制備和檢定具有可檢驗的口服吸收性云芝的免疫調節的肽聯葡聚糖的制作方法

專利名稱：制備和檢定具有可檢驗的口服吸收性云芝的免疫調節的肽聯葡聚糖的制作方法
參考相關申請本申請是2002年5月22日提交的美國申請號60/383,339的非臨時申請，以其全文在此引作參考。有關聯邦資助的研究或開發下進行的發明的權益的聲明不適用參考“序列表”，表格或以小型盤提交的計算機程序表附錄適用發明背景當分離的缺陷已經導致臨床疾病時，個別免疫功能成分對寄主的天然防御的重要性已經非常明確地闡明了。因為這樣的異常現在已經可以通過新的實驗室方法來有效檢測和限定，免疫缺陷疾病正在以更快的速度發現。免疫缺陷紊亂必須在兩大類中考慮初級免疫缺陷，經常由遺傳決定，和次級免疫缺陷狀態。后者是作為感染和侵染、腸胃紊亂、營養失調、衰老、淋巴惡性腫瘤、其他癌癥和許多其他疾病的并發癥而發生的。嚴重程度不同的免疫缺陷也遇到許多治療模式包括癌癥的放療和化療的副作用。從此觀點來看，初級和次級免疫缺陷不是稀有的疾病。這些問題已必需研究具有免疫強化特性的新型治療劑。
在數目逐漸增加的疾病的致病機理中發現有免疫系統的參與，已經不可避免地導致了人們試圖通過操縱免疫機制的各種因素來調節這些疾病的過程。刺激免疫系統常常是緩和免疫缺陷狀態的選擇。這一途徑，其中有幾套如今可得的有效試劑(即芽孢桿菌Calmette-Guerin、內毒素)，在醫藥中的兩個主要治療領域——癌癥和感染疾病具有特別的前景。
根據免疫監督的概念，當惡性細胞出現時，免疫系統就消除它們。T細胞和更近的巨噬細胞、天然殺傷細胞的抗癌作用已經有報道。另外，即使抗腫瘤免疫應答主要不涉及腫瘤生長的控制，似乎適當的免疫刺激可以引發有效的免疫應答或給予原本無效的反應以有效反應。所有這些考慮因素已經在癌癥的治療中為免疫刺激用作外科手術、放療或化療的輔助方法提供根據1。
在動物模型的感染疾病中，免疫刺激劑也已經廣泛研究。感染個體呈現被識別的免疫缺陷問題并經常顯示機會微生物的感染，理論上應該從免疫治療中獲益。但是應該注意到，與免疫缺陷不顯著相關的感染也可以用免疫強化劑來治療，因為加強免疫應答可以幫助消除阻遏正常生理反應的特殊的強毒劑。另外，衰老個體的情況應該給予特別的關注，他們經常對許多疫苗缺乏反應(例如流感疫苗)。
本發明的簡要說明在一個方面，本發明提供了云芝(coriolus versicolor)的純化的提取物，其包括至少一種含有通過(1→3)鍵連接的葡聚糖分子的肽聯葡聚糖，具有由大小排阻層析確定的0.7kDa到5kDa的分子量；和提供免疫刺激活性。在另一方面，本發明提供了云芝的分離的肽聯葡聚糖，其包含多個(1→3)鍵連接的葡聚糖分子，具有由大小排阻層析確定的0.7kDa到3.0kDa的分子量；以及分離的肽聯葡聚糖及其活性成分具有免疫刺激活性。本發明進一步提供了包含云芝的分離的肽聯葡聚糖及其活性成分的藥物組合物。
在另一方面，本發明提供了從云芝純化肽聯葡聚糖的方法，其包括下列步驟用堿處理云芝，分離上清液；將上清液進行陽離子交換，將來自陽離子交換的洗脫物進行陽離子交換；將來自陰離子交換的洗脫物通過大小分級分離技術進行分離，并且回收包含肽聯葡聚糖、分子量為0.7kDa到5kDa的組分。
在另一方面，本發明提供了刺激免疫應答的方法，其包括將免疫系統的細胞與提取物、肽聯葡聚糖或其活性成分接觸。在另一方面，本發明提供了治療需要免疫系統刺激的患者的方法，包括對患者給藥有效量的權利要求所述的提取物、純化的肽聯葡聚糖或其活性成分來刺激免疫應答。
附圖的簡要說明圖l是說明CV粗取物的制備方案中所用步驟的流程圖。
圖2A和2B。圖2A是大小排阻層析譜，其顯示CV粗提取物的蛋白質成分的洗脫圖。圖2B是CV粗提取物的大小排阻層析譜，其顯示CV粗提取物的碳水化合物成分的洗脫圖。
圖3說明與CV粗提取物或伴刀豆球蛋白A(Con A)體外接觸的活鼠脾細胞的增殖。
圖4說明與CV粗提取物或LPS體外接觸的分離的鼠骨髓細胞的增殖效果。
圖5說明與CV粗提取物或LPS體外接觸的鼠腹膜巨噬細胞分泌一氧化氮增加。
