GSK－3β抑制劑在制備增加骨生成的藥物中的應用的制作方法

專利名稱：GSK－3β抑制劑在制備增加骨生成的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制劑促進骨生成和治療骨代謝疾病如骨質疏松癥的用途。
本發明尤其涉及GSK-3β抑制劑在制備增加哺乳動物骨生成的藥物中的應用。
糖原合成酶激酶(GSK)是絲氨酸/蘇氨酸激酶，已經鑒定了它的兩個同工型，α和β。最初，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)被鑒定為蛋白質激酶，其磷酸化并滅活糖原合成酶，是調節胰島素刺激的糖原合成的關鍵酶(見Embi等，Eur.J.Biochem.107，519-527，(1980)；Rylatt等，Eur.J.Biochem.107，529-537，(1980)；和Vandenheede等，J.Biol.Chem.255，11768-11774，(1980))。后來，發現經胰島素激活后GSK-3β被抑制，因此允許糖原合成酶的激活。因此，GSK-3β的抑制刺激胰島素依賴性過程并可用于治療2型糖尿病，其特征在于降低對胰島素的敏感性并增加血糖濃度。許多藥物，如5-碘殺結核菌素、二甲雙胍、曲格列酮(troglitazonem)已經被用來治療糖尿病。然而這些藥物的應用受限，因為二甲雙胍會引發低血糖，曲格列酮(troglitazonem)會引起嚴重的肝毒性，5-碘殺結核菌素，已知的GSK-3抑制劑，抑制其它絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶。
近來，已經發現GSK-3β在阿爾茨海默氏病((見Lovestone等，Current Biology，4，1077-86(1994)，Brownlees等，Neuroreport，8，3251-3255(1997)，Takashima等，PNAS 95，9637-9641(1998)，和Pei等，J Neuropathol.Exp.，56，70-78(1997))和雙相性精神障礙(見Chen等，J.Neurochemistry，72，1327-1330(1999))的發病機理中發揮作用。也已發現，GSK-3β牽涉通過NF-AT阻斷早期免疫應答基因激活和調節細胞凋亡(見Beals等，Science，275，1930-33(1997)和Pap，M.等J.Biochem.273，19929-19932，(1998))。另外，據報道在牽涉對感染有促炎應答的TNF-α信號途徑中，NF-κB介導的存活響應需要GSK-3β((Hoeflich等，Nature，406，86-90(2000))。
此外，已知GSK-3β也調節蛋白質(β-連環蛋白)的降解，此蛋白質控制TCF家族轉錄因子的活性((見Dale，T.C.，Biochem.J.329，209-223(1998)；Clevers，H.& van de Wetering，M.，Trends inGenetics 13，485-489(1997)；Staal，F.J.T.等，InternationalImmunology 11，317-323(1999))。此途徑已顯示調節結腸上皮細胞的轉化。
GSK-3β抑制劑在下述參考文獻中有描述WO99/65897(Chiron)、WO01/20727A1(Sanofi-Synthelabo)、EP1 136 493 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 489 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136486 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 483 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136099A1(Sanofi-Synthelabo)、WO 2000/021927(SKB)、WO2001/049709、WO 2001/056567(Novo Nordisk)、WO 2001/081345、WO2001/085685、WO 2001/009106(SKB)、WO2001/52862(Isis)、WO2001/37819、WO2001/60374、EP 1 106180A1(CNRS)和WO2000/38675(SKB)。
本發明涉及糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)促進骨生成的用途。
一方面，本發明涉及GSK-3β抑制劑增加患者骨礦物質密度的用途。另一方面，本發明涉及GSK-3β抑制劑降低骨折率和/或增加患者骨折愈合率的用途。另一方面，本發明涉及GSK-3β抑制劑增加骨松質形成和/或患者新骨生成的用途。另一方面，本發明涉及GSK-3β抑制劑治療骨質疏松癥的用途。相應地，一方面，本發明涉及式(I)表示的3-吲哚基-4-苯基-1H-吡咯-2，5-二酮衍生物或其藥用鹽增加哺乳動物骨生成的用途
其中R1和R2獨立地代表氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基；R3代表氫、烷基、環烷基、雜烷基、-COR7(其中R7是氫或烷基)或苯基，此苯基任選地被一個或兩個獨立地選自氫、烷基、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基的基團取代；R4和R5獨立地代表氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基；R6是雜烷基、雜環基、雜環烷基、雜烷基取代的雜環基、雜烷基取代的環烷基、雜取代的環烷基、-OR8、-S(O)nR8(其中n是0-2；且R8是雜烷基、雜芳烷基、雜環基或雜環烷基)、-NR9R10(其中R9是氫或烷基且R10是雜烷基、雜芳烷基、雜取代的環烷基、雜環基或雜環烷基)或-X-(亞烷基)-Y-Z(其中X是共價鍵、-O-、-NH-或-S(O)n1其中n1是0-2且Y是-O-、-NH-或-S-且Z是雜烷基或SiR11R12R13其中R11、R12和R13獨立地是氫或烷基)或者當R6與R4彼此相鄰時，它們一起形成亞甲二氧基或亞乙二氧基。
