一種短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療hiv感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一種短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療hiv感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種短棒狀桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，尤其涉及在制備治療HIV感染或愛滋病(AIDS)藥劑中的應(yīng)用，屬于藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
愛滋病即獲得性免疫缺陷綜合癥(acquied immunodeficiencysyndrome，AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的一種嚴(yán)重傳染病。病毒特異性地侵犯并損耗淋巴細(xì)胞分化群4+T淋巴細(xì)胞(cluster of differentiation 4+T cell)，即CD4+T細(xì)胞，又稱T4細(xì)胞，造成機(jī)體細(xì)胞免疫受損。臨床上初始表現(xiàn)為無癥狀病毒攜帶者，繼續(xù)發(fā)展為持續(xù)性全身淋巴結(jié)腫大綜合癥(persistent generalized lymphadenopathy，PGL)和愛滋病相關(guān)復(fù)合癥(AIDS related complex，ARC)，出現(xiàn)發(fā)熱、倦怠、盜汗、消瘦、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、全身淋巴腫大、鵝口瘡、口唇皰疹及帶狀皰疹等，最后并發(fā)各種嚴(yán)重機(jī)會性感染和惡性腫瘤，成為愛滋病(AIDS)。因目前尚無特效療法，病死率極高，故被稱為“20世紀(jì)的瘟疫”。
愛滋病是一種全球性的傳染病，預(yù)防和控制這種疾病已成為一個需要各國認(rèn)真對待的“全球性政治問題”。據(jù)聯(lián)合國愛滋病規(guī)劃署資料，截止到目前全球已有6000萬人感染了愛滋病病毒，其中2000萬人已被愛滋病奪去生命。目前，全球有4000萬感染者，其中90％在發(fā)展中國家，如不加強(qiáng)預(yù)防措施，到2020年，全球愛滋病還將奪走6800萬人的生命。同時據(jù)報道，目前中國實(shí)際愛滋病病毒感染人數(shù)已超過100萬人，如不加以有效控制，到2010年將超過1000萬人。愛滋病已經(jīng)成為全世界第四大死亡原因。
愛滋病的診斷標(biāo)準(zhǔn)國際上常用的有美國疾病控制中心(CDC)Walter Reed的分類。最主要的條件是卡波氏肉瘤和機(jī)會性感染。實(shí)驗室診斷為CD4細(xì)胞下降和愛滋病病毒抗體陽性。1993年美國CDC修訂的HIV感染分類及AIDS診斷標(biāo)準(zhǔn)中，將CD4水平和臨床癥候綜合考慮在內(nèi)，新分類的重要變化是可根據(jù)CD4計數(shù)＜200/μL確定患有艾滋病。
愛滋病病毒(HIV)是單鏈RNA病毒，可在體外淋巴細(xì)胞系中培養(yǎng)，屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬，分兩個型，即HIV-1型和HIV-2型，HIV-1型選擇性侵犯CD4+T淋巴細(xì)胞，也能感染單核巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及骨髓干細(xì)胞，是引起愛滋病的主要毒株；HIV-2型的毒力不如HIV-1型強(qiáng)。HIV-1型和HIV-2型兩者均能引起AIDS，但一般所指的AIDS為HIV-1型所致。
人是愛滋病的傳染源，無癥狀HIV感染者及愛滋病患者均具有傳染性。已發(fā)現(xiàn)病毒存在于血液、唾液、淚水、乳汁、精子及陰道分泌物中，提示能造成傳播，汗液中尚未能檢出HIV。
愛滋病的傳染途徑為性接觸傳播、注射傳播、血源傳播和母嬰傳播等。發(fā)病年齡主要為40歲以下的青壯年。
HIV對CD4+T淋巴細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等)有特殊的親嗜性。據(jù)目前的研究，愛滋病的發(fā)病與HIV含量、毒力、變異及CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量、功能和機(jī)體免疫狀況有關(guān)。
1、HIV侵入及復(fù)制過程 HIV侵入人體后，在輔助受體(趨化因子受體)CCR5、CXCR4等的協(xié)同作用下，病毒表面gp120與CD4+T淋巴細(xì)胞的CD4分子特異受體結(jié)合，借助于gp41脫去衣殼后，病毒核心蛋白及RNA進(jìn)入細(xì)胞漿，兩條病毒RNA鏈在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，然后以此DNA為模板在DNA多聚酶作用下復(fù)制DNA，部分存留在胞漿內(nèi)，部分與宿主細(xì)胞的DNA整合，成為潛伏狀態(tài)的前病毒DNA(proviral DNA)。Proviral DNA可被某種因素所激活，復(fù)制、轉(zhuǎn)錄成病毒RNA和mRNA，翻譯病毒蛋白，裝配成新病毒，以芽生方式釋出，再感染其他細(xì)胞。
2、CD4+T淋巴細(xì)胞受損傷的方式和表現(xiàn)(1)直接損傷HIV在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞溶解或破裂。
(2)間接損傷又稱融合性損傷，愛感染的CD4+T淋巴細(xì)胞HIV-env基因高度編碼gp120和gp41，使受染的細(xì)胞表面有g(shù)p120表達(dá)，可與鄰近未受感染的CD4+T淋巴細(xì)胞結(jié)合，形成融合細(xì)胞，使細(xì)胞膜通透性改變，細(xì)胞發(fā)生溶解破壞。
(3)骨髓干細(xì)胞受損HIV可以感染破壞干細(xì)胞，使CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生減少。
(4)免疫損傷血液中游離的gp120可以與CD4+T淋巴細(xì)胞結(jié)合，使之成為靶細(xì)胞而被免疫細(xì)胞損傷，使其數(shù)量減少。
CD4+T還表現(xiàn)功能異常，主要表現(xiàn)在識別功能障礙，淋巴因子產(chǎn)生減少，白細(xì)胞介素受體表達(dá)減少，對同種異型抗原的反應(yīng)性減低，對B細(xì)胞的輔助功能減低等。
