促胰島素分泌肽及其用途的制作方法

專利名稱：促胰島素分泌肽及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，更具體地說，涉及用于治療糖尿病的促胰島素分泌肽、其制備方法、包含該促胰島素分泌肽的組合物及其用途。
背景技術：
胰高血糖素類似肽(Glucogan Like Peptide 1，簡稱GLP-1，其氨基酸序列為HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG)是體內分泌的、具有在血糖濃度較高情況下促進胰島素分泌的生物活性多肽。根據這一特點，GLP-1受到廣泛重視，期望能開發成治療糖尿病的新一代藥物。但是大量的研究結果表明，GLP-1無法作為藥物在臨床使用，原因是GLP-1非常不穩定，在人體內會迅速降解，因此無法發揮其功能。研究表明，GLP-1的極端不穩定性來自兩方面1)其N-端的His-Ala很容易被體內的二肽酶特異性降解(Deacon等人，Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism，臨床內分泌學和代謝雜志，1995.80p.952-57.)。2)其C-端的結構較松散，因此多肽分子很不穩定(Neidigh等人，Biochemistry，生物化學，2001.40(44)p.13188-200.)。
通過比較GLP-1與其他多肽的序列，人們發現北美大毒蜥唾液中分泌的伸展蛋白4(Exendin-4，簡稱EX4，其氨基酸序列為HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)與GLP-1有一定的同源性。進一步的研究表明，伸展蛋白4具有與GLP-1同樣的促胰島素分泌的功能，但是其穩定性卻明顯高于GLP-1。基于這些優點，各國科學家對伸展蛋白4進行了廣泛的研究，目前伸展蛋白4在美國正進行第三期臨床試驗，主要用于治療II型(非胰島素依賴型)糖尿病。
迄今為止的臨床研究結果表明，伸展蛋白4具有明顯的降血糖作用，對II型糖尿病有很好的療效。同現有的治療糖尿病的磺脲類、雙胍類、胰島素等藥物相比，伸展蛋白4具有許多明顯的優勢。目前臨床常用的磺脲類、雙胍類藥物主要是刺激胰島細胞分泌胰島素，但是不能改善胰島細胞的功能。隨著病情的發展，胰島細胞產生胰島素的功能逐漸喪失，這些藥物會完全失效，病人需要改用注射胰島素治療，每年有10％的病人會轉用胰島素，病人需要每天注射胰島素并不斷增加劑量才有可能維持病情的穩定。當胰島素使用到一定程度時，病人體內的胰島素受體也會逐漸失去活性，導致胰島素治療的無效。伸展蛋白4不僅能促進胰島細胞產生、分泌胰島素，還能刺激胰島細胞的分化、增殖，改善胰島細胞的功能，從而從根本上達到治療糖尿病的目的(Movassat等人，Journal of ClinicalEndocrinology&Metabolism，臨床內分泌學和代謝雜志，2002.87(10)p.4775-81.)。除了作用于胰島細胞，伸展蛋白4還能直接作用于肝臟和肌肉細胞，通過不依賴胰島素的途徑抑制糖元的降解和促進糖元的合成，達到降血糖的作用(Alcantara等人，Archives of Biochemistry&Biophysics，生物化學和生物物理檔案，1997.341(1)p.1-7.)。另外，外源注射的胰島素在任何血糖濃度下均有降血糖的作用，因而在劑量不當的情況下會導致血糖過低，引起病人休克、昏迷等現象。但是伸展蛋白4只有在高血糖濃度時才具有降血糖的作用，而在正常血糖濃度下則不發揮作用，因而不會有胰島素的副作用(Vella等人，Diabetologia，糖尿病學雜志，2002.45(10)p.1410-5.)。伸展蛋白4還能夠通過抑制胃排空而抑制糖尿病病人的食欲，從而有助于治療糖尿病(Edwards等人，American Journal of PhysiologicalEndocrinology&Metabolism，美國生理內分泌學和代謝雜志，2001.281(1)p.E155-61.)。伸展蛋白4這方面的優點也是其他糖尿病藥物所不具備的。
但是，伸展蛋白4也有其缺點，主要是副作用較強，會導致惡心、嘔吐、甚至休克等副作用。由于副作用較強，目前伸展蛋白4的臨床劑量范圍非常窄，劑量也很小，需要每天注射兩次，很不方便。雖然導致伸展蛋白4副作用的原因目前還不十分明確，但是可以推測，這可能是由于伸展蛋白4是北美大毒蜥唾液中分泌的多肽，是人體的外源物質的緣故。
因此，人們迫切希望開發一種活性更高、穩定性更好而且副作用較低的用于治療糖尿病的藥物。

發明內容
本發明的目的在于開發一類具有高活性、高穩定性、低副作用的促胰島素分泌肽，使之成為新一代治療糖尿病的藥物。