圖6A和6B。圖6A說明用CV粗提取物腹膜內(i.p.)給藥處理(3天服藥計劃)的小鼠的活脾細胞的體內效果。圖6B說明用CV粗提取物腹膜內給藥處理(3天服藥計劃)的活骨髓細胞的離體增殖效果。
圖7A和7B。圖7A說明用CV粗提取物口服給藥治療(7天服藥計劃)的正常小鼠的活脾細胞的體內效果。圖7B說明用CV粗提取物口服給藥處理(7天服藥計劃)的正常小鼠的活骨髓細胞的離體增殖效果。
圖8A、8B和8C。圖8A說明用CV粗提取物腹膜內給藥處理(3天服藥計劃)的無免疫應答的小鼠的活脾細胞和活骨髓細胞的體內效果。圖8B說明用CV粗提取物口服給藥處理(7天服藥計劃)的無免疫應答的小鼠的活脾細胞和活骨髓細胞的體內效果。圖8C說明用CV粗提取物口服給藥處理(7天服藥計劃)的重度無免疫應答的小鼠的活脾細胞和活骨髓細胞的體內效果。
圖9A、9B和9C。圖9A說明用CV粗提取物口服給藥處理(14天服藥計劃)的重度無免疫應答的小鼠的活脾細胞和骨髓細胞的體內效果。圖9B說明用CV粗提取物口服給藥處理(14天服藥計劃)的重度無免疫應答的小鼠的活脾細胞的離體增殖效果。圖9C說明用CV粗提取物口服給藥處理(14天服藥計劃)的重度無免疫應答的小鼠的活骨髓細胞的離體增殖效果。


圖10說明用各種劑量的CV粗提取物口服給藥處理(7天服藥計劃)的無免疫應答的小鼠的活脾細胞和骨髓細胞的體內效果。
圖11說明用CV粗提取物口服給藥處理，然后用2，4-二硝基-1-氟苯(DNFB)攻擊的正常、免疫抑制和嚴重免疫抑制的小鼠的耳朵測量。
圖12A、12B和12C。圖12A說明用CV粗提取物口服給藥處理(30天服藥計劃)的正常小鼠的活脾細胞和骨髓細胞的體內效果。圖12B說明用CV粗提取物口服給藥處理(30天服藥計劃)的正常小鼠的活脾細胞的離體增殖效果。圖12C說明用CV粗提取物口服給藥處理(30天服藥計劃)的正常小鼠的活骨髓細胞的離體增殖效果。
圖13說明用粗CV提取物、CV-D2、CV-D3、CV-D4和CV-5體外接觸的活鼠脾細胞的增殖。
圖14說明用CV粗提取物、CV-E8、CV-E6、CV-E4、CV-E2、CV-E0體外接觸的鼠腹膜巨噬細胞分泌一氧化氮增加。
圖15是流程圖，說明在從圖1的粗CV提取物進一步純化活性成分的方案中所用的步驟。
圖16說明CV組分基本結構單元(中性糖、糖醛酸和蛋白質/肽)的組成與體外促有絲分裂活性的關系。
圖17顯示3個部分純化的CV活性部分，即C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX對鼠腹膜巨噬細胞分泌一氧化氮的體外刺激活性。
圖18A和18B。圖18A是說明CV粗提取物的分子量分布的層析譜。圖18B是說明透過Caco-2細胞單層的CV粗提取物成分的分子量分布的層析譜。
圖19A和19B。圖19A是說明CV部分純化的提取物C1D5E8的分子量分布的層析譜。圖19B是說明透過Caco-2細胞單層的C1D5E8提取物成分的分子量分布的層析譜。
圖20A和20B。圖20A是說明CV部分純化提取物C1D5E7的分子量分布的層析譜。圖20B是說明透過Caco-2細胞單層的C1D5E7提取物成分的分子量分布的層析譜。
圖21A和圖21B。圖21A是說明CV部分純化提取物C1D5EX的分子量分布的層析譜。圖21B是說明透過Caco-2細胞單層的C1D5EX提取物成分的分子量分布的層析譜。
圖22說明與CV部分純化的提取物的可滲透Caco-2細胞單層的成分或LPS接觸的小鼠腹膜巨噬細胞分泌一氧化氮的體外影響。
圖23A和23B。圖23A說明用CV部分純化的提取物腹膜內給藥處理(3天服藥計劃)的無免疫應答的小鼠的活脾細胞的體內影響。圖23B說明用CV部分純化的提取物腹膜內給藥處理(3天服藥計劃)的無免疫應答小鼠的活骨髓細胞的體內影響。
圖24A和24B。圖24A說明用CV部分純化的提取物口服給藥處理(7天服藥計劃)的無免疫應答小鼠的活脾細胞的體內影響。圖24B說明用CV部分純化的提取物口服給藥(7天服藥計劃)的無免疫應答小鼠的活骨髓細胞的體內影響。
