物動力學。在選定的時間點(例如0.083分鐘(iv靜脈內))和iv或po(經口服給藥)后0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24和48h取血。通過將血離心立即制備血漿。用HPLC/UV檢測或LC-MS測定血漿中未改變的式I或II化合物和化合物A。
此外，式I或II化合物與血漿蛋白的結合減少可導致表觀分布容積的增加，原因是未結合藥物(fu)的比例升高。有利的是，式I或II化合物在器官和組織(包括腦)的分布與化合物A不同。這可顯示如下。
-用未放射性標記的N-氧化物給藥時小鼠或大鼠腦中的式I或II化合物和化合物A。
動物(例如小鼠或大鼠)接受單劑量的式I或II化合物(一組動物靜脈內處理，一組動物口服處理)。在選定的時間點(例如0.083(iv)和iv或po給藥后1、8、24和48小時)將動物處死。取出經處理的動物的腦，制備腦勻漿并制備樣品(例如用有機溶劑如甲醇、乙腈等萃取勻漿)用于式I或II化合物或化合物A的分析(HPLC/UV或LC-MS)。測量腦和血漿中式I或II化合物和化合物A的濃度以確定腦/血漿比。
-用放射性標記的N-氧化物給藥時小鼠或大鼠中的放射性物質分布。
對于組織分布研究，例如將10mg/kg的放射性標記的N-氧化物(例如[14C]-標記；100μCi/kg b.w.)口服施用于動物。用定量全身自放射發光繪圖法(QWABL)研究放射活性物質在動物全身的吸收/分布。在選定的時間點處死動物并在約-75℃的干冰和己烷的混合物中冷凍。將冷凍的動物包埋入預冷的約-75℃的2％Na-CMC水性凝膠中；在約-20℃下用CryoMacrocut低溫切片機(Leica Instr.GmbH，D-Nussloch)獲得40μm厚的切片。使切片在低溫切片機中于-23℃下脫水24-60h。在鉛屏盒中于室溫下將切片暴露于BAS III成像板(Fuji Photo Film有限公司，日本，東京)1天以使背景增加最小。暴露的時間允許檢測約2dmp/mg，即相應于總放射活性劑量(如果放射活性平均分布于全身)約0.2-0.4％的放射活性濃度。曝光結束后立即在Fuji BAS 2000 TR磷成像儀中、在控光條件下以100μm掃描步幅1024灰度等級進行掃描。圖像分析如下進行將所得光刺激的光數據文件通過減去背景進行校正，借助MCID/M4(3.0Rev.1.3)圖像分析儀(ImagingResearch，St.Catherines，Ontario，加拿大)對文件進行電子處理，并利用在和樣品類似條件下處理的放射活性血標得到的1次多項式校正曲線將其自動轉變成放射活性濃度。通過LD＝背景平均(n＝10)+3SD、QL＝3LD確定檢測限(LD)和定量限(QL)。
測量面積的大小和用于設定校正曲線的血標的每個血標準相同。用Adobe Photoshop軟件處理圖像文件。
對于使用QWABL獲得的總放射活性物質的分布，只使用一半經處理的動物，這使得可能使用器官或組織以在選定的樣品中用HPLC/UV或HPLC-放射活性和/或LC-MS中測定未改變的N-氧化物和/或化合物。
由于N-氧化物更具極性，式I或II化合物對CYP450也具有較低的親和力[1，2]。這些酶代謝大部分市售藥物。較低的親和力表示較小的藥物/藥物相互作用的可能性。特別是阻斷堿性氮如哌嗪/吡啶部分中的堿性氮可降低對CYP2D6的親和力，CYP2D6是一種特別是通過與天冬氨酸殘基的離子相互作用與底物結合的酶，所述相互作用需要堿性部分如哌嗪環系統中的氮。將10種不同的人肝微粒體與所有其代謝活性(NADPH)必需的輔因子以及各個CYP450同工酶特異活性所必須的確定的標記底物一起培養。以遞增濃度加入可能的抑制劑，并用相應的分析方法(LC/MS、HPLC、熒光法)評價代謝反應。將無抑制劑的轉化率設定為100％，以抑制50％轉化所需的抑制劑濃度(IC50)評價抑制率。使用了以下的標記底物底物CYP優選的可接受的1A2乙氧基試鹵靈 咖啡因(低周轉)(ethoxyresorufin) 茶堿(低周轉)非那西丁 乙酰苯胺(在肝細胞中使用最多)甲氧基試鹵靈
(methoxyresorufin)2A6香豆素2C8紫杉醇(標準有效性？)2C9S-華法林 甲苯磺丁脲(低周轉)雙氯芬酸2C19 S-甲妥因(4-羥基代謝物)奧美拉唑2D6丁呋洛爾 美托洛爾右美沙芬 異喹胍可待因(均無問題，但不常使用)2E1氯唑沙宗 4-硝基苯酚月桂酸3A4咪達唑侖 硝苯地平睪酮(強力推薦使用至少兩種 非洛地平結構不相關的底物) 環孢菌素特非那定紅霉素辛伐他汀另外，式I或II化合物在治療移植例如同種移植引起的疾病中表現出有益作用，特別是組織排斥反應，如特別是閉塞性細支氣管炎(OB)，即同種肺移植物的慢性排斥反應。與無OB的患者相比，那些患有OB的患者常常表現出支氣管肺泡灌洗液中的PDGF濃度升高。如果將式I或II化合物例如以50mg/kg的腹膜內劑量施用于具有氣管同種移植物的大鼠，在10和30天后，每組切除10個移植物后對可能的上皮損害和氣道閉塞進行形態測定分析并研究作用的免疫組織化學通路可以證實盡管式I或II化合物對上皮壞死或炎性細胞浸潤沒有顯著效果，但是與對照相比較其確實顯著減少管腔的纖維增殖和閉塞。與其它免疫調節物質或抗炎物質的協同作用是可能的，例如當與以下物質聯合使用時環孢菌素A(CsA)、雷帕霉素或子囊霉素或其免疫抑制類似物，例如環孢菌素G、FK-506或相當的化合物；皮質類甾醇；環磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨喋呤；白瑞夸爾；來氟洛米；咪唑立賓；霉酚酸；霉酚酸酯；15-脫氧斯潘格寧；免疫抑制抗體，特別是白細胞受體的單克隆抗體，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45、CD58或它們的配體；或其它的免疫調節化合物，如CTLA4Ig。如果CsA(1mg/kg皮下施用)例如與式I或II的化合物(50mg/kg)聯用，可以觀察到協同作用。
式I或II化合物對與血管平滑肌細胞遷移和增殖有關的疾病(其中PDGF和PDGF受體也常發揮作用)也有效，如再狹窄和動脈粥樣硬化。這些對體外和體內血管平滑肌細胞增殖或遷移的作用及其結果可通過施用式I或II的化合物以及通過研究其對體內機械損傷后血管內膜肥厚的作用來證實。
式I或II的化合物在0.1N HCl或DMSO中以10mM的濃度用于體外研究。貯備液用細胞培養基進一步稀釋并以10至0.1μM的濃度用于實驗。對于體內施用，將式I或II化合物溶于例如DMSO中，濃度為200mg/ml，然后用1％吐溫的0.9％鹽水溶液進行1∶20稀釋。超聲后，獲得透明的溶液。施用前每天制備新鮮的貯備液。(也可以將式I或II化合物簡單地溶于去離子水中用于口服施用，或溶于0.9％的鹽水溶液中用于胃腸外施用)。在手術前24小時進行施用。在整個觀察期間，將式I或II化合物以每天50mg/kg腹膜內給藥劑量單劑量施用于大鼠。對照大鼠給予相同的制劑，但不含有式I或II化合物。口服施用也是可能的。