另一方面，本發明涉及GSK-3β抑制劑增加骨生成的用途，其中抑制劑選自在如下文獻中公開的化合物WO99/65897(Chiron)、WO01/20727A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 493 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 489 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 486 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 483 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136099A1(Sanofi-Synthelabo)、WO 2000/021927(SKB)、WO2001/049709、WO 2001/056567(Novo Nordisk)、WO 2001/081345、WO2001/085685、WO2001/009106(SKB)、WO2001/52862(Isis)、WO2001/37819、WO2001/60374、EP 1 106180A1(CNRS)和WO2000/38675(SKB)。
WO01/20727A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 493 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136 489 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136486 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1 136 483 A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136 099A1(Sanofi-Synthelabo)公開了不同的嘧啶-4(1H)-酮衍生物，WO2001/37819公開了靛玉紅衍生物。WO2001/60374公開了paullone衍生物。EP 1 106 180A1公開了hymenialdisine衍生物。
在說明書和權利要求書中關于式(I)化合物的說明的下述術語具有如下給出的含義。
“烷基”指具有一到六個碳原子的直鏈飽和一價烴基或具有三到六個碳原子的支鏈飽和一價烴基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基等。
“亞烷基”指具有一到六個碳原子的直鏈飽和二價烴基或具有三到六個碳原子的支鏈飽和二價烴基，例如亞甲基、亞乙基、2，2-二甲基亞乙基、亞丙基、2-甲基亞丙基、亞丁基、亞戊基等。
“烷氧基”指基團-OR，其中R是如上定義的烷基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。
“烷硫基”指基團-SR，其中R是如上定義的烷基，例如甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基等。
“酰基”指基團-C(O)R，其中R是氫、烷基、環烷基、環烷基烷基、苯基或苯烷基，其中烷基、環烷基、環烷基烷基和苯烷基如此處所定義。代表性的例子包括，但不限于甲酰基、乙酰基、環己基羰基、環己基甲基羰基、苯甲酰基、芐基羰基等。
“酰氨基”指基團-NR’C(O)R，其中R’是氫或烷基，且R是氫、烷基、環烷基、環烷基烷基、苯基或苯烷基，其中烷基、環烷基、環烷基烷基和苯烷基如此處所定義。代表性的例子包括，但不限于甲酰氨基、乙酰氨基、環己基羰基氨基、環己基甲基羰基氨基、苯甲酰基氨基、苯基羰基氨基等。
“環烷基”指具有三至七個環碳原子的飽和一價環烴基，例如環丙基、環丁基、環己基、4-甲基環己基等。
“環烷基烷基”指基團-RaRb，其中Ra是亞烷基且Rb是如此處所定義的環烷基，例如環己基甲基等。
“二烷基氨基”指基團-NRR’，其中R和R’獨立地代表如此處所定義的烷基、環烷基或環烷基烷基。代表性的實例包括，但不限于二甲基氨基、甲基乙基氨基、二(1-甲基乙基)氨基、(環己基)(甲基)氨基、(環己基)(乙基)氨基、(環己基)(丙基)氨基、(環己基甲基)(甲基)氨基、(環己基甲基)(乙基)氨基等。
“GSK-3β抑制劑”指化合物，當通過在此處生物實施例1中描述的體外GSK-3β分析測量時，其抗GSK-3β的IC50小于100nM，優選小于50nM，最優選小于10nM。優選地，GSK-3β抑制劑是分子量小于1000道爾頓的有機分子。尤其有用的GSK-3β抑制劑是，與其它激酶例如PKC、cdk1、cdk2、cdk4和c-SRC相比而言，對于GSK-3β顯示選擇性的抑制劑。
“鹵素”指氟、氯、溴或碘，優選碘和氯。
“鹵代烷基”指取代有一個或多個相同或不同鹵素原子的烷基，例如-CH2Cl、-CF3、-CH2CF3、-CH2CCl3等。
“雜烷基”指如此處所定義的烷基，其中一個、兩個或三個氫原子獨立地被選自-ORa、-NRbRc和-S(O)nRd(其中n是從0至2的整數)的取代基取代，條件是雜烷基的附著點是通過碳原子，其中Ra是氫、酰基、烷基、環烷基或環烷基烷基；Rb和Rc各自獨立的是氫、酰基、烷基、環烷基或環烷基烷基；和當n是0時，Rd是氫、烷基、環烷基或環烷基烷基，且當n是1或2時，Rd是烷基、環烷基、環烷基烷基、氨基、酰氨基、單烷氨基或二烷氨基。代表性的例子包括，但不限于2-羥乙基、3-羥丙基、2-羥基-1-羥甲基乙基、2，3-二羥基丙基、1-羥甲基乙基、3-羥丁基、2，3-二羥丁基、2-羥基-1-甲基丙基、2-氨基乙基、3-氨基丙基、2-甲基磺酰乙基、氨基磺酰甲基、氨基磺酰乙基、氨基磺酰丙基、甲基氨基磺酰甲基、甲基氨基磺酰乙基、甲基氨基磺酰丙基等。
“羥烷基”指如此處所定義的被一個或多個，優選一個、兩個或三個羥基取代的烷基，條件是同一個碳原子不攜帶超過一個羥基。代表性的例子包括，但不限于2-羥基乙基、2-羥基丙基、3-羥基丙基、1-(羥基甲基)-2-甲基丙基、2-羥基丁基、3-羥基丁基、4-羥基丁基、2，3-二羥基丙基、2-羥基-1-羥基甲基乙基、2，3-二羥基丁基、3，4-二羥基丁基和2-(羥基甲基)-3-羥基丙基，優選2-羥基乙基、2，3-二羥基丙基和1-(羥基甲基)-2-羥基乙基。相應地，當在這里使用時，術語“羥烷基”被用來定義雜烷基的子集。
“雜取代的環烷基”指如此所定義的環烷基，其中在環烷基中一個、兩個或三個氫原子獨立地被選自羥基、烷氧基、氨基、酰氨基、單烷基氨基、二烷基氨基或-S(O)nR(其中n是從0-2的整數)的基團取代，當n是0時，R是羥基、烷基、環烷基或環烷基烷基且當n是1或2時，R是烷基、環烷基、環烷基烷基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基。代表性的例子包括，但不限于2-，3-或4-羥環己基、2-，3-或4-氨基環己基、2-，3-或4-磺酰氨基(sulfonamide)環己基等，優選4-羥基環己基、2-氨基環己基、4-磺酰氨基環己基。
“雜烷基取代的環烷基”指如此處所定義的環烷基，其中環烷基中的一個、兩個或三個氫原子被雜烷基取代，條件是雜烷基通過碳-碳鍵與環烷基相連。代表性的例子包括，但不限于1-羥甲基環戊基、2-羥甲基環己基等。