3、HIV對其他細(xì)胞的影響 HIV可導(dǎo)致單核-巨噬細(xì)胞受損和功能異常，單核-巨噬細(xì)胞表面有CD4分子和輔助受體CCR5、CXCR4分子等，因此HIV可以感染單核-巨噬細(xì)胞，使之成為病毒的儲存場所，并在病毒的擴(kuò)散中起重要作用，攜帶病毒通過血-腦屏障，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。
HIV可以感染并破壞骨髓的單核-巨噬干細(xì)胞系統(tǒng)。巨噬細(xì)胞具有抗HIV感染所致的細(xì)胞病變作用，但隨著病毒不斷復(fù)制，巨噬細(xì)胞功能出現(xiàn)異常，處理抗原的能力減弱，使機(jī)體對抗HIV感染和其他病原體感染的能力降低。
4、B淋巴細(xì)胞受損和功能異常 B淋巴細(xì)胞有低水平CD4分子的表達(dá)，但還不能確定是否有CCR5、CXCR4等輔助受體的存在，因此HIV是否能直接攻擊B細(xì)胞尚有爭論，但HIV感染者B細(xì)胞功能異常是肯定的。隨著CD4+T淋巴細(xì)胞的功能異常，B細(xì)胞的數(shù)量及功能也發(fā)生改變。在HIV感染早期，由于病毒和病毒蛋白的刺激，多克隆B細(xì)胞激活，外周血B淋巴細(xì)胞增多，循環(huán)免疫復(fù)合物出現(xiàn)，IgG、IgA水平增高。隨著病情的進(jìn)展，B淋巴細(xì)胞功能異常，對新抗原刺激的反應(yīng)性降低，并可出現(xiàn)自身免疫現(xiàn)象。
5、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)損傷的異常表現(xiàn) NK細(xì)胞具有免疫監(jiān)督功能，有抗感染和抗腫瘤的作用，HIV感染者和AIDS病人NK細(xì)胞計數(shù)雖然正常，但功能缺陷，失去監(jiān)督對抗感染和抗腫瘤細(xì)胞的功能。
6、機(jī)體免疫系統(tǒng)崩潰 感染初期，機(jī)體對HIV產(chǎn)生了極好的免疫反應(yīng)，血清中HIV被抑制或被清除，CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制呈相對靜止?fàn)顟B(tài)，因此沒有造成機(jī)體的免疫功能損傷和耗竭，并在血清抗-HIV轉(zhuǎn)陽后仍保持長期的無癥狀期。但在感染過程中，HIV基因不斷產(chǎn)生變異，抗原和毒力也不斷變異，抗原變異能使HIV逃避機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫的攻擊，毒力變異可影響疾病的進(jìn)程和嚴(yán)重性。致使不斷產(chǎn)生復(fù)制快、毒力強(qiáng)的新變異株，使CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，免疫功能受到損害，最后CD4+T淋巴細(xì)胞迅速減少及耗竭，導(dǎo)致整個免疫系統(tǒng)崩潰，使感染者在2-10年時間內(nèi)從無癥狀期發(fā)展至AIDS。
由于目前尚未發(fā)現(xiàn)抗HIV的特效藥物，因而強(qiáng)調(diào)綜合治療，包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及控制機(jī)會性感染的治療等。愛滋病的臨床治療多針對病毒生活周期中的某一特殊階段，通過干擾HIV RNA的復(fù)制、抑制起關(guān)鍵作用的酶或調(diào)節(jié)因子的活性、破壞病毒顆粒的裝配過程和感染細(xì)胞的能力來達(dá)到治療的目的。
常用的抗病毒藥物有(1)齊夫多定(疊氮脫氧胸苷，zidovudine，AZT)是目前療效較好的、已廣泛用于臨床的第一線抗HIV藥。其通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶而阻止愛滋病病毒復(fù)制，可使CD4+細(xì)胞增加，改善免疫功能及臨床癥狀，還能使短期進(jìn)展成愛滋病的病例減少。主要毒性作用是骨髓抑制，其他副作用有肌炎、頭痛、惡心、嘔吐等。(2)雙脫氧胞苷(ddC)及雙脫氧肌苷(ddI)是目前用于臨床的第二線抗HIV藥。優(yōu)點(diǎn)是無AZT的骨髓抑制作用，能有效抑制病毒P24抗原，并使輔助性T細(xì)胞絕對計數(shù)增加，臨床表現(xiàn)改善，體重增加等，副作用為周圍神經(jīng)炎及胰腺炎等，但這里副作用與劑量有關(guān)。(3)膦甲酸鈉(foscarnet sodium)通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性而達(dá)到阻止HIV復(fù)制的目的。其副作用是惡心、頭痛、乏力、貧血及血肌酐升高等。(4)α-干擾素(α-interferon)具有抗逆轉(zhuǎn)錄酶、抑制HIV復(fù)制及減少病毒抗原產(chǎn)生等活性。常見副作用有發(fā)熱、乏力、流感樣綜合癥、白細(xì)胞減少及血小板減少等，可與其他抗病毒藥如AZT等聯(lián)合應(yīng)用。(5)阿昔洛韋(acyclovir)能抑制多種病毒包括HIV的復(fù)制，副作用有發(fā)熱、乏力、局部刺激等，偶見腎損害。
愛滋病毒受體阻斷劑如重組可溶性CD4+制備物(rsCD4)能防止HIV與CD4細(xì)胞結(jié)合，還能阻止HIV感染的細(xì)胞與未感染的CD4+細(xì)胞的融合，從而阻斷病毒在細(xì)胞間的擴(kuò)散。
免疫調(diào)節(jié)治療可增強(qiáng)HIV感染者的免疫功能，常用的有(1)胸腺素(thymosin)細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑，適用于免疫缺陷及免疫功能失調(diào)所致的病毒性及腫瘤性疾病，副作用少而輕，偶見一過性頭暈、胸悶等。(2)香菇多糖(lentinan)能興奮體液及細(xì)胞免疫，具有廣泛的藥理活性，無明顯毒副作用。(3)白介素-2(IL-2)能增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞(NK)的活性，及抑制病毒DNA聚合酶活性的作用，具有興奮細(xì)胞免疫和抗病毒作用，副作用有發(fā)熱、寒戰(zhàn)、厭食及疲勞感。