用Thyberg等人(參見Differentiation25，156-67(1983))所述的方法的改進方法由9至11天齡的DA(AG-B4，RTla)大鼠主動脈分離平滑肌主動脈細胞的原代培養物。通過縱向切割打開主動脈并小心地除去內皮。分離外膜和中膜，并將中膜在37℃下于磷酸鹽緩沖的生理鹽水中用0.1％的膠原酶和脫氧核苷酸酶消化30分鐘。將細胞離心、懸浮于培養基中，然后使其在塑料瓶中生長。2至6次傳代后用初級細胞進行實驗。將傳代培養物保存在補充了10％胎牛血清、2mmol/ml谷氨酰胺、100mmol/ml鏈霉素和100IU/ml青霉素的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s培養基)中。出于鑒別目的，將細胞放置于蓋玻片上使其生長并用由平滑肌細胞獲得的抗-α-肌動蛋白抗體進行免疫組織化學染色(見下文)。
用上下池被孔徑為8μm的聚碳酸酯膜分開的Transwell細胞培養插入物(Costar，Cambrige，MA)對平滑肌細胞的遷移進行體外定量。將細胞(100μl，濃度為1百萬個細胞/ml)暴露在上池中。2小時后，向下側池中加入60ng/ml PDGF-BB或PDGF-AA(Upstate Biotechnology公司，LakePlacid，紐約)，補充0.5％胎牛血清和0.1％牛血清白蛋白，并以濃度3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.003μM加入式I或II的供試化合物。為了測定纖連蛋白依賴性遷移，在4℃下用濃度為10μg/ml的纖連蛋白(人細胞纖連蛋白，Upstate Biotechnology公司)覆蓋Transwell腔室。遷移24小時后，將濾器取出，在甲醇中固定并用邁爾蘇木精和曙紅染色。借助放大400x的光學顯微鏡對濾器上的特定截面區域進行計數，以測定濾膜下側遷移的細胞。用與對照相比的細胞百分數對遷移抑制進行定量。為了排除毒性作用的可能性，通過在補充了10％胎牛血清的DMEM中摻入3H-胸苷對細胞的生存力進行試驗。觀察式I或II化合物對PDGF-AA和特別是PDGF-BB誘發的遷移的抑制作用。
實驗動物剝離雄性Wistar大鼠(購自赫爾辛基大學實驗動物中心，芬蘭)的主動脈和頸動脈。腹膜內施用240mg/kg的水合氯醛將大鼠麻醉，并施用丁丙諾啡(Temgesic，Reckitt&Coleman，Hull，英國)用于減輕手術期間的和手術后的疼痛。按照NIH的“實驗室動物管理法則”和“實驗室動物管理和使用指南”(NIH公告86-23，1985年修訂)對所有動物給予人性管理。使用重200-300g的大鼠進行剝露操作。通過使2F栓子切除術導管(Baxter Healthcare公司，Santa Ana，CA，27)在管腔內通過剝離左側頸總動脈內皮。為了除去內皮，使導管通過管腔三次，導管用0.2ml空氣膨脹。取出導管后結扎頸外動脈并縫合傷口。剝離后4天參照頸動脈中部截面評價組織學變化。用2F Fogarty動脈栓子切除術導管剝離胸主動脈內皮。將導管經左側髂動脈插入胸主動脈、用0.2ml空氣膨脹，并通過管腔5次以除去內皮。然后將髂動脈拮扎。選擇三個時間(3、7和14天)評價組織學變化。
為了對增殖細胞進行定量，剝離大鼠頸動脈后使用3種不同方法用溴脫氧尿苷(BrdU)標記細胞。在該模型中，剝離后24小時血管中層細胞開始增殖；72-96小時后首次出現內膜細胞。為了在出現內膜細胞之前對平滑肌細胞的增殖進行定量，在剝離后0至72小時的術后期間靜脈內施用0.1ml BrdU-標記的試劑(ZYMED，San Francisco，CA)(共計施用6次0.1ml)。為了在遷移初始波期間對增殖進行定量，在手術后72-96小時期間以8小時間隔給予大鼠3×0.1ml BrdU-標記的試劑。為了在遷移初始波末期對增殖進行定量，處死前3小時給予第三組大鼠0.3ml BrdU的脈沖劑量。
將組織學樣本在3％的多聚甲醛溶液中固定4小時以在石蠟中進行包埋。由邁爾蘇木精-曙紅染色的石蠟切片評價形態學變化。在400x放大下計算不同脈管切片的細胞數。為了鑒別培養物中的細胞和剝離損傷4天內新內膜中出現的細胞，用由平滑肌細胞獲得的抗-α-肌動蛋白抗體(Bio-Makor，Rehovot，以色列)對丙酮固定的樣本進行免疫組織化學染色。在丙酮固定的蓋玻片上用相同的染色方法鑒別初級平滑肌細胞。將切片與初級抗體(1∶2000稀釋)一起培養、洗滌并連續與和過氧化物酶偶聯的兔-抗鼠-Ig和羊-抗兔-Ig一起培養，然后用含色原3-氨基-9-乙基咔唑和過氧化氫的底物溶液處理。用初級鼠抗體(Bu20a，Dako，A/S，丹麥)和VectastainElite ABC-Kit(Vector Laboratiories，Burliname，CA)由石蠟切片制備BrdU染色。將切片去除石蠟并用500W的微波處理(在0.1M的檸檬酸鹽緩沖液，pH6中處理2×5分鐘)，然后在70℃下用95％的甲酰胺的0.15M檸檬酸三鈉溶液處理45分鐘。根據生產商的說明書制備抗體稀釋液。用邁爾蘇木精和曙紅進行復染，對內膜、中層和外膜的正染色細胞分別進行計數。
在經處理動物的頸動脈中，發現平滑肌細胞的細胞數顯著減少。外膜和血管中層顯示出細胞數的顯著減少。由于式I或II化合物，在最初兩個標記期間(0-72和72-96小時)發現內膜、中層和外膜中BrdU標記的細胞的絕對數量略微減少，93-96小時后發現所有區域中的標記細胞數量減少。在剝離動脈的動物中也同樣發現了平滑肌細胞數量減少。
因此，根據這些發現，式I或II化合物可以抑制血管平滑肌細胞的增殖，以及特別是遷移。
式I或II化合還能抑制血管生成。這可以證實如下將含瓊脂(0.8％和肝素(2U/ml)的小室皮下植入正常小鼠(C57 BL/6)中，同時植入或不植入生長因子(VEGF 3μg/ml，PDGF 1μg/ml或bFGF 0.3μg/ml)。以在裸鼠異種移植物模型中以表現出良好抗腫瘤活性的劑量口服施用式I或II化合物。在植入小室前一天開始給藥。5天后將小室取出。通過測定在植入物周圍生長的血管化組織和該組織的血容量(外部血)對血管生成功效進行定量。通過測定血紅蛋白對血液進行測定。盡管脈管沒有生長進入瓊脂，但如果存在抗血管生成作用，瓊脂將變得非常紅。如果化合物抑制生長因子誘發的血液增加，可將此視為所試驗的化合物可阻斷相關生長因子的血管生成作用的表現。抑制血液的重量而不是體積顯示對成纖維細胞增殖的作用。對對照響應的抑制顯示對傷口愈合的抑制。在每天一次50mg/kg的口服劑量下，式I或II化合物可抑制所有三種生長因子(VEGF、PDFG、bFGF)的血管生成作用。
有趣的是，發現4-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-羥甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺、4-[(4-甲基-4-氧化-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基}-苯基}-苯甲酰胺和4-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(1-氧化-3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基]-苯甲酰胺代表N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺(ST1571或伊馬替尼，下文稱為化合物A)的代謝物，其在施用化合物A后可在人體中發現。化合物A在EP 0564409B1中述及，并且在WO 99/03854中述及甲磺酸鹽形式。
