專利名稱：抑制細胞生長的多肽的獲得及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種由25個氨基酸(甲硫氨酸-天門冬氨酸-精氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸-丙氨酸-天門冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸)構成的多肽在腫瘤及其它增殖性疾病的治療中的應用，屬于醫學生物工程領域。
背景技術：
腫瘤是一種嚴重危害人類健康的疾病，目前其死亡率在國內已成為僅次于心腦血管疾病的第二位致死病因。臨床中主要應用化療、放療及手術治療，這些方法形成了比較成熟的治療體系，取得了較好的效果。然而，由于這些方法選擇性低，難以避免毒副作用強、正常細胞和腫瘤之間治療窗口小的缺點，要進一步提高療效乃至達到治愈目的發展潛力有限，因此亟待研發新的有效治療方法。
近來腫瘤細胞生物學的快速發展，為滿足這一社會需求提供了現實的可能性，其中，隨著細胞的信號轉導途徑(Signaling transduction pathways)的闡明，發現了越來越多的可用作治療腫瘤的藥靶。有一些已經成功地應用于臨床，取得了非常好的效果。比如在許多乳腺癌細胞中ErbB2(一種能促進蛋白磷酸化的上皮生長因子受體)過度表達，并且其蛋白激酶活性也增強，應用一種特異性針對這一蛋白單克隆抗體能有效的抑制ErbB2蛋白激酶活性，阻斷這一蛋白介導的信號轉導。這一抗體目前已獲FDA批準進入臨床使用。
細胞生長的信號是由細胞內外促進生長的因子經過一系列蛋白參與傳遞到細胞核，引起細胞周期的許多調節蛋白結構和功能變化而導致細胞分裂。在這些調節細胞生長周期的蛋白中，視神經母細胞瘤蛋白(Retinoblastoma Protein，Rb)擔當著一個極其重要的角色，Rb是一個具有強烈抑制細胞生長的核蛋白，其抑制細胞分裂的能力是由其磷酸化的程度決定的。當細胞內外刺激生長的信號傳到細胞核時，一些能磷酸化修飾Rb的蛋白激酶(比如CDK4或6)受到激活，使Rb中的十幾個絲氨酸和蘇氨酸磷酸化，這一結果導致Rb抑制細胞周期的功能喪失，細胞因此進入分裂周期。因此，阻斷Rb的磷酸化是一個很有前途的開發治療腫瘤新藥的途徑。至今為止，多個參與Rb磷酸化的酶和蛋白質已被發現，但由于Rb磷酸化途徑是一個很復雜的有多個蛋白參與的過程，其機制還不清楚，目前沒有有效的方法或化合物能直接阻斷Rb的磷酸化，達到抑制細胞生長作用。
發明內容
在研究中，我們發現了Rb和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的一個亞基的相互作用。PI3K由調節亞基和催化亞基組成，催化亞基催化某些脂類及蛋白質上的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的活性是PI3K蛋白的核心效應組成部分，然而，催化亞基的活性受調節亞基的調控，調控通過以下兩個機制實現①催化亞基的活性本身受調節亞基影響；②調節亞基通過和其他蛋白的相互作用把催化亞基定位于目標蛋白。我們研究發現，Rb和PI3K的相互作用是由PI3K中的55千道爾頓的調節亞基(p55PIK)中氨基端1-25號氨基酸(序列為甲硫氨酸-天門冬氨酸-精氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸-丙氨酸-天門冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸；見《氨基酸和核苷酸序列表》)參與的，該多肽片段被稱為Rb結合功能區(Rb bindingdomain)，它把PI3K和Rb相互連接在一起，PI3K的蛋白激酶活性導致了Rb的磷酸化，從而引起了細胞分裂。根據這一模型，我們設想，如果我們僅僅只是在細胞中表達p55PIK中Rb結合功能區，這一多肽能有效地結合于Rb，競爭性抑制細胞內PI3K和Rb的結合，由于這個多肽不具有任何磷酸化蛋白激酶活性，所以多肽結合Rb將抑制Rb的磷酸化過程，保持Rb抑制細胞生長的功能，從而達到阻止腫瘤細胞分裂過程的目的。