本發明的詳細說明I.定義為了本發明的目的，如下定義了下面的術語“免疫刺激劑”、“免疫刺激試劑”和“免疫調節劑”，如本文所用，指誘導免疫應答的試劑。
“免疫原”指能夠引起免疫應答或產生免疫性的試劑或物質。
“免疫原性”指免疫原誘導免疫應答的能力。
“免疫缺陷”指在免疫應答能力中的任何缺陷，如體液或細胞介導的免疫性的缺陷性生產。
“免疫活性”指對抗原或免疫原的免疫應答能力。
“非特異免疫性”指由抗體的形成和特異抗原反應淋巴細胞的生成以外的任何其他機制所產生的對病原體入侵的抗性。
“肽”指包含通過酰胺鍵連接的氨基酸殘基的任何物質。
“多糖”指一類碳水化合物，其中該分子來自單糖亞基的聚合。多糖通常含有5個或更多個通過糖苷鍵相互連接的單糖亞基。
“葡聚糖”指由葡萄糖組成的多糖。
術語“免疫介導”指天然的自身免疫或炎性的過程。
提取物或組合物的活性成分是刺激免疫系統的一種成分。
術語“白細胞”指白血球。淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞是白細胞的例子。
術語“淋巴細胞”指介導體液或細胞免疫性的單核白細胞。
術語“單核細胞”指在遷移至組織中變成巨噬細胞之前，在血流中暫時循環的單核巨噬細胞白細胞。
“T細胞”指在胸腺中成熟和表達T細胞受體、CD3和CD4或CD8的淋巴細胞。存在幾個被識別的T細胞亞群。
“患者”包括接受預防或治療性處理的人和其他哺乳動物個體。
術語“分離的”、“純化的”或“基本純的”指已經從其天然環境的成分中富集或分離的目標品種。所以，在提取物中的肽聯葡聚糖是分離的，盡管它可以與其他肽聯葡聚糖或其他細胞成分一起存在。該術語也可以表明，目標品種是存在的主要的大分子品種(即在摩爾基礎上，它在組合物中比任何其他單個品種更豐富)。并且目標品種優選至少含有約50％(在摩爾基礎上)的所有存在的大分子品種。通常，分離的、純化的或基本純的組合物將在組合物中含有80％到90％以上的所有大分子品種。更優選地，使目標品種純化到基本均一(即通過常規檢測方法，在組合物中不能檢測到污染品種)，其中組合物基本由單一的大分子品種組成。
所有定量值包括在量的測量中表示典型實驗誤差的誤差幅度。II.概述本發明提供了云芝(CV)純化的提取物及其活性成分、純化其的方法和利用其刺激免疫應答的方法。本發明純化的提取物的活性成分是一種或多種低分子量的肽聯葡聚糖(0.7kDa到5kDa和優選0.7kDa到3kDa)。肽聯葡聚糖保留了CV粗提取物的免疫刺激特性，它們在中國人群體中作為輔助手段定期食用，已經普遍地促進改善健康和帶來長壽。最近，傳統的提取物已經更通常地用于治療一般性的免疫衰弱和腫瘤。接受外科、化療和/或放療的癌癥患者在延長口服給藥傳統的CV提取物后，已觀察到他們的免疫和健康狀態有顯著提高。
本發明的提取物、肽聯葡聚糖及其活性成分正如中醫傳統實踐中的CV粗提取物，以相似方式用于在患者體內和體外刺激免疫應答。另外，本申請提供的數據表明，本發明的肽聯葡聚糖可以通過腸壁吸收，允許采用傳統中醫的粗提取物口服給藥。但是本發明的提取物和肽聯葡聚糖及其活性成分具有純度更高、藥效更大和/或再現性更好的優點。本發明的提取物、肽聯葡聚糖及其活性成分也可以用于進一步分離。例如，在實施例中所示的數據表明，一種或多種肽聯葡聚糖的肽成分具有主要的免疫刺激活性，雖然葡聚糖成分可以給予傳統的免疫刺激活性。所以，提取物和肽聯葡聚糖可以用于制備分離的肽及其活性成分。
雖然對于實施本發明，認識機制是不需要的，但可以認為，作用方式明顯包括淋巴細胞和骨髓細胞的增殖和巨噬細胞的活化。III.本發明的純化的提取物和肽聯葡聚糖本發明的純化的提取物包括至少一種由大小排阻層析確定的分子量為0.7kDa到5kDa的肽聯葡聚糖。所述至少一種肽聯葡聚糖具有免疫刺激活性。免疫刺激活性可以通過在下文或實施例中所述的任何分析中的統計學上顯著的應答來測量。
