專利名稱：優(yōu)化的sars冠狀病毒n蛋白基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)、基因工程學(xué)及疫苗學(xué)，更具體地涉及優(yōu)化的SARS冠狀病毒N蛋白基因。此基因可運(yùn)用于在哺乳類動(dòng)物尤其是人類細(xì)胞環(huán)境中高效表達(dá)產(chǎn)生N蛋白。本發(fā)明還涉及含有該基因的載體及疫苗。
背景技術(shù)：
非典型肺炎，簡稱非典，又稱嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)已蔓延到全球三十多個(gè)國家和地區(qū)，尤為嚴(yán)重的包括中國、中國香港、新加坡、加拿大、越南、中國臺(tái)灣和美國，短期內(nèi)已導(dǎo)致嚴(yán)重的生命財(cái)產(chǎn)損失。最近的流行病學(xué)研究估計(jì)在60歲以上患者，死亡率可高達(dá)近半數(shù)。
一種新的SARS冠狀病毒(SARS Coronavirus)已經(jīng)被確認(rèn)為是非典的致病誘因，該病毒的基因組已被測序并公布。SARS冠狀病毒為ssRNA(+)病毒，復(fù)制不經(jīng)過DNA中間體，使用標(biāo)準(zhǔn)密碼子。在電鏡下，病毒顆粒呈不規(guī)則形，直徑約為60-220nm，其表面有梅花形的膜粒，狀如皇冠。顆粒中心在負(fù)染電鏡下呈不定形態(tài)，核殼體呈疏松狀態(tài)。包膜上有兩種糖蛋白S蛋白和M蛋白。S蛋白為刺突糖蛋白，是主要的抗原，與受體結(jié)合，使細(xì)胞融合。M蛋白為跨膜蛋白，參與包膜形成。此外，N蛋白也具有免疫原性。
發(fā)展疫苗為預(yù)防病毒感染的最有效的方法，并被證實(shí)已成功地運(yùn)用于多種致命的病毒感染，如天花、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、腮腺炎、甲型肝炎、乙型肝炎。為了有效地控制和預(yù)防SARS，人們正在開發(fā)各種SARS疫苗，其中主要有五種類型滅活疫苗、減毒活疫苗、重組亞單位疫苗、DNA疫苗和減毒病毒載體疫苗。
然而，迄今為止尚沒有真正有效的SARS疫苗問世。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)有效的SARS疫苗，尤其是能夠在宿主體內(nèi)大量引入或產(chǎn)生免疫原性SARS多肽的疫苗。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種能夠在宿主體內(nèi)大量產(chǎn)生免疫原性SARS多肽的優(yōu)化的SARS冠狀病毒N蛋白基因，含有該基因的載體及疫苗。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的核酸分子，它編碼SARS冠狀病毒的N蛋白或免疫原性片段，且其與天然的SARS冠狀病毒的N蛋白編碼序列的相同性為76±3％。
在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子編碼SEQ ID NO2所示的SARS冠狀病毒N蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子選自下組(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列相同性大于95％，且編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，與天然的SARS病毒的N蛋白編碼序列相比，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，所述核酸分子編碼的N蛋白的表達(dá)量提高至少100％。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明上述的核酸分子。
在另一優(yōu)選例中，所述的載體是質(zhì)粒或病毒載體，更佳地所述的病毒載體是腺病毒。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明上述的載體，或者被本發(fā)明上述的核酸分子所轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明的第四方面，提供了了一種組合物，它含有本發(fā)明上述的載體或核酸分子以及藥學(xué)上可接受的賦型劑或稀釋劑。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對SARS冠狀病毒的N蛋白的編碼序列進(jìn)行了一系列優(yōu)化。優(yōu)化后的編碼序列更適合于在哺乳動(dòng)物例如人類以及其他哺乳類動(dòng)物的細(xì)胞或組織環(huán)境中表達(dá)，從而不僅更適合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)大規(guī)模高效表達(dá)生產(chǎn)N蛋白，而且也更適合作為DNA疫苗。
本發(fā)明一種優(yōu)化的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，含1269bp，編碼與原始冠狀病毒N蛋白相同的氨基酸序列以保持其免疫抗原性質(zhì)。然而，此優(yōu)化合成的基因只與原始冠狀病毒N蛋白基因有76.3％相同性。其423個(gè)密碼子中的265個(gè)密碼子(或63％密碼子)已被改變，但保留了與原N蛋白相相同的氨基酸序列以優(yōu)化在哺乳類細(xì)胞中的表達(dá)，以及用于疫苗的用途。
SEQ ID NO1所示的核苷酸序列被稱為“CONO”，意為優(yōu)化的冠狀病毒N蛋白基因(CoronavirusNproteinoptimized gene)。