“雜芳基”指有5-12個環原子的一價單環或二環基團，具有至少一個包含一個、兩個或三個選自N、O或S的環雜原子的芳環，剩余的環原子是C，條件是雜芳基的附著點在芳環上。雜芳環任選地獨立地被一個或多個取代基，優選一個或兩個取代基取代，取代基選自烷基、鹵代烷基、雜烷基、羥基、烷氧基、鹵素、硝基、氰基。更特別的，術語雜芳基包括，但不限于，吡啶基、呋喃基、噻吩基、異噻吩基、噻唑基、異噻唑基、三唑基、咪唑基、異噁唑基、吡咯基、吡唑基、嘧啶基、苯并呋喃基、四氫苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并異噻唑基、苯并三唑基、吲哚基、異吲哚基、苯并噁唑基、喹啉基、四氫喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并異噁唑基或苯并噻吩基和它們的衍生物。
“雜芳烷基”指基團-RaRb，其中Ra是亞烷基且Rb是如此處所定義的雜芳基，例如嘧啶-3-基甲基、咪唑基乙基、嘧啶基乙基、3-(苯并呋喃-2-基)丙基等。
“雜環基”指有5-8個環原子的飽和環基團，其中一或兩個環原子是雜原子選自NR(其中R獨立地是氫、烷基或雜烷基)、O或S(O)n(其中n是0-2的整數)，剩余的環原子是C，其中一個或兩個碳原子可以任選地被羰基基取代。雜環基環可以任選地獨立地被一個、兩個或三個取代基取代，取代基選自烷基、鹵代烷基、雜烷基、鹵素、硝基、氰基、羥基、烷氧基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、-COR(其中R是烷基)。更特別的，術語雜環基包括，但不限于四氫吡喃、2，2-二甲基-1，3-二氧戊環、哌啶子基、N-甲基哌啶-3-基、哌嗪、N-甲基吡咯烷-3-基、3-吡咯烷、嗎啉、硫代嗎啉、硫代嗎啉-1-氧化物、硫代嗎啉-1，1-二氧化物、吡咯啉基、咪唑啉基和它們的衍生物。
“雜烷基取代的雜環基”指如此處所定義的雜環基，其中在雜環基團中一個、兩個或三個氫原子被雜烷基取代，條件是雜烷基通過碳-碳鍵與雜環基基團相連。代表性的例子包括，但不限于4-羥基甲基哌啶-1-基、4-羥基甲基哌嗪-1-基、4-羥基乙基哌啶-1-基、4-羥基乙基哌嗪-1-基等。
“雜環烷基”、“環烷基烷基”或“苯烷基”指基團-RaRb，其中Ra是亞烷基且Rb是如此處所定義的苯基或雜環基或環烷基，例如四氫吡喃-2-基甲基、4-甲基哌嗪-1-基乙基、3-哌啶基甲基、2，2-二甲基-1，3-dioxoxolan-4-基甲基、芐基、環己基甲基等。“單烷基氨基”指基團-NHR，其中R是如此處所定義的烷基、環烷基或環烷基烷基，例如甲基氨基、(1-甲基乙基)氨基、環己基氨基、環己基甲基氨基、環己基乙基氨基等。
“任選的”或“任選地”指隨后描述的事件或狀況可以發生但是不是必須發生，并且此說明包括事件或狀況發生的實例和不發生的實例。例如，“任選地被烷基單-或二取代的雜環基”指烷基可以存在但是不是必須存在，并且此說明包括雜環基被烷基單-二取代的情況和雜環基不被烷基取代的情況。
“苯基烷基”指基團RaRb，其中Ra是亞烷基，且Rb是如此處所定義的苯基，例如芐基等。
“羥基或氨基保護基團”指在合成過程中，為了保護氧和氮原子防止不合需要的反應的那些有機基團。合適的氧和氮原子保護基是本領域公知的，例如三甲基甲硅烷基、二甲基-叔-丁基甲硅烷基、芐基、芐氧基-羰基(CBZ)、叔-丁氧基羰基(Boc)、三氟乙酰基、2-三甲基甲硅烷基乙磺酰基(SES)等。其它在書T.W.Greene和G.M.Wuts，ProtectingGroups in Organic Synthesis，Second Edition，Wiley，New York，1991中可以找到，它們在這里被引用作為參考。
具有相同分子式，但是性質或它們的原子的鍵合順序或它們的原子在空間中的排列不同的化合物稱作“異構體”。在空間中它們的原子的排列不同的異構體稱作“立體異構體”。互相不是鏡像的立體異構體稱作“非對映體”，并且那些互相是非重疊鏡像的立體異構體稱作“對映異構體”。當化合物有不對稱中心時，例如其連接四個不同的基團，一對對映異構體是可能的。對映異構體可以通過它的不對稱中心的絕對構型來表征，并且通過Cahn和Prelog的R-和S-順位規則來描述，或通過分子旋轉偏振光平面的方式來描述，并指定為右旋的或左旋的(即分別為(+)或(-)異構體)。手性化合物可以以單獨的對映異構體或作為它們的混合物存在。包含等比例對映異構體的混合物稱作“外消旋混合物”。
式(I)化合物可以有一個或多個不對稱中心；這種化合物因此可以作為單獨的(R)-或(S)-立體異構體或作為它們的混合物生產。例如，如果式(I)化合物中的R6取代基是2-羥乙基，則連接羥基的碳是不對稱中心并且因此式(I)化合物可以作為(R)-或(S)-對映異構體存在。除非另有說明，說明書和權利要求書中的特定化合物的說明或命名意欲包括單獨的對映異構體和它們的混合物，外消旋物或其它。用于測定立體化學和分離立體異構體的方法是本領域公知的(見discussion inChapter 4 of″Advanced Organic Chemistry″，4th edition J.March，John Wiley and Sons，New York，1992)。
“藥用賦形劑”指在制備藥物組合物中使用的賦形劑，其通常是安全、無毒并且不是有生物活性或其它不合需要的，并且包括獸和人可藥用的賦形劑。當在本說明書和權利要求書中使用時，“藥用賦形劑”包括一種和多于一種這種賦形劑。
“藥用鹽”指可藥用的并且母體化合物具有理想的藥理活性的鹽。這些鹽包括(1)酸加成鹽，與無機酸形成，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸和類似酸；或與有機酸形成，例如醋酸、丙酸、己酸、環戊烷丙酸、羥乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥芐基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、3-苯丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羥基萘酸、水楊酸、硬脂酸、己二烯二酸和類似酸；或(2)當在母體化合物中存在酸性質子時形成的鹽，被金屬離子取代，例如堿金屬離子、堿土金屬離子、或鋁離子；或與有機堿配位，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺和類似有機堿。
式(I)化合物可以作為前藥。前藥指當此前藥被給予哺乳動物患者時，釋放式(I)的活性母體藥物的任何化合物。式(I)化合物的前藥通過修飾在式(I)化合物中存在的功能基團制備，在此方式下修飾基團可以在體內裂解來釋放母體化合物。前藥包括其中化合物(I)中的羥基、氨基或巰基與任何可以在體內裂解來分別再生游離羥基、氨基或巰基的鍵相連的式(I)化合物。前藥的例子包括，但不限于式(I)化合物中羥基官能團的酯(例如醋酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物)、氨基甲酸酯類(例如N，N-二甲氨基-羰基)和類似前藥。