除以上提及的代謝物外，其它化合物A的代謝物在猴中被鑒定，如4-[(4-甲基羰基-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺；4-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-羧基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺；4-羧基-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺；4-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基]-苯甲酰胺，其中吡啶基部分在一個環碳原子上被羥基取代；以及4-[(1-哌嗪基)-甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基]-苯甲酰胺，其中吡啶基部分在一個環碳原子上被羥基取代。
優選的是如下的式II化合物，其中R1為氫，R2為甲基或羥甲基，R3為甲基，且星號指示任選地帶有氧原子以形成相應N-氧化物的氮原子，條件是如果R2為甲基，則用星號標記的三個氮原子中的至少一個帶有氧原子，或所述化合物的鹽。
特別優選的還有如下的式II化合物，其中R1為氫，R2為羥基-低級烷基，R3為甲基，且星號指示任選地帶有氧原子以形成相應N-氧化物的氮原子，或所述化合物的鹽。
特別優選的是選自以下的化合物4-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-羥甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺、4-[(4-甲基-4-氧化-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺和4-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(1-氧化-3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基]-苯甲酰胺，以及這些化合物的可藥用鹽。
非常特別優選的還有以下實施例中提及的式I或II化合物或其鹽，特別是其可藥用的鹽。
盡管以前沒有對制備式I或II化合物的描述，但是式I或II化合物或其鹽可根據本身已知的方法制備，特別是用以下方法
(a)使式III化合物 其中R1和R2具有式I下給出的含義，與式IV化合物反應， 其中A具有式I下給出的含義，并將由此獲得的化合物用適宜的氧化劑轉化為式I的N-氧化物，或者如果不轉化為N-氧化物，A就必須在環碳上被氧代基取代；優選地，使式III化合物 其中R1和R2具有式II下給出的含義，且星號指示任選地帶有氧原子的氮原子，與式IV化合物反應，
其中R3具有式II下給出的含義，且星號指示任選地帶有氧原子的氮原子；并任選地將由此獲得的化合物用適宜的氧化劑轉化為式II的N-氧化物；或(b)使式V化合物 其中R1和R2具有式I下給出的含義，Hal為鹵素(例如-Cl、-Br、-F、-I)，與式VI化合物反應，AH (VI)其中A具有式I下給出的含義，并任選地將由此獲得的化合物用適宜的氧化劑轉化為式I的N-氧化物；優選地，使式V化合物
其中R1和R2具有式II下給出的含義，Hal為鹵素(例如-Cl、-Br、-F、-I)，且星號指示任選地帶有氧原子的氮原子，與式VI化合物反應， 其中R3具有式II下給出的含義，且星號指示任選地帶有氧原子的氮原子；并任選地將由此獲得的化合物用適宜的氧化劑轉化為式II的N-氧化物；其中存在于方法a)或b)的起始化合物中并且不應參與反應的官能團必要時以被保護的形式存在，并且將存在的保護基裂解，其中所述的起始化合物也可以以鹽的形式存在，條件是存在成鹽基團且鹽形式的反應是可能的；并且如果需要，將方法a)或b)獲得的式I或II化合物轉化為另一種式I或II化合物，將所得的游離式I或II化合物轉化為鹽，將所得的式I或II化合物的鹽轉化為游離化合物或另一種鹽，和/或將式I或II的異構體化合物的混合物拆分為單獨的異構體。
在最優選的實施方案中，式I或II化合物為基本上純的形式。
在本發明的上下文中，術語“基本上純的”應理解為意指基本上不含生物學物質，如在血中發現的生物學物質，特別是所述生物學物質少于10％、優選少于1％，且最優選不含所述的生物學物質。
方法變體描述用于將方法a)或b)所得的化合物轉化為式I或II的N-氧化物的適宜氧化劑優選為過氧化氫或適宜的過酸，例如適宜的過苯甲酸，如特別是間-氯-過苯甲酸。該反應在如下條件下進行在惰性溶劑中，例如鹵化烴如二氯甲烷；在約-20℃至所述溶劑沸點的溫度下，通常低于+100℃。如果使用過氧化氫作為氧化劑，該反應優選在水中、約室溫下進行。然后可以用常規方法如例如柱色譜法或重結晶法純化所需的N-氧化物。
另一方面，式I或II的N-氧化物可以根據前段所述的方法、通過先行氧化式I或II化合物合成中所用的起始原料制備。
關于方法a)式III化合物和式IV化合物之間的反應優選在適宜的惰性溶劑、特別是N，N-二甲基甲酰胺中、于丙膦酸酐(Fluka，Buchs，瑞士)和堿如特別是三乙胺存在下、優選在室溫下進行。
關于方法b)式V化合物和式IV化合物之間的反應優選在適宜的惰性溶劑中、特別是醇例如低級醇如特別是乙醇、于升高的溫度下、優選接近所用溶劑的沸點溫度下進行。
式V化合物中存在的鹵素為例如氟、氯、溴和碘，優選氯。
其它方法步驟在根據需要進行的其它方法步驟中，起始化合物中不應參與反應的官能團可以以未保護的形式存在或可以例如被一個或多個保護基保護。然后根據已知方法之一全部或部分地除去保護基。
保護基和它們被引入和除去的方法在以下文獻中述及例如“有機化學中的保護基”，Plenum出版社，倫敦，紐約1973；和“Methoden derorganischen Chemie”，Houben Weyl，第4版，第15卷/1，Georg-Thieme-Verlag，斯圖加特1974以及Theodora W.Greene，“有機合成中的保護基”，John Wiley & Sons，紐約1981。保護基的特征在于它們可例如通過溶劑分解、還原、光解或者備選地在生理條件容易地除去，即不發生不期望的副反應。
但是，式I或II的終產物也可以含有在用于制備式I或II的其它終產物的起始原料中也可用作保護基的取代基。因此，在本文范圍內，除非上下文中另外說明，否則只有不構成式I的具體所需終產物的、易于除去的基團才被稱為“保護基”。
一般方法條件在此所述的所有方法步驟均可在已知反應條件下進行，優選在那些特別提及的條件下進行，不存在或通常存在溶劑或稀釋劑，優選那些對所用試劑呈惰性且能溶解它們的溶劑或稀釋劑；不存在或存在催化劑、縮合劑或中和劑，例如離子交換劑，通常是例如質子化(H+-)形式的陽離子交換劑，這取決于反應和/或反應物的類型；溫度為降低的、正常的或升高的溫度，例如-100℃至約190℃、優選約-80℃至約150℃，例如-80℃至-60℃下、RT、-20℃至40℃、0℃至100℃或所用溶劑的沸點；如果需要在壓力下進行，壓力為大氣壓力或在密閉容器中；和/或在惰性氣氛例如在氬氣或氮氣中。
