竹紅菌素水溶性納米粒及用途的制作方法

專利名稱：竹紅菌素水溶性納米粒及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種竹紅菌素與蛋白或多糖生物材料或高分子材料制成的水溶性納米粒和作為光動力藥物靜脈注射針劑的用途。
背景技術：
竹紅菌素，包括竹紅菌甲素(HA)和竹紅菌乙素(HB)，是從特產于我國云南箭竹上的一種寄生真菌—竹紅菌(Hypocrella bambusae(B.et Br.)Sacc.)中提取的一類天然光敏色素。具有單線態氧量子產率高、結構明確、化學修飾性好、暗毒性低、體內代謝快等理想光敏劑的特征，公認是一種最有前景的新型光動力光敏劑。民間曾用竹紅菌素治療胃痛和關節炎，皮膚疾病；現已證明在光動力抗艾滋病毒、抗腫瘤和微血管類疾病有潛在用途。
眾所周知，光對人體組織的穿透深度和光波長成正比，所以通常把腫瘤的光動力醫療窗口規定為600nm-900nm的波長范圍，此波長范圍的光對組織的穿透深度約為幾毫米到1厘米以上。竹紅菌素類光敏劑的主吸收波長在500nm附近，此波長范圍光對組織的穿透深度約1毫米左右，不能滿足實體腫瘤光動力治療的要求；而以600nm以上的紅光激發竹紅菌素，則由于光吸收值低而大大降低其光動力效率。然而，微血管類疾病通常的病灶深度不超過1毫米，恰好與竹紅菌素類光敏劑主吸收光穿透深度相符；而對這種淺表類型的疾病，以長波光照射反而可能會增加對深層正常組織的傷害。因此，竹紅菌素短波長吸收的特性對于光動力醫療實體腫瘤是其劣勢；而對醫療淺表腫瘤和微血管類疾病則成為其獨特的優勢。
竹紅菌素本身是一類脂溶性有機分子，在極性溶劑和血液中會自發聚集而形成毛細血管栓塞；而通過化學修飾獲得的水溶性衍生物在體內細胞攝取率低而大大降低甚至喪失竹紅菌素特有的強光動力功能。因此，微血管疾病光動力藥物必須滿足在血液中的有效傳輸和在病灶上選擇吸附的雙重要求。由于竹紅菌素母體具有很高光敏化效率，而且其光物理性質能很好的滿足微血管類疾病的光動力醫療的要求，因此可以直接采用具有兩親性質的生物相容性材料與脂溶性竹紅菌素分子組裝來改善藥物的物理化學性質，從而滿足臨床光動力藥物的要求。為了達到這一目標，竹紅菌素-膠束、脂質體體系已經進行了大量的研究，取得了重要的進展。但是也存在著不少問題，如膠束體系可以具有較高的穩定性，但卻有缺少對靶體細胞選擇性和雙親材料生物相容性等問題；脂質體具有很高的靶向性和藥物釋放特性，但屬于半流體的脂質體制劑穩定性差，泄漏快，易變質。藥物納米粒具有很好的靶向性并且有很好的穩定性和生物相容性，因此選用作為脂溶性竹紅菌素類光敏劑水溶性改造的一種新方法，力圖提供更好的新劑型。
納米粒為固態膠體顆粒，其尺寸分布可以在10～1000nm之間，可由生物大分子、聚合物等作為藥物載體。納米粒優于其他微粒制劑之處在于其粒子極細(粒子的尺寸可以用制備工藝調控)，能很快分散于水中成透明的膠體分散體系，適宜配制注射針劑供靜脈注射；所用材料便于進一步表面修飾，以實現主動靶向性；成品穩定性較好，尺寸適當，可以使用超過濾法加工除菌，因此，藥物顆粒的粒徑應該小于500納米；可制成緩釋型延長療效；對所包含的藥物有保護作用，可防止氧、介質和體內酶對藥物的破壞；選用適當的材料(明膠和血清白蛋白等)可達到生物相容，毒副作用小并能在體內生物降解等。故自1976年Birrenback首次提出以來引起了各國科學家的廣泛注意。
用于制備納米粒的包封材料有天然生物蛋白、多糖大分子以及可生物降解的高分子聚合物等。制備納米粒的方法主要有大分子聚合物分散法和散單體的聚合法。對于天然生物蛋白和多糖大分子聚合物主要采取前者，而高分子聚合物納米材料主要采取后者。天然生物蛋白可以通過高溫固化法或析出固化法來制得。