優選地，本發明的純化的提取物包含至少50％、分子量為0.7kDa到5kDa的肽聯葡聚糖。本發明的一些純化的提取物包含至少60％、分子量為0.7kDa到5kDa的肽聯葡聚糖。本發明的一些純化的提取物包含至少70％、分子量為0.7kDa到5kDa的肽聯葡聚糖。本發明的一些純化的提取物包含至少80％、分子量為0.7kDa到5kDa的肽聯葡聚糖。本發明的一些純化的提取物包含至少85％、分子量為0.7kDa到5kDa的肽聯葡聚糖。本發明的一些純化的提取物包含至少90％、分子量為0.7kDa到5kDa的肽聯葡聚糖。本發明的一些純化的提取物包含至少99％、分子量為0.7kDa到5kDa的肽聯葡聚糖。
肽聯葡聚糖的葡聚糖成分包括通過1→3鍵連接的葡萄糖分子。一些提取物含有幾個肽聯葡聚糖，而其他含有單個肽聯葡聚糖。在含有幾個肽聯葡聚糖的提取物中，肽成分如葡聚糖成分，在不同的肽葡聚糖中可以相同或不同。在優選的提取物中，肽聯葡聚糖的平均分子量是0.7到3kDa。在一些提取物中，肽聯葡聚糖的平均分子量是0.7kDa或1.0kDa。分子量不超過3kDa在保證通過腸壁時是有優勢的。本發明的一些肽聯葡聚糖進一步的特征是在水、乙醇和丙酮中可溶，在氯仿和二氯仿中不溶，和缺乏吸濕性。IV.制備本發明的純化的提取物和肽聯葡聚糖I.制備云芝的活性水提取物正如圖1的流程圖所示，可以從干的CV果實體中通過用液體溶劑抽提果實體和濃縮得到的溶液形成濃縮的提取物來制備CV的活性水相提取物。在一些方法中，將干的CV果實體浸軟、脫色，并在稀釋的堿溶液如0.01N氫氧化鈉溶液中煮沸。其他堿性溶液如氫氧化鉀也可以利用。在這一加熱條件下，這些堿性水溶液提取劑的濃度優選為0.1N以避免可能的活性損失。提取后，例如通過過濾除去不溶性物質，并且通過離心或其他方法澄清剩余的產物。濃縮清亮的上清液，并且在存儲之前凍干、備用。
凍干的上清液經鑒定，其肽組成按重量計約4-6％，優選4.7％，(在實驗誤差范圍內)，由Bradford分析確定。優選的提取物按重量計具有由酚硫酸方法所確定的50％-60％(優選55％)的葡萄糖化合物。優選的提取物按重量計具有約4-6％，優選約4.8％的糖醛酸化合物。2.制備CV提取物的純化或部分純化的活性組分在圖15中的流程圖顯示了制備部分純化的提取物的示例方法。將干的粗CV提取物溶于水，并通過離心除去水溶性較小的物質。pH4的水溶性CV提取物中的陽離子物質可以通過陽離子交換樹脂吸收并除去。然后，通過對帶負電荷的分子有選擇性的任何技術可以進一步純化活性成分。優選利用陰離子交換樹脂DEAE纖維素。部分純化的組分可以通過乙醇梯度分級分離或根據它們的分子量分離分子的凝膠過濾來進一步分級分離。優選的的分子量范圍是0.7-3kDa。在五步的乙醇梯度中，從所有步驟中分離出活性組分，除了95％的水醇可溶性物質以外。利用本領域已知的一些標準方法如層析可以達到進一步的純化。例如，通過肽酶處理可以從肽成分中分離出肽聯葡聚糖的葡聚糖成分。通過葡聚糖酶處理，可以從葡聚糖成分中分離肽。通過選擇性的蛋白質水解消化可以制備肽聯葡聚糖的肽片段。通過凝膠電泳，任選在兩維中，可以分離單個肽聯葡聚糖和切出分離帶。V.確定純化的提取物和活性成分的免疫刺激活性的方法對不同的細胞類型，免疫刺激活性有不同的效果。對于不成熟的免疫細胞，當其受到免疫刺激劑攻擊時，發生了一系列生化事件，包括磷脂合成增加，和二價陽離子通透性提高。然后不久發生了蛋白質、RNA和最終DNA的合成。最后的現象是DNA合成增加(這最終導致了細胞分裂)，形成淋巴細胞和骨髓細胞活化的定量測定的基礎。通過采用一種摻入新合成DNA中的核苷酸前體，含氚的胸腺嘧啶(3H-Tdr)來脈沖標記培養物，從而測量DNA的合成。通過閃爍計數確定摻入的3H-Tdr相對于DNA合成速率的量。閃爍計數產生了通常用作標準測量促有絲分裂原反應性的每分鐘計數(CPM)的數據。通過在對照培養物中測量CPM，使刺激培養物的CPM標準化以產生稱為刺激指數的比例。
效應免疫細胞如巨噬細胞當被免疫刺激劑激活時能夠分泌胞毒介質(例如NO-)和細胞因子(例如白介素和組織壞死因子)。由于巨噬細胞只在免疫原刺激基礎上分泌NO-，提高巨噬細胞的NO-的產生通常用作定量免疫原的免疫刺激活性的方法。在與免疫刺激劑溫育的過程中，巨噬細胞產生的高活性NO-將很快氧化成更穩定的亞硝酸鹽(NO2-)。然后培養物上清液中的亞硝酸離子的量可以通過Griess反應來測量。