本發明還涉及這樣的方法實施方案其中，從在任何階段作為中間體可獲得的化合物開始并且進行余下的步驟，或在任何階段中斷方法，或在反應條件下形成起始原料，或使用活性衍生物或鹽形式的所述起始原料，或生成在這些方法條件下用本發明的方法可獲得的化合物，并進一步對所述的化合物進行原位處理。在優選的實施方案中，反應由那些生成前述優選化合物的起始原料開始。
在優選的實施方案中，式I或II化合物根據實施例中定義的方法和方法步驟制備。
式I或II化合物，包括它們的鹽，也可以以水合物形式獲得，或者它們的晶體可以包含例如用于結晶的溶劑(以溶劑合物形式存在)。
起始原料新的起始原料和/或中間體及其制備方法同樣是本發明的主題。在優選實施方案中，使用了所述的起始原料，并對反應條件進行了選擇以便能獲得優選化合物。
上述方法中所用的起始原料是已知的、可根據已知方法制備(也可參見EP 0564409B1)或市售可得；具體而言，它們可以用實施例中所述的方法制備。
在起始原料的制備中，必要時對不參與反應的現有官能團進行保護。優選的保護基、它們的引入和除去在上文中或在實施例中描述。也可以用其鹽代替各個起始化合物和過渡物進行反應，條件是存在成鹽基團且用鹽進行的反應是可能的。當在上下文中使用術語起始原料時，其鹽也總是被包括在內，只要是合理的和可能的即可。
其中R2為低級烷基且用星號標記的氮原子不帶有氧原子作為取代基的式III化合物可以如EP 0564409B1所述進行制備。然后，如以上“方法變體描述”下所述，可以用適宜的氧化劑將所述化合物轉化為相應的N-氧化物。
其中R2為羥基-低級烷基的式III化合物可以用類似于實施例1的方法由以下的式VII化合物開始制備 其余的起始原料是已知的、可以根據已知方法如例如EP 0564409B1中所述的那些方法制備或市售可得；或者具體而言，它們可以用實施例中所述的方法制備。為形成相應N-氧化物的適宜的N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物也在例如EP 0564409B1中述及。
本發明還涉及用于治療患有所述疾病、特別是腫瘤疾病的、包括人在內的溫血動物的方法，其中向需要所述治療的包括人在內的溫血動物施用可有效對抗相關疾病量的、特別是具有抗增殖和特別是抑制腫瘤功效的量的式I或II化合物。此外，本發明還涉及式I或II化合物用于抑制上述酪氨酸激酶、特別是PDGF受體激酶、v-Abl激酶和/或c-Kit受體激酶的用途，或在制備用于治療包括人在內的溫血動物、特別是用于治療腫瘤如神經膠質瘤、卵巢腫瘤、前列腺腫瘤、結腸腫瘤和肺部腫瘤如特別是小細胞性肺癌、以及乳腺腫瘤或其它婦科腫瘤的藥物組合物中的用途。根據種屬、年齡、個體狀況、施用方式和相關臨床情況，可向約70kg體重的、包括人在內的溫血動物施用有效的劑量，例如約1-2500mg、優選1-1000mg、特別是5-500mg的日劑量。
因此，另一方面，本發明涉及其中至少一個氮原子帶有氧原子以形成相應N-氧化物的N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物或所述化合物的可藥用鹽在制備用于治療增殖性疾病的藥物組合物中的用途。
優選地，本發明涉及式I或II化合物或所述化合物的可藥用鹽在制備用于治療增殖性疾病的藥物組合物中的用途。
最優選地，增殖性疾病選自腫瘤或腦增殖性疾病。
本發明還提供了用于治療包括人在內的溫血動物的方法，其包括以有效對抗所述疾病的劑量向所述的患有增殖性疾病的溫血動物施用式I或II化合物或所述化合物的可藥用鹽。
在另一項實施方案中，本發明提供了包含至少一種其中至少一個氮原子帶有氧原子以形成相應的N-氧化物的N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物或其可藥用鹽以及可藥用載體的藥物組合物。
優選地，本發明提供了包含式I或II化合物或其可藥用鹽以及可藥用載體的藥物組合物。
本發明的組合物可含有至少一種其它的藥學活性化合物如4-(4-甲基哌嗪-1-基甲)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基-苯基]-苯甲酰胺。
優選地，用于在包括人在內的溫血動物中治療增殖性疾病的藥物組合物，包含式I或II的化合物或所述化合物的可藥用鹽作為活性成分，以及可藥用的載體。
因此，本發明還涉及包含式I或II化合物作為活性成分以及可藥用載體的藥物組合物，其特別用于預防或治療所述疾病之一，所述的藥物組合物適合于例如局部、經腸例如口服或直腸、或胃腸外施用。用于口服施用的特別是片劑或明膠膠囊劑，其含有活性物質以及稀釋劑，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素，和/或甘油，和/或潤滑劑，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其鹽，通常是硬脂酸鎂或硬脂酸鈣，和/或聚乙二醇。片劑也可以含有粘合劑，例如硅酸鋁鎂、淀粉，通常是玉米、小麥或米淀粉、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮，以及如果需要，還含有崩解劑，例如淀粉、瓊脂、海藻酸或其鹽，通常是藻酸鈉，和/或泡騰混合物或吸附劑、著色劑、芳香劑和甜味劑。本發明的藥理學活性化合物還可以以用于胃腸外施用的制劑或輸注溶液形式使用。所述溶液優選為等張水溶液或混懸劑，這些可能在使用前制備，例如含有單獨的或與載體例如甘露醇一起的活性物質的凍干制劑。藥物物質可以是已滅菌的和/或含有賦形劑，例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑和/或乳化劑、增溶劑、調節滲透壓的鹽，和/或緩沖劑。本發明的藥物組合物如果需要可含有其它藥理學活性物質，如其它c-Kit抑制劑或VEGF受體或c-Scr活性抑制劑，其通過本身已知的方法、例如通過常規的混合、制粒、包衣、溶解或凍干方法制備，并含有約1％至100％、特別是約1％至約20％的一種或多種活性物質。
實施例以下實施例用于闡述本發明，但不以任何方式限制其范圍。
