冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因及其用途的制作方法

專利名稱：冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒基因序列，特別是涉及SARS(Severe Acute RespiratorySyndrome)冠狀病毒的基因及其編碼蛋白(多肽)的功能，并證明了冠狀病毒導(dǎo)致疾病的一種或一種以上的機(jī)理。同時(shí)，本發(fā)明又是一種新的冠狀病毒感染致病的細(xì)胞模型，用于篩選作用于冠狀病毒致病環(huán)節(jié)的藥物，即以上述蛋白為靶點(diǎn)的藥物，該類(lèi)藥物可以用于抑制冠狀病毒X1、X2、X3蛋白的致病過(guò)程，發(fā)揮治療SARS的作用。
背景技術(shù)：
自從2003年4月16日科學(xué)家宣布SARS的病原體是一種冠狀病毒，立即引起了各國(guó)科學(xué)家的高度關(guān)注，在短時(shí)間內(nèi)就完成了冠狀病毒基因序列的測(cè)定，針對(duì)冠狀病毒的研究迅速展開(kāi)，在病毒的快速檢測(cè)、殺滅病毒的藥物以及病毒致病機(jī)理等方面成為新的研究熱點(diǎn)。但到目前為止，對(duì)病毒引起人肺病變的機(jī)制仍處于探索階段，還沒(méi)有實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明冠狀病毒的致病因素和機(jī)理。
在SARS研究中，SARS冠狀病毒(SARS-CoV)致病機(jī)理的研究具有十分重要的地位，對(duì)致病機(jī)理的深入認(rèn)識(shí)，不僅有助于疾病的治療、預(yù)防，也有利于藥物的研究和開(kāi)發(fā)。
本發(fā)明人通過(guò)認(rèn)真分析冠狀病毒的致病特點(diǎn)和SARS病人的臨床表現(xiàn)，認(rèn)為SARS冠狀病毒的致病過(guò)程與病毒在人體內(nèi)產(chǎn)生的病毒蛋白有關(guān)。因此，尋找具有誘發(fā)或?qū)е路螕p傷功能的SARS病毒基因及其編碼蛋白，成為人們認(rèn)識(shí)冠狀病毒致病機(jī)理、篩選新的預(yù)防和治療SARS疾病藥物的一種途徑。為了探討SARS冠狀病毒的致病機(jī)理，對(duì)其未知功能基因及其編碼蛋白(多肽)進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，SARS冠狀病毒在繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的某些蛋白質(zhì)，在誘發(fā)或?qū)е路螕p傷方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可能是SARS發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于根據(jù)GenBank(GenBank accession numberAY274119.3或AY278741)SARS-CoV基因序列(為RNA基因)，人工合成SARS冠狀病毒基因的cDNA片段，通過(guò)原核和/或真核基因表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生重組蛋白，該蛋白具有破壞人的肺細(xì)胞的作用。人工合成基因(cDNA)及其編碼蛋白的編號(hào)為SEQ NO.1[SARS-CoV X1(ORF 3)]和相應(yīng)編碼的氨基酸SEQ NO.2SEQ NO.2[SARS-CoV X2(ORF 4)]和相應(yīng)編碼的氨基酸SEQ NO.4SEQ NO.3[SARS-CoV X4(ORF 8)]和相應(yīng)編碼的氨基酸SEQ NO.6本發(fā)明的目的之二在于利用上述人工合成基因轉(zhuǎn)染人的細(xì)胞，建立SARS冠狀病毒致病細(xì)胞模型。
本發(fā)明的目的之三在于應(yīng)用SARS冠狀病毒致病基因建立細(xì)胞模型，用于篩選治療和預(yù)防SARS疾病的藥物。
本發(fā)明的目的之四在于應(yīng)用SARS冠狀病毒重組蛋白建立分子和細(xì)胞藥物模型，篩選治療和預(yù)防SARS疾病的藥物。
換言之，本發(fā)明涉及冠狀病毒蛋白基因，其特征在于具有序列1或者序列2或者序列3所述的序列。本發(fā)明還涉及所述的三種基因轉(zhuǎn)染的人肺細(xì)胞系，以及所述基因轉(zhuǎn)染表達(dá)的蛋白質(zhì)。在上述的細(xì)胞系中，所述的細(xì)胞是人肺成纖維細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及上述的細(xì)胞系在篩選抗冠狀病毒藥物中的應(yīng)用。
另外，本發(fā)明還涉及經(jīng)過(guò)上述基因表達(dá)的蛋白質(zhì)在于作為靶點(diǎn)制備篩選模型，以篩選預(yù)防、治療作用于該蛋白引起人肺細(xì)胞損傷的藥物中的應(yīng)用。
因此，為了完成本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明主要涉及SARS冠狀病毒的幾種基因序列，其中包括SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3；由上述幾種基因(其中包括SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3)所編碼的氨基酸序列(或稱蛋白或多肽序列)；這些序列的蛋白或多肽能夠?qū)θ说姆渭?xì)胞產(chǎn)生特異性的損傷作用，可以作為藥物篩選模型用于藥物篩選，并以該蛋白質(zhì)或多肽作為藥物作用靶點(diǎn)建立藥物篩選模型，篩選與該靶點(diǎn)相關(guān)的預(yù)防和治療藥物。
SARS冠狀病毒系正鏈RNA病毒，當(dāng)它侵入宿主細(xì)胞后RNA本身可作為mRNA進(jìn)行翻譯，也可以通過(guò)合成負(fù)鏈RNA再?gòu)?fù)制出大量的mRNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。所以，病毒的全部遺傳信息，包括各種有關(guān)的酶、S蛋白(spike)、E蛋白、M蛋白、N蛋白以及一些功能未知蛋白的信息均貯存在被復(fù)制的RNA當(dāng)中。
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(Paul A.Rota，et al.Characterization of a Novel CoronavirusAssociated with Severe Acute Respiratory Syndrome.Science 300，1394-1399，2003；Marco A.Marra et al.The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus.Science 300，1399-1404，2003；GenBank accession numberAY278741、AY274119.3)，SARS冠狀病毒基因組由5個(gè)主要開(kāi)放讀碼框(ORF)組成，分別編碼RNA聚合酶蛋白、S蛋白、E蛋白、M糖蛋白和N蛋白，其順序和大小均與其他冠狀病毒相似。在主要ORF之間還存在著數(shù)量不等的非保守ORF。目前已發(fā)現(xiàn)，Tor2病毒株(Marco A.Marra et al.Science 300，1399-1404，2003 GenBank accessionnumberAY274119.3)有9個(gè)可編碼SARS病毒特異性蛋白的潛在ORF，這些ORF在Urbani病毒株(Paul A.Rota，et al.Science 300，1394-1399，2003；GenBankaccession numberAY278741)中也能找到。這些蛋白可能不是病毒復(fù)制所必需的，但有可能在病毒復(fù)制和致病過(guò)程中發(fā)揮特殊功效，還有可能起到調(diào)節(jié)宿主對(duì)病毒感染的免疫應(yīng)答作用。