本發明人考慮到GLP-1具有較好生物活性和伸展蛋白4具有較好生物穩定性的特點，設計出一類促胰島素分泌肽(Super-insulinotropic Peptide，簡稱SIP)，該類促胰島素分泌肽中最具代表性的優選例子有下列4種SIP-1HXEGTFTSDVSKYMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSSIP-2HGEGTFTSDVSKYMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSSIP-3HSQGTFTSDVSKYMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSSIP-4Ac-HXEGTFTSDVSKYMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS本發明人對此進行了大量的實驗研究，結果表明，該類促胰島素分泌肽具有遠高于GLP-1的穩定性和明顯優于EX-4的生物活性，據此可以判斷，本發明的促胰島素分泌肽能夠達到上述本發明的目的。由于這一研究成果，從而完成了本發明。
也就是說，本發明的技術方案如下一種促胰島素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列為NH2-His AA1AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5 Met Glu Glu Glu AlaVal Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly AlaPro Pro Pro Ser-COOH，其中各符號的定義如下His組氨酸，Ala丙氨酸，Glu谷氨酸，Gly甘氨酸，Thr蘇氨酸，Phe苯丙氨酸，Ser絲氨酸，Asp天門冬氨酸，Val纈氨酸，Tyr酪氨酸，Leu亮氨酸，Gln谷氨酰胺，Lys賴氨酸，Ile異亮氨酸，Trp色氨酸，Met甲硫氨酸，Arg精氨酸，Asn天門冬酰胺，Pro脯氨酸；AA1為中性或疏水性氨基酸，優選為選自D-丙氨酸、絲氨酸、β-丙氨酸、甘氨酸中的任一種，更優選是D-丙氨酸或甘氨酸，最優選是D-丙氨酸；AA2為側鏈帶有負電荷的酸性氨基酸，優選為選自谷氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸中的任一種，更優選是谷氨酸或谷氨酰胺，最優選是谷氨酸；AA3優選是選自纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸中的任一種，更優選是纈氨酸；AA4優選是賴氨酸或精氨酸，更優選是賴氨酸；AA5優選是酪氨酸或苯丙氨酸，更優選是酪氨酸。
上述的促胰島素分泌肽，其特征在于，其羧基端具有選自氨基、疏水基團和大分子載體基團中的任一種基團作為保護基，其中優選是氨基。
上述的促胰島素分泌肽，其特征在于，其氨基端具有選自乙酰基、疏水基團和大分子載體基團中的任一種基團作為保護基，其中優選是乙酰基。
上述的促胰島素分泌肽，其特征在于，上述的疏水基團為選自芐氧羰基、丹酰基、叔丁氧羰基中的任一種基團；上述的大分子載體基團為選自脂質-脂肪酸軛合物、聚乙二醇和碳水化合物中的任一種基團。
上述的促胰島素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列為下述氨基酸序列的任何一種SIP-1NH2-His D-Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys TyrMet Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys AsnGly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2SIP-2NH2-His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys TyrMet Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys AsnGly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2SIP-3NH2-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr MetGlu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn GlyGly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2SIP-4Ac-His D-Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys TyrMet Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys AsnGly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2一種藥物組合物，其特征在于，它含有上述任一項所述的促胰島素分泌肽和可藥用的常規輔料。