上述藥物盡管在體內(nèi)應(yīng)用或體外試驗均顯示一定的抗病毒作用，能延長患者的生存期，但效果有限，藥物的毒性如骨髓抑制和抗藥病毒株的不斷出現(xiàn)等因素仍限制了這些藥物的長期大劑量使用，所以目前強(qiáng)調(diào)聯(lián)合治療，適當(dāng)?shù)穆?lián)合用藥可望降低每種藥物的用量和降低抗藥株產(chǎn)生的頻率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種短棒狀桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)在制藥中的新應(yīng)用，即在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用，所述短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)甲醛滅活后制成的制劑，所述NCP為納米級、顆粒大小均一、吸收度及擴(kuò)散度提高，低熱原、無甲醛殘留，與全菌體制劑具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，可減少CPP的發(fā)燒、胸痛，注射局部紅腫、硬結(jié)，肝腎毒性等副作用；短棒狀桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)作為一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，均具有明顯的抗小鼠逆轉(zhuǎn)錄白血病病毒的作用，可用于HIV感染或愛滋病的治療或輔助治療。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種短棒狀桿菌制劑在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用。
一種無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的短棒狀桿菌制劑(CPP，2000版《中國生物制品規(guī)程》)是一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑。它是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)甲醛滅活后制成的死菌苗，其制備過程公開在1995版及2000版《中國生物制品規(guī)程》。目前應(yīng)用的CPP制劑還有法國Merleux研究所生產(chǎn)的滅活菌苗；英國Wellcome藥廠生產(chǎn)的滅活菌苗等。
CPP具有激活單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的能力。CPP對免疫系統(tǒng)的作用主要表現(xiàn)在激活單核巨噬細(xì)胞、使NK細(xì)胞活性增強(qiáng)、促進(jìn)機(jī)體對多種抗原產(chǎn)生IgG和IgM、誘生干擾素、白細(xì)胞介素-2等，因此具有抗腫瘤和抗感染作用。
CPP的抗腫瘤作用已為許多實(shí)驗和臨床研究所證實(shí)。對實(shí)驗動物接種腫瘤前后應(yīng)用CPP，能顯著抑制某些實(shí)體瘤(如乳腺癌、黑色素瘤等)、腹水型腫瘤及白血病的生長。腫瘤消退的動物對于再次攻擊的腫瘤細(xì)胞有特異性的抵抗力。CPP對腫瘤轉(zhuǎn)移亦有抑制作用。
CPP抗腫瘤及抗感染的核心是通過激活巨噬細(xì)胞，使其數(shù)量和質(zhì)量大大提高，激活的巨噬細(xì)胞可將腫瘤細(xì)胞及感染的微生物殺死。
CPP作為免疫調(diào)節(jié)劑用于腫瘤及其它疾病的治療已有數(shù)十年的歷史，其通過激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)抗腫瘤、抗感染的效果已被公認(rèn)。
02123571.6、02123570.8和02123572.4已經(jīng)申請了一種無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑、其制備方法和在制備治療結(jié)核病藥物上的用途。
本發(fā)明所述無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)為由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)破碎制備的無細(xì)胞制劑，粒度小于100nm。
其中所述的CP，學(xué)名為粉刺丙酸桿菌(propionibacterium acnes)菌號為65101(76-27或7627)、65102(H-84)或65103(77-1或771)。
所述的NCP的熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余為多糖。
優(yōu)選本發(fā)明NCP的熱原小于60EU/ml，蛋白質(zhì)含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余為多糖。
本發(fā)明NCP的粒度優(yōu)選為10-50nm。
本發(fā)明所述的NCP是通過下述步驟制備的1).CP工作種子批菌種連續(xù)2-4次傳代后接種于大瓶或營養(yǎng)罐，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天；2).收集無雜菌污染的菌體，加熱煮沸15-60分鐘得到菌液；3).無菌試驗合格的菌液經(jīng)洗滌后，用破碎裝置破碎菌體；4).菌體破碎后的懸液經(jīng)離心后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液；5).將懸液加熱滅菌，得到NCP。
其中步驟1)中所述的CP學(xué)名為粉刺丙酸桿菌，菌號為65101(76-27或7627)、65102(H-84)或65103(77-1或771)。
培養(yǎng)基為選自硫乙醇酸鹽、蛋白胨、肝或酵母透析液培養(yǎng)基中的一種，且為低熱原培養(yǎng)基。
步驟1)中培養(yǎng)條件為36-37℃培養(yǎng)。
優(yōu)選所述培養(yǎng)基為不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。
其中步驟3)中所述的菌體是滅活菌，菌體濃度為50-500億/ml。
所述破碎裝置是將菌體破碎到小于100nm，優(yōu)選粒度為10-50nm的超高壓射流對撞機(jī)。
其中所述菌體破碎是在無菌條件下進(jìn)行。
其中步驟3)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌至少2次；步驟4)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌0-5次。
步驟4)菌體破碎后懸液的離心條件是在4℃-室溫，6000-12000rpm離心30-150分鐘。
步驟5)中所述的加熱為在60-65℃加熱0.5-2小時。
本發(fā)明的制備方法中，進(jìn)一步包括將步驟5)得到的NCP分裝后，安瓿在60+2℃加熱30分鐘。