Scheffel等人(Scheffel.et al.J.Nucl.Med.，3，1972498-503)通過對白蛋白W/O乳劑的加熱變性來完成的，即白蛋白水溶液室溫下在棉籽油中乳化和乳勻，將乳劑傾入熱油中使大分子物質變性，制備方法簡便，但需用大量的油，余油用少量的有機溶劑多次洗滌除去，為微粒的純化帶來了困難。另外加熱變性對不穩定性藥物可能不利。Widder等(Widder，et al.Proceed.Soc.Exp.Bio.Med.，58，1978141-146)用甲醛或2，3-丁二酮在室溫下對大分子物質進行化學交聯來代替加熱變性。Marty，Oppenheim和Speiser等(Marty J.J.，et al.，Pharm Acta Helv，53，197817-23；Oppenheim，et al.，Austr.J.Pharm.Sci.，7，1978113-117；Australian Patent459261，1978)根據天然大分子物質的去溶劑化作用設計了析出固化法來制備，從而簡化了純化操作。此法是將大分子物質溶于水，再加入硫酸鈉、乙二醇或硫酸銨使其去溶劑化，再用戊二醛交聯。該法已用在明膠和白蛋白納米粒的制備上。Vauthier等人(Vauthier，et al.，Proc.Int.Symp.Contr.Rel.Biaoact.Mater.，18，1991367-368)通過向海藻酸鈉水溶液中加入適量氯化鈣后形成微膠來制備納米粒。殼聚糖納米粒可以由殼聚糖醋酸溶液加凝聚劑多聚磷酸鈉制得(Chandy T，et al.Biomaterials，17(1)，199661-66；袁弘等，中國藥學雜志，37(5)，2002349-352)。
可生物降解的高分子聚合物通過以下方法來聚合制得①膠束聚合法(Micell polymerization method，Kreuter J.et al.Pharm Acta Helv 1978，53(2)33)系將聚合物水溶性單體及藥物溶解于水中，于表面活性劑存在下經攪拌分散至大量疏水介質中(如正己烷)，然后加入引發劑或在γ-射線、X-射線、紫外光或可見光照射下發生聚合而得。②乳化聚合法(Emulsionpolymerization method，Courreur P.et al.US Patent 1982，4329332)系將含有葡聚糖或表面活性劑的酸性溶液中，在機械攪拌下加入水不溶性單體如氰基丙烯酸烷烴酯而制得，其聚合機理是水中的羥基與氰基丙烯酸烷烴酯發生親核反應而聚合。③界面聚合法(Interfacial polymerization method，AlkhouriFallouh N.et al.Int J Pharm 1986，28125)系將藥物與氰基丙烯酸烷烴酯溶于乙醇中，在攪拌下慢慢滴入含有表面活性劑的水溶液中而制得。

發明內容
本發明目的在于提供一類新型的水溶性竹紅菌素納米粒，以滿足光動力藥物在血液中順利傳輸和在細胞表面吸附的雙重要求，發展一種新劑型和提供制備上述水溶性納米粒的新方法，解決竹紅菌素類光敏劑作為光動力藥物的實用化問題；同時采用本發明制成的納米粒具有穩定性高，靶向性及生物可降解性好，同時保持了竹紅菌素類光敏劑強光動力功能的特點，可以溶于水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液，可以方便地配制成竹紅菌素藥物的靜脈注射針劑。