應(yīng)理解，由于SARS病毒也會(huì)象其他病毒一樣發(fā)生變異，因此，對于氨基酸序列不同于SEQ ID NO2的變異的N蛋白，可以在SEQ ID NO1的基礎(chǔ)上，在相應(yīng)位置用相應(yīng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選的密碼子替換相應(yīng)的SARS病毒的密碼子，從而獲得優(yōu)化的、編碼突變N蛋白的核苷酸序列。
如本文所用，術(shù)語“優(yōu)化的N蛋白編碼序列”是指SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，以及與SEQ ID NO1相同性大于95％，較佳地大于96％，更佳地大于98％的核苷酸序列。與原SARS病毒的N蛋白核苷酸序列相比，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞等)中，優(yōu)化的N蛋白編碼序列的表達(dá)量提高至少100％，更佳地提高至少200％或更高。
此外，本發(fā)明除了包括全長的優(yōu)化的N蛋白編碼序列之外，還包括其片段，例如基于SEQ ID NO1所示序列且編碼免疫原性N蛋白片段的核苷酸序列。
本發(fā)明優(yōu)化的N蛋白編碼序列，可通過DNA重組技術(shù)導(dǎo)入脊椎類動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物例如人類以及其他哺乳類動(dòng)物的細(xì)胞或組織環(huán)境中，從而高效地表達(dá)N蛋白、免疫原性片段或其衍生產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了含有全部或部分優(yōu)化的N蛋白編碼序列的質(zhì)粒或病毒載體，以及因被所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入或病毒載體轉(zhuǎn)染入從而含有本發(fā)明優(yōu)選的N蛋白編碼序列的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。
一種優(yōu)選的病毒載體是腺病毒載體，例如目前已用于臨床疫苗試驗(yàn)的復(fù)制缺陷腺病毒載體，包括E1區(qū)域缺失型、E3區(qū)域或缺失或保留的5型或2型或其他亞型腺病毒。在某些情況下，腺病毒載體也可包括E1區(qū)域，但在其他區(qū)域被缺失。其他腺病毒載體可包括多區(qū)域缺失的載體，例如助手依賴型或全缺失型腺病毒載體。
在腺病毒基因組的E1區(qū)域或者E3區(qū)域或其他合適區(qū)域，可插入一個(gè)SARS病毒的N蛋白表達(dá)盒。該表達(dá)盒從5′→3′依次含有1)表達(dá)啟動(dòng)子(promoter)；2)與所述啟動(dòng)子操作性相連的優(yōu)化的冠狀病毒N蛋白編碼序列(包括其變異體或衍生片段)；3)與該優(yōu)化的編碼序列相連的多腺苷酸化信號(hào)序列。
除了腺病毒載體之外，其他的其他病毒載體包括但不局限于腺病毒相關(guān)病毒(AAV，adem-assocated virus)、痘病毒(vaccinia virus)等。
另一種優(yōu)選的載體是質(zhì)粒載體。在該質(zhì)粒載體中同樣插入SARS病毒的N蛋白表達(dá)盒。
通過培養(yǎng)導(dǎo)入本發(fā)明優(yōu)化的N蛋白編碼序列的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以大規(guī)模高效率地生產(chǎn)N蛋白，然后用常規(guī)的分離和純化方法獲得純化的N蛋白。純化的N蛋白可用于生產(chǎn)抗體、SARS診斷試劑盒、和其他用途。
疫苗組合物本發(fā)明還提供了一種疫苗組合物，它包括攜帶全部或部分優(yōu)化的N蛋白編碼序列的質(zhì)?；虿《据d體，以及藥學(xué)上可接受的載體。當(dāng)本發(fā)明的疫苗組合物被施用于哺乳動(dòng)物(如人)時(shí)，這些質(zhì)粒或病毒載體會(huì)在體內(nèi)高效表達(dá)N蛋白、免疫原性片段或其衍生產(chǎn)物，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫以防治SARS冠狀病毒的感染。
可將藥用組合物制備成各種劑型，如粒劑、片劑、膠囊、懸浮液、噴霧、栓劑、透皮藥物(如貼片等)、油膏、洗劑等。
另外，本發(fā)明的疫苗組合物的配制還可含有其它成分，包括如佐劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑等。這些成分是疫苗領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
給藥途徑和劑量當(dāng)用作疫苗時(shí)，可用已知的方法將本發(fā)明的重組病毒載體施用于個(gè)體。通常采用與常規(guī)疫苗相同的施用途徑和/或模擬病原體感染路徑施用這些疫苗。給藥的常規(guī)和藥學(xué)上可接受的途徑包括鼻內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)口服或其它腸胃外給藥途徑。如果需要可以組合給藥途徑，或按抗原肽或疾病情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。
疫苗組合物可以單劑量或多劑量給予，且可以包括給予加強(qiáng)劑量以引發(fā)和/或維持免疫力。
應(yīng)以“免疫有效量”給予本發(fā)明的疫苗，即重組病毒載體的量在所選用的給藥路徑中足以引發(fā)免疫應(yīng)答，能有效地促使保護(hù)宿主抵抗SARS病毒感染或SARS癥狀。
