專利名稱：一種新的天然藥物有效部位的制作方法
技術領域：
本發明屬于天然藥物化學領域，涉及從狗棗獼猴桃[A ctinidaiKolomiKa(Rupr.et Maxim.)Planch]葉中提取分離的一種新的天然藥物有效部位—狗棗獼猴桃葉總黃酮及其制備方法以及在醫藥領域中的用途，尤其在制備預防與治療與自由基損傷有關的疾病的藥物方面的用途。
背景技術：
現代研究表明，很多疾病包括腫瘤、動脈硬化、冠心病、腦血栓、腦梗塞、腦出血、糖尿病、高脂血癥、老年癡呆以及某些消化系統、泌尿系統、眼科方面的疾病，都與活性氧尤其是與自由基損傷有直接或間接的關系，其中羥自由基(·OH)對人體造成的損害最為嚴重。
因此，人們試圖通過抑制體內的活性氧，尤其是通過清除體內的過量自由基來預防與治療上述疾病，并取得了一定的成果。如日本三菱東京制藥株式會社開發的腦保護劑《Radicut》注射劑，就是一種通過清除腦缺血再灌注時產生的過量自由基，從而保護腦細胞，減輕腦血栓引起的后遺癥的新藥，自上市以來獲得了良好的臨床效果。
黃酮類化合物是自然界中抗氧化作用最強的一類天然化合物，由于它具有很強的抑制活性氧、清除自由基作用，同時毒副作用相對小于化學合成藥，所以人們一直努力從黃酮類化合物中尋找藥用活性物質。目前已有一些以黃酮類化合物為有效成份的新藥在臨床得到應用，如銀杏葉總黃酮就是其中一種。目前銀杏葉總黃酮已用于治療冠心病、腦供血不足及老年癡呆等疾病，臨床療效很好。
總之，黃酮類化合物作為高效清除自由基的一類天然化合物，在預防與治療與自由基損傷有關的疾病方面的應用越來越受到人們的關注。
發明內容
本發明的目的是要提供一種以黃酮類化合物為主要有效成分的能夠用來制備預防與治療與自由基損傷有關的疾病的藥物的一種新的天然藥物有效部位以及它的制備方法及其藥物組合物。
本發明所述狗棗猴猴桃葉總黃酮是指從狗棗獼猴桃[A ctinidaiKolomiKa(Rupr.et Maxim.)Planch]葉中提取分離的黃酮類化合物的天然混合物。
本發明是通過以下技術方案完成的。具體內容包括狗棗獼猴桃葉中黃酮類成份的提取分離及結構鑒定；狗棗猴猴桃葉總黃酮提取工藝研究；總黃酮含量的測定方法研究；狗棗獼猴桃葉總黃酮清除羥自由基活性研究，最終完成了本發明。
(1)狗棗獼猴桃葉中黃酮類成份的提取分離及結構鑒定。
狗棗獼猴桃[Actinidia Kolomikta(Rupr、et Maxim.)Planch]是獼猴桃科獼猴桃屬多年生藤本植物，主要分布于中國、日本、俄羅斯等地，吉林省長白山區資源較為豐富。曾有文獻報道，狗棗獼猴桃的葉中含有大量的黃酮類化合物，但是除了常曉麗等人報道從狗棗獼猴桃的葉中分得山柰甲黃素-7-O-鼠李糖苷(Kaempferide-7-O-rhamnoside)和山柰甲黃素-7-O-鼠李糖基-3-O-蕓香糖苷(Kaempferide-7-O-rhamnosyl-3-O-rutinoside)(中草藥、1993年、第24卷第6期、283-285頁)外，未見其他報道。
本發明人對狗棗獼猴桃葉的化學成分進行了更加深入的研究。首先將狗棗獼猴桃葉用乙醇回流提取，提取液經減壓濃縮得乙醇提取物。此提取物再溶于水制成混懸液，分別用乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯萃取部分和正丁醇萃取部分，經減壓濃縮、干燥后分別得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，取正丁醇萃取物利用硅膠柱層析進行粗分離，再利用ODS柱層析進行進一步分離、純化，最終分離鑒定了8種黃酮類化合物。它們分別是山柰酚(Kaempferol)-3-O-葡萄糖苷(化合物1)；山柰酚-3-O-蕓香糖苷(化合物2)；槲皮素3-O-葡萄糖苷(化合物3)；山柰甲黃素(Kaempferide)-3-O-葡萄糖苷(化合物4)；山柰甲黃素-7-O-鼠李糖基-3-O-蕓香糖苷(化合物5)；山柰甲黃素-3-O蕓香糖苷(化合物6)；山柰甲黃素-7-O-(4-O-乙酰基-鼠李糖基)-3-O-葡萄糖苷(化合物7)；山柰甲黃素-7-O-(4-O-乙酰基-鼠李糖基)-3-O-蕓香糖苷(化合物8)。