免疫刺激活性也可在免疫性的體內模型中測量。這些模型具有在整個動物水平整合免疫應答的優點。對免疫性的體內影響進行評估的可獲得的模型包括重要的免疫器官的細胞性(活成分細胞的數目)和遲發型過敏性的檢測。免疫學研究的最新趨勢已經朝著更加重視利用離體淋巴細胞增殖反應以證明免疫反應性的方向發展3，4。離體分析實驗利用了培養的淋巴細胞增殖的能力，因為體外增殖是淋巴細胞已被充分識別的特性，并且已經顯示與寄主免疫性有良好的關系。在藥物治療結束后，處死動物，回收免疫活性細胞。然后，細胞在體外培養一定時期，評估含氚胸腺嘧啶的細胞吸收。雖然，大多數免疫活性細胞培養時是可以增殖的，但不得不用免疫刺激劑，例如Con A和LPS來增強增殖以達到可測量的水平3。
遲發型過敏性反應與細胞介導的免疫性有良好的關系。接觸超敏感性是一類遲發型過敏性；在皮膚表面的抗原，主要是半抗原，通過Langerhans細胞吸收、加工并呈遞給T CD4+淋巴細胞，該淋巴細胞最終導致血管舒張和耳朵腫漲。強烈的接觸性致敏物，如二硝基氟苯(DNFB)用于小鼠中誘導接觸敏感性反應，其強度可以通過用藥物處理動物或與化學物接觸來調節。在致敏之前立即和致敏后24小時用數字卡尺測量耳朵的厚度。耳朵厚度的增加是延遲類型超敏感性的良好指征。
在臨床和臨床前研究中，對患者也可以測量免疫刺激活性，這表明免疫刺激劑具有增強癌癥常規性治療的臨床效率，從無免疫應答狀態恢復免疫功能和增強對感染的抗性的能力，這主要是由于他們的免疫防御系統的非特異刺激2。非特異免疫性可以通過抗原，或更直接地通過免疫原來加強。在分子水平，免疫原具有稱為抗原決定簇的特殊結構單元，可以與某些免疫細胞的表面受體交聯，導致克隆擴充或活化。
當在其中一種上述分析中引發統計學上顯著的反應時，本發明的提取物或肽聯葡聚糖或其活性成分具有免疫刺激活性。通常，將對提取物或肽聯葡聚糖或其活性成分的反應與對照或空白對照劑比較。VI.腸通透性本發明的純化的提取物、肽聯葡聚糖及其活性成分也可以通過腸篩選其通透性。這在允許口服給藥時是有的。篩選可以采用Caco-2細胞系，這是一個從結腸瘤派生的分化很好的人腸細胞系，其作為體外研究腸吸收的腸上皮細胞的替代物已經過嚴格驗證。在人中的生物利用率與用Transwell插入片段中的Caco-2單層得到的通透性結果之間的良好關系已經確立。通過大小排阻層析和上面所述的生物實驗可以鑒定能夠跨越Caco-2單層轉運的成分的分子量分布和免疫原性5，6。通透性也可以在體內動物模型中測量。VII.對細胞反應的體外方法CV提取物、肽聯葡聚糖或活性成分可以用于許多體外或離體方法中。在一些方法中，分析對這些試劑的細胞反應得到了使這些試劑的劑量方案體內最佳的信息。在一些方法中，CV提取物、肽聯葡聚糖或活性成分用作陽性對照來篩選其他藥物對脾細胞或骨髓細胞的增殖或巨噬細胞的分泌的影響。如果陽性對照刺激脾細胞或骨髓細胞的增殖或巨噬細胞的分泌，而候選藥物在平行反應中沒有作用，那么可以得出結論，測試藥物是無效的。在其他方法中，從有免疫紊亂的患者中得到增殖的PMB。用CV提取物、肽聯葡聚糖或活性成分來離體處理淋巴細胞，然后返回給患者。正如利用刺激免疫系統的其他試劑，如Con A或LPS，CV提取物、肽聯葡聚糖或活性成分也可以作為科研試劑上市，給學術團體研究細胞的活化狀態或用作對照來發現刺激免疫系統的其他試劑。VIII.經受治療的患者經受治療的患者包括有免疫缺陷之風險，但還沒有免疫缺陷的個體，以及目前正患有免疫缺陷的患者。免疫缺陷導致對機會感染的敏感性增強。所以，用CV提取物或肽聯葡聚糖或其活性成分治療的患者對機會感染的敏感性下降。
這些方法特別適用于治療從初級病癥產生的次級免疫缺陷。在一些紊亂中，次級免疫缺陷可能是短暫的，并且患者可能隨著初級疾病，如結核病、麻風病的恰當治療變成免疫活性。在其他病癥中，次級免疫缺陷可能變成永久的，例如先天性風疹。所以，治療方案可以根據初級病癥來變化。各種紊亂是與次級免疫缺陷相關的，次級免疫缺陷可能是由感染、惡性腫瘤疾病、自身免疫疾病、蛋白質損失狀態、免疫抑制治療、外科手術或麻醉造成的。
