專利名稱：一種微囊化酵母菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可在腸道內生長代謝并分泌基因工程藥物的微囊化酵母菌。
本發明還涉及上述微囊化酵母菌在治療疾病中的應用。
背景技術：
基因工程藥物使許多疾病如腫瘤、免疫缺陷性疾病、遺傳基因缺陷疾病等的治愈成為可能[文獻1Pennisi E.Breakthrough of the year.Genomics comes of age.Science，2000，290(5500)2220-2221]、[文獻2Peltonen L，McKusick VA.McKusick.Genomics and medicine.Dissectinghuman disease in the postgenomic era.Science，2001，291(5507)1224-1229]。隨著生物工程技術的發展，蛋白、多肽類基因工程藥物的大規模生產成為現實，并大量應用于臨床。理想的基因工程藥物最終目的應該是實現安全、有效且費用低廉的治療。但目前基因工程藥物的使用尚存在一些問題，如基因工程藥物多從基因工程菌(大腸桿菌或酵母菌)的代謝產物中提取，藥物制備的分離純化工藝復雜，成本高；基因工程藥物目前的用藥途徑為注射給藥。因此，降低藥物生產成本及改變用藥途徑是目前國際有關基因工程藥物的主要研究方向。
目前有關這方面的研究僅檢索到加拿大Chang TMS[文獻3S.Prakash，T.M.S.Chang.In vitro and in vivo uric acid lowering by artificial cellscontaining microencapsulated genetically engineered E.coli DH5 cells.Theinternational journal of artificial organs，2000，23(7)429-435]、[文獻4Chang Thomas M.S.，Prakash Satya.Microencapsulated genetically engineeredmicroorganisms for clinical application.United States Patent 6,217,859，April17，2001]以及本專利申請人[文獻5付穎麗，雄鷹，劉袖洞，于煒婷，馬小軍。殼聚糖/海藻酸鈉微膠囊固定化大腸桿菌的研究。生物工程學報，2002，18(2)239-241]。Chang TMS等通過研究口服攜帶脲激酶基因的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(alginate-polylysine-alginate，APA)微囊化大腸桿菌治療尿毒癥。
但微囊化大腸桿菌作為口服劑型應用存在如下問題①大腸桿菌是原核細胞，表達的蛋白產物多以包含體的形式聚集在細胞質內，無法分泌到細胞外；②大腸桿菌表達的蛋白產物不能進行轉錄后的修飾加工，常常沒有生物活性；③大腸桿菌作為基因工程菌的宿主細胞無法表達長基因片段；④大腸桿菌作為口服劑型由于有臭味而很難被患者接受；⑤大腸桿菌多為條件致病菌，其毒理問題尚需考察。與大腸桿菌相比，酵母菌作為基因工程的宿主細胞有其明顯的優勢①酵母菌是真核細胞，表達的目標產物可以分泌到細胞外；②酵母菌表達的目標產物能進行轉錄后的修飾加工，形成有生物活性的蛋白；③酵母菌作為基因工程菌的宿主細胞可以表達長基因片段；而且，作為口服劑型，④酵母菌已被廣泛用于食品業和釀酒業，具有酒香味作為口服劑型易于被患者接受；⑤酵母菌安全無毒，不致病，不存在毒理問題。因此，將包埋有基因工程酵母菌的APA微膠囊直接口服，作為腸道內細胞微反應器，使微膠囊內的酵母細胞在腸道內生長代謝，分泌目標產物達到治療目的。
發明內容
本發明的目的在于提供一種微囊化酵母菌，口服后其可在腸道內生產基因工程藥物，其優點是1、APA微膠囊具有良好的生物相容性，口服安全無毒。
2、APA微囊化基因工程酵母菌在生理條件下制備，制備過程中對酵母菌活性沒有損害；3、APA微膠囊作為酵母菌的保護載體保證酵母菌在胃腸道的存活率，與游離酵母菌相比其囊內細胞存活率提高200倍以上。
4、APA微膠囊膜對酵母菌表達產物具有控釋作用，保證穩定的血藥濃度。