疾病的“治療”包括(1)預防疾病，即使哺乳動物疾病的臨床癥狀不發展，此哺乳動物可能遭受了或易感染疾病，但是不經歷或顯示疾病癥狀。
(2)抑制疾病，即阻止或減少疾病或其臨床癥狀的發展，或(3)緩解疾病，即使疾病或其臨床癥狀消退。
“治療有效量”指當給予哺乳動物來治療疾病時，對于疾病的這種治療是足夠有效的化合物的量。“治療有效量”可以隨化合物，被治療的哺乳動物的疾病和其嚴重性、年齡、體重等變化。
命名法式(I)化合物的名稱和編號在下面說明。

在本申請中使用的命名法通常是基于IUPAC推薦的命名法。因為嚴格按照這些推薦當只有單個取代基變化時會導致名稱完全變化，所以化合物以維持分子基本結構名稱一致性的形式命名。例如，式(I)化合物，其中R1、R2、R4和R5是氫，R3是甲基，R6是2-羥乙基氨基并且在苯環與吡咯-2，5-二酮環相連的碳的間位，命名為3-(1-甲基吲哚基)-4-[3-(2-羥乙基氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮。
式(I)化合物，其中R1、R2、R4和R5是氫，R3是甲基，R6是2-羥乙基氨基并且在苯環與吡咯-2，5-二酮環相連的碳的對位，命名為3-(1-甲基吲哚基)-4-[4-(2-羥乙基氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮。
優選的式(I)化合物選自I.式(I)化合物，其中R1、R2、R4和R5＝氫，R3＝甲基且R6如下所定義
II.本發明進一步優選的化合物是式(I)化合物，其中R1、R2、R4和R5＝氫，R3＝甲基且R6如下所定義
III.進一步優選的式(I)化合物是其中R2、R4和R5＝氫，R1、R3和R6如下所定義的那些
IV.也優選的是其中R1、R2、R4和R5＝氫，R3＝甲基且R6如下所定義的式(I)化合物
V.進一步優選的式(I)化合物是其中R4-R6中只有一個是氫的那些，并且此化合物選自3-(1-甲基-吲哚-3-基)-4-{3-((R)-2，3-二羥基-丙氧基)-2-甲基苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮；3-(1-甲基-吲哚-3-基)-4-{3-((R)-2，3-二羥基-丙氧基)-2-硝基苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮；和3-(1-甲基吲哚-3-基)-4-{5-((R)-2，3-二羥基-丙氧基)-2-硝基苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮。
式(I)化合物按照共同未決美國專利申請序列號09/916,706(2001年7月27日申請)的方法制備，其在這里被引入作為參考。
其它在這里描述的方法中有用的化合物包括N6-{2-[4-(2，4-二氯-苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-嘧啶-2，6-二鹽酸胺，如WO99/65897的描述制備。
尤其優選的是如前面提及的用途或治療方法，其中GSK-3β抑制劑選自a)下式化合物 其中R6是2(R)3-二羥基丙氧基；b)下式化合物 其中R6是2，3-二羥基-丙基氨基；c)下式化合物 其中R1是氟，R3是甲基且R6是3-氨基丙氧基；和d)N6-{2-[4-(2，4-二氯-苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-吡啶-2，6-二氨基。
優選的是GSK-3β抑制劑在制備增加哺乳動物骨生成的藥物中的應用。
進一步優選的是上述應用，其中藥物增加哺乳動物骨礦物質密度。
本發明另一個優選的方面是上述應用，其中藥物減少哺乳動物骨折發生率。
也優選的是上述應用，其中藥物促進哺乳動物骨折愈合。
進一步優選的是上述GSK-3β抑制劑在制備用于預防和治療骨質疏松癥的藥物中的應用。
也優選的是治療或預防哺乳動物骨質疏松癥的方法，通過給予哺乳動物有效量的GSK-3β抑制劑。
尤其優選的是上述應用或方法，其中哺乳動物是人。
極優選的是上述應用或方法，其中哺乳動物是雌性。
優選的是上述應用或方法，其中GSK-3β抑制劑是式(I)代表的化合物或其藥用鹽 其中R1和R2獨立地代表氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基；R3代表氫、烷基、環烷基、雜烷基、-COR7(其中R7是氫或烷基)或苯基，此苯基任選地被一個或兩個獨立地選自氫、烷基、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基和二烷基氨基的基團取代；R4和R5獨立地代表氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基；R6是雜烷基、雜環基、雜環烷基、雜烷基取代的雜環基、雜烷基取代的環烷基、雜取代的環烷基、-OR8、-S(O)nR8(其中n是0-2；且R8是雜烷基、雜芳烷基、雜環基或雜環烷基)、-NR9R10(其中R9是氫或烷基且R10是雜烷基、雜芳烷基、雜取代的環烷基、雜環基或雜環烷基)或-X-(亞烷基)-Y-Z(其中X是共價鍵、-O-、-NH-或-S(O)n1其中n1是0-2且Y是-O-、-NH-或-S-且Z是雜烷基或SiR11R12R13其中R11、R12和R13獨立地是氫或烷基)或者當R6與R4彼此相鄰時，它們一起形成亞甲二氧基或亞乙二氧基。
尤其優選的是上述應用或方法，其中GSK-3β抑制劑選自a)下式化合物 其中R6是2(R)3-二羥基丙氧基；b)下式化合物 其中R6是2，3-二羥基-丙基氨基；c)下式化合物
其中R1是氟、R3是甲基且R6是3-氨基丙氧基；和d)N6-{2-[4-(2，4-二氯-苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-吡啶-2，6-二氨基。
進一步優選的是上面提及的應用或方法，其中GSK-3β抑制劑是口服給藥。
本發明另一個優選的方面是上述應用或方法，其中用GSK-3β治療，然后用抗再吸收劑治療。
也優選的是上述應用或方法，其中GSK-3β抑制劑抗GSK-3β的IC50為低于50nM。
尤其優選的是上述應用或方法，其中GSK-3β抑制劑抗GSK-3β的IC50為低于10nM。
進一步尤其優選的是上述應用或方法，其中GSK-3β抑制劑的分子量為低于1000道爾頓。
