專利名稱：能夠與金葡菌毒力因子調控蛋白結合的小分子多肽及其醫藥用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一組小分子肽，具體涉及一組能夠與金葡菌毒力因子調控蛋白TRAP(Target of RNAIII activating protein)結合的小分子肽，該結合肽能特異抑制金葡菌的毒素產生。本發明還涉及這些小分子多肽在醫藥領域中的應用。
背景技術：
金黃色葡萄球菌(金葡菌)是一類常見的革蘭氏陽性致病菌，是引起燒傷及戰傷感染、肺炎、心內膜炎、敗血癥、中毒性休克等致命性疾病的主要微生物之一。每年僅醫院內感染金葡菌的人數就超過數百萬。目前臨床上對金葡菌的治療多采用聯合使用抗生素的辦法，但是效果并不理想。由于金葡菌極易產生耐藥性且無好的解決方法，常用的許多抗生素對之無效，控制金葡菌感染是臨床醫學殛待解決的問題之一。
金葡菌的主要致病物質是毒素，包括溶血毒素、殺白細胞素、腸毒素等。最新研究表明，金葡菌這些毒力因子的合成是受一種可調節RNA分子，及RNAIII控制的。RNAIII激活毒力因子的基因轉錄，通過堿基互補調節毒力因子的翻譯。在細菌生長的對數早期其RNAIII水平低，但到對數晚期RNAIII水平會增加40倍，而RNAIII的水平是由金葡菌自身分泌的蛋白RAP(RNAIIIactivating protein)即RNAIII激活蛋白調節的，故因子RAP又稱為金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持續分泌RAP，在RAP達到一定濃度后才有激活毒力因子產生的作用。沒有RAP產生的金葡菌本身并不致病。最新研究發現，RAP激活RNAIII的轉錄是通過一個21KD的蛋白TRAP(Target of RNAIIIactivating protein)介導的，當TRAP蛋白的編碼基因被突變失活后，RAP不能夠激活RNAIII的轉錄。TRAP由167個氨基酸組成，具有His激酶活性。TRAP蛋白在金葡菌生長的早期開始磷酸化，在對數生長中期達到最大水平。在RAP作用后，通過自身磷酸化來進行信號傳導，從而介導細胞內RNAIII水平上升，加速金葡菌外毒素的分泌(Naomi B，et al，J.Biol.Chem 2001，2762658-2667)。2001的研究發現TRAP的抗體可以有效的降低金葡菌外毒素的分泌(Oleny V.et al.Peptides 2001，221621-1627)。由此可見TRAP蛋白在金葡菌的毒素表達調控也起著關鍵性的作用。
發明內容
本發明的目的是提供一組能夠與金葡菌毒力因子調控蛋白TRAP(Targetof RNAIII activating protein)結合的小分子肽，該結合肽能特異抑制金葡菌的毒素產生。
本發明的另一目的是提供這些小分子多肽在醫藥領域中的應用。
為實現本發明的第一個目的，我們根據文獻報道的TRAP基因序列設計了特異性引物，從金葡菌菌株RN6390B中釣取了TRAP蛋白的編碼基因，利用大腸桿菌表達系統對TRAP進行了表達。并以純化的TRAP蛋白為靶標，利用噬菌體展示技術從隨機十二肽庫中篩選出能特異與TRAP蛋白結合的小分子多肽。本發明的多肽無論從來源還是從結構上都是全新的，未見任何文獻報道。
本發明的能夠與金葡菌毒力因子調控蛋白TRAP(Target of RNAIIIactivating protein)結合的小分子肽是具有以下氨基酸序列的多肽ATWSHHLSSAGLHWDPFSLSAYFP
ASTAHRHAFYWVSAFHHYSALADLATSHLHVRLPSKWHNEWWSPFPMDSHPWNAQRELSVDRMLLPFNLLALFAPWDTASFMLG其中大寫英文字母分別代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構體的一種，即A代表丙氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，N代表天冬酰胺殘基，D代表天冬氨酸殘基，Q代表谷氨酰胺殘基，E代表谷氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，W代表色氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，F代表苯丙氨酸殘基，T代表蘇氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，G代表甘氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基，M代表甲硫氨酸殘基。