一種藥物制劑，其特征在于，它含有上述任一項所述的促胰島素分泌肽或上述的藥物組合物，其劑型為粉針劑、注射劑、噴霧劑和口服劑中的任一種。
本發明還提供了上述的促胰島素分泌肽或藥物組合物用于制備治療糖尿病或肥胖癥的藥物制劑的用途。
另外，本發明還提供了促胰島素分泌肽的制備方法，其特征在于，該方法為固相多肽化學合成法。
下面對本發明技術方案中的一些問題進行解釋。
在上述技術方案中給出的氨基酸序列左端的NH2-為氨基酸(本發明中為組氨酸His)所固有的氨基，而氨基酸序列右端的-COOH為氨基酸(本發明中為絲氨酸Ser)所固有的羧基。上述左端的氨基和右端的羧基由于是氨基酸所固有的，因此也可以不寫出，在此情況下也表示在該氨基酸序列的左端為氨基，右端為羧基，二者的次序不能顛倒。
另外，在上述氨基酸序列SIP-1～SIP-4的右端寫明的酰氨基-CONH2是該氨基酸序列的羧基端的保護基，而上述技術方案中所說的羧基端具有氨基作為保護基是指在引入氨基后，通過氨基與羧基的反應生成的酰氨基-CONH2對該氨基酸序列的右端(即羧基端)起到保護作用。上述氨基酸序列SIP-1～SIP-4皆為這種情況。另外，上述技術方案中所說的氨基端具有乙酰基作為保護基是指在引入乙酰基后，通過乙酰基與氨基的反應生成的乙酰氨基(表示為Ac-)對該氨基酸序列的左端(即氨基端)起到保護作用。上述氨基酸序列SIP-4屬于這種情況。
下面對本發明進行詳細的描述。
促胰島素分泌肽是GLP-1和伸展蛋白4的雜合體，其氨基端部分與GLP-1氨基端部分相同或相似；其羧基端部分與伸展蛋白4的羧基端部分相同或相似。因為GLP-1的N-端(氨基端)是其結合受體而發揮其生物學功能的重要部分，因此需要保留這段序列；但是為了避免二肽酶的降解，需要將第二位的L-丙氨酸(L-Ala)進行改變。為了盡可能地保持促胰島素分泌肽的活性，改變后的氨基酸與L-丙氨酸相似，這些氨基酸包括D-丙氨酸(D-Ala)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)等側鏈較短且不帶電荷的氨基酸。
GLP-1第3位的氨基酸殘基是谷氨酸(Glu)，是二肽酶識別位點的一部分，因此將此氨基酸殘基改變成與谷氨酸相似的氨基酸，如谷氨酰胺(Gln)或天門冬氨酸(Asp)，這樣會增強促胰島素分泌肽的穩定性，而不影響其活性。
GLP-1第10位的氨基酸是纈氨酸，伸展蛋白4第10位的氨基酸是亮氨酸，都是側鏈較大的疏水性氨基酸，對促胰島素分泌肽的生物活性有重要影響，因此我們將該位點的氨基酸殘基設計為纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)或異亮氨酸(Ile)等側鏈較大的疏水性氨基酸。
伸展蛋白4結構分析結果表明，其第12位的賴氨酸參與形成離子鍵，有助于其穩定性，因此該位的氨基酸設計為側鏈帶正電荷的堿性氨基酸，如賴氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)。
伸展蛋白4和GLP-1在第13位的氨基酸殘基有很大的不同，為了保持GLP-1的高活性，促胰島素分泌肽的第13位氨基酸選用GLP-1中的氨基酸，即酪氨酸(Tyr)，或相似的帶有苯環的氨基酸，如苯丙氨酸(Phe)。
結構分析結果表明，GLP-1的C-端(羧基端)結構非常松散，但是伸展蛋白4的C-端(羧基端)結構卻非常緊密，能夠大大增強多肽的穩定性，因此本發明中促胰島素分泌肽的C-端(包括第14位至第39位氨基酸)選用伸展蛋白4的C-端序列。
根據多肽的特點，為了增加其穩定性，本發明人將某些促胰島素分泌肽的氨基端用氨基保護基團保護，例如由引入的乙酰基與原有的氨基反應而生成的乙酰氨基；將某些促胰島素分泌肽的羧基端用羧基保護基團保護，例如由引入的氨基與原有的羧基反應而生成的酰胺基。
本發明提供了促胰島素分泌肽的制備方法，該方法為固相多肽化學合成。
根據促胰島素分泌肽的氨基酸組成特點，本發明人選擇Fmoc固相多肽合成的方法進行多肽的人工合成，然后利用高效液相色譜法(HPLC)對粗產品進行純化。