本發明的技術特征是利用天然生物蛋白、多糖類生物大分子或可生物降解的高分子聚合物為包封材料，在助溶劑和分散劑存在下對脂溶性竹紅菌素藥物包封，制成適合于靜脈注射的粒徑為20～200nm的竹紅菌素光動力藥物的水溶性納米粒子。
本發明中所涉及的竹紅菌素包括竹紅菌甲素(HA)、竹紅菌乙素(HB)以及兩種母體的脂溶性衍生物，均屬于4，9-二羥基-3，10-醌衍生物，HA和HB分子式分別為C30H26O10、C30H24O9，分子量分別為546、528，其結構式如下所示 本發明所涉及的納米粒，包封材料中所用的天然生物蛋白選自藥用明膠、阿拉伯膠、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白；多糖類生物大分子選自海藻酸鈉、殼聚糖；高分子聚合材料選自聚丙稀酰胺、聚甲基丙烯酸烷烴酯、聚氰基丙烯酸烷烴酯。
本發明中所述的助溶劑選自吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、司盤-60、司盤-65、司盤-80、司盤-85、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯芳基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯，其濃度為0.5％～3.0％(重量體積百分比)；所述的分散劑選自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、膽固醇、葡聚糖、右旋糖酐，其濃度為0.1～5％(重量體積百分比)。
水溶性納米粒的制備方法已有許多公開報道，如天然生物蛋白一般通過加入高濃度硫酸鹽水溶液作為凝聚劑析出固化法制備水溶性納米粒，其中天然生物蛋白的濃度為1％～5％(重量體積比)，硫酸鹽凝聚劑選自硫酸鈉或硫酸銨，固化劑可選自戊二醛、甲醛；亦可通過其乳化液熱固化制得。海藻酸鈉可以通過加入氯化鈣溶液制得納米粒子，其中海藻酸鈉溶液的濃度為0.01％～2％(重量體積比)，氯化鈣溶液的濃度為0.1％～0.5％(重量體積比)；殼聚糖納米粒可以由殼聚糖醋酸溶液加凝聚劑多聚磷酸鈉制得，其中殼聚糖的濃度為0.1％～0.3％(重量體積比)，醋酸溶液的濃度為0.5％～2％(重量體積比)，多聚磷酸鈉的濃度為0.05％～0.3％(重量體積比)。高分子聚合物可以通過乳化聚合法或界面聚合法聚合而得，其中聚合單體濃度為0.5～5％(重量體積百分比)。但是，由于竹紅菌素藥物的特殊性質，如果按照報道方法采用高濃度的硫酸鈉鹽作為凝聚劑制備竹紅菌素明膠納米粒，在這種高離子性溶液中，脂溶性竹紅菌素藥物會發生自發聚集沉淀而不能被包封。因此在本發明中對報道方法進行了改進，不采用高濃度硫酸鹽而采用醇類作為凝聚劑，并結合改變溫度調控明膠的凝聚。
本發明所制得的水溶性竹紅菌素納米粒具有以下優點1.利用天然生物蛋白、多糖類大分子以及可生物降解的高分子聚合物為包封材料，將脂溶性竹紅菌素藥物進行包封制成適合于靜脈注射的水溶性的粒徑為20～200nm的超微粒，原料廉價易得、制備方法簡單、易操作、不需特別設備、制備工藝成本低；2.所得到的竹紅菌素納米粒具有穩定性高，靶向性及生物可降解性好，同時保持了竹紅菌素類光敏劑強光動力功能的特點；可以溶于水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液，可以方便地配制成竹紅菌素藥物的靜脈注射針劑。