上述8種化合物中除了化合物5之外，其余七種均為首次從狗棗獼猴桃葉中分離得到的黃酮類化合物，而且化合物6、化合物7、化合物8為新的黃酮類化合物。化合物6、化合物7、化合物8結構鑒定過程如下化合物6化合物6為淡黃色粉末，高分辨質譜(HR-FABMS)給出分子量為609.1834，分子式為C28H31O15。
1H-NMR給出的化學位移為6.43ppm(1H，d，J＝1.8)和6.21ppm(1H，d，J＝1.8)的兩個雙重峰，說明化合物6中存在1對處于苯環的間位的氫原子，另外在8.08ppm(1H，d，J＝8.8)和7.06ppm(1H，d，J＝8.8)處出現的兩個雙重峰，說明化合物6中存在兩對處于苯環的鄰位的氫原子，同時在12.50ppm(1H，S)處出現的單峰，說明有一個與羰基氧形成氫鍵的羥基氫，在3.85ppm(3H，S)處出現的一個很強的單峰，說明存在一個甲氧基。根據上述推測，再參考相關文獻，確定化合物6的骨架為山柰甲黃素(Kaempferide)。另外，化合物6的1H-NMR、13C-NMR給出了一個葡萄糖和一個鼠李糖的信號，因此可推測化合物6為黃酮苷類化合物。由于13C-NMR給出的葡萄糖的第6位碳的化學位移為66.63ppm，表明葡萄糖與鼠李糖(6-1)結合，形成了蕓香糖。同時化合物6的C-2的化學位移為156.39ppm，比其苷元山柰甲黃素的C-2化學位移增加約10個ppm，C-3的化學位移則減少了約2個ppm，說明3位上連有糖，而C-7的化學位移與山柰甲黃素比較幾乎沒有變化，說明7位沒連有糖，因此可判定蕓香糖連接在3位上。綜合上述判斷，再根據化合物6的DEPT、1H-1HCOSY、.HMBC、HMQC、NOESY、MS等光譜數據給出的信息，確定化合物6的結構為山柰甲黃素-3-O-蕓香糖苷(Kaempferide-3-O-rutinoside)。
結構式如下 化合物6
表1化合物6的1H-NMR、13C-NMR數據(400MHz、δppm from TMS in DMSO-d6J＝Hz)1H-NMR13C-NMRKaempferide(aglycone) Kaempferide(aglycone) 3-O-RutinosylOH-512.50(1H，s) C-2 156.39 GlcH-6 6.43(1H，d，J＝1.8)C-3 133.46 C-1101.37H-8 6.21(1H，d，J＝1.8)C-4 177.31 C-274.05H-2′，6′ 8.08(2H，d，J＝8.8)C-5 161.11 C-375.59H-3′，5′ 7.06(2H，d，J＝8.8)C-6 98.72 C-469.624′-OCH33.85(3H，S)C-7 164.24 C-576.25C-8 93.72 C-666.633-O-Rutinosyl C-9 156.47 RhaGlcC-10 103.94 C-1100.38H-1 5.35(1H，d，J＝7.6)C-1′ 122.32 C-270.55H-2 3.16(1H，m)C-2′ 130.63 C-370.26H-3 3.25(1H，m)C-3′ 