固相多肽合成的基本原理可歸納如下按照目標多肽的氨基酸序列，從羧基端開始，將氨基端和側鏈均被保護的氨基酸依次連接在不溶性的高分子樹脂上，從而形成相應的多肽分子。每連接一個氨基酸稱為一個周期，每個周期簡單的說包括三個組成部分第一、去掉前一個氨基酸氨基端的保護基；第二、通過形成新的共價酰胺鍵(肽鍵)，將下一個氨基端帶保護基的氨基酸的羧基端與前一個氨基酸的氨基端偶聯；第三、前兩部分之間的過濾清洗過程。在肽鏈的延伸完成后，將多肽從樹脂上洗脫下來從而得到粗產品。
固相合成法將逐步延伸的肽鏈連接在不溶性的高分子樹脂上，通過使用簡單的過濾清洗的方法，將過量的試劑及反應中產生的副產物清除，從而簡化了中間產物的分離純化步驟，降低了中間過程中產品的損失，具有液相合成法無可比擬的優越性。而且過濾清洗的方法操作簡單，整個合成過程完全程序化、自動化，大大提高了生產效率。促胰島素分泌肽的氨基酸序列很長，在39個左右，遠遠超出了常規液相合成法的適應范圍，因此，固相合成法是唯一的選擇。
本發明提供了促胰島素分泌肽的生物活性檢測方法。
用GLP-1或伸展蛋白4刺激大鼠胰島瘤細胞RIN會特異性激活細胞內胰島素基因的啟動子，產生胰島素分泌到細胞培養液中，通過檢測培養液中胰島素的含量可以測量這些多肽的生物活性。但是，胰島素含量的測定需要特殊的檢測試劑盒，價格昂貴，操作復雜。為了建立一種操作簡便、可靠、靈敏度高的檢測方法，本發明人將報告基因熒光素酶克隆到大鼠胰島素基因啟動子下游，當用促胰島素分泌肽刺激細胞時，胰島素基因啟動子被激活，導致熒光素酶的表達。這樣，通過測定細胞裂解液中熒光素酶的活性就可以測定促胰島素分泌肽的生物活性。
本發明提供了促胰島素分泌肽的穩定性檢測方法。
為了研究促胰島素分泌肽在人體內的穩定性，本發明人利用人血漿模擬體內的條件，將促胰島素分泌肽加入到血漿中，37℃溫浴后，取樣加入到上述活性檢測細胞培養液中，通過分析刺激細胞熒光素酶活性的增加檢測所保留的生物活性。
本發明提供了一種促胰島素分泌肽的藥物組合物。
為了研究促胰島素分泌肽作為藥物的可行性，本發明人在含有促胰島素分泌肽的溶液中添加甘露醇和人血白蛋白，用磷酸緩沖液調節酸堿度至中性，制成藥物組合物，冷凍干燥后，發現可明顯增加促胰島素分泌肽的保存期限，而不影響促胰島素分泌肽的生物活性。
與本領域的同類現有技術相比，本發明涉及的促胰島素分泌肽具有如下有益效果促胰島素分泌肽具有高于伸展蛋白4的促胰島素分泌活性，具有遠高于GLP-1的穩定性，促胰島素分泌肽的穩定性也高于伸展蛋白4。因此，本發明的促胰島素分泌肽能在提高藥物有效性的同時，降低給藥劑量，在治療糖尿病和控制飲食方面既能提高療效，又可降低毒副作用。


圖1是促胰島素分泌肽1、2、3、4與伸展蛋白4和GLP-1的序列比較圖；圖2是促胰島素分泌肽1高效液相純度分析圖；圖3是報告載體pGL3-RIP-Luc的構建圖。
圖4是促胰島素分泌肽1、2、3、4與GLP-1和伸展蛋白4生物活性比較圖。
圖5是促胰島素分泌肽1、2、3、4與GLP-1和伸展蛋白4穩定性比較圖。
在圖1中，SIP-1、2、3、4分別代表促胰島素分泌肽1、2、3、4，EX-4代表伸展蛋白4。圖中氨基酸代號如下H組氨酸(His)，A丙氨酸(Ala)，E谷氨酸(Glu)，G甘氨酸(Gly)，T蘇氨酸(Thr)，F苯丙氨酸(Phe)，S絲氨酸(Ser)，D天門冬氨酸(Asp)，V纈氨酸(Val)，Y酪氨酸(Tyr)，L亮氨酸(Leu)，Q谷氨酰胺(Gln)，K賴氨酸(Lys)，I異亮氨酸(Ile)，W色氨酸(Trp)，XD-丙氨酸(D-Ala)，M甲硫氨酸(Met)，R精氨酸(Arg)，N天門冬酰胺(Asn)，P脯氨酸(Pro)；Ac乙酰基。
在圖2中，促胰島素分泌肽1純化后，利用HPLC方法檢測其純度，檢測方法見實施例1。
在圖3中，大鼠胰島素啟動子(Rat Insulin Promoter，RIP)序列(-410至9)利用聚合酶鏈式反應(PCR)方法從大鼠基因組DNA中擴增出來，通過所用的寡聚核苷酸引物在兩端引進BgIII的StuI酶切位點，經酶切后克隆到報告基因熒光素酶(Luciferase，Luc)上游。最終產物報告載體pGL3-RIP-Luc中的箭頭代表轉錄起始。
在圖4中，SIP-1、2、3、4分別代表促胰島素分泌肽1、2、3、4，EX-4代表伸展蛋白4。報告細胞系RIN-RIP-Luc用10nM的促胰島素分泌多肽刺激后，裂解細胞，測定細胞中熒光素酶的活性，分別用多肽刺激后細胞中熒光素酶活性除以未經多肽刺激的細胞中熒光素酶活性，計算出多肽所刺激的熒光素酶活性增加倍數，此值越大，表明多肽的活性越高。圖中結果為三次試驗結果的平均值。