證明這一模型的關鍵之處在于合成這一多肽并把這一多肽導入分裂細胞中，再觀察這一多肽對細胞分裂的影響。為達到這一目的，我們采用分子生物學的手段，制造一個DNA構建體，這一構建體編碼由這一Rb結合功能區和綠色熒光蛋白(GFP)的融合蛋白，再把這種構建體轉入培養細胞中，因為檢測GFP的技術已相當成熟，我們把產生GFP信號的細胞(含有轉入的DNA構建體)單獨分離出來，分析其細胞分裂狀況。其結果和僅僅只表達GFP的細胞(轉染相應的對照DNA構建體)進行比較，以證實單獨表達p55PIK中的Rb結合功能區多肽是否能抑制細胞生長。
實驗結果表明，在幾種不同的具有生長分裂能力的培養細胞系中表達這一25氨基酸的多肽，這些細胞的DNA合成及其他幾個證明細胞生長的觀察指標都顯著降低，證明了這一多肽具有抑制細胞生長的能力。
與現有抑制細胞生長的方法相比，采用本發明達到了以下效果(說明見附圖1)①細胞中單獨表達p55PIK的Rb結合功能區能結合于Rb，抑制了Rb的磷酸化過程，從而有效提高Rb的抑制細胞周期的能力，為治療細胞生長異常疾病新藥的設計和篩選，提供了一種新的方法和途徑。
②這一多肽的序列存在于細胞的蛋白中，毒副作用低，抗原性弱，實驗結果也發現這一多肽對細胞凋亡沒有明顯的影響，所以這一多肽，對正常細胞沒有明顯的殺傷作用。
③這一多肽及相應cDNA在細胞內，能有效地抑制細胞增殖。
④這一多肽分子量小能化學合成，便于大規模直接應用于臨床，同時也可用其他的方法(比如用質粒及病毒載體)把這一多肽投入到細胞內，以達到治療腫瘤的目的。
四
附圖1N25(p55PIK Rb結合功能區)阻斷細胞分裂。在細胞中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通過p55PIK和Rb相互作用，這一相互作用激活了促進Rb磷酸化的一系列蛋白激酶，導致Rb的磷酸化。Rb的磷酸化使Rb抑制細胞生長的功能喪失，細胞進入生長周期。Rb結合功能區N25多肽具有結合Rb的能力，但這一結合并不能激活引起Rb的磷酸化的蛋白激酶，從而保持了Rb的低磷酸化和其抑制細胞生長的能力，阻斷了細胞的分裂。
附圖2在培養的細胞中檢測GFP，N25-GFP和N25-GFP蛋白的表達。用pEGFP-C1(表達GFP蛋白)，pEGFP-N25(表達N25-GFP融合蛋白)和pEGFP-C25(表達GFP-N25融合蛋白)質粒各10微克轉染培養的COS7細胞。48小時后，把細胞裂解。裂解液中蛋白用12％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移到尼龍膜。該膜用于Western印跡法檢測GFP，N25-GFP和N25-GFP蛋白的表達(GFP抗體來自CLONTECH)。圖中箭頭表明N25-GFP和GFP-N25的位置。
附圖3N25多肽抑制了Rb的磷酸化。3T3細胞(購自ATCC)培養于10厘米培養皿中。用pEGFP-C1(表達GFP蛋白)，pEGFP-N25(表達N25-GFP融合蛋白)和pEGFP-C25(表達GFP-N25融合蛋白)質粒各10微克轉染細胞。兩天后，表達GFP的細胞用流式細胞儀分離，細胞裂解后，來自不同細胞的等量蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移到膜上，膜用識別磷酸化Rb的抗體檢測細胞Rb磷酸化水平。圖中ppRb代表磷酸化Rb。
五具體實施例方式
例1在pEGFP質粒中引入編碼p55PIK氨基端的25個氨基酸殘基的多肽cDNA(這一多肽以下簡稱為N25)。
pEGFP-N1和pEGFP-C1質粒載體購于美國Clontech公司(目錄號為6085-1，6084-1)，質粒包含編碼綠色熒光蛋白(GFP)的cDNA，用EcoRI-BamHI(購于美國Promega公司，目錄號為R6011，R6021)酶切質粒，酶切后的質粒在瓊脂糖膠中分離、純化，用于以后的連接反應。從膠中回收DNA片段的試劑盒來自德國Qiagen公司(產品目錄號為28704)。