圖1為本發明中竹紅菌乙素納米粒的吸收光譜；圖2為本發明中竹紅菌乙素納米粒的熒光發射光譜；圖3為本發明中采用天然生物蛋白中明膠制成的竹紅菌素納米粒(×26K)的透射電鏡照片；圖4為本發明中采用多糖類大分子中的海藻酸鹽制成的竹紅菌素納米粒(×100K)的透射電鏡照片。
具體實施例方式
在以下實施例中將進一步舉例說明本發明，這些實施例僅用于說明本發明，而對本發明沒有限制。
實施例1將1％～5％(重量體積百分比)藥用明膠溶液5ml，加入0.5％～3.0％(重量體積百分比)的吐溫-80，升溫至30℃～60℃，強烈攪拌下徐徐加入1ml竹紅菌乙素(HB)的DMSO溶液(3mg/ml，其中溶解竹紅菌素所用的溶劑選用二甲基亞砜DMSO)，并加入3ml無水乙醇，然后在低溫下5℃～16℃下超聲1～10分鐘，溶液開始出現強烈的散射光，此時再進行攪拌，升溫至30℃～60℃，散射光消失，如此可循環多次，然后一次性加入固化劑戊二醛0.4ml固化20～40分鐘，透析除去乙醇和DMSO，冷凍干燥得竹紅菌乙素明膠納米粒，冰箱中4℃冷藏。
實施例2將0.02％～0.5％(重量體積百分比)海藻酸鈉水溶液5ml，強烈攪拌下徐徐加入0.5ml竹紅菌乙素(HB)的DMSO溶液(3mg/ml，其中溶解竹紅菌素所用的溶劑選用二甲基亞砜DMSO)，加入0.22ml濃度為0.1～0.5％(重量/體積比，W/V)的氯化鈣水溶液，繼續攪拌20～40分鐘，然后超聲1～10分鐘，最后透析除去DMSO小分子有機溶劑得竹紅菌乙素海藻酸鹽納米粒，冰箱中4℃冷藏。
實施例3殼聚糖溶于1％的醋酸溶液，配制成濃度為0.02～0.5％(重量體積百分比)的溶液，移取5.0ml，在強烈攪拌條件下，加入0.5ml竹紅菌乙素(HB)的DMSO溶液(3mg/ml，其中溶解竹紅菌素所用的溶劑選用二甲基亞砜DMSO)，然后加入2ml濃度為0.1～0.5％的多聚磷酸鈉溶液，繼續攪拌20～30分鐘，然后超聲1～10分鐘，最后透析除去DMSO小分子有機溶劑得竹紅菌乙素殼聚糖納米粒，冰箱中4℃冷藏。
實施例4(乳化聚合法)5.0ml含有0.5～5％(重量體積百分比)氰丙烯酸正丁酯單體的溶液，加入0.1～5％的右旋糖酐為穩定劑，強烈攪拌下加入1ml竹紅菌乙素(HB)的DMSO溶液(3mg/ml，其中溶解竹紅菌素所用的溶劑選用二甲基亞砜DMSO)，稀鹽酸調PH值至1～3，繼續攪拌至乳狀液，室溫下繼續攪拌1～2小時后，用稀氫氧化鈉調PH值至5～7，用G3玻砂漏斗抽慮，即得乳白色納米粒，冰箱中4℃冷藏。
實施例5(界面聚合法)將0.05ml氰基丙烯酸正丁酯、0.4ml三甘油酯溶入10ml乙醇中，并加入1ml竹紅菌乙素(HB)的DMSO溶液(3mg/ml，其中溶解竹紅菌素所用的溶劑選用二甲基亞砜DMSO)，強烈攪拌下緩緩滴加到20ml含0.1～5.0％葡聚糖和0.5～3.0％吐溫-20(重量體積百分比)的水相溶液中，滴加完畢后再于室溫下反應1～2小時，得乳白色懸浮液，于20℃真空旋轉蒸發除去大量乙醇，最后透析除去DMSO小分子有機溶劑得竹紅菌乙素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒，冰箱中4℃冷藏。
竹紅菌素納米粒的表征本發明實施例中竹紅菌乙素明膠及海藻酸鹽納米粒的光物理性質以吸收、熒光光譜和熒光量子產率表征；納米粒的型貌以電子顯微鏡觀測。