本發(fā)明中所述培養(yǎng)基優(yōu)選為經(jīng)過0.22μm或μm0.45μm膜過濾的低熱原培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述的制備方法中，還包括將步驟5)得到的NCP冷凍干燥，得到NCP的凍干制劑。
上述方法制備的NCP熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余為多糖。
優(yōu)選上述方法制備的NCP熱原小于60EU/ml，蛋白質(zhì)含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余為多糖。
上述方法制備的NCP粒度小于100nm，優(yōu)選粒度為10-50nm。
本發(fā)明中所述的無菌檢驗合格是指按照《中國生物制品規(guī)程》規(guī)定的方法檢驗不得有任何細(xì)菌生長。
本發(fā)明中由于采用低熱原培養(yǎng)基，特別是硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，并結(jié)合嚴(yán)格的質(zhì)控，以及整個生產(chǎn)過程中無菌低熱原操作，保證了最終產(chǎn)品低熱原和無雜菌的污染。
本發(fā)明通過超高壓射流對撞機(jī)將CP破碎至納米級，通過選擇不同的離心力(轉(zhuǎn)速)，確定了離心提取條件，獲得的沉淀部分為NCP，經(jīng)多次動物試驗證明，該制劑與全菌體具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，上清部分則無脾激活及抑瘤作用，表明本發(fā)明的NCP具有良好的生物學(xué)活性。
為了消除CPP中殘留甲醛對機(jī)體的刺激性，尤其是對敏感胸膜的刺激性，本發(fā)明中采用加熱滅活替代了甲醛滅活。動物實(shí)驗表明，加熱滅活的NCP、CPP較甲醛滅活的CPP具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性。
超高壓射流對撞機(jī)的工作原理是將混有被加工物的液體用高壓泵(工作壓力為10-3000kgf/cm2)加壓后分成兩股，以高速射流進(jìn)入兩片直徑為8MM人造金剛石晶片組成的通道中，相向?qū)ψ埠罅鞒觥Ｓ捎谝后w的速度很高，流體相向?qū)ψ矔r產(chǎn)生很強(qiáng)的沖擊波，使金剛石晶片產(chǎn)生高頻、高強(qiáng)超聲波。大功率高頻超聲波使被加工物顆粒瞬間粉碎、超微化。
本發(fā)明的制備過程中，為更好地破碎菌體，采用超高壓射流對撞機(jī)，在菌體濃度為50-500億/ml，工作壓力為800-1500kgf/cm2的條件下破碎，破碎后的菌體懸液在4℃-室溫下，6000-12000rpm離心30-150分鐘，棄上清，沉淀用無菌生理鹽水溶液洗滌0-5次后制成懸液，在60-65℃加溫0.5-2小時，無菌試驗合格后合并，經(jīng)配制、分裝，分裝后安瓿在60+2℃加熱15-60分鐘，得到高質(zhì)量、粒度和均一性良好的目的產(chǎn)品。
本發(fā)明的NCP是將CP的細(xì)胞破碎至納米級，經(jīng)離心去除無效的上清部分，收集沉淀部分制備的，產(chǎn)品具有低熱原、無雜菌污染、無甲醛殘留，顆粒具有納米級，粒度均一，吸收度和擴(kuò)散度提高，有利于人體吸收并提高藥效；同時可減少發(fā)燒、胸痛，注射局部紅腫、硬結(jié)等副作用，是一種有前途的免疫制劑。
根據(jù)需要，本發(fā)明的NCP可以制成無菌生理鹽水的懸浮制劑，固體含量為1.0mg/ml或2.0mg/ml，也可以制成凍干粉針或適合藥用的其他劑型；本發(fā)明的CPP可為目前常用的劑型，如懸浮制劑、凍干粉針或適合藥用的其他劑型。
本發(fā)明所用的CPP、NCP均為非特異性免疫增強(qiáng)劑，NCP是由CP經(jīng)破碎制備的無細(xì)胞制劑，為納米級、顆粒大小均一、吸收度及擴(kuò)散度提高，低熱原、無甲醛殘留，與全菌體制劑具有相同的脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，可減少CPP的發(fā)燒、胸痛，注射局部紅腫、硬結(jié)，肝腎毒性等副作用，因此NCP克服了CPP的一些不足，可作為一種性能優(yōu)異的非特異性免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于抗腫瘤和抗感染等疾病的治療。
本發(fā)明經(jīng)過對短棒狀桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)的藥效學(xué)研究，表明CPP、NCP具有明顯的小鼠抗逆轉(zhuǎn)錄白血病病毒作用，顯示具一定的抗AIDS作用，可應(yīng)用在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中；由于NCP產(chǎn)品具有低熱原、無雜菌污染、無甲醛殘留，顆粒具有納米級，粒度均一，吸收度和擴(kuò)散度高，易于人體吸收，同時還降低發(fā)燒、胸痛，注射局部紅腫、硬結(jié)等副作用，因此NCP在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的效果更為明顯。
由于愛滋病患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)受到毀滅性破壞，T淋巴細(xì)胞數(shù)量少而且功能障礙，患者因多種病原難以控制的感染不治身亡。感染中以卡氏肺囊蟲肺炎最為常見，它是HIV潛伏感染已經(jīng)活化的臨床標(biāo)志。愛滋病的臨床表現(xiàn)非常復(fù)雜，機(jī)會性感染及惡性腫瘤可累及全身各個系統(tǒng)及器官，且常有多種感染和腫瘤并存，并常死于這些并發(fā)癥。比如機(jī)會性感染引起的肺炎、卡波齊肉瘤以及肺結(jié)核等。
本發(fā)明的CPP、NCP均為非特異性免疫增強(qiáng)劑，主要作用于MΦ，對單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)具有強(qiáng)大而持久的刺激，且可通過促進(jìn)造血多能干細(xì)胞分化為單核巨噬細(xì)胞，調(diào)動機(jī)體免疫系統(tǒng)蘊(yùn)藏的潛力，發(fā)揮抗癌、殺微生物功能。
CPP、NCP抗HIV作用主要是通過對單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)強(qiáng)大而持久的刺激，引起MΦ增生、活化、吞噬功能增強(qiáng)及誘導(dǎo)分泌干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL-2)活性氧(H2O2、NO)等殺傷因子及增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性，達(dá)到抑制和殺傷HIV的目的。