效用、試驗和給藥效用申請人出乎意料地發現，具有GSK-3β抑制劑共同特征的多種結構不同的化合物能有效地增加骨生成。因此，在此公開的方法提供用于增加骨礦物質密度、形成新骨、增加骨折愈合率、改善骨機械性質(即形成皮層骨和小梁骨)的治療以及治療骨質疏松癥、醫源性的和老年骨質疏松癥和相關的骨代謝疾病。
利用GSK-3β抑制劑的治療能用來治療I型(絕經后的)、II型(醫源性的)和III型(老年的)骨質疏松癥，包括與皮質類固醇激素治療(例如哮喘)、與化學療法有關的治療，也能用來治療由于腎透析和甲狀腺功能亢進的骨質營養不良。用如在這里描述的GSK-3β抑制劑的治療產生增加的骨礦物質密度，并且與常規的治療不同，提供良好質量的骨。因此，在這里描述的治療會降低骨折發生率并且使先前存在的骨折更快地愈合。這種治療對于患有雌激素減少的患者(例如高齡女性)是特別有用的，她們有骨折率增加的風險。能治療的骨折類型包括外傷性和骨質疏松的骨折，例如臀、股骨的頸、腕、椎骨、脊柱、肋骨、胸骨、喉、氣管、橈骨/尺骨、脛骨、膝蓋骨、鎖骨、骨盆、肱骨、小腿、手指、腳趾、面部和踝骨折。
試驗通過體外試驗可以鑒定抑制GSK-3β的化合物，例如在下面生物實施例1和2中詳細描述的配體結合試驗和β-連環蛋白降解抑制試驗。
給藥和藥物組合物通常，GSK-3β抑制劑可以通過對于用來增加骨生成的藥劑任何可接受的給藥方式以治療有效量給予。抑制劑的實際量取決于多種因素，例如被治療疾病的嚴重性、患者的年齡和相對健康、所使用化合物的效能、給藥途徑和形式以及其它因素。抑制劑可以每天給藥超過一次，優選一天一次或兩次。
GSK-3β抑制劑的治療有效量大約為每天接收者每千克體重1mg-50mg；優選約3mg/kg/天。因此，對于70kg的人給藥，劑量在約70-3500mg/天范圍內，最優選約200mg/天。
通常，GSK-3β抑制劑通過下述途徑中的任何一種作為藥物組合物給藥口服、全身給藥(例如經皮、鼻內或栓劑)、或腸胃外給藥(肌內、靜脈內或皮下)。優選的給藥方式是口服，利用方便的日劑量服法，其可以按照痛苦的程度調整。組合物可以是片劑、丸劑、膠囊、半固體、粉劑、緩釋劑、溶液劑、混懸劑、酏劑、氣霧劑或任何其它合適的組合物。
本發明的相關的方面涉及增加骨生成的GSK-3β抑制劑與其它活性試劑例如二膦酸鹽、雌激素、SERMS(選擇性雌激素受體調制劑)、降鈣素或合成代謝療法的聯合療法。二膦酸鹽的例子包括阿侖膦酸，伊班膦酸鹽，帕米膦酸鹽，依替膦酸鹽和利塞膦酸鹽。SERMS的例子包括雷洛昔芬、二羥基雷洛昔芬和拉索昔芬。降鈣素包括人和鮭魚降鈣素。合成代謝劑包括甲狀旁腺激素(PTH)例如hPTH(1-34)、PTH(1-84)和與甲狀旁腺激素相關的蛋白質(PTHrP)和它們的類似物。PTHrP的具體的類似物在″Mono-and Bicyclic Analogs of Parathyroid Hormone-Related Protein.1.Synthesis and Biological Studies，″Michael Chorev等Biochemistry，363293-3299(1997)和″Cyclic analogs of PTH andPTHrP，″WO 96/40193和U.S.專利5,589,452和WO 97/07815中有描述。其它活性劑可以同時地、在GSK-3β之前或之后給藥，且可以通過不同的輸送方法給藥。優選地，GSK-3β抑制劑首先給藥。這一給藥時期可以是任何長度，但是典型地在6-24個月范圍內。然后在這一治療后用抗再吸收劑治療，例如二膦酸鹽、SERM、降鈣素或激素替代療法。
近來，已經研發了藥物制劑，特別是用于顯示較差生物利用度的藥物，基于此規則，通過增加表面積，即減少顆粒尺寸可以增加生物利用度。例如，美國專利4,107,288描述了顆粒尺寸在10-1,000nm范圍內的藥物制劑，其中活性物質由大分子的交聯基質承載。美國專利5,145,684描述了藥物制劑的生產，其中在表面改性劑的存在下將藥物研磨成納米顆粒(平均顆粒大小400nm)，然后將其分散在液體介質中以得到顯示極高生物利用度的藥物制劑。
GSK-3β抑制劑的藥物組合物通常包含至少一種藥用賦形劑。可接受的賦形劑是無毒的、輔助給藥并且對于抑制劑的治療益處無不利影響。這種賦形劑可以是任何固體、液體、半固體，或者當是氣霧劑組合物時是本領域技術人員通常可得到的氣體賦形劑。
固體藥物賦形劑包括淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、氯化鈉、干燥的脫脂乳或類似物。液體和半固體賦形劑可以選自甘油、丙二醇、水、乙醇和各種油，包括石油、動物油、植物油或合成油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。優選的液體載體，尤其是注射用溶液，包括水、鹽水、水性葡萄糖和乙二醇。
Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin編著(Mack PublishingCompany，18th ed.，1990)。
制劑中化合物的量可以在本領域技術人員使用的整個范圍內變化。典型地，制劑包含，基于重量百分比(wt％)，基于制劑總量約0.01-99.99wt％的GSK-3β，其余是一種或多種適宜的藥用賦形劑。優選地，化合物以約1-80wt％的水平存在。
實施例給出下面的制備和實施例以使得本領域技術人員能更清楚的理解和實施本發明。它們不應該被認為是限制本發明的范圍，而僅僅是作為說明性的和代表性的例子。
在實施例中使用的縮寫詞如下所定義“HCl”指鹽酸、“DMF”指二甲基甲酰胺、“NaOH”指氫氧化鈉、“KOH”指氫氧化鉀、“DMSO”指二甲亞砜、“NaHCO3”指碳酸氫鈉、“NaCl”指氯化鈉、“K2CO3”指碳酸鉀、“NaCO3”指碳酸鈉、“LiOH”指氫氧化鋰、“Et3N”指三乙胺、“NH3(水)”指氫氧化銨、“CH2Cl2”指二氯甲烷、“MeOH”指甲醇、“Ph3P”指三苯基膦、“CsCO3”指碳酸銫、“BINAP”指2，2-雙-(二苯基膦)-1，1’-聯萘、“Pd2(dba)3”指三(聯苯亞甲基丙酮)-二鈀、“NaCNBH3”指氰基氫硼化物、“THF”指四氫呋喃、“Na2SO4”指硫酸鈉、“RT”指室溫、“PTLC”指預備的薄層色譜、“SiO2”指硅膠、“EtOAc”指乙酸乙酯、“APMA”指氨基苯基-醋酸汞、“IL-1”指白介素-1和“RPMI”指RoswellPark Memorial Institute。
合成實施例實施例1-3顯示制備式(I)的特定化合物的方法實施例1合成3-(1-甲基吲哚-3-基)-4-[3-(3-叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基丙基氨基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮 步驟1將四丙基過釕酸銨(0.18g，5.3mmol)加入到包含3-(叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基)-丙醇(2g，0.01mmol)、N-甲基嗎啉N-氧化物(1.76g)和4的分子篩的二氯甲烷(20mL)和乙腈(2mL)混合物中。將反應混合物在RT攪拌過夜，然后過濾通過硅膠墊。將濾過液在真空下濃縮以提供3-(叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基)-丙醛(1.3g，66％)。