根據(jù)生物信息學(xué)研究結(jié)果，各種可能表達(dá)的蛋白質(zhì)氨基酸序列已經(jīng)明確。但是，除了一些保守的ORF編碼的蛋白(包括結(jié)構(gòu)蛋白)外，還有一些蛋白質(zhì)(即功能未知蛋白“unknown functional proteins”)在病毒復(fù)制或致病過(guò)程中的作用還沒(méi)有被認(rèn)識(shí)。為了認(rèn)識(shí)這些蛋白質(zhì)的作用，本發(fā)明人采用分子生物學(xué)技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的綜合研究方法，探討了SARS冠狀病毒功能未知基因及其編碼蛋白質(zhì)的致病作用。
SARS冠狀病毒有多個(gè)讀碼框架(ORF)，本發(fā)明根據(jù)TOR2病毒株的基因組序列(GenBank accession numberAY274119.3)合成上述功能未知基因，同時(shí)，其他SARS-CoV也具有同樣的ORF。
SARS冠狀病毒的ORF3，也就是X1基因，由825個(gè)核苷酸組成，編碼274個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)對(duì)已測(cè)序的19株SARS冠狀病毒基因組序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)只有TOR2的X1第31位堿基發(fā)生突變(G-A)，其編碼的氨基酸殘基由Gly突變?yōu)锳rg，與其它18株SARS冠狀病毒基因有98％的同源性(結(jié)果來(lái)自利用BLAST對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析)。X1基因及其編碼的氨基酸序列見(jiàn)序列表中的SEQNO.1。在該基因序列的5’-和3’-端分別添加EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，隨后把該基因亞克隆到適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的載體pcDNA3.1。
SARS冠狀病毒的ORF4，也就是X2基因，由465個(gè)核苷酸組成，編碼154個(gè)氨基酸殘基。該基因分別與X1和E蛋白基因部分重迭。在已測(cè)序的19株SARS冠狀病毒基因組序列中X2的序列是完全保守的。X2基因及其編碼的氨基酸序列見(jiàn)序列表中的SEQ NO.2。在該基因序列的5’-和3’-端分別添加BamH I和Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，隨后把該基因亞克隆到適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的載體pcDNA3.1。
SARS冠狀病毒的ORF8也就是X4基因，由369個(gè)核苷酸組成，編碼122個(gè)氨基酸殘基。在已測(cè)序的19株SARS冠狀病毒基因組序列中X4的序列是完全保守的。X4基因及其編碼的氨基酸序列見(jiàn)序列表中的SEQ NO.3。在該基因序列的5’-和3’--端分別添加BamH I和Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，隨后把該基因亞克隆到適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的載體pcDNA3.1。
上述X1、X2、X4基因序列在其5’-和3’-端添加適當(dāng)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)后，還被分別亞克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET32a和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K上，用于表達(dá)重組蛋白。
通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法將冠狀病毒蛋白基因(主要為上述基因)轉(zhuǎn)染到人肺細(xì)胞內(nèi)，如成纖維細(xì)胞，二倍體細(xì)胞，觀察病毒蛋白基因轉(zhuǎn)染后人肺細(xì)胞形態(tài)和功能的變化。通過(guò)這種方法評(píng)價(jià)冠狀病毒相關(guān)蛋白質(zhì)對(duì)人肺細(xì)胞的作用。
通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法將冠狀病毒蛋白基因(主要為上述基因)轉(zhuǎn)染到動(dòng)物肺細(xì)胞，如原代培養(yǎng)大鼠肺細(xì)胞內(nèi)，觀察病毒蛋白基因轉(zhuǎn)染后大鼠肺細(xì)胞形態(tài)和功能的變化。通過(guò)這種方法評(píng)價(jià)冠狀病毒相關(guān)蛋白質(zhì)作用的種屬特異性和對(duì)人肺細(xì)胞選擇性。
將以上轉(zhuǎn)基因人肺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液取出，再加入到正常(非基因轉(zhuǎn)染的)細(xì)胞培養(yǎng)液中，觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的培養(yǎng)液(可能含有表達(dá)的冠狀病毒蛋白)對(duì)人肺細(xì)胞和鼠肺細(xì)胞形態(tài)和功能的影響，觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)人和動(dòng)物(大鼠、小鼠)肺細(xì)胞毒性作用的選擇性。
直接將以上大腸桿菌表達(dá)載體pET32a和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的重組冠狀病毒相關(guān)蛋白加入到正常(非基因轉(zhuǎn)染的)細(xì)胞培養(yǎng)液中，觀察重組冠狀病毒蛋白對(duì)人肺細(xì)胞和鼠肺細(xì)胞形態(tài)和功能的影響，觀察重組蛋白對(duì)人和動(dòng)物(大鼠、小鼠)肺細(xì)胞毒性作用的選擇性。