(1)光譜測定結果在納米粒中的竹紅菌素的吸收光譜和熒光光譜與它們在脂質體、膠束、蛋白分子微環境中的相似，而與自由竹紅菌素在有機溶劑中光譜有差別，反映了光敏劑分子與脂質、表面活性分子或蛋白微環境之間的弱相互作用特征；與溶解于有機溶劑中的自由竹紅菌素分子相比，包封于脂質體、膠束和納米粒中的竹紅菌素在質子型溶劑(水)中的熒光量子產率有較大的降低(約為有機溶劑中自由竹紅菌素的一半)，說明溶劑中水分子對竹紅菌素熒光的猝滅作用。比較圖1和圖2中相同濃度的竹紅菌乙素明膠納米粒(HB-Gelatin-NP)和竹紅菌乙素海藻酸鹽納米粒(HB-Alginate-NP)熒光發射光譜可以看出，在明膠納米粒體系中的熒光量子產率要高于海藻酸鹽納米粒體系，可能是由于多糖分子結構的骨架型結構和多羥基特點，海藻酸鹽納米粒比明膠納米粒更容易結合水分子，因此對包封其中的竹紅菌素分子的熒光猝滅作用更強。
(2)竹紅菌素納米粒的電鏡觀察將樣品滴在噴碳銅網上，用醋酸雙氧鈾負染后以透射電鏡觀察納米粒的大小及形貌，結果如圖3、圖4所示。透射電鏡照片顯示竹紅菌素明膠納米粒的粒徑為20～200nm，竹紅菌素海藻酸鹽納米粒的粒徑為20～100nm。
竹紅菌素納米粒的光動力功能和用途一般而言，光動力藥物的體內給藥方法可以有多種，但是特別針對血管類疾病的光動力藥物，藥物的靶體是血管內壁細胞或血液中的硬化斑塊，所以最適宜的給藥方法是靜脈注射。如前所述，脂溶性的竹紅菌素分子在極性環境中自發聚集而造成血管栓塞；而水溶性的竹紅菌素衍生物與靶體的親和性低而喪失光動力活性。細胞實驗表明竹紅菌素納米粒既具有良好的水溶性，同時具有高的細胞攝取率和保持了竹紅菌素固有的高光動力活性。本發明中所述的水溶性竹紅菌素納米粒可用于醫療血管類疾病(或其它需要由靜脈注射給藥的疾病)的光動力藥物靜脈注射針劑。如下的細胞實驗結果證明本發明竹紅菌素納米粒的光動力功能和用途。
細胞試驗測定結果體外培養的鼠肺血管內皮細胞(EC)，按5.0×104個/ml的細胞密度接種于96孔細胞培養板，孵育24小時后，加入光敏劑，選取的光敏劑孵育濃度為1μg/ml，繼續孵育內皮細胞4小時后，采用銅蒸汽激光(波長為510.6nm和578.2nm)照射，激光照射的功率密度為20mw/cm2；照射時間為1000秒；能量密度為20J/cm2。其后采用MTT的方法，測定各孔的光密度值。受試的幾種樣品對細胞的殺傷率如下表所示。
內皮細胞OD值與HB對其殺傷率樣品1 樣品2 樣品30.116 0.101 0.1130.101 0.084 0.136各孔0.106 0.081 0.074OD值0.113 0.105 0.0960.096 0.111 0.1100.107 0.087 0.0990.110 0.101 0.097OD平均值0.107 0.09570.104殺傷率 72.0％78.2％73.9％其中樣品1為竹紅菌乙素-多糖納米粒；樣品2為竹紅菌乙素-明膠納米粒；樣品3為竹紅菌乙素脂質體。完全空白對照組OD值平均為0.238286，本底組OD值平均為0.056。
細胞殺傷率如下式得到細胞殺傷率(％)＝1-細胞存活率＝1-(實驗組OD-本底組OD)/(完全空白組OD-本底組OD)×100％在光敏劑濃度為1μg/ml的條件下，以7組樣品平均計算，得到3組光敏劑樣品對受試細胞的殺傷率基本相仿，均大于70％，證明在納米粒中竹紅菌素保持了其特有的強光動力功能。制備后立即使用的竹紅菌乙素-脂質體體系已經成功用于微血管類疾病(鮮紅斑痣、視網膜黃斑變性等)光動力醫療的研究(顧瑛等，專利申請號02116879.2.)，以血管內壁細胞為受試細胞的對比實驗證明竹紅菌素-脂質體對血管內壁細胞的殺傷率比血卟啉衍生物光敏劑高幾十倍。由此可以得到結論本發明中竹紅菌素納米粒保持了竹紅菌素特有的光動力活性，光動力活性遠高于現有光敏劑HpD，可以作為一種竹紅菌素臨床光動力藥物的新劑型；由于納米粒卓越的水溶性，可以用水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液等極性溶劑方便地配制成適當濃度的藥液；本發明獲得的納米粒在20-200納米之間，不會經超濾方法除菌法(濾掉＞500nm成分)濾掉，可以使用超濾除菌法除去細菌。因此本發明竹紅菌素納米粒可以用于血管類疾病(或需要通過靜脈注射給藥的疾病)臨床光動力治療的竹紅菌素類藥物靜脈注射針劑。