步驟2將在CH2Cl2(10mL)和MeOH(5mL)中的3-(1-甲基吲哚-3-基)-4-(3-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮(0.2g，6mmol)和3-(叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基)丙醛(0.25g，13mmol)在室溫攪拌15分鐘，然后加入NaCNBH3(57mg，1.5eq)。將反應混合物在RT攪拌過夜，然后在真空下濃縮。通過預備的TLC純化殘留物，得到98mg 3-(1-甲基吲哚-3-基)-4-[3-(3-叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基丙基氨基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮(32％)MS(LSIMS)(M+H)+490，MP58-65℃。
按照上面實施例1中的描述進行，但是用2-(叔-丁基二苯基甲硅烷基氧基)乙醇代替3-(叔-丁基二甲基甲硅烷基氧基)丙醇，得到3-(1-甲基吲哚-3-基)-4-[3-(3-叔-丁基二苯基甲硅烷基氧基-乙基氨基)苯基]-1H-吡咯-2，5-二酮。
實施例2合成3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-{3-[(RS)-2，3-二羥基丙基氨基]苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮 步驟1向在干DMF(40mL)中的5-氯吲哚(4.97g)的室溫溶液中加入氫氧化鉀小球(2.76g)并攪拌1h，直到大部分固體溶解。將得到的混合物在冰浴中冷卻至0℃，并滴加吲哚甲烷(2.45mL)，稍后在氬氣下在室溫攪拌過夜。將反應混合物倒入水中，并用ETOAc提取兩次。使結合的ETOAc部分結合，用水洗滌，通過硫酸鎂干燥，濃縮并用10％ETOAc/己烷快速色譜分離，得到1-甲基-5-氯吲哚，是粉紅色液體(5.43g)。
步驟2如實施例1步驟1中的描述制備1-甲基-5-氯吲哚-3-乙醛酰氯，但是用1-甲基-5-氯吲哚替換1-甲基吲哚。
步驟3如實施例1步驟2中的描述制備3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)呋喃-2，5-二酮，但是用1-甲基-5-氯吲哚-3-乙醛酰氯替代1-甲基吲哚-3-乙醛酰氯。
步驟4如實施例1步驟3中的描述制備3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮，但是用3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)呋喃-2，5-二酮替代3-(1-甲基吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)呋喃-2，5-二酮。
步驟5將3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮(865mg)、10％.碳載鈀(90mg)和冰冷的HOAc(35mL)混合物攪拌并利用球形瓶在大氣壓下氫化(2h)。將反應混合物過濾通過硅藻土墊，冷卻至0℃并加入KOH小球直到PH8。用ETOAc提取溶液，干燥(硫酸鎂)并剝離。將粗產物用10％-20％的ETOAc-己烷快速色譜分離得到3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮(495mg)。
步驟6向在甲醇(250mL)中的3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮(492mg)的室溫溶液中加入溶解在水中的DL-甘油醛二聚物(15mL)，然后加入氰基氫硼化鈉(110mg)，并在氬氣下將反應混合物攪拌過夜。通過TLC反應似乎只完成了30％。加入另外的二聚物(150mg)和氰基氫硼化鈉(100mg)。在另一個6小時后，反應似乎完成了50％。移去溶液，并將粗殘留物用5％-7％-10％的MeOH/二氯甲烷快速色譜分離。獲得3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-{3-[(RS)-2，3-二羥基丙基氨基]苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮，呈黑紅色固體(220mg)。MS(EI)(M+H)+426。M.pt.224.8-226.1℃。
實施例3合成3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-{3-[(RS)-2，3-二羥基-丙基氨基]苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮 步驟1如實施例2步驟1中的描述制備1-甲基-5-氟吲哚，但是用5-氟吲哚替代5-氯吲哚。
步驟2如實施例2步驟2中的描述制備1-甲基-5-氟吲哚-3-乙醛酰氯，但是用1-甲基-5-氟吲哚替代1-甲基-氯吲哚。
步驟3如實施例2步驟3中的描述制備3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)呋喃-2，5-二酮，但是用1-甲基-5-氟吲哚-3-乙醛酰氯替代1-甲基-5-氯吲哚-3-乙醛酰氯。
步驟4如實施例2步驟3中的描述制備3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮，但是用3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)呋喃-2，5-二酮替代3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)呋喃-2，5-二酮。
步驟5如實施例2步驟5中的描述制備3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-(3-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮，但是用3-(1-3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮替代1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮。