編碼小鼠p55PIK全長蛋白的cDNA來源于小鼠睪丸組織cDNA文庫(美國Stratagene公司，目錄號為937308)，克隆到pcDNA3(購于Invitrogen公司，目錄號為V79020)，用于擴增N25 cDNA的PCR引物序列為引物15′TTTTGAATTCTATGGACCGCGATGACGCAGA引物25′TTTTGGATCCATTTCAATATAAAATATCAGTPCR條件94℃ 2分鐘；94℃ 1分鐘、55℃ 1分鐘、72℃ 2分鐘共25個循環；72℃延伸5分鐘。
PCR試劑盒來自美國Promega公司(目錄號為M1861)，PCR產物經過純化后(純化用的試劑盒來自德國Qiagen公司，產品目錄號為28704)，用EcoRI-BamHI酶切；再用瓊脂糖膠純化，然后和酶切純化后的載體pEGFP-N1或pEGFP-C1進行連接反應(連接試劑盒來自美國Promega公司，目錄號為M1801)。轉化細菌后(感受態細菌來自美國Promega公司，目錄號為L2001)，克隆用常規菌落PCR進行篩選。選出陽性克隆，其cDNA序列的正確性通過核酸序列測定得到證實后，大規模純化制備質粒(大規模純化試劑盒來自美國Promega公司，目錄號為A7270)，用于以后的實驗。這兩種質粒在真核細胞分別表達一個N25和GFP的融合蛋白。pEGFP-N1中，表達的N25連接在GFP的N未端，該融合蛋白稱為N25-GFP；在pEGFP-C1表達的融合蛋白中N25是連接于GFP的C-未端，該蛋白稱為GFP-N25。
例2DNA構建體表達融合蛋白的檢測采用常規的DNA轉染實驗檢測融合蛋白的表達。我們用COS7細胞(購于美國ATCC，目錄號為CRL-1651)檢測融合蛋白的表達。
轉染試劑盒購于美國Invitrogen(目錄號為11668)，轉染實驗也按照生產廠家提供的使用說明完成。COS7細胞培養在10％小牛血清DMEM營養液中。轉染48小時后，COS7細胞用生理鹽水(PBS)洗兩次，加入細胞裂解液裂解細胞，用超聲波破壞DNA后，加入適量的2-巰基乙醇和溴酚藍，于沸水中處理5分鐘，置于冰上保存，隨后上樣于12％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離后的蛋白轉移到尼龍膜上，此膜用抗GFP抗體(購于美國Invitrogen，目錄號為R970)檢測融合蛋白的產生，結果證實了GFP-N25和N25-GFP在細胞中的表達(見附圖1)。
例3N25多肽的表達抑制細胞生長及細胞周期的實驗。
用NIH/3T3(小鼠成纖維上皮細胞，購自美國ATCC，目錄號為CRL-1658)和MCF-7(人乳腺癌細胞系，購自美國ATCC，目錄號為HTB-22)檢測N25氨基酸多肽對細胞生長的影響。
細胞在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養液，37℃、5％CO2/95％空氣培養條件下培養于10厘米細胞培養皿。
用于實驗質粒pEGFP-N25(表達N25-GFP融合蛋白)；pEGFP-C25(表達GFP-N25融合蛋白)；pEGFP-N1或pEGFP-C1作為對照質粒。
用于轉染的質粒和脂質體轉染試劑(購自購于美國Invitrogen，目錄號為11668)混合后，室溫放置15分鐘，加入培養于無血清DMEM營養液的細胞中(細胞密度約為50％)在37℃中培養5小時，再加10％胎牛血清，繼續培養48小時。在熒光顯微鏡中，表達融合綠色熒光蛋白或單獨熒光蛋白的細胞很容易和不表達這些蛋白的細胞區分開來。另外，采用流式細胞儀，這些熒光蛋白陽性細胞也很容易分離純化出來。幾種檢測細胞生長的標志指標被用來研究證實N25多肽對細胞生長的影響，在這些實驗中，僅僅只表達熒光蛋白的細胞作為對照組用。
首先，我們用上述質粒轉染3T3和MCF7細胞，兩天后，采用流式細胞儀把轉染了DNA的GFP陽性細胞挑選出來，分析這些細胞的細胞周期分布。
實驗結果表明表達N25對細胞凋亡沒有明顯影響，而N25能抑制細胞周期進入S期，誘導細胞進入G0/G1期，其作用見下表。
表1N25抑制細胞周期，誘導細胞進入G0/G1期作用