113.61 C-471.71H-4 3.08(1H，m)C-4′ 161.13 C-568.16H-5 3.21(1H，m)C-5′ 113.61 C-617.62H-6 3.69(1H，d，J＝10.3) C-6′ 130.63Rha4′-OCH35 5.29H-1 4.39(1H，s)H-2 3.29(1H，m)H-3 3.45(1H，s)H-4 3.09(1H，m)H-5 3.28(1H，m)H-6 0.98(3H，d，J＝6.1)化合物7化合物7為淡黃色粉末，高分辨質譜(HR-FABMS)給出分子量為651.1950，分子式為C30H34O16。
化合物7的1H-NMR給出的化學位移為6.51ppm(1H，d，J＝2.1)和6.89ppm(1H，d，J＝2.1)的兩個雙重峰，說明化合物7分子中存在一對處于苯環的間位的兩個氫，另外化學位移為8.18(2H，d，J＝9.0)和7.09(2H，d，J＝9.0)的兩個雙重峰，說明化合物7分子中存在兩對處于苯環的鄰位的的氫原子。同時在12.57ppm(1H，S)出現的單峰可歸屬于與羰氧形成氫鍵的羥基氫的信號，在3.86ppm(3H，S)處出現的強的單峰說明化合物7中存在一個甲氧基，根據以上推測，再參照有關文獻，推斷化合物7仍為以山柰甲黃素為骨架的黃酮類化合物。化合物7的1H-NMR及1C-NMR同樣給出了1分子葡萄糖和1分子鼠李糖的信號。由于化合物7的C-2的化學位移比山柰甲黃素的化學位移增加了約10個ppm，C-3的化學位移、C-7的化學位移減少了約2個ppm，因此可推定兩個糖中1個連接在3位上，另1個連接在7位上。由于HMBC給出了鼠李糖的端基氫與骨架上的7位C的遠程偶合信號，故可判定鼠李糖連在7位上，而葡萄糖則連在3位上。另外，化合物7的1H-NMR給出了一個乙酰基甲基氫的信號(2.08ppm，3H，S)，13C-NMR給出了乙酰基羰基C(169.59ppm)和甲基碳(20.93ppm)的信號，說明化合物7分子中存在一個乙酰基。由于鼠李糖上4號碳的化學位移向低場移動了約2個ppm，3號碳和5號碳的化學位移向高場移動了約2個ppm，可推測乙酰基連在4號碳上。另外，從HMBC中觀察到了鼠李糖上4號氫與乙酰基羰基C的遠程偶合，故最終確定化合物7為山柰甲黃素-7-O-(4-O-乙酰基-鼠李糖基)-3-O-葡萄糖苷[Kaempferide-7-O-(4-O-acetyl-rhamnosyl)-3-O-glucoside]。
結構式如下 化合物7
表2化合物7的1H-NMR、13C-NMR數據(400MHz、δppm from TMS in DMSO-d6J＝Hz)1H-NMR13C-NMRKaempferide(aglycone) Kaempferide(aglycone) 3-O-GlucosylOH-5 12.57(1H，s) C-2 156.07 C-1101.37H-6 6.51(1H，d，J＝2.1) C-3 133.56 C-274.08H-8 6.89(1H，d，J＝2.1) C-4 177.31 C-377.49H-2′，6′8.18(2H，d，J＝9.0) C-5 160.56 C-469.84H-3′，5′7.09(2H，d，J＝9.0) C-6 99.33C-576.304′-OCH33.86(3H，S) C-7 161.07 C-660.82C-8 94.507-O-RhamnosylC-9 155.70 C-197.733-O-Glucosyl C-10 105.69 C-269.61H-1 5.51(1H，d，J＝7.3) C-1′122.13 