步驟6如實施例2步驟5中的描述制備3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-{3-[((RS)-2，3-二羥基丙基氨基]苯基}-1H-吡咯-2，5-二酮，但是用3-(1-甲基-5-氟吲哚-3-基)-4-(3-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮替代3-(1-甲基-5-氯吲哚-3-基)-4-(3-氨基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮。MS(EI)(M+H)+410，MP223.2°-225°。
制劑實施例下面是包含式(I)化合物的代表性的藥物制劑。
實施例1片劑制劑將下述成分密切混合并壓制成有單獨劃痕的片劑。
每種成分的量 片劑，mg本發明的化合物400玉米淀粉 50交聯羧甲基纖維素鈉25乳糖 120硬脂酸鎂 5實施例2膠囊制劑將下述成分密切混合并裝入硬殼明膠膠囊。
每種成分的量 膠囊，mg本發明的化合物200乳糖，噴霧干燥148硬脂酸鎂 2實施例3混懸制劑將下面組分混合以形成適于口服給藥的混懸劑成分 量本發明的化合物1.0g
富馬酸0.5g氯化鈉2.0g羥苯甲酸甲酯 0.15g羥苯甲酸丙酯 0.05g粒狀糖25.0g山梨醇(70％溶液) 13.00g硅酸鎂鋁K(Vanderbilt Co.) 1.0g調味劑0.035mL著色劑0.5mg蒸餾水適量至100mL實施例4注射用制劑混合下述組分以形成注射用制劑。
成分 量本發明的化合物0.2mg-20mg醋酸鈉緩沖溶液，0.4M 2.0mLHCl(1N)或NaOH(1N) 適量至合適的PH水(蒸餾的，無菌的)適量至20mL實施例5栓劑制劑通過將本發明的混合物與WitepsolH-15(飽和植物脂肪酸的甘油三酸酯；Riches-Nelson，Inc.，紐約)混合制備總重量為2.5g的栓劑，并具有下列組成本發明的化合物500mgWitepsolH-15 余量生物實施例實施例1
抑制糖原合成激酶-3β-體外試驗用重組兔GSK-3β酶的截短形式測定本發明化合物的體外GSK-3β抑制活性。
分離GSK-3β按照在Wang，Q.M.等，J.Biol.Chem.269，14566-14574(1994)中描述的步驟在pGEX-3X載體中克隆構建體。缺失N-端的十個氨基酸以獲得組成活性的GSK-3β(見Murai H.等，FEBS Lett.392，153-60，(1996))。GSK-3β在BL21 DE3細胞中表達。使細胞在37℃生長直到它們到達對數中期，并且然后用異丙基-β-(D)-硫代吡喃半乳糖苷(最終濃度0.4mM)在30℃誘導2h。均化細胞并將細胞提取物上樣至谷胱甘肽瓊脂糖4B柱。將GSK-3β用谷胱甘肽緩沖液(50mM Tris pH8和10mM還原型谷胱甘肽)洗脫。在3分鐘級分中收集洗脫液并在10％SDS PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)上分析GSK-3β含量。合并20％峰高以上部分，等分并儲存在-80℃直至使用。
抑制GSK-3β在96孔聚丙烯板中的50μl反應液中進行GSK-3β結合試驗，每一反應液包含20mM氯化鎂、40μM ATP、2mM DTT、88.5μM生物素化的和磷酰化的CREB-肽底物(biotin-KRREILSRRPS(PO4)YR-OH，見Wang，Q.M.等，J.Biol.Chem.269，14566-14574(1994))、[γ-32P]ATP(1μCi)和2μl在DMSO(不同濃度)中的本發明化合物。加入15μl GSK-3β(不同濃度)并將反應混合物在30℃溫育1h。通過轉移25μl反應混合物至包含130μl 1.85％磷酸的磷酸纖維素板來停止反應。在真空下用1.85％的磷酸洗去膜中的游離放射核苷酸(5次)。在最后一次洗滌后，將板轉移至接收器(adoptor)板，并向將50μl閃光混合物(cocktail)(Microscint-20，Packard，cat.#20-133)加入到每個孔中，并且在頂部計數器中計算放射性的量。
在這一試驗中，本發明的化合物是有活性的。
在表I-IV中公開本發明的某些化合物的GSK-3β抑制活性(表示為IC50，引起對照中活性50％的抑制的抑制劑濃度)低于2μm。某些具體化合物的活性在下面給出
實施例2抑制β-連環蛋白降解-體外試驗在用本發明的化合物治療后，如下利用ELISA通過測量JurkatT-細胞中的β-連環蛋白水平來測定本發明化合物基于細胞的GSK-3β活性。
將Jurkat細胞(5×105細胞/mL)放置在6孔板中(6mL/孔)，然后用不同濃度的本發明化合物(優選1nM-10μM)處理24h。在溫育末期，收集細胞并用PBS洗滌一次。然后將細胞混懸在0.3mL放射免疫沉淀分析裂解(RIPA)緩沖液(Boehringer Mannheim，cat.#1 920 693)中。在3個冷凍-融化周期后，在15,000rpm離心細胞提取物10分鐘。收集上清液并如下描述利用ELISA分析進行分析。
將96微孔板用稀釋于包被緩沖液(0.1M NaHCO3，pH 9.5)中的俘獲抗體(小鼠單克隆抗-β-連環蛋白，Zymed La.，cat.#13-8400，100μl/孔，包含250ng抗體)包被過夜。抽吸孔并用300μl洗滌緩沖液(包含0.05％土溫20的PBS)洗滌3次并用200μl分析緩沖液(PBS，10％RBS，pH 7；PharMingen)封閉，然后在室溫溫育至少72h。將孔按上面所述再次洗滌。將100μl Jurkat細胞上清液和各種濃度的β-連環蛋白標準(Behrens等Nature，Vol.382，p638(1996))加入到孔中，并在室溫溫育2h。在溫育后，洗滌孔并將100μl稀釋在試驗稀釋劑(1∶1250)中的抗-β-連環蛋白抗體(Santa Cruz，β-連環蛋白H-102，sc-7199，兔IgG)加入到每個孔中，并將細胞在室溫溫育2h。在洗滌后，將100μl稀釋在試驗稀釋劑中的工作檢測器(Sigma B5283，小鼠單克隆抗-兔IgG-生物素)加入到每一孔中，并在室溫溫育1h。3，3’，5，5’-四甲聯苯胺(PharMingen，Cat.#2642KK)被用來顯色。通過將50μl停止溶液(2N H2SO4)加入到每一孔中來停止反應。在停止反應30分鐘內用ELISA板讀出器在570nm處讀板。
通過將化合物濃度對β-連環蛋白水平度作圖來計算GSK-3β抑制的水平。結果顯示在

圖1中，確證了本發明化合物對β-連環蛋白濃度的影響。