可以導致次級免疫缺陷的感染包括風疹、先天性風疹、麻疹、麻風病、結核病、球蟲病、慢性感染、急性病毒感染、細胞肥大病毒、多重病毒感染和重復病毒感染。
可以導致次級免疫缺陷的惡性腫瘤疾病包括霍奇金(Hodgkin)病、急性白血病、慢性白血病、非淋巴癌和骨髓瘤。
可以導致次級免疫缺陷的自身免疫疾病包括全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕關節炎和慢性活動肝炎。
可以導致次級免疫缺陷的蛋白質損失狀態包括腎病綜合癥和蛋白質損失腸病。
可以導致次級免疫缺陷的免疫抑制治療包括皮質類固醇、胞毒藥物、烷化劑、抗代謝物、抗胸腺細胞球蛋白、輻射、環孢菌素、phenytoin和青霉胺。
可以導致次級免疫缺陷的其他病癥包括糖尿病、酒精肝硬變、營養失調、灼傷、結節病、脾切除術、鐮刀細胞病、尿毒癥、衰老、亞急性硬化性全腦炎、唐氏綜合征(Down’s syndrome)、新生兒和早產兒。VIII.治療方法、藥物組合物和給藥方法A.治療方法在預防性應用中，將藥物組合物或藥物以足以預防、減少或阻止免疫紊亂發展的量對易于發展成免疫紊亂或有此危險的患者給藥。在治療應用中，將組合物或藥物以足以逆轉、阻止或至少部分阻止免疫紊亂癥狀的量對懷疑發展或已經患有免疫疾病的患者給藥。在預防和治療方案中，通常以幾個劑量給藥本發明的云芝提取物或肽聯葡聚糖或活性成分直至達到足夠的反應。但是，在預防和治療方案中，可以單個劑量給藥本發明的提取物、肽聯葡聚糖或活性成分或CV部分純化的提取物，直至達到足夠的反應。通常，監測治療并給予重復的劑量。另外，治療方案可以利用與治療其他免疫介導的紊亂中所用的那些相似的劑量、給藥途徑和給藥頻率。
可以根據治療的疾病、哺乳動物的種類和特定的給藥方式來改變CV提取物、肽聯葡聚糖或其活性成分與載體物質結合后所產生的單個劑量形式的量。對任何特定患者而言，“有效劑量”、“可藥用劑量”或“可藥用量”可以根據各種因素，包括所用的特定化合物的活性、物種、年齡、體重、總的健康狀況、性別和正被治療的患者的飲食；給藥的時間和途徑；代謝或排泄的速度；同時給藥或過去已經給藥的其他藥物；免疫疾病的類型和嚴重程度；副作用的嚴重性，患者是動物還是人等。通常，患者是人，但是非人哺乳動物包括轉基因哺乳動物也可以治療。
對于本發明的方法中所用的任何提取物、肽聯葡聚糖或活性成分，最初可以從非人動物模型估計人的有效劑量。利用本領域已知的參數，通過臨床醫生可以確定有效劑量。一般而言，開始時，劑量稍低于最佳有效劑量。然后，通過小量的增加提高劑量直至達到有效劑量(參見，Merck診斷和治療手冊，第16版，22卷，1992，Berkow，Merck研究實驗室，Rathway，新澤西，引入本文作為參考)。
劑量需要滴定以使安全性和功效最佳。本文所述的化合物的毒性和治療功效可以通過實驗動物中的標準藥物方法，例如通過確定LD50(致死達到50％測試群體的劑量)和ED50(在50％測試群體中治療有效的劑量)來確定。毒性與治療效果之間的劑量比例是治療指數，并可以表達成LD50與ED50之間的比例。顯示高治療指數的化合物是優選的。從這些非人動物研究得到的數據可以用于配制人利用時沒有毒性的劑量范圍。這樣的化合物的劑量優選位于包括小的或無毒性的ED50的循環濃度的范圍之內。恰當的配方、給藥途徑和劑量可以通過單個醫師根據患者病癥來選擇(參見，例如Fingl等(1975)，治療的藥物原理(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第1章，引入本文作為參考)。