序列中的有些氨基酸可以根據氨基酸的相似性進行相互替代，其中谷氨酰胺殘基(Q)，谷氨酸殘基(E)，天冬氨酸殘基(D)或天冬酰胺殘基(N)之間可以相互替代；色氨酸殘基(W)，酪氨酸殘基(Y)或苯丙氨酸殘基(F)之間可以相互替代；賴氨酸殘基(K)和精氨酸殘基(R)之間可以相互替代；絲氨酸殘基(S)和蘇氨酸殘基(T)之間可以相互替代；丙氨酸殘基(A)和甘氨酸殘基(G)之間可以相互替代；亮氨酸殘基(L)和甲硫氨酸殘基(M)之間可以相互替代。
具有上述結構模式的多肽能夠與金葡菌毒力刺激因子RAP的結合蛋白TRAP特異結合，并抑制其活性。具體表現為，在體外具有上述結構模式的多肽無論是以何種形式如展示在噬菌體或其他微生物上、或體外化學合成、或用基因工程方法重組表達，都能夠與TRAP特異結合，并抑制TRAP的磷酸化，降低金葡菌毒素的產生。
本發明的小分子多肽可通過現有技術中的化學合成或用基因工程重組表達的方法制得。
傳統抗生素治療產生抗藥性的原因主要是用藥后細菌在生存壓力下產生分解抗生素中有效基團的誘導酶。本發明利用特異抑制TRAP活性的多肽建立的治療金葡菌感染方案，由于不殺滅細菌而使細菌的致病性喪失，所以不會象傳統抗生素治療那樣對細菌產生選擇壓力而產生抗藥株，這就為一直困擾臨床的抗藥性金葡菌感染這一常見、多發且有致命性的疾病的治療找到新的出路。
圖1為純化的TRAP蛋白SDS-PAGE電泳2為Western Blot鑒定TRAP蛋白圖3為不同滴度的序列1噬菌體對RN6390B菌株TRAP蛋白的磷酸化水平的影響圖4為不同滴度的序列1噬菌體作用后的金葡菌上清對MDBK生長影通過體內磷酸化水平的檢測，發現這些小分子多肽可以有效地降低TRAP在RN6390B中的磷酸化水平，同時通過MDBK細胞模型檢測發現所篩選獲得的小分子多肽可以有效的降低金葡菌外毒素的分泌水平，為治療金葡菌感染開辟了新的途徑，從而實現本發明的第二個目的。本發明對研制新型抗金葡菌感染的小分子多肽藥物具有重要意義，并具有廣泛的應用價值及廣闊的市場前景。
具體實施例方式
下面以序列1為實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例1.TRAP蛋白的基因工程表達及分離純化將鑒定正確的大腸桿菌TRAP基因連接至表達載體，在大腸桿菌中獲得表達，經SDS-PAGE電泳鑒定發現在上清和包涵體中都有目的蛋白的條帶，其中上清中的目的蛋白占總量的50％以上。將帶有His標簽的目的蛋白通過金屬螯合柱純化，SDS-PAGE檢測，分子量約23kD，純度＞90％。用凝血酶將His標簽切割下來，純化的TRAP蛋白分子量約21kD，純度＞95％。(見附圖1，圖中1表示分子量蛋白標準；2表示純化的TRAP蛋白)。
實施例2.純化的TRAP蛋白的鑒定通過WESTEN BLOT檢測我們純化的TRAP蛋白能與TRAP蛋白多抗發生特異性的反應(附圖2)實施例3.TRAP結合肽的篩選首先用100μl純化的TRAP蛋白包被于酶聯板，置4℃過夜。經過2％的明膠封閉1h后，加入噬菌體十二肽庫，室溫孵育1h，用TBST(50mmol/LTris-HCl，0.1％TWEEN20，pH7.5)洗滌非特異結合的噬菌體，再用0.2mmol/L甘氨酸-HCl pH2.2洗脫特異結合的噬菌體，洗脫液用1mmol/L Tris-HCl pH9.0中和。按照試劑盒提供的方法，測定洗脫液中的噬菌體的滴度，以未包被的靶蛋白的洗脫噬菌體的滴度作為對照，測定投入產出比。同時將洗脫的與TRAP結合的噬菌體擴增，并測定其下滴度，用于下一輪的篩選。經過3輪篩選后，測定的投入產出有了明顯的提高。將富集的噬菌體克隆進行ELISA鑒定，隨機挑取18個陽性克隆進行測序。分析后得到包含序列1的上述9種結合肽。