實施例3研究用化合物II-3治療的大鼠中的GSK8-骨生成使用卵清蛋白敏化的Brown-Norway大鼠。將它們用在0.2ml明礬中的100μg OA(卵清蛋白)i.p.敏化，每星期一次，共三星期(第0、7和14天)。在最終敏化后7天(第21天)，用1％的OA攻擊大鼠45分鐘并在72小時后對其實施無痛致死術(第24天)。通過口服管飼法在第6-8天和第13-23天每天給藥兩次化合物II-3。化合物被制備成脂質體制劑-8mg/ml脂質體溶液，1.44g化合物和54克L-α-磷脂酰膽堿的脂質體組合物在160ml無菌水中來注射。
將股骨標本在10％甲酸中脫鈣，埋置在石蠟中，做5微米厚的切片，并用蘇木精和曙紅染色。當用光學顯微鏡檢查時，在股骨的生長板下，動物骨松質有適度的增長。
實施例4研究用化合物II-9治療大鼠的MT021骨生成將化合物制成在10％w/v Solutol.中的溶液。通過口服管飼法對雄性Wistar大鼠給藥，每天一次以25、75或150mg/kg/天的劑量給藥14天，并與載體對照(10％Solutol，10ml/kg/天)相比。做完全驗尸，并將組織保存在10％的福爾馬林中。加工股骨、胸骨和vertabra并按照實施例3中的描述進行試驗和分析。在所有組中觀察到了骨松質增長-在25mg/kg組中只有一只動物。150mg/kg組6只中的5只新骨生成增加，更加增強和活性效應。
實施例5大鼠中的骨合成代謝在骨質稀少的大鼠模型中，試驗兩種結構不同的GSK-3β抑制劑III-2和N6-{2-[4-(2，4-二氯-苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-吡啶-2，6-二胺(化合物X)的骨合成代謝活性。將三個月大的大鼠切除卵巢(Ovx)并給予牛甲狀旁腺激素(氨基酸1-34)(表中的bPTH)或本發明化合物中的一種，一天一次，通過口給藥，開始于卵巢切除后至少4星期并且持續至每天治療3星期后最終死亡。對照組，假的(未切除卵巢的大鼠)和Ovx，每天給載體。牛甲狀旁腺激素(bPTH)在40μg/kg(最佳劑量)試驗作為合成代謝活性的內部陽性對照。也在完整假動物中試驗III-2作用。在治療開始后2-3星期收集血和尿樣本并測定血清和尿中鈣的量。
利用QDR-4500W骨光密度計TM(Hologic，Waltham，MA)上的HighResolution Software測定右股骨的骨礦物質密度。通過將動物以仰臥位置放置在有機玻璃塊上掃描，這樣右腿與主體垂直并且脛骨與股骨垂直。化合物引起的骨礦物質密度增長和尿和血清中鈣量的增長在下面的表中給出。在與血鈣過多或高鈣尿無關的劑量觀察化合物的功效。在脛骨中觀察到了相似的結果。
下表中顯示在實施例3-5中使用的GSK-3β抑制劑和它們在生物實施例1的GSK-3β分析中的IC50。
化合物編號 結構 IC50(nM)III-2 0.7II-33.2R6是2(R)3-二羥基丙氧基
II-9 1.5化合物X 1.7為了清楚和理解的目的，通過舉例說明和實施例的方式詳細地描述了前述發明。在后附的權利要求范圍內可進行改變和修飾對于本領域技術人員是顯而易見的。因此，應該理解上述說明是為了說明而不是限制。本發明的范圍，因此不應該參考上述說明確定，而是應該參考下述后附的權利要求以及與這些權利要求授權的同等的完整范圍確定。
在這一申請中所有引用的專利、專利申請和出版物因此為了所有目的被完整地引入作為參考，引用的程度是似乎每一個單獨的專利、專利申請或出版物是這樣單獨地表示的。
權利要求
1.GSK-3β抑制劑在制備用于增加哺乳動物骨生成的藥物中的應用。
2.權利要求1的應用，其中所述藥物增加哺乳動物骨礦物質密度。
3.權利要求1或2的應用，其中所述藥物減少哺乳動物骨折發生率。
4.權利要求1-3中任一項的應用，其中所述藥物促進哺乳動物骨折愈合。
5.GSK-3β抑制劑在制備用于預防和治療哺乳動物骨質疏松癥的藥物中的應用。
6.治療或預防哺乳動物骨質疏松癥的方法，其通過給予哺乳動物有效量的GSK-3β抑制劑。
7.權利要求1-6中任一項的應用或方法，其中所述哺乳動物是人。
8.權利要求1-7中任一項的應用或方法，其中所述哺乳動物是雌性。
9.權利要求1-8中任一項的應用或方法，其中所述GSK-3β是式(I)代表的化合物或其藥用鹽 其中R1和R2獨立地代表氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基；R3代表氫、烷基、環烷基、雜烷基、-COR7(其中R7是氫或烷基)或苯基，此苯基任選地被一個或兩個獨立地選自氫、烷基、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基的取代基取代；R4和R5獨立地表示氫、烷基、鹵素、鹵代烷基、烷硫基、羥基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、單烷基氨基或二烷基氨基；R6是雜烷基、雜環基、雜環烷基、雜烷基取代的雜環基、雜烷基取代的環烷基、雜取代的環烷基、-OR8、-S(O)nR8(其中n是0-2；且R8是雜烷基、雜芳烷基、雜環基或雜環烷基)、-NR9R10(其中R9是氫或烷基且R10是雜烷基、雜芳烷基、雜取代的環烷基、雜環基或雜環烷基)或-X-(亞烷基)-Y-Z(其中X是共價鍵、-O-、-NH-或-S(O)n1其中n1是0-2且Y是-O-、-NH-或-S-且Z是雜烷基或SiR11R12R13其中R11、R12和R13獨立地是氫或烷基)或者當R6與R4彼此相鄰時，它們一起形成亞甲二氧基或亞乙二氧基；或它們的藥用鹽。
10.權利要求1-9中任一項的應用或方法，其中所述GSK-3β抑制劑選自a)下式化合物 其中R6是2(R)3-二羥基丙氧基；b)下式化合物 其中R6是2，3-二羥基-丙基氨基；c)下式化合物 其中R1是氟、R3是甲基且R6是3-氨基丙氧基；和d)N6-{2-[4-(2，4-二氯-苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-乙基}-3-硝基-吡啶-2，6-二胺。
11.權利要求1-10中任一項的應用或方法，其中所述GSK-3β抑制劑是通過口服給藥。
12.權利要求1-11中任一項的應用或方法，其中用所述GSK-3β抑制劑治療，然后用抗再吸收劑治療。
13.權利要求1-12中任一項的應用或方法，其中所述GSK-3β抑制劑抗GSK-3β的IC50值為低于50nM。
14.權利要求1-13中任一項的應用或方法，其中所述GSK-3β抑制劑抗GSK-3β的IC50值為低于10nM。
15.權利要求1-14中任一項的應用或方法，其中所述GSK-3β抑制劑的分子量為低于1000道爾頓。
16.在上文中描述的發明。
全文摘要
本發明涉及糖原合成酶激酶－3β增加骨生成的應用。
文檔編號A61K31/405GK1703207SQ03802126
公開日2005年11月30日 申請日期2003年1月7日 優先權日2002年1月10日
發明者P·A·戴-洛利尼, 龔樂一 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司