在一些方法中，CV提取物、肽聯葡聚糖或活性成分以口服給藥，劑量為每天1.0mg到1000mg/kg體重，劑量優選為20mg/kg到50mg/kg。在其他方法中，CV提取物、肽聯葡聚糖或活性成分以口服給藥，劑量為每天0.001mg到100mg/kg。CV提取物、肽聯葡聚糖或活性成分可以以每天單個劑量或以每天多個劑量給藥。在一些方法中，CV提取物、肽聯葡聚糖或其活性成分以口服給藥，每天劑量相當于每天每公斤體重至少50mg的CV粗提取物。B.藥物組合物和給藥方法CV提取物、肽聯葡聚糖及其活性成分可單獨以可藥用鹽或其可水解前體的形式，或以藥物組合物形式來遞送或施用給哺乳動物，例如病人或個體，在藥物組合物中該化合物是以有效劑量與適當的載體或一種或多種賦形劑混合。固體口服劑量是優選的藥物組合物。有效的方案指，藥物或藥物組合以有效量和頻率，并通過適當的途徑給藥，至少可檢測地預防、延遲、抑制或逆轉至少一種免疫紊亂癥狀的發展。“有效劑量”、“可藥用劑量”或“可藥用量”指以適當的治療方案給藥時，CV提取物、肽聯葡聚糖或其活性成分為達到所需的結果，例如刺激免疫應答，預防、延遲、抑制或逆轉免疫紊亂癥狀或免疫紊亂發展的有效量。
CV提取物、肽聯葡聚糖或其活性成分用于本發明的方法中時可以作為藥物組合物單獨，和/或與各種其他的可藥用成分一起給藥。藥物組合物可以是固體(如粉末、顆粒、糖衣丸、片劑或丸劑)、半固體(如凝膠、糖漿或油膏)、液體或氣體(如氣霧劑或吸入劑)的形式。
用于本發明的適當的配方可以在Remington藥物科學(Mack出版社，1985)，Philadephia，PA，第17版)和Langer，科學(1990)，2491527-1533中找到，引入本文作為參考。本文所述的藥物組合物可以常規方式配制，即混合、溶解、造粒、制成糖衣丸、研磨、乳化、包囊、包埋或凍干工藝。
CV提取物、肽聯葡聚糖或活性成分可以和常用的賦形劑、稀釋劑或載體一起配制并壓成片劑，或配制成酏劑或方便口服給藥的溶液。CV提取物、肽聯葡聚糖或活性成分也可以配制成持續釋放的劑量形式等。化合物的給藥可以各種方法進行，包括口服、口腔、直腸、腸胃外、腹膜內、經皮、氣管內、靜脈內、皮下和肌內給藥。口服給藥是優選的。化合物可以以補給或持續釋放的制劑形式局部給藥而不是全身性方式給藥。另外，化合物可以脂質體給藥。進一步，化合物可以與食物結合而食用，或與可消費液體結合而作為飲料飲用。
為了口服給藥，化合物可以采取以常規方式配制的丸劑、片劑、膠囊、粉末或顆粒形式。為了口服給藥，組合物可以是流體形式，例如溶液、懸浮液或乳液。
為了口腔給藥，化合物可以采取以常規方式配制的片劑或錠劑形式。
為了吸入給藥，根據本發明使用的化合物是以氣霧噴劑的形式從受壓容器、噴霧器或注射噴灑器中利用合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適當的氣體或從無推進劑的干粉吸入器中方便地遞送出來。在受壓氣霧劑的情況中，劑量單位可以通過提供遞送計量的閥來確定。用于吸入器或吹入器的明膠的膠囊和軟片可以配制成含有化合物和適當粉底如乳糖或淀粉的粉末混合物。
化合物可以配制成通過注射，例如通過大丸藥注射或連續輸注用于腸胃外給藥。注射的制劑可以表示成單位劑量形式，例如，安瓿或多劑量的容器，其中加入防腐劑。組合物可以采取如油基或水溶液載體中的懸浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制試劑如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。腸胃外給藥的組合物配制成無菌、基本等滲并且完全符合美國食品和醫藥管理局的優質生產規范(GMP)條例。
CV提取物、肽聯葡聚糖或活性成分也可以配制成直腸組合物，如栓劑或滯留的灌腸劑，例如含有常規的栓劑基質，如可可油、碳蠟、聚乙二醇或其他甘油，所有這些在體溫中溶化，但在室溫下仍然是固化的。
除了上述制劑以外，CV提取物、肽聯葡聚糖或活性成分也可以配制成補給品。如此長期作用的制劑可以通過植入(例如皮下或肌內)或通過肌內注射給藥。所以，例如，化合物可以與適當的聚合物或疏水物質(例如作為可接受油中的乳液)或離子交換樹脂，或作為微溶性衍生物，例如作為微溶性鹽來配制(參見例如，Urquhart等(1984)，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24199；Lewis編，1981，殺蟲劑和藥物釋放，Plenum出版社，紐約，N.Y.，美國專利號3,773,919和3,270,960，引入本文作為參考)。