以上實(shí)驗(yàn)技術(shù)目的在于探討冠狀病毒相關(guān)蛋白質(zhì)對(duì)人肺細(xì)胞的毒性作用，用于研究冠狀病毒的致病機(jī)理；通過(guò)以上作用的評(píng)價(jià)，確認(rèn)冠狀病毒蛋白藥物靶點(diǎn)作用，建立用于預(yù)防和治療SARS的藥物篩選和藥物研究。


附圖1哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的載體pcDNA3.1。
附圖2SARS冠狀病毒基因X4在大腸桿菌中的表達(dá)(蛋白電泳圖)。CK對(duì)照(pET32a空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌)；R重組子(pET32a-X4轉(zhuǎn)化大腸桿菌)；箭頭示重組子表達(dá)的特異性蛋白條帶。
附圖3人肺成纖維細(xì)胞HL細(xì)胞系轉(zhuǎn)染冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白X4基因轉(zhuǎn)染前，細(xì)胞形態(tài)。
附圖4人肺成纖維細(xì)胞HL細(xì)胞系轉(zhuǎn)染冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白X4基因空轉(zhuǎn)后6小時(shí)的細(xì)胞形態(tài)。
附圖5人肺成纖維細(xì)胞HL細(xì)胞系轉(zhuǎn)染冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白X4基因轉(zhuǎn)染后6小時(shí)的細(xì)胞形態(tài)。
附圖6人肺成纖維細(xì)胞HL細(xì)胞系轉(zhuǎn)染冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白X4基因空轉(zhuǎn)后24小時(shí)的細(xì)胞形態(tài)。
附圖7人肺成纖維細(xì)胞HL細(xì)胞系轉(zhuǎn)染冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白X4基因轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的細(xì)胞形態(tài)。
附圖8人肺成纖維細(xì)胞HL細(xì)胞系轉(zhuǎn)染冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白X4基因空轉(zhuǎn)后72小時(shí)的細(xì)胞形態(tài)。
附圖9人肺成纖維細(xì)胞HL細(xì)胞系轉(zhuǎn)染冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白X4基因轉(zhuǎn)染后72小時(shí)的細(xì)胞形態(tài)。
附圖10.基因轉(zhuǎn)染人肺細(xì)胞功能測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施方案以下將結(jié)合附圖具體說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1、X1基因的克隆根據(jù)GenBank accession numberAY274119.3發(fā)表的SARS冠狀病毒基因組序列設(shè)計(jì)人工合成X1 cDNA，該基因序列為序列表中序列1(SEQ NO.1)，參見(jiàn)附圖1，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法在該序列的5’-和3’-端添加適當(dāng)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)后分別亞克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET32a、畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的載體pcDNA3.1上。
實(shí)施例2、X2基因的克隆根據(jù)GenBank accession numberAY274119.3發(fā)表的SARS冠狀病毒基因組序列設(shè)計(jì)人工合成X2 cDNA，該基因序列為序列表中序列2(SEQ NO.2)，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法在該序列的5’-和3’-端添加適當(dāng)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)后分別亞克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET32a、畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的載體pcDNA3.1上(圖略)。
實(shí)施例3、X4基因的克隆根據(jù)GenBank accession numberAY274119.3發(fā)表的SARS冠狀病毒基因組序列設(shè)計(jì)人工合成X4 cDNA，該基因序列為序列表中序列4(SEQ NO.4)，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法在該序列的5’-和3’-端添加適當(dāng)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)后分別亞克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET32a、畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的載體(pcDNA3.1)上(圖略)。
實(shí)施例4、SARS-CoV蛋白表達(dá)參見(jiàn)附圖2，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法將攜帶X4基因的大腸桿菌表達(dá)載體pET32a-X4轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21trxB(DE3)，進(jìn)行了外源蛋白X4的表達(dá)研究，獲得了X4基因在大腸桿菌中的高表達(dá)。結(jié)果如X4在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白電泳(SDS-PAGE)圖。
實(shí)施例5、SARS相關(guān)冠狀病毒蛋白基因轉(zhuǎn)染對(duì)人肺成纖維細(xì)胞HL的損傷作用在本發(fā)明中，發(fā)明人采用重組的方法，在不同的表達(dá)系統(tǒng)中，對(duì)冠狀病毒蛋白質(zhì)進(jìn)行了表達(dá)，獲得了相關(guān)的研究結(jié)果。
將冠狀病毒質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染到人肺成纖維細(xì)胞HL細(xì)胞系中，觀察SARS病毒蛋白質(zhì)基因的作用。