C-367.70H-2 3.22(1H，m) C-2′130.59 C-473.20H-3 3.10(1H，m) C-3′113.56 C-567.41H-4 3.10(1H，m) C-4′160.97 C-617.52H-5 3.22(1H，m) C-5′113.56 4-OCOCH3H-6a 3.69(1H，m) C-6′130.59 169.59H-6b 3.58(1H，br-d，J＝11.2) 4′-OCH355.38 20.937-O-RhamnosylH-1 5.64(1H，s)H-2 3.93(1H，br-s)H-3 3.88(1H，m)H-4 4.89(1H，t，J＝9.7)H-5 3.64(1H，m)H-6 1.01(3H，d，J＝6.3)4-OCOCH32.08(3H，s)化合物8化合物8為淡黃色粉末，高分辨質譜(HR-FABMS)給出分子量為797.2487，分子式為C28H44HO20。
同化合物6、化合物7一樣，根據1H-NMR、13C-NMR數據的解析，可推斷新化合物8仍然是一個以山柰甲黃素為苷元的黃酮苷類化合物。化合物8的1H-NMR、13C-NMR給出了一個葡萄糖和兩個鼠李糖的信號，同時給出一個乙酰基的化學信號，由于萄萄糖上第6號碳的化學位移為66.34ppm，比游離的葡萄糖增加了約6個ppm，因此說明化合物8中的萄萄糖與另一個鼠李糖(6-1)成鍵，也就是說存在1分子蕓香糖，另外一個鼠李糖是游離的(沒有和葡萄糖結合)。同時由于C-2的化學位移向低場移動約10個ppm，C-3、C-7的化學位分別向高場移動約2個ppm，說明C-3、C-7位都連有糖。由于從化合物8的HMBC中觀察到了游離鼠李糖上的端基氫與骨架上的第7位碳的遠程偶合，故判定游離鼠李糖連接在7位，而蕓香糖則連在了3位上。至于乙酰基的結合位置，由于連在7位的鼠李糖4號碳的化學位移向低場移動約2個ppm，3號和5號碳的化學位移向高場移動約2個ppm，另外從HMBC中觀察到了連接在7位上的鼠李糖第4號碳上的氫與乙酰基羰基碳之間的遠程偶合，故判斷乙酰基連在7位鼠李糖的第4號碳上。綜上所述，確定化合物8為山柰甲黃素-7-O-(4-O-乙酰基-鼠李糖基)-3-O-蕓香糖苷[Kaempferide-7-O-(4-O-acetyl-rhamnosyl)-3-O-rutinoside]。
結構式如下 化合物8
表3化合物8的1H-NMR、13C-NMR數據(400MHz、δppm from TMS in DMSO、J＝Hz)1H-NMR13C-NMRKaempferide(aglycone)Kaempferide(aglycone) 3-O-RutinosylOH-5 12.50(1H，s) C-2 156.88 GLCH-6 6.51(1H，d，J＝2.1)C-3 133.76 C-1 101.22H-8 6.84(1H，d，J＝2.1)C-4 177.55 C-2 74.06H-2′，6 8.13(1H，d，J＝8.8)C-5 161.30 C-3 75.66H-3′，5 7.08(1H，d，J＝8.8)C-6 99.39 C-4 69.624-OCH33.86(3H，S)C-7 160.81 C-5 76.26C-8 94.75 C-6 66.53C-9 156.09 Rha3-O-RutinosylC-10 105.76 C-1 100.62GLC C-1′ 122.15 C-2 70.54H-1 5.34(1H，d，J＝4.5)C-2′ 130.74 C-3 69.64H-2 3.18(1H，m)C-3′ 113.67 C-4 71.71H-3 3.26(1H，m)C-4′ 