權利要求
1.竹紅菌素水溶性納米粒，其特征在于利用天然生物蛋白、多糖類生物大分子或可生物降解的高分子聚合物為包封材料，在助溶劑和分散劑存在下對脂溶性竹紅菌素藥物包封，制成適合于靜脈注射的粒徑為20～200nm的竹紅菌素光動力藥物的水溶性納米粒子。
2.根據權利要求1所述的竹紅菌素水溶性納米粒，其特征在于所述的竹紅菌素包括竹紅菌甲素(HA)、竹紅菌乙素(HB)以及HA和HB兩種母體脂溶性衍生物。
3.根據權利要求1所述的竹紅菌素水溶性納米粒，其特征在于所述的天然生物蛋白材料選自藥用明膠、阿拉伯膠、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白。
4.根據權利要求1所述的竹紅菌素水溶性納米粒，其特征在于所述的多糖類生物大分子選自海藻酸鈉、殼聚糖。
5.根據權利要求1所述的竹紅菌素水溶性納米粒，其特征在于所述的高分子聚合材料選自聚丙稀酰胺、聚甲基丙烯酸烷烴酯、聚氰基丙烯酸烷烴酯。
6.根據權利要求1所述的竹紅菌素水溶性納米粒，其特征在于所述的助溶劑選自吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、司盤-60、司盤-65、司盤-80、司盤-85、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯芳基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯，所述的助溶劑濃度為0.5～3％(重量體積百分比)。
7.根據權利要求1所述的竹紅菌素水溶性納米粒，其特征在于所述的分散劑選自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、膽固醇、葡聚糖、右旋糖酐，所述的分散劑濃度為0.1～5％(重量體積百分比)。
8.竹紅菌素水溶性納米粒用于微血管類疾病以及需要通過靜脈注射給藥的疾病的光動力醫療中的應用。
全文摘要
本發明涉及一類竹紅菌素水溶性納米粒及用途，其特征在于利用天然生物蛋白、多糖類大分子以及可生物降解的高分子聚合物為包封材料，將脂溶性竹紅菌素藥物進行包封制成適合于靜脈注射的水溶性的粒徑為20～200nm的超微粒。本發明具有原料廉價易得、制備方法簡單、易操作、不需特別設備、制備工藝成本低；所得到的竹紅菌素納米粒具有穩定性高，靶向性及生物可降解性好，同時保持了竹紅菌素類光敏劑強光動力功能的特點；可以溶于水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液，此類制劑可作為竹紅菌素光動力藥物的靜脈注射針劑。
文檔編號A61P9/00GK1565433SQ0314814
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月3日 優先權日2003年7月3日
發明者趙井泉, 趙寶忠, 謝杰, 顧瑛, 劉凡光 申請人:中國科學院化學研究所, 中國人民解放軍總醫院