具體方法按照分子生物學(xué)的常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，先將人肺細(xì)胞系，即人肺成纖維細(xì)胞HL細(xì)胞系(該細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，武漢大學(xué)細(xì)胞中心)培養(yǎng)傳代(常規(guī)細(xì)胞生物學(xué)培養(yǎng)方法，5％CO2，37℃，以下細(xì)胞培養(yǎng)方法相同)，將生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的細(xì)胞分布到24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12小時(shí)細(xì)胞貼壁后，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染液，進(jìn)行細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
應(yīng)用INVITROGEN公司的LIPOFECTAMINETM2000試劑與質(zhì)粒2∶1混合，放置20分鐘使成復(fù)合物，然后按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染(分子生物學(xué)常規(guī)技術(shù))。作用6小時(shí)，然后加入含有血清的培養(yǎng)基，連續(xù)觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的形態(tài)變化(熒光顯微鏡觀察)。
根據(jù)附圖所示，冠狀病毒轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明，正常人肺成纖維HL細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化(見(jiàn)附圖3)，X4基因轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，空轉(zhuǎn)細(xì)胞無(wú)明顯變化(見(jiàn)附圖4)，基因轉(zhuǎn)染的HL細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈現(xiàn)出細(xì)胞結(jié)構(gòu)由梭形變?yōu)椴灰?guī)則球形，呈萎縮狀，(見(jiàn)附圖5)；15小時(shí)后，空轉(zhuǎn)細(xì)胞無(wú)明顯變化(見(jiàn)附圖6)，基因轉(zhuǎn)染的HL細(xì)胞形態(tài)損傷加重，(見(jiàn)附圖7)。作用72小時(shí)后，空轉(zhuǎn)細(xì)胞變化不明顯(見(jiàn)附圖8)，基因轉(zhuǎn)染的HL細(xì)胞形態(tài)損傷加重，細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)大量粘稠狀滲出(見(jiàn)附圖9圖箭頭所示)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，但沒(méi)有發(fā)生全部死亡現(xiàn)象。
在以上實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)轉(zhuǎn)染的基因共有7個(gè)，包括ORF3，ORF4，ORF7，ORF8，ORF9，ORF10，ORF11等，其中X1，X2，X4蛋白對(duì)人肺細(xì)胞的形態(tài)和功能有明顯影響。(細(xì)胞形態(tài)圖略)。
實(shí)施例6、SARS相關(guān)冠狀病毒蛋白基因轉(zhuǎn)染對(duì)人肺成纖維細(xì)胞MRC的損傷作用采用同實(shí)施例5的方法，不同的是將攜帶冠狀病毒X1，X2，X4等7種基因的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染到人肺成纖維細(xì)胞MRC(二倍體)細(xì)胞系中，觀察SARS病毒蛋白質(zhì)基因?qū)RC的作用。
具體方法按照分子生物學(xué)的常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法同實(shí)施例5。連續(xù)觀察細(xì)胞經(jīng)基因轉(zhuǎn)染后的形態(tài)變化。(細(xì)胞形態(tài)圖略)結(jié)果證明，上述蛋白的基因轉(zhuǎn)入人肺細(xì)胞后，出現(xiàn)如實(shí)施例5所示結(jié)果，細(xì)胞形態(tài)及功能發(fā)生受到損傷，證明該基因轉(zhuǎn)染后導(dǎo)致人肺二倍體細(xì)胞系MRC細(xì)胞損傷。
實(shí)施例7、SARS相關(guān)冠狀病毒蛋白基因轉(zhuǎn)染對(duì)人肺成纖維細(xì)胞HPF的損傷作用采用同實(shí)施例5的方法，不同的是將攜帶冠狀病毒X1，X2，X4等7種基因的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到人肺成纖維細(xì)胞HPF細(xì)胞系中，觀察SARS病毒蛋白質(zhì)基因的作用。
具體方法按照分子生物學(xué)的常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法同實(shí)施例5。連續(xù)觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的形態(tài)變化。
結(jié)果證明，上述蛋白的基因轉(zhuǎn)入人肺細(xì)胞后，出現(xiàn)如實(shí)施例5所示結(jié)果，細(xì)胞形態(tài)及功能發(fā)生受到損傷，證明該基因轉(zhuǎn)染后導(dǎo)致人肺二倍體細(xì)胞系HPF細(xì)胞損傷。表現(xiàn)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損，邊緣不清，細(xì)胞形狀由梭型轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐?，功能降低?細(xì)胞形態(tài)圖略)實(shí)施例8、SARS相關(guān)冠狀病毒蛋白基因轉(zhuǎn)染對(duì)人肺成纖維細(xì)胞KMB-17的損傷作用采用同實(shí)施例5的方法，不同的是將冠狀病毒X1，X2，X4等7種基因的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染到人肺成纖維細(xì)胞KMB-17細(xì)胞系中，觀察SARS病毒蛋白質(zhì)基因?qū)MB的作用。
具體方法按照分子生物學(xué)的常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法同實(shí)施例5。連續(xù)觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的形態(tài)變化。