在各疫苗劑份中所選用的病毒載體的量，是按可引發(fā)免疫保護(hù)性應(yīng)答而無明顯的副作用的量而定。通常，在感染宿主細(xì)胞后，各劑份的疫苗足以產(chǎn)生約1-1000μg，較佳地為1-200μg，更佳地10-100μg蛋白質(zhì)。以病毒載體核酸為基礎(chǔ)計(jì)算的疫苗有效劑量，通常包括給予約1ug-100mg核酸。另外，病毒載體疫苗的有效劑量的一般范圍為約102-107，103-106或104-105空斑形成單位(PFU)。對于以腺病毒載體為例的非致病病毒疫苗載體，通常引入106-1012個(gè)腺病毒顆粒/每人，較佳地107-1011個(gè)腺病毒顆粒/每人。可用包括觀察對象中的抗體滴定度和其它反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)研究方法來確定具體疫苗的最佳用量。可通過監(jiān)控疫苗提供的免疫力水平來確定是否需要增強(qiáng)劑量。在評(píng)估了血清中的抗體滴定度后，可能需要選用增強(qiáng)劑量免疫接種。施用佐劑和/或免疫刺激劑可提高對SARS病毒的免疫應(yīng)答。
通過引介106至1012基因拷貝的非致病病毒疫苗載體腺病毒顆粒以攜帶此多核苷酸進(jìn)入脊椎類動(dòng)物尤以哺乳動(dòng)物例如人類以及其他哺乳類動(dòng)物的體內(nèi)以誘導(dǎo)抗SARS冠狀病毒的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)優(yōu)化的N蛋白編碼序列在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)效率更高，因此生產(chǎn)N蛋白的效率高。
(2)優(yōu)化的N蛋白編碼序列在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)效率更高，因此在接種的哺乳動(dòng)物體內(nèi)可產(chǎn)生更多的免疫原性N蛋白，從而有效地激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1優(yōu)化的N蛋白編碼序列的合成在本實(shí)施例中，根據(jù)公布的SARS冠狀病毒N蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO2，以及哺乳動(dòng)物的優(yōu)選密碼子，并根據(jù)以下原則對編碼序列進(jìn)行優(yōu)化，(a)在不同物種之間密碼子的選用有偏好性；(b)密碼子選用的差異與翻譯速度相關(guān)；(c)密碼子的上下文(context)及某一特定密碼子在某一特定位置的存在可嚴(yán)重影響翻譯速度；尤其是對某些特別影響翻譯速度的密碼子進(jìn)行了替換，設(shè)計(jì)出SEQ ID NO1所示序列。
然后用DNA合成儀(Mclab公司)，通過常規(guī)方法，即先獲得寡核苷酸片段，然后將各片段退火，并PCR延伸，從而合成得到SEQ ID NO1的DNA序列。
SEQ ID NO1所示的優(yōu)化合成的N蛋白基因只與原始冠狀病毒N蛋白基因有76.3％相同性。其423個(gè)密碼子中的265個(gè)密碼子(或63％密碼子)已被改變，但編碼與原N蛋白相相同的氨基酸序列，以優(yōu)化在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>陳，凌陳，克勤<120>優(yōu)化的SARS冠狀病毒N蛋白基因<130>033980<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1269<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1269)<223>優(yōu)化的SARS冠狀病毒N蛋白編碼序列<400>1atgtctgaca atggccccca gtccaaccag aggtctgccc ccaggatcac ctttggcggc60cccacagact ccacagacaa caaccagaat ggcggcagga atggcgccag gcccaagcag120aggaggcccc agggcctgcc caacaacaca gcctcctggt tcacagccct gacccagcat180ggcaaggagg agctgaggtt ccccaggggc cagggcgtgc ccatcaacac caactctggc240cctgatgacc agattggcta ctacaggagg gccaccagga gggtgagggg cggcgatggc300aagatgaagg agctgtcccc caggtggtac ttctactacc tgggcacagg ccctgaggcc360tccctgccat atggcgccaa caaggagggc attgtctggg tggccacaga gggcgccctg420aacaccccca aggaccacat tggcaccagg aaccccaaca acaatgctgc cacagtgctg480cagctgcccc agggcaccac cctgcccaag ggcttctatg ctgagggctc caggggcggc540tcccaggcct cctccaggtc ctcctccagg tccaggggca actccaggaa ctccacccct600ggctcctcca ggggcaactc ccctgccagg atggcctctg gcggcggcga gacagccctg660gccctgctgc tgctggacag gctgaaccag ctggagtcca aggtctctgg caagggccag720