161.24 C-5 67.41H-4 3.08(1H，m)C-5′ 113.67 C-6 17.38H-5 3.21(1H，m)C-6′ 130.74 7-O-RhamnosylH-6 3.68(1H，d，J＝10.0) 4′-OCH355.32 C-1 97.85RhaC-2 70.26H-1 4.40(1H，m) C-3 68.14H-2 3.44(1H.m) C-4 73.23H-3 3.12(1H，m) C-5 67.73H-4 3.28(1H，m) C-6 17.59H-5 3.65(1H，m) 4-OCOCH3169.85H-6 0.97(3H，d，J＝6.1) 20.817-O-RhamnosylH-1 5.64(1H，d，J＝1.2)H-2 3.94(1H，t，J＝4.6)H-3 3.88(1H，m)H-4 4.89(1H，t，J＝9.7)H-5 3.63(1H，m)H-6 1.03(3H，d，J＝6.1)4-OCOCH32.08(3H，S)
化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5的1H-NMR、13C-NMR圖譜以及化合物6、化合物7、化合物8的1H-NMR、13C-NMR、、DEPT、1H-1HCOSY、HMQC、HMBC、MOESY、MS等光譜圖如圖1-34所示。
2.狗棗獼猴桃葉總黃酮的提取狗棗獼猴桃葉中含有大量黃酮苷類化合物，其中山柰甲黃素-7-O-(4-O-乙酰基-鼠李糖基)-3-O-蕓香糖苷[Kaempferide-7-O-(4-O-acetyl-rhamnosyl)-3-O-rutinoside]含量最高，它的7位的鼠李糖的4位上連有一個乙酰基。這個乙酰基在酸堿環境以及受熱條件下容易被水解，因此在提取、分離、純化、濃縮、干燥等過程中應盡量在低溫及中性條件下進行。
為了從狗棗獼猴桃葉中提取高純度的總黃酮，而且提全、提凈，我們研制成功了利用大孔吸附樹脂從狗棗獼猴桃葉的水提取液中吸附黃酮類化合物或者狗棗獼猴桃葉先用有機熔劑提取，提取液減壓濃縮至一定體積后再加水溶解，然后再用大孔吸附樹脂吸附黃酮類化合物的提取方法，此方法具有不丟失成分、提取率高、雜質含量少、產品純度高、成本底、無污染等優點。具體提取過程為(1)水提取-大孔吸附樹脂吸附-用水沖洗-有機溶劑洗脫-減壓回收溶劑-真空干燥或(2)有機溶劑提取-減壓回收溶劑-加水溶解-大孔吸附樹脂吸附-用水沖洗-有機溶劑洗脫-減壓回收溶劑-真空干燥。另外，為了獲得黃酮含量更高的狗棗獼猴桃葉總黃酮，上述(1)或(2)方法用水沖洗后再用堿的溶液沖洗柱子，或者直接用堿的溶液沖洗柱子，把被大孔吸附樹脂吸附的色素類雜質洗掉，然后再用水把堿沖凈，最后用有機溶劑把被吸附的黃酮類化合物洗脫下來，這樣可以獲得純度提高了的狗棗獼猴桃葉總黃酮。另外，把上述方法獲得的狗棗獼猴桃葉總黃酮利用柱層析方法進一步分離純化后可以獲得黃酮含量更高的狗棗獼猴桃葉總黃酮。上述方法中大孔吸附樹脂可以選用AB-8、D4020、860021、D101、HP-20等；有機溶劑可以是甲醇、乙醇、丙酮或它們與水的混合溶液；堿可以是無機堿或有機堿；可以是水溶液也可以是有機溶液，濃度應該適當，否則會洗下黃酮類化合物。為了防止乙酰基被水解掉，提取液應保持中性，并盡可能在底溫下操作。
3.狗棗獼猴桃葉總黃酮中黃酮類成分的研究狗棗獼猴桃葉總黃酮中除了含有化合物1、化合物2、化合物3、化合物5、化合物7、化合物8外還含有化合物4、化合物6以及結構尚未搞清楚的一些黃酮類化合物。