上述蛋白的基因轉(zhuǎn)入人肺細(xì)胞后，出現(xiàn)如實(shí)施例5所示結(jié)果，細(xì)胞形態(tài)及功能發(fā)生受到損傷，證明該基因轉(zhuǎn)染后導(dǎo)致人肺二倍體細(xì)胞系KMB-17細(xì)胞損傷。表現(xiàn)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損，邊緣不清，細(xì)胞形狀由梭型轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐停δ芙档?細(xì)胞形態(tài)圖略)。
結(jié)果證明，上述蛋白的基因轉(zhuǎn)入多種人肺細(xì)胞系后，均出現(xiàn)如實(shí)施例5所示結(jié)果，細(xì)胞形態(tài)及功能發(fā)生受到損傷，證明該基因轉(zhuǎn)染后導(dǎo)致人肺細(xì)胞損傷，可能是冠狀病毒導(dǎo)致肺損傷的重要原因之一。
實(shí)施例9、其他冠狀病毒蛋白基因轉(zhuǎn)染對(duì)人肺細(xì)胞的作用。
采用同實(shí)施例5的方法，不同的是將7種SARS相關(guān)冠狀病毒蛋白基因轉(zhuǎn)染到人肺細(xì)胞(以上4種細(xì)胞)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染的7種蛋白質(zhì)基因中，X1、X2、X4基因轉(zhuǎn)染人肺二倍體細(xì)胞系(HL)后，明顯影響了人肺細(xì)胞的功能和形態(tài)，產(chǎn)生了一系列反應(yīng)，導(dǎo)致人肺細(xì)胞的病理變化。說(shuō)明X1，X2，X4基因轉(zhuǎn)染后通過(guò)基因表達(dá)產(chǎn)生的蛋白(冠狀病毒蛋白)可以影響人肺細(xì)胞的形態(tài)和功能。
實(shí)施例10、人肺成纖維細(xì)胞系HL基因轉(zhuǎn)后的細(xì)胞功能變化以RESAZURIN法測(cè)定基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞功能(檢測(cè)方法見(jiàn)Zhang Haixia等，中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，2003；7)。結(jié)果表明，基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的功能發(fā)生明顯變化，熒光測(cè)定值明顯降低，表明細(xì)胞功能明顯下降，代謝活性顯著降低。結(jié)果如附圖10所示。
實(shí)施例11、冠狀病毒蛋白基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠肺細(xì)胞的影響采用同實(shí)施例5的方法，不同的是將攜帶冠狀病毒X1，X2，X4等7種基因的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染到大鼠肺原代培養(yǎng)細(xì)胞中，觀察SARS病毒蛋白質(zhì)基因的作用。
具體方法按照分子生物學(xué)的常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法同實(shí)施例5。連續(xù)觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的形態(tài)變化。
結(jié)果證明，上述蛋白的基因轉(zhuǎn)入大鼠肺原代培養(yǎng)細(xì)胞后，未見(jiàn)明顯的如實(shí)施例5所示結(jié)果，細(xì)胞形態(tài)及功能基本正常，X1，X4基因轉(zhuǎn)染后導(dǎo)致大鼠肺原代培養(yǎng)細(xì)胞輕微變化，細(xì)胞呈球型，功能略降低。(細(xì)胞形態(tài)圖略)結(jié)果證明，上述蛋白的基因轉(zhuǎn)入大鼠肺原代培養(yǎng)細(xì)胞后，未出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)明顯變化，證明該基因轉(zhuǎn)染后對(duì)大鼠肺原代培養(yǎng)細(xì)胞影響不明顯。
實(shí)施例12、人肺HL細(xì)胞系基因轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)液對(duì)人肺成纖維細(xì)胞HL、MRC、HPF、KMB-17細(xì)胞形態(tài)和功能的影響將以上轉(zhuǎn)基因人肺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液(培養(yǎng)15小時(shí))取出備用。人肺HL、MRC、HPF、KMB-17細(xì)胞系培養(yǎng)方法同實(shí)施例5所述，將細(xì)胞分布到96孔培養(yǎng)板中，每孔20000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)至細(xì)胞貼壁后，每孔加入以上轉(zhuǎn)基因人肺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液10微升，總培養(yǎng)液容積100微升，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，48小時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)和功能變化。
按照實(shí)施例5細(xì)胞形態(tài)和實(shí)施例10功能檢測(cè)方法，檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)和功能變化。結(jié)果表明，X1，X4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液可以輕度影響人肺細(xì)胞形態(tài)和功能(細(xì)胞形態(tài)圖略)。
實(shí)施例13、人肺成纖維細(xì)胞系HL基因轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)液對(duì)小鼠肺細(xì)胞形態(tài)和功能的影響將以上轉(zhuǎn)基因人肺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液(培養(yǎng)15小時(shí))取出備用。小鼠肺原代培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例5所述，將細(xì)胞分布到96孔培養(yǎng)板中，每孔20,000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)至細(xì)胞貼壁后，每孔加入以上轉(zhuǎn)基因人肺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液10微升，總培養(yǎng)液容積100微升，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)和功能變化。
按照實(shí)施例5細(xì)胞形態(tài)和實(shí)施例10功能檢測(cè)方法，檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)和功能變化。結(jié)果表明，全部7中受試基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)大鼠肺原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)和功能無(wú)明顯影響(細(xì)胞形態(tài)圖略)。