隨著對HIV發(fā)病機(jī)理的深入認(rèn)識和分子免疫學(xué)理論的發(fā)展，非特異性免疫在抗HIV中的作用，越來越被人們所重視。MΦ不但在機(jī)體非特異性免疫中起重要作用，而且在特異性免疫中也起著非常重要的作用。單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)除具有吞噬功能，還可發(fā)揮抗原呈遞(antigen presentation)作用，也屬于抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presentation cell，APC)，可輔助T淋巴細(xì)胞活化，并與淋巴細(xì)胞相互刺激其功能，從而放大特異性免疫效應(yīng)。然而只有活化的MΦ才能發(fā)揮抗HIV效應(yīng)，且活化的MΦ的抗HIV不變HIV變異及耐藥性的影響。故充分調(diào)動機(jī)體的免疫功能，配合化療在AIDS的治療中有著重要的作用。
本發(fā)明的一種短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在用于制備治療HIV感染或愛滋病藥劑時，其用法為1～7次/周，每次1～20mg，肌肉注射或其他適宜途徑給藥，1～12個月一個療程或遵醫(yī)囑?？砷g隔用或連續(xù)服用幾個療程。
本發(fā)明所用的CPP、NCP為一種免疫調(diào)節(jié)劑，用于制備治療HIV感染或愛滋病藥劑，具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明提供了CPP、NCP新的醫(yī)藥用途，對治療HIV感染或AIDS提供了新的途徑。
2.本發(fā)明的NCP制劑具有低熱原、無雜菌污染、無甲醛殘留，顆粒具有納米級，粒度均一，吸收度和擴(kuò)散度提高，有利于人體吸收并提高藥效；同時可減少發(fā)燒、胸痛，注射局部紅腫、硬結(jié)，肝腎毒性等副作用，是一種有前途的免疫制劑，可作為用于制備治療HIV感染或愛滋病藥劑。
3.本發(fā)明的制備工藝簡單，可作成口服、注射、片劑等，使用方便。
4.經(jīng)藥效研究表明，本發(fā)明的CPP、NCP具有脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，能抗結(jié)核(TB)感染、抗小鼠逆轉(zhuǎn)錄白血病病毒感染作用，對于HIV感染者有利于病情控制，延緩病情發(fā)作；對愛滋病伴有的機(jī)會性感染或腫瘤有抑制作用，有利于AIDS病情的好轉(zhuǎn)；由于NCP為納米級，具有吸收好、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，其效果更佳。
具體實(shí)施例方式
下面是本發(fā)明的具體實(shí)施例用于詳細(xì)描述本發(fā)明，所述的實(shí)施例用于描述本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。其中CP學(xué)名為粉刺丙酸桿菌(propionibacterium acnes)，菌號為65101(76-27)、65102(H-84)公開于1993版《中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種目錄》，北京理工大學(xué)出版社(ISBN7-81013-859-6/R.7)，65103(77-1或771)公開于2000版《中國生物制品規(guī)程》，化學(xué)工業(yè)出版社。
實(shí)施例1參照2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法進(jìn)行細(xì)菌種子批的建立、檢定以及其它檢定。
本實(shí)施例中采用的培養(yǎng)基為北京三藥科技開發(fā)公司出品的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)，成分為胰酪胨15g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖5g/l，氯化鈉2.5g/l，L-胱氨酸0.5g/l，硫乙醇酸鈉0.5g/l。使用前將培養(yǎng)基用0.22μm膜過濾。
啟開CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes)771(見《中國生物制品規(guī)程》)菌種管，每管含菌60億，用毛細(xì)管吸取約0.2-0.3ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)，加在菌種管底部使之完全溶解后吸出，加入中管(容量38ml)中，用上述培養(yǎng)基8-10ml混合，置37℃培養(yǎng)2天。取菌液用上述培養(yǎng)基(菌液∶培養(yǎng)基體積比＝1∶9)混合，置37℃培養(yǎng)2天。取上述培養(yǎng)的菌液用上述培養(yǎng)基(按1∶9)混合，置37℃培養(yǎng)3天，收獲菌液。逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之。合并收集無雜菌污染的菌體加熱煮沸15分鐘，用超高壓射流對撞擊(日本Nanonizer Inc.產(chǎn)品，型號NMG-75-200)在1000kgf/cm2壓力下破碎菌體3次；破碎后的懸液在室溫、6000rpm離心90分鐘，收集沉淀，用無菌生理鹽水洗滌沉淀3次，無菌檢驗(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后制成固體含量為0.5mg/ml的懸液，60℃加熱1小時，得到NCP。
其中CP，學(xué)名為粉刺丙酸桿菌65103(77-1)或771。
經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量1mg/ml)，本發(fā)明的NCP熱原20EU/ml；考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測定蛋白質(zhì)含量25％(g/g)；紫外法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)260nm測定核酸含量10％(g/g)；蒽酮法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為10％(g/g)。考慮到蛋白質(zhì)和核酸的測定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計其余的多糖未測出。電鏡測定粒度為60-100nm。
分裝后，安瓿在60+2℃加熱20分鐘。