在圖5中，SIP-1、2、3、4分別代表促胰島素分泌肽1、2、3、4，EX-4代表伸展蛋白4。多肽在人血漿中溫浴2小時后，加入到報告細胞RIN-RIP-Luc培養液中，測定生物活性，分別用多肽刺激后細胞中熒光素酶活性除以未經多肽刺激的細胞中熒光素酶活性，計算出多肽所刺激的熒光素酶活性增加倍數。圖中結果為三次試驗結果的平均值。
下面通過本發明的幾個優選實施例，對本發明做更詳細的描述。
實施例1一、促胰島素分泌肽1(SIP-1)的氨基酸序列SIP-1NH2-His AA1 AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys AsnGly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
其中AA1為D-Ala，AA2為Glu，AA3為Val，AA4為Lys，AA5為Tyr。
二、利用固相多肽化學合成方法制備促胰島素分泌肽1具體操作步驟如下1.選擇Rink Amide樹脂，準確稱取1.0克樹脂，置于與ACT90固相合成儀配套的反應器中，按每克樹脂10毫升溶液的比例，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分別清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。
2.根據樹脂的取代常數(即每克樹脂能連接的多肽分子的摩爾數)0.8mmol/g，按1∶3∶3∶7的比例，稱取Fmoc保護的羧基端第一個氨基酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)、交聯試劑HBTU和二異丙基乙基胺，溶于10ml二甲基甲酰胺中，加入固相合成儀的反應器中，室溫振蕩，反應2小時。抽濾除去反應液后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷各清洗樹脂兩次，并抽濾除去溶劑。
3.加入10ml 20％六氫吡啶/二甲基甲酰胺，室溫振蕩，反應30分鐘，去掉氨基端Fmoc保護基。抽濾除去溶劑后，再分別用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷各清洗樹脂兩次，抽濾除去溶劑。
4.重復第2、3步，除第3步中加入的Fmoc保護氨基酸根據肽鏈從羧基端到氨基端的序列而改變以外，其它條件不變，步驟相同。如此循環，直至完成在樹脂上肽鏈的延伸。清洗完全的樹脂真空干燥過夜。
5.將樹脂轉移到250ml圓底燒瓶中，按每克帶肽鏈的樹脂加20ml切割液(95％三氟乙酸/5％水)的比例加入切割液，室溫攪拌1-3小時。抽濾將樹脂與濾液分離，向濾液中加入2000ml、0℃的乙醚，離心將沉淀與乙醚分離，干燥后得促胰島素分泌肽粗品。
促胰島素分泌肽粗品的HPLC純化方法干燥后的促胰島素分泌肽粗品溶于1％乙酸，目標濃度為20mg/ml.用反相高效液相色譜系統，經梯度洗脫分離后，收集主峰流份，經合并再冷凍抽干后得促胰島素分泌肽純品。色譜條件如下色譜儀Varian液相色譜儀ProStarSD-10及其操作分析軟件；
色譜柱Dynamax Analytical C18色譜柱(4.6×250毫米)；流動相A0.1％三氟乙酸/10％乙腈/水；B0.1％三氟乙酸/90％乙腈/水；洗脫梯度30-50％B流動相，30分鐘；流速1.0毫升/分鐘；紫外檢測波長220納米。
粗產物經HPLC純化后純度大于95％(分析結果見附圖2)。
為了確證所合成、純化產物的正確性，對純化后的促胰島素分泌肽1進行了質譜分析，結果如下分子式C188H283N49O60S1；理論分子量4221.71；測定值4222.0上述結果證明了所合成的促胰島素分泌肽1是正確的多肽分子。
三、促胰島素分泌肽1的生物活性分析首先將報告基因熒光素酶克隆到大鼠胰島素基因啟動子下游，構建報告載體pGL3-RIP-Luc(質粒的構建見附圖3)，做法如下大鼠胰島素啟動子(Rat Insulin Promoter，RIP)序列(核苷酸-410至9位)利用聚合酶鏈式反應(PCR)方法從大鼠基因組DNA中擴增出來，通過所用的寡聚核苷酸引物在兩端引進BglII的StuI酶切位點，經酶切后克隆到質粒pGL3-Luc(購自美國Promega公司)中報告基因熒光素酶(Luciferase，Luc)的上游，產生pGL3-RIP-Luc。
將對照質粒pGL3-Luc或報告載體質粒pGL3-RIP-Luc與表達Puro篩選標記的質粒pBabe-puro以10∶1的比例用磷酸鈣沉淀法共轉染到RIN細胞中，然后用5微克/毫升的Puromycin篩選被轉染的細胞，建立含有pGL3-RIP-Luc報告載體的細胞系RIN-RIP-Luc，及含有對照空載體pGL3-Luc的對照細胞系RIN-Luc。