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Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys115 120 125Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys130 135 140Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu145 150 155 160Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly165 170 175Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg180 185 190Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro195 200 205Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu210 215 220Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln225 230 235 240Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser245 250 255Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr260 265 270Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly275 280 285Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln290 295 300Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg305 310 315 320Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly325 330 335Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile340 345 350Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu355 360 365Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro
370 375 380Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp385 390 395 400Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser405 410 415Ala Asp Ser Thr Gln Ala420
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其特征在于，它編碼SARS冠狀病毒的N蛋白或免疫原性片段，且其與天然的SARS冠狀病毒的N蛋白編碼序列的相同性為76±3％。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它編碼SEQ ID NO2所示的SARS冠狀病毒N蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它選自下組(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列相同性大于95％，且編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，與天然的SARS病毒的N蛋白編碼序列相比，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，所述核酸分子編碼的N蛋白的表達(dá)量提高至少100％。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的核酸分子。
7.如權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，它是質(zhì)粒。
8.如權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，它是病毒載體。
9.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
10.一種組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體和藥學(xué)上可接受的賦型劑或稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了優(yōu)化的SARS冠狀病毒N蛋白基因，它編碼SARS冠狀病毒的N蛋白或免疫原性片段，且其與天然的SARS冠狀病毒的N蛋白編碼序列的相同性為76±3％(如SEQ ID NO1)。還提供了含有優(yōu)化的N蛋白編碼序列的載體、宿主細(xì)胞和疫苗組合物。經(jīng)優(yōu)化的N蛋白編碼序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)效率更高，因此生產(chǎn)N蛋白的效率更高，也能更有效地激發(fā)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生抗SARS的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1570101SQ03141620
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月16日
發(fā)明者陳凌, 陳克勤 申請人:陳克勤, 陳凌