實(shí)施例2參照實(shí)施例1的方法，將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes)65101(76-27)連續(xù)4次傳代后接種于營養(yǎng)罐，在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)(使用前將培養(yǎng)基用0.45μm膜過濾)中，36-37℃培養(yǎng)6天；逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之；合并收集無雜菌污染的菌體加熱煮沸60分鐘，用超高壓射流對撞機(jī)在1500kgf/cm2壓力下破碎菌體5次；破碎后的懸液8000rpm離心1小時，用無菌生理鹽水洗滌沉淀5次，無菌檢驗(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后制成固體含量為2.0mg/ml的懸液，65℃加熱60分鐘，得到NCP。
經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量1mg/ml)，NCP熱原160EU/ml；考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測定蛋白質(zhì)含量40％(g/g)；紫外法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)260nm測定核酸含量5％(g/g)；蒽酮法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為20％(g/g)?？紤]到蛋白質(zhì)和核酸的測定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計其余的多糖可能未測出。電鏡檢測粒度為10-50nm，粒度均勻。
分裝后，安瓿在60+2℃加熱30分鐘。
實(shí)施例3參照實(shí)施例1的方法，將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes)65102(H-84)連續(xù)4次傳代后接種于營養(yǎng)罐，在蛋白胨培養(yǎng)基中36-37℃培養(yǎng)7天；逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之；合并收集無雜菌污染的菌體加熱煮沸30分鐘，用超高壓射流對撞機(jī)(日本Nanonizer Inc.產(chǎn)品，型號AQUA300)800kgf/cm2壓力下破碎菌體10次；破碎后的懸液12000rpm離心，用無菌生理鹽水洗滌沉淀4次，無菌檢驗(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中華人民共和國藥典》)合格后制成固體含量為1.0mg/ml的懸液，65℃加熱100分鐘，得到NCP。
經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量1mg/ml)NCP熱原60EU/ml，考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測定蛋白質(zhì)含量12％(g/g)，紫外法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)260nm測定核酸含量25％(g/g)，蒽酮法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為16％(g/g)，考慮到蛋白質(zhì)和核酸的測定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計其余的多糖未測出。電鏡檢測平均粒度為40-80nm，粒度均勻。分裝后，安瓿在60+2℃加熱30分鐘。
實(shí)施例4其他同實(shí)施例1，不同之處在于破碎后的懸液在8000rpm離心1小時后，用凍干機(jī)凍干，得到粉針劑。
實(shí)施例5采用2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes)771連續(xù)3次傳代后接種于營養(yǎng)罐，在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)中36-37℃培養(yǎng)5天；逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之；合并收集無雜菌污染的菌體分別加熱煮沸30、60分鐘進(jìn)行無菌試驗，無菌試驗合格的菌液經(jīng)離心后，用新鮮無菌生理鹽水溶液洗滌沉淀3次并制成懸液，60-65℃加熱1小時，無菌檢測合格后分裝，安瓿在60+2℃加熱30分鐘，經(jīng)檢測兩種樣品每瓶含菌為6.0×109。
實(shí)施例6其他同實(shí)施例5，不同之處在于采集之無雜菌污染的菌體加入甲醛溶液至最終濃度約為0.5％(ml/ml)殺菌48小時，經(jīng)檢測每瓶含菌為6.0×109，游離甲醛含量為0.06g/L。
實(shí)驗例1CPP中殘留有微量的甲醛，甲醛能固定蛋白質(zhì)，殺死細(xì)菌，但對機(jī)體具有較強(qiáng)的刺激性。CPP中甲醛殘留量雖然很少(應(yīng)不高于0.06g/l)，但仍會對人體，尤其是對敏感的胸膜產(chǎn)生刺激性。
本發(fā)明中按照2000版《中國生物制品規(guī)程》中第240-241頁中CPP制造及檢定規(guī)程中規(guī)定的方法制備的CPP的脾激活及抑瘤生物學(xué)活性進(jìn)行了試驗，結(jié)果見表1。
同時，本發(fā)明中按照下述方法對本發(fā)明實(shí)施例1-6的CPP、NCP脾激活及抑瘤生物學(xué)活性進(jìn)行了試驗，結(jié)果見表1。
脾激活試驗用體重18-20g純種小鼠(C3H、615或C57BL)，試驗組及對照組各10只，雌雄各半。試驗組每只小鼠腹腔分別注射CPP 0.5ml(含菌1.5×109)及實(shí)施例1-3的NCP制劑0.5ml(1-3的NCP固體含量都調(diào)整到1mg/ml)，對照組注射同量生理氯化鈉溶液。14天處死小鼠，分別稱體重、脾重、計算脾指數(shù)，其指數(shù)應(yīng)不低于2.0。

抑瘤實(shí)驗(艾氏腹水瘤)用體重18-20g純種小鼠(C3H、615、C57BL、K-LACA或昆明鼠)，試驗組及對照組各10只，雌雄各半。每只小鼠腹腔注射活的瘤細(xì)胞(5.0×106/ml)0.2ml(用傳代5-8天非血性腹水)。試驗組于注射瘤細(xì)胞前1天及注射后次日起，連續(xù)腹腔分別注射CPP 0.25ml(含菌1.5×109)及實(shí)施例1-3的NCP 0.25ml(1-3的NCP固體含量調(diào)整到2mg/ml)5次，每次間隔1天。對照組注射同量生理氯化鈉溶液。對照組小鼠全部因癌性腹水死亡為起點(diǎn)計算試驗組小鼠存活率，觀察期30天，其存活率應(yīng)不低于70％。