為了分析比較GLP-1、伸展蛋白4(EX-4)、促胰島素分泌肽1(SIP-1)的生物活性，RIN-Luc和RIN-RIP-Luc細胞首先在無血清培養基中培養24小時，然后分別加入上述多肽，使終濃度為10nM，2小時后，將含多肽的無血清培養基換成正常培養基，再經24小時后裂解細胞，利用熒光照度計(購自美國Turner Designs公司)測定裂解液中熒光素酶的含量，用多肽刺激后細胞中熒光素酶活性除以未經多肽刺激的細胞中熒光素酶活性，計算出多肽所刺激的熒光素酶活性增加倍數，即為多肽的生物活性，增加倍數越高，表明多肽的生物活性越高，結果見附圖4。
結果表明，RIN-Luc對照細胞中有一定量的熒光素酶表達，但是對上述多肽刺激沒有反應，而RIN-RIP-Luc細胞經多肽刺激后熒光素酶的活性有所增加，表明多肽刺激熒光素酶活性增加是通過RIP啟動子實現的。圖中結果還表明，SIP-1具有高于EX-4和GLP-1的生物活性。
四、促胰島素分泌肽1的穩定性分析為了研究促胰島素分泌肽在人體內的穩定性，本發明實例中利用人血漿模擬體內的條件。將2微克的各種促胰島素分泌肽分別加入到1毫升的血漿中，37℃溫浴2小時后，取50微升加入到1毫升RIN-RIP-Luc細胞培養液中(相當于多肽未降解濃度25nM)，通過分析刺激細胞熒光素酶活性的增加檢測所保留的生物活性，以未經處理的多肽的活性作為對照，計算出活性保留百分率，試驗結果見附圖5。
圖中結果表明，GLP-1具有非常低的穩定性，經與人血漿37℃溫浴2小時后活性幾乎完全喪失；EX-4和促胰島素分泌肽1(SIP-1)的活性保留率則分別為77％和78％，表明促胰島素分泌肽1的穩定性遠高于GLP-1，與伸展蛋白4相似。
五、促胰島素分泌肽1藥物組合物為了研究促胰島素分泌肽1作為藥物的可行性，根據多肽類藥物的常用藥物組合物制備方法，本發明人在含有10微克/毫升促胰島素分泌肽1的溶液中添加5毫克/毫升甘露醇和1毫克/毫升人血白蛋白，用磷酸緩沖液調節酸堿度至pH6-8，制成藥物組合物，冷凍干燥后，樣品更容易鑒別，外觀也更美觀，而且可使促胰島素分泌肽的保存期限達到1年以上，而不影響生物活性。
實施例2一、促胰島素分泌肽2(SIP-2)的氨基酸序列SIP-2NH2-His AA1 AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
其中AA1為Gly，AA2為Glu，AA3為Val，AA4為Lys，AA5為Tyr。
二、利用固相多肽化學合成方法制備促胰島素分泌肽2具體操作步驟與發明實例1中相應方法相同。
為了確證所合成、純化產物的正確性，對純化后的促胰島素分泌肽2進行了質譜分析，結果如下分子式C187H281N49O60S1；理論分子量4207.68；測定值4207.4上述結果證明了所合成的促胰島素分泌肽2是正確的多肽分子。
三、促胰島素分泌肽2(SIP-2)的生物活性分析具體操作步驟與發明實例1中相應方法相同，結果見附圖4。
圖中結果表明，SIP-2具有高于伸展蛋白4和GLP-1的生物活性。
四、促胰島素分泌肽2(SIP-2)的穩定性分析具體操作步驟與發明實例1中相應方法相同，結果見附圖5。
結果表明，SIP-2的穩定性遠高于GLP-1，與伸展蛋白4相近。
實施例3一、促胰島素分泌肽3(SIP-3)的氨基酸序列SIP-3NH2-His AA1 AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys AsnGly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
其中AA1為Ser，AA2為Gln，AA3為Val，AA4為Lys，AA5為Tyr。
二、利用固相多肽化學合成方法制備促胰島素分泌肽3具體操作步驟與發明實例1中相應方法相同。
為了確證所合成、純化產物的正確性，對純化后的促胰島素分泌肽3進行了質譜分析，結果如下分子式C188H284N50O60S1；理論分子量4236.72；測定值4236.3上述結果證明了所合成的促胰島素分泌肽3是正確的多肽分子。
三、促胰島素分泌肽3(SIP-3)的生物活性分析具體操作步驟與發明實例1中相應方法相同，結果見附圖4。
結果表明，SIP-3具有高于伸展蛋白4和GLP-1的生物活性。
四、促胰島素分泌肽3(SIP-3)的穩定性分析具體操作步驟與發明實例1中相應方法相同，結果見附圖5。
結果表明，SIP-3的穩定性遠高于GLP-1，與伸展蛋白4相近。
實施例4一、促胰島素分泌肽4(SIP-4)的氨基酸序列SIP-4Ac-His AA1 AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys AsnGly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