4.總黃酮含量的測定狗棗獼猴桃葉中的黃酮類化合物，在紫外光區有吸收，因此可以用分光光度法測定總黃酮的含量，也可以用高效液相色譜法測定總黃酮的含量。本發明對上述兩種方法均做了相應研究。
5.狗棗獼猴桃葉總黃酮清除羥自由基活性研究參照文獻(中草藥、第34卷第4期、317-319頁)方法進行了羥自由基的清除活性試驗。結果表明，狗棗獼猴桃葉總黃酮具有較強的清除羥自由基活性，提示有可能用來制備預防與治療與自由基損傷有關的疾病的藥物。
圖1化合物1的1H-NMR圖2化合物1的13C-NMR圖3化合物2的1H-NMR圖4化合物2的13C-NMR圖5化合物3的1H-NMR圖6化合物3的13C-NMR圖7化合物4的1H-NMR圖8化合物4的13C-NMR圖9化合物5的1H-NMR圖10化合物5的13C-NMR圖11化合物6的1H-NMR圖12化合物6的13C-NMR圖13化合物6的DEPT譜圖14化合物6的1H-1HCOSY圖15化合物6的HMQC圖16化合物6的HMBC圖17化合物6的NOESY圖18化合物6的MS圖19化合物7的1H-NMR
圖20化合物7的13C-NMR圖21化合物7的DEPT譜圖22化合物7的1H-1HCOSY圖23化合物7的HMQC圖24化合物7的HMBC圖25化合物7的NOESY圖26化合物7的MS圖27化合物8的1H-NMR圖28化合物8的13C-NMR圖29化合物8的DEPT譜圖30化合物8的1H-1HCOSY圖31化合物8的HMQC圖32化合物8的HMBC圖33化合物8的NOESY圖34化合物8的MS
實施例下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不僅限于所列舉的實施例。
實施例1取狗棗獼猴桃葉1kg，加水提取3次，提取溫度為50℃，用水量分別是15kg、12kg、10kg，提取時間分別為1.5小時、1.0小時、0.5小時，濾過，合并提取液，過AB-8(南開大學化工廠)大孔吸附樹脂(也可用D4020、D101、D86001、HP-20等其他品牌的大孔吸附樹脂)柱吸附，樹脂用量為2kg，樹脂柱為φ110×1200(mm)，吸附完畢后用30L水沖洗樹脂，沖洗掉不被大孔吸附樹脂吸附的雜質，然后用85％的乙醇洗脫(也可以用丙酮、甲醇等)，洗下被吸附的黃酮類化合物，減壓濃縮洗脫液，真空干燥，得狗棗獼猴桃葉總黃酮35g。
實施例2取狗棗獼猴桃葉1kg，加乙醇回流提取3次，乙醇用量分別為12L、10L、8L，提取時間分別為1小時、0.7小時、0.5小時，濾過，合并提取液，減壓濃縮提取液至1L，加水10L，加入D101(也可用D4020、AB-8、D86001、HP-20等其他品牌的大孔吸附樹脂)大孔吸附樹脂2kg吸附，充分攪拌后過濾，用30L水沖洗樹脂，沖洗掉不被大孔吸附樹脂吸附的雜質，然后用甲醇洗脫(也可以用丙酮、乙醇等)，洗下被吸附的黃酮類化合物，減壓濃縮洗脫液，真空干燥，得狗棗獼猴桃葉總黃酮31g(樣品1)。
實施例3取狗棗獼猴桃葉1kg，加甲醇回流提取3次，甲醇用量分別為12L、10L、8L，提取時間分別為1小時、0.7小時、0.5小時，濾過，合并提取液，減壓濃縮提取液至1L，加水10L，加入D101(也可用D4020、AB-8、D86001、HP-20等其他品牌的大孔吸附樹脂)大孔吸附樹脂2kg吸附，充分攪拌后過濾，用20L水沖洗樹脂，沖洗掉不被大孔吸附樹脂吸附的雜質，再用20L0.1％氫氧化鈉水溶液沖洗樹脂，沖洗掉被大孔吸附樹脂吸附的色素類雜質，然后用甲醇洗脫(也可以用丙酮、乙醇等)，洗下被吸附的黃酮類化合物，減壓濃縮洗脫液，真空干燥，得狗棗獼猴桃葉總黃酮28g。(樣品2)實施例4取實施例1所得狗棗狗獼猴桃葉總黃酮2.4g，上硅膠(青島海洋化工廠樹脂分廠，200-300目)柱分離(100g硅膠，層析柱φ50×100mm)，用乙酸乙酸∶甲醇＝4∶1洗脫，分部收集流分，合并含有狗棗獼猴桃葉黃酮的流分，減壓濃縮，真空干燥，得含量提高了的狗棗獼猴桃葉總黃酮1.6g。