實施例4.不同滴度的序列1噬菌體對RN6390B菌株TRAP蛋白磷酸化水平的影響將不同滴度的序列1噬菌體與RN6390B金葡菌共培養后，檢測TRAP蛋白磷酸化的水平，結果顯示序列1噬菌體能夠抑制RN6390B金葡菌TRAP磷酸化水平，隨著序列1克隆滴度的增加，TRAP蛋白的磷酸化水平降低(附圖3，圖中1表示無關噬菌體與金葡菌培養，2表示PBS與金葡菌培養，3表示1×1010序列1噬菌體和金葡菌共培養，4表示3×1010序列1噬菌體和金葡菌共培養，5表示6×1010序列1噬菌體和金葡菌共培養)。
實施例5.利用細胞模型檢測序列1噬菌體克隆活性選擇不同滴度的序列1噬菌體克隆，利用了MDBK細胞模型測定其對金葡菌外毒素分泌水平的影響。結果顯示隨著噬菌體滴度的增加，金葡菌的培養上清對MDBK細胞的殺傷作用在逐漸降低，這表明該噬菌體能夠有效的抑制金葡菌外毒素的分泌(附圖4，圖中0表示正常金葡菌培養上清，1表示1×1010序列1噬菌體和金葡菌共培養上清，2表示3×1010序列1噬菌體和金葡菌共培養上清，3表示6×1010序列1噬菌體和金葡菌共培養上清)。
序列表<110> 中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所海南通用同盟藥業有限公司<120> 能夠與金葡菌毒力因子調控蛋白結合的小分子多肽及其醫藥用途<130>
<160> 9<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 12<212> PRT<213>
<400> 1Ala Thr Trp Ser His His Leu Ser Ser Ala Gly Leu1 5 10<210> 2<211> 12<212> PRT<213>
<400> 2His Trp Asp Pro Phe Ser Leu Ser Ala Tyr Phe Pro1 5 10<210> 3<211> 12<212> PRT<213>
<400> 3Ala Ser Thr Ala His Arg His Ala Phe Tyr Trp Val1 5 10<210> 4<211> 12<212> PRT
<213>
<400> 4Ser Ala Phe His His Tyr Ser Ala Leu Ala Asp Leu1 5 10<210> 5<211> 12<212> PRT<213>
<400> 5Ala Thr Ser His Leu His Val Arg Leu Pro Ser Lys1 5 10<210> 6<211> 12<212> PRT<213>
<400> 6Trp His Asn Glu Trp Trp Ser Pro Phe Pro Met Asp1 5 10<210> 7<211> 12<212> PRT<213>
<400> 7Ser His Pro Trp Asn Ala Gln Arg Glu Leu Ser Val1 5 10<210> 8<211> 12<212> PRT<213>
<400> 8Asp Arg Met Leu Leu Pro Phe Asn Leu Leu Ala Leu
1 5 10<210> 9<211> 12<212> PRT<213>
<400> 9Phe Ala Pro Trp Asp Thr Ala Ser Phe Met Leu Gly1 5 10
權利要求
1.能夠與金葡菌毒力因子調控蛋白TRAP結合的小分子肽，具有下述(1)或(2)所述氨基酸序列(1)包含序列表所示氨基酸序列之一的氨基酸序列；(2)對(1)序列中的一個或幾個氨基酸殘基進行替換而成的氨基酸序列。
2.權利要求1所述的小分子肽，其特征在于它具有序列表所示氨基酸序列之一的氨基酸序列。
3.權利要求1或2所述的小分子肽在制備抗金葡菌感染藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一組能夠與金葡菌毒力因子調控蛋白TRAP結合的小分子肽，這些小分子肽具有序列表所示氨基酸序列。本發明的多肽可用于制備新型抗金葡菌感染藥物。
文檔編號A61K38/00GK1569891SQ0315020
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月21日 優先權日2003年7月21日
發明者邵寧生, 楊光, 柳川, 高亞萍, 董潔, 丁紅梅, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所, 海南通用同盟藥業有限公司