其中AA1為D-Ala，AA2為Glu，AA3為Val，AA4為Lys，AA5為Tyr。
二、利用固相多肽化學合成方法制備促胰島素分泌肽4具體操作步驟與發明實例1中相應方法基本相同，只是在肽鏈合成完成后，用乙酸酐將其氨基端乙酰化。
為了確證所合成、純化產物的正確性，對純化后的促胰島素分泌肽4進行了質譜分析，結果如下分子式C190H285N49O61S1；理論分子量4263.75；測定值4263.9上述結果證明了所合成的促胰島素分泌肽4是正確的多肽分子。
三、促胰島素分泌肽4(SIP-4)的生物活性分析具體操作步驟與發明實例1中相應方法相同，結果見附圖4。
結果表明，SIP-4具有高于伸展蛋白4和GLP-1的生物活性。
四、促胰島素分泌肽4(SIP-4)的穩定性分析具體操作步驟與發明實例1中相應方法相同，結果見附圖5。
結果表明，SIP-4的穩定性遠高于GLP-1，也明顯高于伸展蛋白4。
綜上所述，本發明的促胰島素分泌肽SIP-1～4具有高于EX-4的促胰島素分泌活性和穩定性，尤其是其穩定性遠高于GLP-1。因此，本發明的促胰島素分泌肽可以在提高藥物有效性的同時，降低給藥劑量并因此可降低毒副作用。從而可以推斷，本發明的促胰島素分泌肽可用于制備治療糖尿病及肥胖癥的藥物制劑。
序列表<110>北京中科亞光生物科技有限公司<120>促胰島素分泌肽及其用途<130>PF030030CNI，Deng Dingji，Zhongzi Law Office<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>胰高血糖素類似肽(Glucogan Like Peptide 1，簡稱GLP-1)<400>1His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly20 25<210>2<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>伸展蛋白4(Exendin-4，簡稱EX4)<400>2His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>3<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>SIP-1<220><221>MISC FEATURE<222>(2)..(2)<223>D-Ala<400>3His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>4<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>SPI-2<400>4His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>5<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>SPI-3<400>5His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>6<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>SPI-4<220><221>MISC FEATURE<222>(2)..(2)<223>D-Ala<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙酰化<400>6His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser3權利要求
1.一種促胰島素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列為NH2-HisAA1 AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5 Met Glu GluGlu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser-COOH，其中AA1中性或疏水性氨基酸；AA2側鏈帶有負電荷的酸性氨基酸；AA3疏水性氨基酸；AA4側鏈帶正電荷的堿性氨基酸；AA5側鏈帶有苯環的氨基酸。
2.如權利要求1所述的促胰島素分泌肽，其特征在于，上述的AA1是選自D-丙氨酸、絲氨酸、β-丙氨酸、甘氨酸中的任一種，上述的AA2是選自谷氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸中的任一種；上述的AA3是選自纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸中的任一種；上述的AA4是賴氨酸或精氨酸；上述的AA5是酪氨酸或苯丙氨酸。