實施例5取實施例2所得狗棗狗獼猴桃葉總黃酮14.8g，上硅膠(青島海洋化工廠樹脂分廠，200-300目)柱分離(450g硅膠，層析柱φ70×100mm)，用乙酸乙酸∶甲醇＝3∶1洗脫，分部收集流分，合并含有狗棗獼猴桃葉黃酮的流分，減壓濃縮，真空干燥，得含量更加提高了的狗棗獼猴桃葉總黃酮12.2g。(樣品3)實施例6紫外分光光度法測定狗棗獼猴桃葉總黃酮中黃酮類化合物的含量(一)最大吸收波長λmax選擇將化合物8(對照品)及總提取物溶于甲醇制成20μg/ml的溶液，在190-420nm波長范圍內進行掃描，以甲醇為空白，得到各自的紫外吸收光譜。
結果表明，對照品及樣品均在350nm和267nm處有強吸收，但在267nm處吸收最強，故選λmax＝267nm。
(二)標準曲線法測定總黃酮含量1.方法將0.25mg/ml的化合物8對照品甲醇溶液按倍比配制成系列溶液5份，然后以甲醇為空白，于267nm下測定各標準溶液的吸光度值，平行測定3次，取平均值，計算出其回歸方程。再將1mg/ml樣品甲醇溶液稀釋至相應濃度，在同樣條件下測定其吸光度值，平行測定3次，取平均值，代入回歸方程求樣品中按化合物8計的總黃酮的含量。
2.結果2.1化合物8標準品系列溶液吸光度值
2.2回歸方程A＝0.02519C+0.0548r＝0.9978
2.3樣品濃度、吸光度及總黃酮含量
3.結論樣品1、樣品2、樣品3中總黃酮的含量分別為63.55％、71.30％、81.95％，均超過了50％。
實施例7HPLC法測定狗棗獼猴桃葉總黃酮中黃酮類化合物的含量利用HPLC法測定狗棗獼猴桃葉總黃酮中的每個黃酮類化合物的含量，把它們的含量之和作為總黃酮的含量，排除了黃酮以外的成分的干擾，結果更為準確，并可以建立黃酮類化合物的指紋圖譜。目前以5個成分為指標建立了含量測定方法，正在研究以所有成分為指標的含量測定方法。
(一).實驗材料及儀器1.實驗材料及試劑各種對照品及樣品均為自制；試劑均為色譜純(天津四友)2.實驗儀器Agilent 1100液相色譜儀(二).實驗條件及方法由于不同的化合物其保留時間相差較大，所以選擇兩種流動相分別進行含量測定。
1.測定化合物8含量的色譜條件ODS柱(4.5mm×25.0mm)；流動相甲醇∶水＝50∶50；流速1.2ml/min；柱溫25℃；檢測波長267nm；進樣量10μl。
2.測定其它成分含量的色譜條件ODS柱(4.5mm×25.0mm)；流動相甲醇∶水＝40∶60；流速1.0ml/min；柱溫25℃；檢測波長267nm；進樣量10μl。
3.方法采用外標一點法。
(三).實驗結果1.對照品測定結果
2.樣品測定結果
結論樣品1、樣品2、樣品3中化合物8、化合物3、化合物2、化合物5、化合物6的含量之和分別為44.9％、67.2％和61.2％，如果加上尚未測定的其他黃酮類化合物之后總黃酮含量都能超過50％，與比色法測定的數據基本一致。
實施例8狗棗獼猴桃葉總黃酮清除羥自由基活性研究1、實驗方法羥自由基的產生和清除試驗參照文獻(中草藥、第34卷第4期、317-319頁)方法進行。取7.5mmol·L-1鄰二氮菲水溶液1.8ml，加入PH＝7.4的磷酸緩沖溶液(PBS)5.0ml，充分混勻后再加入7.5mmol·L-1的硫酸亞鐵水溶液1.8ml，充分混勻后加入0.1％H2O2水溶液2.4ml，最后用水補充體積至15ml，反應液37℃恒溫反應1小時，測536nm處吸光度A損傷，實驗組先加樣品液后再加H2O2，測A加樣；未損傷管不加H2O2和樣品液，測A空白。按下式計算羥自由基清除率。