縮略語DMF N，N-二甲基甲酰胺h小時min 分鐘m.p. 熔點RT 室溫THF 四氫呋喃實施例14-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-羥甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺在20分鐘內，將丙膦酸酐的N，N-二甲基甲酰胺溶液(Fluka，Buchs，瑞士；350μl，50％，0.6mmol)逐份加入攪拌的N-(5-氨基-2-羥甲基-苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺(117mg，0.4mmol)、4-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-苯甲酸二鹽酸鹽(123mg，0.4mmol)和三乙胺(445μl，3.2mmol)于干燥N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中的混合物中。將混合物在RT下攪拌24小時。在減壓下蒸除溶劑，將殘余物用飽和碳酸氫鈉水溶液(20ml)處理，并用乙酸乙酯(2×20ml)萃取。將合并的萃取液用飽和氯化鈉水溶液(15ml)洗滌、干燥(MgSO4)、過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到的粗產物用反相高壓液相色譜法(NagelPolygoprep C18，7μm，300；Macherey-Nagel，Düren，德國)純化，洗脫劑為0.1％三氟乙酸的水溶液-0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。將含純產物的級分合并、用飽和碳酸氫鈉水溶液堿化并在減壓下蒸發至干。將殘余物用飽和碳酸氫鈉水溶液處理并用乙酸乙酯(5×)萃取。將合并的萃取液用水洗滌、干燥(MgSO4)、過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到的產物用甲醇-乙酸乙酯重結晶，得到標題化合物，為淺黃色結晶性固體，m.p.196-198℃。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，δ)2.14(s，3H)，2.25-2.45(m，8H)，3.52(s，2H)，4.56(s，2H)，5.50(br.s，1H)，7.29(d，J＝8.3Hz，1H)，7.41(dd，J＝2.0，8.3Hz，1H)，7.44(d，J＝8.1Hz，2H)，7.50(d，J＝5.1Hz，1H)，7.52(dd，J＝3.3，8.1Hz，1H)，7.93(d，J＝8.1Hz，2H)，8.56(d，J＝2.0Hz，1H)，8.57(d，J＝5.1Hz，1H)，8.59(ddd，J＝1.4，2.1，8.1Hz，1H)，8.69(dd，J＝1.4，3.3Hz，1H)，9.10(s，1H)，9.33(d，J＝2.1Hz，1H)和10.22(s，1H)。
步驟1.12-氨基-4-硝基苯甲醇將在20℃下攪拌的2-氨基-4-硝基苯甲酸(Aldrich；18.2g，100mmol)于干燥THF(500ml)中的溶液用硼烷-THF復合物(BH3·THF；Fluka；100ml，1.0M)處理，在45分鐘內滴加，以調節氣體逸出。然后將混合物在65℃下加熱2小時。然后將攪拌的混合物冷卻至0℃、用水(20ml)處理并溫熱至RT。氣體逸出停止后，立即加入鹽酸(20ml，12M)，然后將混合物在65℃下加熱30分鐘。之后在減壓下經旋轉蒸發將冷卻的混合物濃縮至體積為約150ml以得到懸液。過濾懸液并將沉淀重新溶解在乙酸乙酯(500ml)中，并用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×150ml)洗滌。將溶液干燥(Na2SO4)、過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到的粗產物通過用乙酸乙酯-己烷重結晶進行純化，得到標題化合物，為黃色結晶性固體，m.p.126-128℃。
步驟1.22-[(2-丙烯基氧基)-甲基]-5-硝基苯胺將氬氣氛、0℃下攪拌的2-氨基-4-硝基苯甲醇(14.3g，85mmol)于干THF(350ml)中的溶液在35分鐘內滴加叔丁醇鉀的THF溶液(Fluka；85ml，1.0M)進行處理。將混合物在0℃下攪拌15分鐘，然后在0℃下于50分鐘內滴加烯丙基溴(7.9ml，94mmol)于干燥THF(80ml)中的溶液進行處理，之后在20℃下攪拌90分鐘。將混合物用乙酸乙酯(800ml)稀釋。將得到的溶液用飽和氯化銨水溶液(3×400mD洗滌、干燥(MgSO4)、過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到的粗產物用硅膠柱色譜法純化，洗脫劑為50％乙酸乙酯的己烷溶液，得到標題化合物，為褐色油。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，δ)4.06(d，J＝5.3Hz，2H)；4.47(s，2H)；5.22和5.34(dd，J＝10.4，17.3Hz，2H)；5.65(br.s，2H)；5.98(m，J＝5.3，10.4，17.3Hz，1H)；7.35(d，J＝8.3Hz，1H)；7.38(dd，J＝2.0，8.3Hz，1H)和7.52(d，J＝2.0Hz，1H)。
步驟1.3{2-[(2-丙烯基氧基)-甲基]-5-硝基苯基}-胍在20℃下，將硝酸(1.04ml，65％，15mmol)加入攪拌的2-[(2-丙烯基氧基)-甲基]-5-硝基苯胺(3.15g，15mmol)的乙醇(30ml)溶液中。然后在95℃下，于60分鐘內向攪拌的混合物中滴加氨腈(0.95g，22.5mmol)于水(1ml)中的溶液。將混合物在95℃下加熱14小時，在這期間加入另外的氨腈等分試樣(共計2.2g，58mmol)并通過加入硝酸(65％)階段性地將pH調為3。將得到的溶液冷卻至0℃、用氨水(5ml，25％)堿化、用水(150ml)稀釋并用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。將合并的萃取掖用飽和氯化銨水溶液(50ml)洗滌、干燥(MgSO4)、過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到標題化合物，為褐色油，其不經進一步純化直接用于下一步驟。
步驟1.4N-{2-[(2-丙烯基氧基)-甲基]-5-硝基-苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺將攪拌的{2-[(2-丙烯基氧基)-甲基]-5-硝基-苯基}-胍(3.75g，15mmol)、3-(二甲基氨基)-1-(3-吡啶基)-2-丙烯-1-酮(2.60g，15mmol)和乙基二異丙基胺(2.6ml，15mmol)于1-丁醇(50ml)中的混合物在120℃下加熱20小時。然后在減壓下蒸除溶劑，將得到的殘余物溶于乙酸乙酯(100ml)。將得到的混合物過濾(硅藻土)、用飽和氯化鈉水溶液(50ml)洗滌、干燥(MgSO4)、過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到的粗產物用硅膠柱色譜法純化，洗脫劑為乙酸乙酯，并用乙酸乙酯-己烷重結晶，得到標題化合物，為黃色結晶性固體，m.p.213-215℃。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，δ)4.10(d，J＝5.3Hz，2H)，4.77(s，2H)，5.22和5.35(dd，J＝10.4，17.3Hz，2H)，5.96(m，J＝5.3，10.4，17.3Hz，1H)，7.58(dd，J＝4.8，7.9Hz，1H)，7.66(d，J＝8.4Hz，1H)，7.69(d，J＝5.2Hz，1H)，7.95(ddd，J＝1.2，1.2，7.9Hz，1H)，8.51(dd，J＝1.6，8.4Hz，1H)，8.67(d，J＝5.2Hz，1H)，8.73(dd，J＝1.2，4.8Hz，1H)，9.05(d，J＝1.2Hz，1H)，9.23(br.s，1H)和9.35(d，J＝1.6Hz，1H)。