表1

脾激活及抑瘤實(shí)驗可說明CPP或NCP的生物學(xué)活性及藥效。表1的結(jié)果表明，加熱煮沸30分鐘、加熱煮沸60分鐘、0.5％甲醛溶液滅活制備的CPP以及本發(fā)明的NCP，其小鼠脾激活及抑瘤實(shí)驗效果相同，無明顯差異，說明加熱煮沸滅活以及破碎提取對CPP及NCP的生物學(xué)活性及藥效無明顯影響。
實(shí)驗例2本實(shí)驗例涉及NCP的吸收性能及與CPP吸收性能的比較。
內(nèi)容家兔CPP及NCP皮內(nèi)吸收實(shí)驗。
家兔1500-2000克，雌雄各半。
分組分為CPP組及NCP組，每組各4只。
給藥每只兔背部皮內(nèi)注射，對照組CPP組0.2ml/只(150億/ml，相當(dāng)于2.5mg/ml)，NCP組0.2ml/只(2.5mg/ml)，觀察并測試注射局部，結(jié)果見表2。
表2


結(jié)論觀察72小時，NCP易于被吸收，未產(chǎn)生明顯紅腫、硬結(jié)，CPP不易被吸收，產(chǎn)生了明顯的紅腫、硬結(jié)反應(yīng)。此結(jié)果說明將CPP的細(xì)胞破碎至納米級制備的NCP更有利于機(jī)體的吸收，并能減少副作用，因此NCP效果更佳，為優(yōu)選的非特異性免疫增強(qiáng)劑。
實(shí)驗例3本實(shí)驗例涉及NCP的動物急性毒性試驗。
藥物采用實(shí)施例1的方法制備，但NCP含量31.7mg/ml，由中國藥品生物制品檢定所提供。
動物昆明種小鼠，雌雄各半，由中國藥品生物制品檢定所動物中心提供。
最大給藥量測定，取上述健康小鼠40只，隨機(jī)分為兩組，雌雄各半，給藥組小鼠一次肌注最大濃度(31.7mg/ml)，最大體積(0.1m/每側(cè)×2)的NCP，對照組一次肌注等體積生理鹽水，記錄以上兩組給藥前后第三天及第七天的體重與臨床表現(xiàn)，結(jié)果見表3。
表3

上述結(jié)果表明，小鼠一次肌注最大劑量的NCP 31.7mg/ml，小鼠未出現(xiàn)死亡，未發(fā)現(xiàn)與給藥有關(guān)的臨床表現(xiàn)，也未發(fā)現(xiàn)給藥對體重的影響，給藥劑量相當(dāng)臨床用藥量的452.9倍，說明人臨床擬用劑量是一個安全劑量。
實(shí)驗例4本發(fā)明的CPP、NCP均為非特異性免疫增強(qiáng)劑，具有脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，能抗小鼠逆轉(zhuǎn)錄白血病病毒感染作用。本實(shí)施例選擇優(yōu)選的NCP對逆轉(zhuǎn)錄病毒鼠白血病感染小鼠模型的藥效學(xué)進(jìn)行評價。
體內(nèi)動物實(shí)驗由于HIV種特異性強(qiáng)，不能感染非靈長類動物，人們設(shè)法由與HIV同屬逆轉(zhuǎn)錄病毒的相關(guān)病毒，或由基因重組方法建立動物模型，最常用的模型是猴免疫缺陷病毒(sinian immmodeficiency virus，SIV)及小鼠白血病病毒(murineleukemia virus，MuLV)，由于小鼠模型易于操作，用藥量少，價格便宜，所以最常被采用。
1.實(shí)驗設(shè)計依據(jù)、目的根據(jù)衛(wèi)生部《新藥臨床前研究指導(dǎo)原則》，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒鼠白血病感染小鼠模型對其抗AIDS療效進(jìn)行研究，以評價NCP抗AIDS的藥效作用。
2.材料與方法2.1動物、設(shè)施與飼養(yǎng)Balb/c小鼠，雌性，6周齡，16-19克，由山東大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，動物合格證號魯動質(zhì)[20021239]；實(shí)驗動物設(shè)施合格魯動環(huán)字200101004；常規(guī)小鼠飼養(yǎng)。
2.2供試品NCP(2mg/ml)，由中國藥品生物制品檢定所提供，批號020117；4℃存放，用時生理鹽水配制。
2.3陽性對照藥雙汰芝，片劑，每片含拉米夫啶150mg，齊多夫啶300mg；Glaxowellcom提供，批號MAR2001。
2.4動物模型小鼠逆轉(zhuǎn)錄白血病病毒(SRS8)，由上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物物理教研室提供；該病毒株復(fù)蘇后先離心去上清，隨后加新鮮10％小牛血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，小鼠腹腔接種。
病毒毒力測定每只小鼠腹腔注射1×105～1×106個細(xì)胞/0.3ml；接種后觀察小鼠死亡情況。以動物死亡50％接種量為模型接種量。
2.5劑量、分組與給藥1)正常對照組20只2)模型對照組20只3)陽性對照組20只。染毒4小時后給藥，200mg/kg·天雙汰芝灌胃，連續(xù)給藥14天。
4)NCP高劑量組2.0mg/次·只，10只5)NCP中劑量組0.5mg/次·只，20只6)NCP低劑量繃帶0.125mg/次·只，10只
NCP給藥方法動物腹腔染毒4小時后肌肉注射給藥，隔日1次，共5次。
2.6觀察、測定雌性Balb/c小鼠腹腔感染后4小時，按給藥方案給藥；隔2日稱體重；14天時1)、2)、3)、5)組各殺死10只小鼠，解剖取脾，觀察脾病灶并計數(shù)；稱脾重計算脾系數(shù)；取血測血常規(guī)，與各試驗組比較；剩余動物觀察存活率及平均生活日，觀察至60天，計算保護(hù)率和統(tǒng)計學(xué)意義。
3.結(jié)果3.1病毒活力測定(見表4)表4 病毒活力測定接種量(個細(xì)胞/只) No21天存活率(％)1×10610 0.05×10510 0.03×10510 0.01×10510 40.0小鼠接種SRS8病毒株細(xì)胞后，死亡時間集中在16～21天，接種量為1×105時，動物存活在50％左右，故小鼠感染模型接種量為1×105個細(xì)胞/只。
3.2給藥14天時指標(biāo)變化3.2.1第一次實(shí)驗結(jié)果小鼠感染病毒給藥后14天內(nèi)，體重各組變化不明顯(表5)；血液學(xué)變化明顯，雙汰芝對照組及NCP組WBC計數(shù)、淋巴百分比，血小板計數(shù)明顯高于模型對照組，NCP組脾指數(shù)明顯高于正常對照及模型組(表6)，且差異顯著。
3.2.2存活時間攻毒、給藥至22天時，模型組腹水明顯，其他組不明顯；30天存活率NCP高、中劑量組明顯高于對照組、模型組，并顯示一定劑量效應(yīng)關(guān)系；60天時模型組存活率為0，NCP高、中劑量組大于40％，低劑量組僅為10％。