3.如權利要求2所述的促胰島素分泌肽，其特征在于上述的AA1是D-丙氨酸或甘氨酸；上述的AA2是谷氨酸或谷氨酰胺；上述的AA3是纈氨酸；上述的AA4是賴氨酸；上述的AA5是酪氨酸。
4.如權利要求3所述的促胰島素分泌肽，其特征在于，上述的AA1是D-丙氨酸；上述的AA2是谷氨酸。
5.如權利要求1所述的促胰島素分泌肽，其特征在于，其羧基端具有選自氨基、疏水基團和大分子載體基團中的任一種基團作為保護基。
6.如權利要求5所述的促胰島素分泌肽，其特征在于，其羧基端具有氨基作為保護基。
7.如權利要求1所述的促胰島素分泌肽，其特征在于，其氨基端具有選自乙酰基、疏水基團和大分子載體基團中的任一種基團作為保護基。
8.如權利要求7所述的促胰島素分泌肽，其特征在于，其氨基端具有乙酰基作為保護基。
9.如權利要求5或7所述的促胰島素分泌肽，其特征在于，上述的疏水基團為選自芐氧羰基、丹酰基、叔丁氧羰基中的任一種基團；上述的大分子載體基團為選自脂質-脂肪酸軛合物、聚乙二醇和碳水化合物中的任一種基團。
10.如權利要求1～6中的任一項所述的促胰島素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列為NH2-His D-Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser AspVal Ser Lys Tyr Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu TrpLeu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
11.如權利要求1～6中的任一項的促胰島素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列為NH2-His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val SerLys Tyr Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu LysAsn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
12.如權利要求1-6中的任一項所述的促胰島素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列為NH2-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp ValSer Lys Tyr Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp LeuLys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
13.如權利要求1-6中的任一項所述的促胰島素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列為Ac-His D-Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser AspVal Ser Lys Tyr Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu TrpLeu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
14.一種藥物組合物，其特征在于，它含有權利要求1～13中任一項所述的促胰島素分泌肽和可藥用的常規輔料。
15.一種藥物制劑，其特征在于，它含有權利要求1～13中任一項所述的促胰島素分泌肽或權利要求14所述的藥物組合物，其劑型為粉針劑、注射劑、噴霧劑和口服劑中的任一種。
16.權利要求1～13中任一項所述的促胰島素分泌肽或權利要求14所述的藥物組合物用于制備治療糖尿病或肥胖癥的藥物制劑的用途。
全文摘要
本發明提供一類促胰島素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列為NH
文檔編號A61P3/10GK1490333SQ03149858
公開日2004年4月21日 申請日期2003年7月30日 優先權日2003年7月30日
發明者袁有榮, 王劼, 宋加賓 申請人:北京中科亞光生物科技有限公司