·OH清除率＝(A加樣-A損傷)/(A空白-A損傷)×100％2、試驗用樣品狗棗獼猴桃葉總黃酮
3、實驗數據
4.結論樣品1、樣品2、樣品3均具有較強的清除羥自由基作用，在250μg/ml濃度下羥自由基清除率分別為59.8％、67.8％、72.9％。
實施例9膠囊劑制備取狗棗獼猴桃葉總黃酮100g，加輔料藥用淀粉適量，充分混勻后裝入膠囊，制成每粒含狗棗獼猴桃葉總黃酮100mg的膠囊劑1000粒，供口服使用。
實施例10注射劑的制備取狗棗獼猴桃葉總黃酮10g，以聚山梨酯80做助溶劑，加注射用純凈水溶解，制成250ml含狗棗獼猴桃葉總黃酮100mg的注射液供靜脈點滴使用。
權利要求
1.一種新的天然藥物有效部位—狗棗獼猴桃葉總黃酮，其特征在于主要由狗棗獼猴桃[Actinidia Kolomikta(Rupr、et Maxim.)Planch]的葉中提取的黃酮類化合物組成。
2.權利要求1所述的狗棗獼猴桃葉總黃酮，其特征在于含有山柰酚(Kaempferol)-3-O-葡萄糖苷；山柰酚-3-O-蕓香糖苷；槲皮素-3-O-葡萄糖苷；山柰甲黃素-7-O-鼠李糖基-3-O-蕓香糖苷；山柰甲黃素-3-O蕓香糖苷；山柰甲黃素-7-O-(4-O-乙酰基-鼠李糖基)-3-O-蕓香糖苷中的兩種或兩種以上。
3.權利要求1所述的狗棗獼猴桃葉總黃酮，其特征在于其中至少含有山柰甲黃素-7-O-(4-O-乙酰基-鼠李糖基)-3-O-蕓香糖苷。
4.權利要求1所述的狗棗獼猴桃葉總黃酮，其特征在于其中黃酮類化合物的含量大于50％。。
5.權利要求1所述的狗棗獼猴桃葉總黃酮的制備方法，其特征在于狗棗獼猴桃葉經水或有機溶劑提取、大孔吸附樹脂吸附、有機溶劑洗脫、濃縮、干燥而得。
6.權利要求5所述的制備方法，其特征在于進一步包括柱層析分離純化步驟。
7.權利要求5所述的制備方法，其中大孔吸附樹脂包括AB-8、D4020、D101、860021、HP-20；；有機溶劑包括甲醇、乙醇、丙酮及它們與水的混合液。
8.權利要求5所述的制備方法，其特征在于水提取液直接過大孔吸附樹脂吸附；有機溶劑提取液先回收有機溶劑，加水溶解后再用大孔吸附樹脂吸附。
9.權利要求5所述的制備方法，其特征在于有機溶劑洗脫之前用堿溶液沖洗大孔吸附樹脂柱。
10.權利要求5所述的制備方法，其特征在于提取溫度低于100℃。
11.權利要求6所述的柱層析，包括硅膠、氧化鋁、ODS、聚酰胺柱層析的一種或一種以上。
12.權利要求1所述的狗棗獼猴桃葉總黃酮，在制備預防與治療與自由基損傷有關的疾病的藥物中的用途。
13.權利要求12所述的用途，其中的疾病包括腫瘤、動脈硬化、冠心病、腦血栓、腦出血、腦梗塞、腦供血不足、糖尿病、癡呆、白內障。
14.權利要求1所述的狗棗獼猴桃葉總黃酮與醫學上可接受的藥用輔料組成的藥物組合物及制劑。
15.權利要求14所述的制劑，包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、注射劑。
全文摘要
本發明公開了從狗棗獼猴桃葉中提取的一種新的天然藥物有效部位，狗棗獼猴桃葉總黃酮及其制備方法以及在藥物制備中的用途，尤其在制備預防與治療與自由基損傷有關的藥物中的用途。
文檔編號A61K31/7042GK1566126SQ0314519
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月3日 優先權日2003年7月3日
發明者金永日, 桂明玉, 李緒文 申請人:金永日