步驟1.5N-(2-羥甲基-5-硝基-苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺將聚甲基氫硅氧烷(860mg)、四(三苯基膦)鈀(70mg)和氯化鋅(2.66ml，0.5M的THF溶液，1.33mmol)加入攪拌的N-{2-[(2-丙烯基氧基)-甲基]-5-硝基-苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺(2.60g，7.2mmol)于干燥THF(60ml)中的溶液中。然后將混合物在30℃、氬氣氛下攪拌30小時。然后在減壓下蒸除溶劑，將得到的殘余物用飽和氯化鈉水溶液(50ml)處理并用乙酸乙酯(3×50ml)萃取。將合并的萃取液干燥(Na2SO4)、過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到的粗產物用THF重結晶，得到標題化合物，為淺黃色結晶性固體，m.p.247-250℃。
步驟1.6N-(5-氨基-2-羥甲基-苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺在25℃、大氣壓力下，將N-(2-羥甲基-5-硝基-苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺(0.23g，0.71mmol)于乙醇(230ml)中的溶液用阮內鎳(0.2g)氫化。在13小時內吸收計算量的氫。然后將混合物過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到的粗產物用硅膠柱色譜法純化，洗脫劑為25％氨水-乙醇-二氯甲烷(1∶9∶90)，得到標題化合物，為黃色結晶性固體，m.p.213-215℃。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，δ)4.42(d，J＝5.1Hz，2H)，5.05(br.s，2H)，5.26(t，J＝5.1Hz，1H)，6.23(dd，J＝2.1，8.0Hz，1H)，6.91(d，J＝8.0Hz，1H)，7.35(d，J＝2.0Hz，1H)，7.45(d，J＝5.1Hz，1H)，7.56(dd，J＝4.7，8.0Hz，1H)，8.47(ddd，J＝1.8，1.8，8.0Hz，1H)，8.53(d，J＝5.1Hz，1H)，8.70(dd，J＝1.4，4.7Hz，1H)，8.88(s，1H)和9.29(d，J＝2.4Hz，1H)。
實施例24-[(4-甲基-4-氧化-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺在-20℃下，將3-氯過氧苯甲酸(Fluka，Buchs，瑞士；2.06g，55％，4.27mmol)加入攪拌的4-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺(如EP 0564409B1實施例21所述制備，2.00g，4.05mmol)于二氯甲烷(70ml)中的混合物中。然后將得到的混合物在RT下攪拌72小時。之后在減壓下蒸除溶劑，得到的混合物用硅膠柱色譜法純化，洗脫劑為二氯甲烷-甲醇-水(70∶30∶5)，得到標題化合物，為黃色結晶性固體，m.p.154-158℃。
實施例34-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(1-氧化-3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基]-苯甲酰胺將N-甲基哌嗪(99mg，1.0mmol)加入攪拌的4-氯甲基-N-[4-甲基-3-[[4-(1-氧化-3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基]-苯甲酰胺(220mg，0.49mmol)于乙醇(5ml)中的懸液中。然后將混合物在100℃下攪拌15小時以得到溶液，之后將其冷卻至RT并用乙酸乙酯(200ml)處理。將得到的溶液用氫氧化鈉水溶液(100ml，2M)和飽和氯化鈉水溶液(100ml)洗滌、干燥(Na2SO4)、過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到的粗產物用硅膠柱色譜法純化，洗脫劑為25％氨水-甲醇-二氯甲烷(0.5∶10∶90)，得到標題化合物，為黃色結晶性固體，m.p.232-235℃。
步驟3.1N-[4-甲基-3-[[4-(1-氧化-3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基]-苯甲酰胺利用實施例2中所述的方法，但用N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基]-苯甲酰胺(如EP 0564409B1實施例20所述制備)代替4-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺，得到的標題化合物用硅膠柱色譜法純化，洗脫劑為10％甲醇的二氯甲烷溶液，并用乙醇重結晶，得到標題化合物，為淺黃色結晶性固體，m.p.258-260℃。
步驟3.24-甲基-N-3-[4-(1-氧化-3-吡啶基)-2-嘧啶基]-1，3-苯二胺將鹽酸(9ml，4M)加入N-[4-甲基-3-[[4-(1-氧化-3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基]-苯甲酰胺(0.43g，1.08mmol)于正丙醇(9ml)中的懸液中，并將得到的混合物在100℃下加熱34小時。在減壓下蒸發冷卻后的混合物，得到油，將其溶于水(10ml)、過濾并用氫氧化鈉水溶液(4M)堿化。將生成的沉淀過濾、用水洗滌并干燥，得到的粗產物用乙醇重結晶，得到標題化合物，為黃色結晶性固體，m.p.104-106℃。
步驟3.34-氯甲基-N-[4-甲基-3-[[4-(1-氧化-3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基]-苯甲酰胺將4-(氯甲基)-苯甲酰氯(Fluka，Buchs，瑞士；184mg，0.977mmol)于二噁烷(2ml)中的溶液滴加至4-甲基-N-3-[4-(1-氧化-3-吡啶基)-2-嘧啶基]-1，3-苯二胺(275mg，0.937mmol)于二噁烷(5ml)中的溶液中，并將混合物在20℃下攪拌75分鐘。然后加入第二份溶于二噁烷(1ml)的4-(氯甲基)-苯甲酰氯(60mg，0.317mmol)，并將混合物繼續攪拌120分鐘。將得到的懸液用乙酸乙酯(50ml)處理，用氫氧化鈉水溶液(2×50ml，2M)洗滌得到的溶液。將乙酸乙酯溶液干燥(Na2SO4)、過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到的粗產物用硅膠柱色譜法純化，洗脫劑為5％甲醇的二氯甲烷溶液，得到標題化合物，為黃色結晶性固體，m.p.224-226℃。