表5 小鼠給藥體重變化(g)給藥后時間(d)組別 N2 4 6 8 10 12 1422.17± 22.08± 21.80± 23.40± 23.36± 23.48± 23.02±正常對照 102.572.88 3.343.242.87 2.722.6720.57± 21.68± 21.90± 22.36± 22.30± 22.43± 18.38±模型組101.101.09 0.961.001.41 1.492.15NCP組19.89± 20.36± 20.62± 20.84± 21.31± 21.51± 20.95±10(0.5mg/ 2.672.32 2.162.392.33 2.262.33
只)21.72± 19.76± 19.16± 21.8± 20.18± 20.68± 20.68±雙汰芝101.532.553.71 2.94 2.151.80 2.39表6 NCP給藥14天時血液學(xué)變化WBC分類PBCWBC× HBPLT× 脾指數(shù)組別×109/L N(％) L(％) M(％) g/l 109/L(％)1012/L12.71±7.46±141.7± 0.60±正常對照 79.5±7.9 9.3±3.1 11.2±5.3 1788±5729.89 1.06 7.0 0.165.68±70.9± 8.63±154.8±0.45±模型組13.4±5.2 15.7±5.9 1229±5033.23 10.3 0.98 12.90.1212.37± 64.1± 21.0± 7.99± 2967± 1.35±雙汰芝 15.0±7.6 133±10.74.86** 10.2 6.7**ΔΔ 0.931061** 0.3313.29± 64.8± 18.4± 8.59±143.7± 1785± 1.27±NCP組16.7±7.8Δ5.69** 12.6 5.7*ΔΔ 1.22 14.8 354**0.18N＝10NCP＝0.5mg/只，隔日1次共5次；**P＜0.01，*P＜0.05，與模型組相比；ΔΔP＜0.01，與正常組相比。
WBC白細(xì)胞；N(％)中性粒細(xì)胞；L(％)淋巴細(xì)胞；M(％)嗜酸、嗜堿及單核細(xì)胞RBC紅細(xì)胞；Hb；血紅蛋白；PLT血小板結(jié)論NCP試驗結(jié)果，表明NCP具有明顯的抗小鼠逆轉(zhuǎn)錄白血病病毒作用，顯示具一定的抗AIDS作用。
權(quán)利要求
1.一種短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌經(jīng)甲醛滅活后制成的制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌經(jīng)破碎制備的無細(xì)胞制劑，粒度小于100nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑熱原小于160EU/ml，蛋白質(zhì)含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余為多糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑的粒度為10-50nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的短棒狀桿菌為粉刺丙酸桿菌，菌號為76-27、H-84或77-1。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的短棒狀桿菌為77-1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑熱原小于60EU/ml，蛋白質(zhì)含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余為多糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑通過下述方法制備的1).短棒狀桿菌工作種子批菌種連續(xù)2-4次傳代后接種于大瓶或營養(yǎng)罐，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天；2).收集無雜菌污染的菌體，加熱煮沸15-60分鐘得到菌液；3).無菌試驗合格的菌液經(jīng)洗滌后，用破碎裝置破碎菌體；4).菌體破碎后的懸液經(jīng)離心后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液；5).將懸液加熱滅菌，得到無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的培養(yǎng)條件為36-37℃；所述培養(yǎng)基為不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基；所述的菌體是滅活菌，所述破碎裝置是將菌體破碎到小于100nm，優(yōu)選粒度為10-50nm的超高壓射流對撞機(jī)，破碎在無菌條件下進(jìn)行；步驟3)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌至少2次；步驟4)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌0-5次；菌體破碎后懸液的離心條件是在4℃-室溫下，6000-12000rpm離心30-150分鐘；步驟5)中所述的加熱為在60-65℃加熱0.5-2小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種短棒狀桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)在制備治療HIV感染或愛滋病藥劑中的應(yīng)用，所述短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)甲醛滅活后制成的制劑，所述無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑為納米級、顆粒大小均一、吸收度及擴(kuò)散度提高，低熱原、無甲醛殘留；本發(fā)明的CPP與NCP均具有脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，具有明顯的抗小鼠逆轉(zhuǎn)錄白血病病毒作用，可用于HIV感染或愛滋病的治療或輔助治療。
文檔編號A61P31/00GK1600323SQ0315745
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月22日
發(fā)明者高尚先, 李守悌 申請人:中國藥品生物制品檢定所