為實現上述目的，本發明采用海藻酸鈉、聚賴氨酸、海藻酸鈉(alginate-polylysine-alginate，APA)復合材料制備微膠囊并包埋有基因工程酵母菌。該微囊化的酵母菌經直接口服，作為腸道內細胞微反應器，使微膠囊內的酵母細胞在腸道內生長代謝，分泌目標產物達到治療目的。本發明采用的酵母菌為基因工程酵母菌，包括各種組成型或誘導型分泌表達藥用生物活性蛋白的基因工程酵母菌。
其制備方法是在原有海藻酸鹽固定化細胞的基礎上，通過大功率微膠囊制備儀，使均勻混合有酵母細胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成粒徑在100-1000μm可控、分布均勻的液滴，與鈣溶液固化形成微膠珠，并在微膠珠表面通過離子絡合反應瞬間形成一層聚賴氨酸微膠囊膜，再用檸檬酸鈉溶液置換出海藻酸鈣凝膠中的鈣，使微膠囊內液化成液體環境，得到包埋有酵母菌的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微膠囊(APA微膠囊)，該微膠囊中酵母菌含量為106-1010個/ml。APCA微膠囊膜本身對分子量在1-10萬Da的蛋白藥物有明顯控釋作用，增強了藥物的生物利用度。由于本發明的微囊化酵母菌是在生理條件下制備，pH6.0-7.0，20-37℃，1個大氣壓，無震蕩及剪切，制備過程中對酵母菌活性沒有損害。
關于本發明的制備過程不是本發明所要討論的重點，而且微囊化的制備技術已較普遍，本領域的技術人員很容易理解和掌握，所以本發明對此不作詳細描述。有關制備過程請參見圖1。
本發明提供的包埋酵母菌的APA微膠囊在胃腸道內無破損，特異性粘附小腸黏膜10小時以上。本發明的微囊化酵母菌在腸道內與游離酵母菌相比，細胞存活率提高200倍以上。
本發明提供的微囊化酵母菌在腸道內生長代謝并分泌基因工程藥物，可用于治療尿毒癥、肝功衰竭、苯丙酮酸尿癥、內分泌性疾病、神經變性疾病、遺傳性疾病及惡性腫瘤等疾病。
本發明提供的包埋有酵母菌的APCA微膠囊在腸道內生產基因工程藥物的原理請參見圖2。
圖1為本發明微膠囊制備示意圖。
圖2為本發明包埋有酵母菌的APA微膠囊在腸道內生產基因工程藥物的原理。
圖3為本發明APA微膠囊在模擬胃腸液中的存活率。
具體實施例方式
例1在生理條件下制備出含有酵母菌的APA微膠囊，制備過程中酵母菌存活率100％，酵母菌含量108個/ml微膠囊，微膠囊粒徑在100-1000μm精確可控。
例2含有酵母菌的APA微膠囊經模擬胃、腸液處理后，與游離酵母菌相比其囊內細胞存活率提高200倍以上(見圖3)。
例3含有牛血紅蛋白的APA微膠囊在模擬胃液血紅蛋白顯示零級釋放，在模擬腸液中呈現一級釋放曲線。
例4將含有酪氨酸羥化酶基因的基因工程酵母菌包埋在APA微膠囊中給帕金森模型鼠口服后，酵母菌在小鼠腸道內以內源性酪氨酸為底物，在酪氨酸羥化酶的作用下，生成多巴胺，經腸道吸收入血，可以糾正帕金森模型鼠的震顫行為。
權利要求
1.一種微囊化酵母菌，為包埋有酵母菌的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微膠囊，其粒徑為100-1000μm，表面為一層聚賴氨酸微膠囊膜，該微膠囊內為液體環境，其中酵母菌含量為106-1010個/ml。
2.如權利要求1所述的微囊化酵母菌，其特征在于，所述酵母菌為基因工程酵母菌，包括各種組成型或誘導型分泌表達藥用生物活性蛋白的基因工程酵母菌。
3.如權利要求1所述的微囊化酵母菌，其特征在于，所述酵母菌由微膠囊的保護，在腸道內繼續存活，生長代謝分泌蛋白多肽類藥物。
4.如權利要求1所述的微囊化酵母菌，其特征在于，包埋有酵母菌的微膠囊在胃腸道內無破損，特異粘附在小腸黏膜10小時以上，
5.如權利要求1所述的微囊化酵母菌，其特征在于，所述微膠囊膜對分子量在1-15萬Da的蛋白藥物有控釋作用。
6.如上述任一項權利要求所述的微囊化酵母菌在治療尿毒癥、肝功衰竭、苯丙酮酸尿癥、內分泌性疾病、神經變性疾病、遺傳性疾病及惡性腫瘤的應用。
全文摘要
一種微囊化酵母菌，為包埋有基因工程酵母菌的海藻酸鈉－聚賴氨酸－海藻酸鈉微膠囊，其粒徑為100－1000μm，表面為一層聚賴氨酸/殼聚糖微膠囊膜，該微膠囊內為液體環境，其中酵母菌含量為10
文檔編號A61P35/00GK1589778SQ03155729
公開日2005年3月9日 申請日期2003年9月1日 優先權日2003年9月1日
發明者馬小軍, 于煒婷, 謝威揚 申請人:中國科學院大連化學物理研究所