實施例44-[4-甲基-1，4-二氧化-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺將4-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺單甲磺酸鹽(3.00g，5mmol；如WO 99/03854所述制備)加入過氧化氫水溶液(30ml，3％)中，并將得到的溶液在20℃下攪拌160小時。然后用氫氧化鈉水溶液(4M)調節溶液pH至14，并將得到的懸液攪拌1.5小時。將粗產物濾出、用水洗滌、干燥并用硅膠柱色譜法純化，洗脫劑為25％氨水-乙醇-二氯甲烷(5∶30∶70)，得到標題化合物，為黃色結晶性固體，m.p.242-244℃。
實施例54-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-羥甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺在20分鐘內，將丙膦酸酐的N，N-二甲基甲酰胺溶液(Fluka，Buchs，瑞士；350μl，50％，0.6mmol)逐份加入攪拌的實施例1步驟1.6中所述的N-[2-[5-氨基-(2-羥基)甲基]苯基]-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺(117mg，0.4mmol)、4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]苯甲酸二鹽酸鹽(123mg，0.4mmol)和三乙胺(445μl，3.2mmol)于干燥N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中的混合物中。將混合物在室溫下攪拌24小時。減壓下蒸除溶劑，將殘余物用飽和碳酸氫鈉水溶液(20ml)處理并用乙酸乙酯(2×20ml)萃取。將合并的萃取液用飽和氯化鈉水溶液(15ml)洗滌、干燥(MgSO4)、過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到的粗產物用反相高壓液相色譜法(Nagel Polygoprep C18，7μm，300；Macherey-Nagel，Düren，德國)純化，洗脫劑為0.1％三氟甲酸的水溶液-0.1％三氟甲酸的乙腈溶液。將含純產物的級分合并、用飽和碳酸氫鈉水溶液堿化并在減壓下蒸發至干。將殘余物用飽和碳酸氫鈉水溶液處理并用乙酸乙酯(5×)萃取。合并的萃取液用水洗滌、干燥(MgSO4)、過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到的產物用甲醇-乙酸乙酯重結晶，得到標題化合物，為淺黃色結晶性固體，m.p.196-198℃。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，δ)2.14(s，3H)，2.25-2.45(m，8H)，3.52(s，2H)，4.56(s，2H)，5.50(br.s，1H)，7.29(d，J＝8.3Hz，1H)，7.41(dd，J＝2.0，8.3Hz，1H)，7.44(d，J＝8.1Hz，2H)，7.50(d，J＝5.1Hz，1H)，7.52(dd，J＝3.3，8.1Hz，1H)，7.93(d，J＝8.1Hz，2H)，8.56(d，J＝2.0Hz，1H)，8.57(d，J＝5.1Hz，1H)，8.59(ddd，J＝1.4，2.1，8.1Hz，1H)，8.69(dd，J＝1.4，3.3Hz，1H)，9.10(s，1H)，9.33(d，J＝2.1Hz，1H)和10.22(s，1H)。
實施例64-[(3-氧代-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基l苯基}苯甲酰胺將丙膦酸酐的N，N-二甲基甲酰胺溶液(Fluka，Buchs，瑞士；1.3ml，50％，2.25mmol)滴加至攪拌的4-甲基-N-[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-1，3-苯二胺(416mg，1.5mmol)、4-[(3-氧代-1-哌嗪基)甲基]苯甲酸(351mg，1.5mmol)和三乙胺(1.7ml，12mmol)于干燥N，N-二甲基甲酰胺(4ml)中的混合物中。將混合物在室溫下攪拌17小時，然后用飽和碳酸氫鈉水溶液(100ml)處理。將形成的沉淀過濾、用水洗滌、干燥并用甲醇重結晶，得到標題化合物，為膏狀結晶性固體。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，δ)ppm 2.21(s，3H)，2.63(t，J＝5.49Hz，2H)，2.80(s，3H)，2.96(s，2H)，3.26(t，J＝5.42Hz，2H)，3.60(s，2H)，7.19(d，J＝8.39Hz，1H)，7.42(d，J＝5.19Hz，1H)，7.46(m，3H)，7.51(dd，J＝7.93，4.73Hz，1H)，7.91(d，J＝8.09Hz，1H)，8.06(s，1H)，8.47(m，1H)，8.50(d，J＝5.04Hz，1H)，8.67(dd，J＝4.73，1.53Hz，1H)，8.99(s，1H)，9.26(d，J＝1.98Hz，1H)和10.18(s，1H)。
4-[(3-氧代-1-哌嗪基)甲基]苯甲酸將3-溴甲基苯甲酸(4.30g，20mmol)、哌嗪-2-酮(2.0g，20mmol)和粉狀的碳酸鉀(2.76g，20mmol)于甲醇(50ml)中的混合物在室溫下攪拌17小時。將得到的混合物過濾并在減壓下蒸除溶劑，得到的殘余物用鹽酸(80ml，0.25M)處理并攪拌5分鐘。將沉淀的產物過濾、用水洗滌、干燥并用甲醇重結晶，得到標題化合物，為膏狀結晶性固體。
實施例74-[(4-甲基-3-氧代-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺利用實施例6中所述的方法，但用4-[(4-甲基-3-氧代-1-哌嗪基)甲基]苯甲酸代替4-[(3-氧代-1-哌嗪基)甲基]苯甲酸，得到標題化合物，為黃色結晶性固體，m.p.187-192℃。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6，δ)2.21(s，3H)，2.55(t，J＝5.34Hz，2H)，2.91(s，2H)，3.15(m，2H)，3.61(s，2H)，7.19(d，J＝8.24Hz，1H)，7.42(d，J＝5.19Hz，1H)，7.46(t，J＝8.01Hz，1H)，7.48(m，2H)，7.51(dd，J＝7.86，4.81Hz，1H)，7.77(s，1H)，7.91(d，J＝8.09Hz，2H)，8.07(s，1H)，8.47(d，J＝7.94Hz，1H)，8.50(d，J＝5.19Hz，1H)，8.67(d，J＝3.36Hz，1H)，8.99(s，1H)，9.27(s，1H)和10.18(s，1H)。