結(jié)果顯示，基因轉(zhuǎn)染人肺細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)小鼠肺細(xì)胞形態(tài)和功能無(wú)明顯影響以上結(jié)果證明，X4蛋白對(duì)人肺細(xì)胞具有選擇性損傷作用，而對(duì)大、小鼠肺細(xì)胞無(wú)明顯影響，結(jié)果提示，冠狀病毒表達(dá)的X1、X2、X4蛋白可能在SARS發(fā)展過(guò)程中起到破壞肺細(xì)胞的作用，是導(dǎo)致急性非損傷的重要因素之一。
實(shí)施例14、藥物篩選試驗(yàn)采用實(shí)施例5所述的方法，不同的是將生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的細(xì)胞分布到24孔培養(yǎng)板中(或96孔板中)，各孔加入質(zhì)粒pcDNA3.1-X4或冠狀病毒X4(或X1、X2)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。基因轉(zhuǎn)染或加入冠狀病毒X4(或X1、X2)蛋白后(1-6小時(shí))，加入待篩選藥物，分別于培養(yǎng)24、48小時(shí)后，觀察細(xì)胞形態(tài)、測(cè)定細(xì)胞功能(方法同實(shí)施例5、實(shí)施例10)。篩選能夠保護(hù)細(xì)胞形態(tài)和功能的樣品，作為預(yù)防或治療SARS的藥物。(藥物篩選方法見(jiàn)杜冠華主編，高通量藥物篩選，化學(xué)工業(yè)出版社，2003年1月，北京)。
序列表<110> 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所<120> 冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因及其用途<130>
<160> 6<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 825<212> DNA<213> 人<220>
<221> CDS<222> (1)..(825)<223>
<400> 1atg gat ttg ttt atg aga ttt ttt act ctt aga tca att act gca cag48Met Asp Leu Phe Met Arg Phe Phe Thr Leu Arg Ser Ile Thr Ala Gln1 5 10 15cca gta aaa att gac aat gct tct cct gca agt act gtt cat gct aca96Pro Val Lys Ile Asp Asn Ala Ser Pro Ala Ser Thr Val His Ala Thr20 25 30gca acg ata ccg cta caa gcc tca ctc cct ttc gga tgg ctt gtt att144Ala Thr Ile Pro Leu Gln Ala Ser Leu Pro Phe Gly Trp Leu Val Ile35 40 45ggc gtt gca ttt ctt gct gtt ttt cag agc gct acc aaa ata att gcg192Gly Val Ala Phe Leu Ala Val Phe Gln Ser Ala Thr Lys Ile Ile Ala50 55 60ctc aat aaa aga tgg cag cta gcc ctt tat aag ggc ttc cag ttc att240Leu Asn Lys Arg Trp Gln Leu Ala Leu Tyr Lys Gly Phe Gln Phe Ile65 70 75 80tgc aat tta ctg ctg cta ttt gtt acc atc tat tca cat ctt ttg ctt288
Cys Asn Leu Leu Leu Leu Phe Val Thr Ile Tyr Ser His Leu Leu Leu85 90 95gtc gct gca ggt atg gag gcg caa ttt ttg tac ctc tat gcc ttg ata336Val Ala Ala Gly Met Glu Ala Gln Phe Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu Ile100 105 110tat ttt cta caa tgc atc aac gca tgt aga att att atg aga tgt tgg384Tyr Phe Leu Gln Cys Ile Asn Ala Cys Arg Ile Ile Met Arg Cys Trp115 120 125ctt tgt tgg aag tgc aaa tcc aag aac cca tta ctt tat gat gcc aac432Leu Cys Trp Lys Cys Lys Ser Lys Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn130 135 140tac ttt gtt tgc tgg cac aca cat aac tat gac tac tgt ata cca tat480Tyr Phe Val Cys Trp His Thr His Asn Tyr Asp Tyr Cys Ile Pro Tyr145 150 155 160aac agt gtc aca gat aca att gtc gtt act gaa ggt gac ggc att tca528Asn Ser Val Thr Asp Thr Ile Val Val Thr Glu Gly Asp Gly Ile Ser165 170 175aca cca aaa ctc aaa gaa gac tac caa att ggt ggt tat tct gag gat576Thr Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Gly Gly Tyr Ser Glu Asp180 185 190agg cac tca ggt gtt aaa gac tat gtc gtt gta cat ggc tat ttc acc624Arg His Ser Gly Val Lys Asp Tyr Val Val Val His Gly Tyr Phe Thr195 200 205gaa gtt tac tac cag ctt gag tct aca caa att act aca gac act ggt672Glu Val Tyr Tyr Gln Leu Glu Ser Thr Gln Ile Thr Thr Asp Thr Gly210 215 220att gaa aat gct aca ttc ttc atc ttt aac aaa ctt gtt aaa gac cca720Ile Glu Asn Ala Thr Phe Phe Ile Phe Asn Lys Leu Val Lys Asp Pro225 230 235 240ccg aat gtg caa ata cac aca atc gac ggc tct tca gga gtt gct aat768Pro Asn Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser Ser Gly Val Ala Asn245 250 255cca gca atg gat cca att tat gat gag ccg acg acg act act agc gtg816
Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr Thr Thr Thr Ser Val260 265 270cct ttg taa-825Pro Leu<210> 2<211> 274<212> PRT<213> 人<400> 2Met Asp Leu Phe Met Arg Phe Phe Thr Leu Arg Ser Ile Thr Ala Gln1 5 10 15Pro Val Lys Ile Asp Asn Ala Ser Pro Ala Ser Thr Val His Ala Thr20 25 30Ala Thr Ile Pro Leu Gln Ala Ser Leu Pro Phe Gly Trp Leu Val Ile35 40 45Gly Val Ala Phe Leu Ala Val Phe Gln Ser Ala Thr Lys Ile Ile Ala50 55 60Leu Asn Lys Arg Trp Gln Leu Ala Leu Tyr Lys Gly Phe Gln Phe Ile65 70 75 80Cys Asn Leu Leu Leu Leu Phe Val Thr Ile Tyr Ser His Leu Leu Leu85 90 95Val Ala Ala Gly Met Glu Ala Gln Phe Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu Ile100 105 110
Tyr Phe Leu Gln Cys Ile Asn Ala Cys Arg Ile Ile Met Arg Cys Trp115 120 125Leu Cys Trp Lys Cys Lys Ser Lys Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn130 135 140Tyr Phe Val Cys Trp His Thr His Asn Tyr Asp Tyr Cys Ile Pro Tyr145 150 155 160Asn Ser Val Thr Asp Thr Ile Val Val Thr Glu Gly Asp Gly Ile Ser165 170 175Thr Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Gly Gly Tyr Ser Glu Asp180 185 190Arg His Ser Gly Val Lys Asp Tyr Val Val Val His Gly Tyr Phe Thr195 200 205Glu Val Tyr Tyr Gln Leu Glu Ser Thr Gln Ile Thr Thr Asp Thr Gly210 215 220Ile Glu Asn Ala Thr Phe Phe Ile Phe Asn Lys Leu Val Lys Asp Pro225 230 235 240Pro Asn Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser Ser Gly Val Ala Asn245 250 255Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr Thr Thr Thr Ser Val260 265 270Pro Leu
<210> 3<211> 465<212> DNA<213> 人<220>
<221> CDS<222> (1)..(465)<223>
<400> 3atg atg cca act act ttg ttt gct ggc aca cac ata act atg act act48Met Met Pro Thr Thr Leu Phe Ala Gly Thr His Ile Thr Met Thr Thr1 5 10 15gta tac cat ata aca gtg tca cag ata caa ttg tcg tta ctg aag gtg96Val Tyr His Ile Thr Val Ser Gln Ile Gln Leu Ser Leu Leu Lys Val20 25 30acg gca ttt caa cac caa aac tca aag aag act acc aaa ttg gtg gtt144Thr Ala Phe Gln His Gln Asn Ser Lys Lys Thr Thr Lys Leu Val Val35 40 45att ctg agg ata ggc act cag gtg tta aag act atg tcg ttg tac atg192Ile Leu Arg Ile Gly Thr Gln Val Leu Lys Thr Met Ser Leu Tyr Met50 55 60gct att tca ccg aag ttt act acc agc ttg agt cta cac aaa tta cta240Ala Ile Ser Pro Lys Phe Thr Thr Ser Leu Ser Leu His Lys Leu Leu65 70 75 80cag aca ctg gta ttg aaa atg cta cat tct tca tct tta aca agc ttg288Gln Thr Leu Val Leu Lys Met Leu His Ser Ser Ser Leu Thr Ser Leu85 90 95tta aag acc cac cga atg tgc aaa tac aca caa tcg acg gct ctt cag336Leu Lys Thr His Arg Met Cys Lys Tyr Thr Gln Ser Thr Ala Leu Gln100 105 110gag ttg cta atc cag caa tgg atc caa ttt atg atg agc cga cga cga384Glu Leu Leu Ile Gln Gln Trp Ile Gln Phe Met Met Ser Arg Arg Arg115 120 125cta cta gcg tgc ctt tgt aag cac aag aaa gtg agt acg aac tta tgt432