DNA合成是細胞增殖的標志。下一個實驗中，我們檢測N25的細胞DNA合成的影響。3T3和MCF7細胞在轉染pEGFP-N1及表達N25-GFP和GFP-N25質粒兩天后，在細胞培養液加入能滲入到新合成的DNA鏈中的BrdU標記細胞15小時，再用免疫熒光技術檢測轉染了質粒的GFP陽性細胞，再確定這些細胞DNA中BrdU滲入的陽性率(這代表了細胞DNA合成率)。結果表明，N25也強烈抑制了細胞DNA的合成。(見表2)表2N25抑制細胞DNA合成
例4N25表達抑制Rb的磷酸化Rb的磷酸化和Rb抑制細胞生長的功能密切相關。我們采用Western印跡法檢測了轉染不同的質粒的細胞中Rb的磷酸化水平，用上述質粒轉染MCF7細胞兩天后，采用流式細胞儀把GFP陽性細胞分離純化出來，用裂解液裂解細胞，上樣，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再把蛋白轉移到膜上，膜用針對Rb磷酸化的抗體(購自美國Santa Cruz公司目錄號為IF8)進行檢測，結果(見附圖2)表明，Rb在表達GFP的細胞中主要以磷酸化狀態存在，而在表達N25的細胞中，Rb處于低磷酸化狀態。表明了這些細胞中，Rb具有抑制細胞生長的作用。
氨基酸和核苷酸序列表<110>夏獻民<120>抑制細胞生長的多肽的獲得及用途<160>2<210>1<211>25<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<400>1Met Asp Arg Asp Asp A1a Asp Trp Arg Glu Val Met Met Pro Tyr1 5 10 15Ser Thr Glu Leu Ile Phe Tyr Ile Glu Met20 25<210>2<211>75<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)...(75)<400>2ATG GAC CGC GAT GAC GCA GAC TGG AGG GAG 30Met Asp Arg Asp Asp Ala Asp Trp Arg Glu1 5 10GTG ATG ATG CCC TAT TCG ACA GAA CTG ATA 60Val Met Met Pro Tyr Ser Thr Glu Leu Ile15 20TTT TAT ATT GAA ATG 75Phe Tyr Ile Glu Met2權利要求
1.應用p55PIK蛋白氨基酸殘基1-25的多肽及含有這一多肽序列的衍生物，治療人類腫瘤，及其他和細胞生長異常有關的疾病。多肽序列為甲硫氨酸-天門冬氨酸-精氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸-丙氨酸-天門冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸，見《氨基酸和核苷酸序列表》。技術特征為這段多肽及其衍生物具有結合Rb并抑制Rb磷酸化的能力。
2.權利要求1所述多肽相應的核苷酸編碼序列。
3.權利要求1所述多肽相應的核苷酸編碼序列在制備基因治療載體中的用途。
4.權利要求1所述多肽及其相應的核苷酸編碼序列用于制備腫瘤治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種由25個氨基酸組成的多肽和相應的cDNA的編碼序列和制備方法，以及該多肽及其衍生物和相應的cDNA在腫瘤及其它增殖性疾病治療中的具體用途。其特征是確定了p55PIK蛋白(磷脂酰肌醇－3－激酶的調節亞基)中氨基端25個氨基酸的多肽具有結合視網膜母神經瘤蛋白(Rb)的關鍵作用，在細胞內能阻斷Rb的磷酸化，達到抑制細胞分裂的生物效應。應用這一多肽及衍生物或采用轉染相應的cDNA，在細胞內表達這一多肽，能達到有效抑制細胞生長及腫瘤生長的作用，在腫瘤及有關細胞分裂疾病的臨床治療、腫瘤藥物及診斷試劑的制備中具有獨特的使用價值。同時本發明公開的阻斷Rb的磷酸化過程的新方法，也提供了一個設計新的治療腫瘤藥物的途徑。
文檔編號A61K38/16GK1565621SQ0314626
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月7日 優先權日2003年7月7日
發明者夏獻民, 程愛武, 胡俊波, 周劍峰 申請人:夏獻民