4-[(4-甲基-3-氧代-1-哌嗪基)甲基]苯甲酸利用4-[(3-氧代-1-哌嗪基)甲基]苯甲酸項下所述的方法，但用1-甲基哌嗪-2-酮代替哌嗪-2-酮，得到標題化合物，為膏狀結晶性固體。
實施例8通常以如下組成制備含100mg式II化合物、例如實施例1-4中所述的式II化合物之一的片劑組成活性成分 100mg結晶乳糖 240mgAvicel 80mgPVPPXL 20mgAerosil 2mg硬脂酸鎂5mg447mg
制備將活性成分與載體物質混合并在壓片機(Korsch EKO，沖直徑10mm)上壓制。
Avicel是微晶纖維素(FMC，費城，美國)。
PVPPXL是交聯聚乙烯聚吡咯烷酮(BASF，德國)。
Aerosil是二氧化硅(Degussa，德國)。
實施例9通常以如下組成制備含100mg式II化合物、例如實施例1-4中所述的式II化合物之一的膠囊劑組成活性成分 100mgAvicel 200mgPVPPXL 15mgAerosil 2mg硬脂酸鎂1.5mg318.5mg制備通過將各成分混合并將混合物填充至1號硬明膠膠囊中制備膠囊劑。
權利要求
1.式I的化合物 其中R1為氫或羥基，R2為氫、低級烷基或羥基-低級烷基，A為-NR5R6、-CR5R6或-OR5R6，R5R6一起為含有四個、五個或六個碳原子的亞烷基、含有一個氧原子和三個或四個碳原子的氧雜-低級亞烷基，或含一個或兩個氮原子和兩個、三個或四個碳原子的氮雜-低級亞烷基，其中的氮原子是未取代的或被低級烷基、羥基-低級烷基或乙酰基取代，且其中每種情況下的低級亞烷基可以是部分或完全不飽和的和/或當低級亞烷基不是完全不飽和時，低級亞烷基的碳原子可被低級烷基、羥基、低級烷氧基或氧代基取代，且其中至少一個氮原子帶有氧原子以形成相應的N-氧化物，或當沒有氮原子帶有氧原子時，A被氧代基取代，或所述化合物的可藥用鹽。
2.根據權利要求1的式I化合物，其中A為吡咯烷子基、哌啶基、哌啶子基、哌嗪基、吡啶基、吡咯烷子基、吡咯烷基、嗎啉代、低級烷基哌嗪子基、N-甲基哌嗪子基、4-甲基-3-氧代-1-哌嗪基、3-氧代-1-哌嗪基、1H-咪唑基、1H-2-甲基咪唑基、1H-4-甲基咪唑基、1H-2，4-二甲基咪唑基、環己基或苯基，任選地在環碳上被氧代基取代，或所述化合物的可藥用鹽。
3.根據權利要求1的式I化合物，其中A為下式A’的哌嗪基 任選地在環碳上被氧代基取代，且R3為氫、低級烷基或乙酰基，或所述化合物的可藥用鹽。
4.根據權利要求3的式I化合物，其中R1為氫，R2為氫、甲基或羥甲基，R3為甲基或氫，或所述化合物的可藥用鹽。
5.根據權利要求1的式I化合物，其為4-[(3-氧代-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺，或其可藥用鹽。
6.根據權利要求1的式I化合物，其為4-[(4-甲基-3-氧代-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺，或其可藥用鹽。
7.式II的化合物 其中R1為氫或羥基，R2為低級烷基或羥基-低級烷基，R3為氫、甲基或乙酰基，且星號指示任選地帶有氧原子以形成相應N-氧化物的氮原子，條件是如果R1為氫、R2為甲基且R3為氫或甲基，則用星號標記的三個氮原子中的至少一個帶有氧原子，或其鹽。
8.根據權利要求7的式II化合物，其中R1為氫，R2為甲基或羥甲基，R3為甲基，且星號指示任選地帶有氧原子以形成相應N-氧化物的氮原子，條件是如果R2為甲基，則用星號標記的三個氮原子中的至少一個帶有氧原子，或其鹽。
9.根據權利要求7的式II化合物，其中R1為氫，R2為羥基-低級烷基，R3為甲基，且星號指示任選地帶有氧原子以形成相應N-氧化物的氮原子，或其鹽。
10.根據權利要求7的式II化合物，其為4-[(4-甲基-4-氧化-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺，或其可藥用的鹽。
11.根據權利要求8的式II化合物，其為4-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(1-氧化-3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基]-苯甲酰胺，或其可藥用的鹽。
12.根據權利要求8的式II化合物，其為4-[(4-甲基-1，4-二氧化-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺，或其可藥用的鹽。
13.根據權利要求8或9的式II化合物，其為4-[(4-甲基-1-哌嗪基)-甲基]-N-{4-羥甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]-氨基]-苯基}-苯甲酰胺，或其可藥用的鹽。
14.權利要求1至13中任一項的化合物或其可藥用鹽，用于治療性治療包括人在內的溫血動物的方法中。
15.包含權利要求1至13中任一項的化合物或其可藥用鹽以及可藥用載體的藥物組合物。
16.用于治療包括人在內的溫血動物的增殖性疾病的藥物組合物，其包含權利要求1至13中任一項的化合物或所述化合物的可藥用鹽作為活性成分以及可藥用的載體。
17.權利要求1至13中任一項的化合物或所述化合物的可藥用鹽在制備用于治療增殖性疾病的藥物組合物中的用途。
18.權利要求1至13中任一項的化合物或所述化合物的可藥用鹽在治療增殖性疾病中的用途。
19.治療包括人在內的溫血動物的方法，其包括向所述的患有增殖性疾病的溫血動物以有效對抗所述疾病的劑量施用權利要求1至13中任一項的化合物或所述化合物的可藥用鹽。
20.制備權利要求7的式II化合物或其鹽的方法，其特征在于使式II化合物 其中R1和R2具有權利要求1的式I化合物所定義的含義，且星號指示任選地帶有氧原子的氮原子，與式III化合物反應， 其中R3具有權利要求1的式I化合物所定義的含義，且星號指示任選地帶有氧原子的氮原子；并任選地將由此獲得的化合物用適宜的氧化劑轉化為式I的N-氧化物；其中存在于式II和III化合物中且不應參與反應的官能團必要時以被保護的形式存在，并將存在的保護基裂解，其中式II和III化合物也可以以鹽的形式存在，條件是存在成鹽基團且鹽形式的反應是可能的；并且如果需要，將由此獲得的式I化合物轉化為另一種式I化合物，將所得的游離式I化合物轉化為鹽，將所得的式I化合物的鹽轉化為游離化合物或另一種鹽，和/或將式I的異構體化合物的混合物分離為單獨的異構體。
全文摘要
本發明涉及其中至少一個氮原子帶有氧原子以形成N－氧化物的式(I)的N－苯基－2－嘧啶－胺衍生物，其制備方法、包含這些化合物的藥物組合物，以及其在制備用于治療性治療包括人在內的溫血動物的藥物組合物中的用途。
文檔編號A61P43/00GK1646519SQ03802708
公開日2005年7月27日 申請日期2003年1月22日 優先權日2002年1月23日
發明者K·O·伯恩森, P·恩德, G·格羅斯, U·普法爾, P·W·曼利, J·齊默爾曼 申請人:諾瓦提斯公司