Leu Leu Ala Cys Leu Cys Lys His Lys Lys Val Ser Thr Asn Leu Cys130 135 140act cat tcg ttt cgg aag aaa cag gta cgt taa465Thr His Ser Phe Arg Lys Lys Gln Val Arg145 150<210> 4<211> 154<212> PRT<213> 人<400> 4Met Met Pro Thr Thr Leu Phe Ala Gly Thr His Ile Thr Met Thr Thr1 5 10 15Val Tyr His Ile Thr Val Ser Gln Ile Gln Leu Ser Leu Leu Lys Val20 25 30Thr Ala Phe Gln His Gln Asn Ser Lys Lys Thr Thr Lys Leu Val Val35 40 45Ile Leu Arg Ile Gly Thr Gln Val Leu Lys Thr Met Ser Leu Tyr Met50 55 60Ala Ile Ser Pro Lys Phe Thr Thr Ser Leu Ser Leu His Lys Leu Leu65 70 75 80Gln Thr Leu Val Leu Lys Met Leu His Ser Ser Ser Leu Thr Ser Leu85 90 95Leu Lys Thr His Arg Met Cys Lys Tyr Thr Gln Ser Thr Ala Leu Gln100 105 110Glu Leu Leu Ile Gln Gln Trp Ile Gln Phe Met Met Ser Arg Arg Arg
115 120 125Leu Leu Ala Cys Leu Cys Lys His Lys Lys Val Ser Thr Asn Leu Cys130 135 140Thr His Ser Phe Arg Lys Lys Gln Val Arg145 150<210> 5<211> 369<212> DNA<213> 人<220>
<221> CDS<222> (1)..(369)<223>
<400> 5atg aaa att att ctc ttc ctg aca ttg att gta ttt aca tct tgc gag48Met Lys Ile Ile Leu Phe Leu Thr Leu Ile Val Phe Thr Ser Cys Glu1 5 10 15cta tat cac tat cag gag tgt gtt aga ggt acg act gta cta cta aaa96Leu Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys20 25 30gaa cct tgc cca tca gga aca tac gag ggc aat tca cca ttt cac cct144Glu Pro Cys Pro Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro35 40 45ctt gct gac aat aaa ttt gca cta act tgc act agc aca cac ttt gct192Leu Ala Asp Asn Lys Phe Ala Leu Thr Cys Thr Ser Thr His Phe Ala50 55 60ttt gct tgt gct gac ggt act cga cat acc tat cag ctg cgt gca aga240Phe Ala Cys Ala Asp Gly Thr Arg His Thr Tyr Gln Leu Arg Ala Arg65 70 75 80tca gtt tca cca aaa ctt ttc atc aga caa gag gag gtt caa caa gag288Ser Val Ser Pro Lys Leu Phe Ile Arg Gln Glu Glu Val Gln Gln Glu
85 90 95ctc tac tcg cca ctt ttt ctc att gtt gct gct cta gta ttt tta ata336Leu Tyr Ser Pro Leu Phe Leu Ile Val Ala Ala Leu Val Phe Leu Ile100 105 110ctt tgc ttc acc att aag aga aag aca gaa tga369Leu Cys Phe Thr Ile Lys Arg Lys Thr Glu115 120<210> 6<211> 122<212> PRT<213> 人<400> 6Met Lys Ile Ile Leu Phe Leu Thr Leu Ile Val Phe Thr Ser Cys Glu1 5 10 15Leu Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys20 25 30Glu Pro Cys Pro Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro35 40 45Leu Ala Asp Asn Lys Phe Ala Leu Thr Cys Thr Ser Thr His Phe Ala50 55 60Phe Ala Cys Ala Asp Gly Thr Arg His Thr Tyr Gln Leu Arg Ala Arg65 70 75 80Ser Val Ser Pro Lys Leu Phe Ile Arg Gln Glu Glu Val Gln Gln Glu85 90 95Leu Tyr Ser Pro Leu Phe Leu Ile Val Ala Ala Leu Val Phe Leu Ile100 105 110
Leu Cys Phe Thr Ile Lys Arg Lys Thr Glu115 120
權(quán)利要求
1.冠狀病毒蛋白基因，其特征在于包括SEQ NO.1或者SEQ NO.3或者SEQ NO.5所述的序列。
2.經(jīng)權(quán)利要求1所述基因轉(zhuǎn)染的人肺細(xì)胞系。
3.經(jīng)權(quán)利要求1所述基因轉(zhuǎn)染表達(dá)的氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的氨基酸，其特征在于包括SEQ NO.2或者SEQ NO.4或SEQ NO.6所述的序列。
5.如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞系，其特征在于該所述的細(xì)胞是人肺成纖維細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞系在篩選抗冠狀病毒和防治SARS的藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求3所述蛋白質(zhì)，其特征在于作為靶點(diǎn)制備篩選模型，以篩選預(yù)防、治療作用于權(quán)利要求3所述蛋白、人肺細(xì)胞損傷的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及冠狀病毒蛋白基因序列及其在篩選抗冠狀病毒和防治SARS的藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1566134SQ0314662
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月10日
發(fā)明者杜冠華, 王偉, 曹立莉, 程克棣, 朱平, 胡娟娟, 黃鋒 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所