或者，可以利用疏水性藥物化合物的其他遞送系統。脂質體和乳液是眾所周知的疏水藥物的遞送媒介物或載體的例子。在一些方法中，長期循環的，即stealth脂質體可以利用。在Woodle等，美國專利號5,013,556中概括地描述了這樣的脂質體，其教導引入作為參考。本發明的化合物也可以通過受控釋放方法、持續釋放方法和/或遞送裝置如美國專利號3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123和4,008,719中所述的那些來給藥，這些公開內容引入作為參考。
藥物組合物也可以包括適當的固體或凝膠相載體或賦形劑。這樣的載體或賦形劑的例子包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和多聚物如聚乙二醇。XI.實施例通過說明而不是限制的方式提供了下面的實施例。所以，通過選擇試劑以及試劑的濃度、溫度和其他可變參數可以舉例本發明的應用，但不認為是對其的限制。本領域的那些專業技術人員將容易認識到非關鍵的參數，這些參數可以改變來完成本文所述的發明。實施例1云芝的粗提取物的制備進行下面的步驟制備云芝(CV)粗提取物。將干的云芝(CV)果實體浸軟。然后切碎浸軟的CV果實體。從浸軟、切碎的CV果實體除去色素。接著，抽提CV果實體。在堿性水溶液，例如氫氧化鈉或氫氧化鉀中煮沸CV果實體完成抽提。小于0.1N的堿性水溶液是優選的。在抽提步驟后，粗CV提取物的制備可以包括一個或多個以下步驟例如通過過濾除去不溶性物質；例如通過離心澄清提取物；例如通過旋轉蒸發器濃縮提取物；例如通過凍干器冷凍提取物或冷干提取物。得到的粗CV提取物然后可以利用或儲存備用。
圖1是說明CV粗提取物的制備方案步驟的流程圖。通過在1L去離子水中浸泡約1小時使300g干的云芝(CV)果實體浸軟。在潷析去離子水后，切碎浸軟的CV果實體。從浸軟、切碎的CV果實體可除去色素。在3L去離子水中浸沒過夜，實現除去浸軟、切碎的CV果實體的色素。通過在2L的0.01N氫氧化鈉中溫和恒定攪拌下煮沸浸軟、切碎的CV果實體進行CV果實體的抽提。
將提取物傾倒在粗布上，除去不溶性物質，布中包裹了不溶性物質。4000rpm離心10分鐘使得到的上清液澄清。然后，通過在80℃旋轉蒸發，濃縮澄清的上清液，直到體積減少50％。接著，在-70℃冷凍澄清、濃縮的上清液，并且凍干。得到的粗CV提取物具有約43g到47g的干質量，顏色為黑棕色，并且質地蓬松。粗CV提取物可以立即使用或儲存備用。實施例II粗CV提取物的物理和化學特征分析CV粗提取物，評估其溶解度、熔點、降解溫度和吸濕性。用于分析的方法和各個結果表示在表I中。
表1
分析CV粗提取物以確定平均分子量，以及中性糖、糖醛酸和肽/蛋白質的w/w百分數。還分析了CV粗提取物中葡萄糖作為單糖成分的存在和葡聚糖鍵(1→3)的存在。鑒定了CV粗提取物中存在的肽成分與碳水化合物成分的鍵合。用于分析和鑒定的方法，和各自結果表示在表II中。
表II
通過大小排阻層析確定粗CV提取物的平均分子量。將200μl的1-2mg/ml水溶液樣品注射到高效液相色譜(HPLC)系統上(快效液相層析系統，Pharmacia)，在Superose 12 10/30柱中運行，用0.2M NaCl溶液pH7.0洗脫。然后，將洗脫液加樣到2×40cm Superdex 75 10/30柱上，并用200mM乙酸銨pH7.0洗脫。收集洗脫液為1ml的組分。隨后，將這些組分用作分析的樣品。在210nm處通過分離過程監測UV吸光度。
樣品的分子量范圍是0.5-40kDa。樣品的平均分子量為2.6kDa。參考利用各種碳水化合物標準構建的校準曲線確定分子量。
圖2A是大小排阻層析譜，顯示CV粗提取物的蛋白質成分的洗脫圖。樣品中的蛋白質含量通過在254nm處監測含蛋白質的物質的洗脫圖來檢測(參見表II)。圖2B是CV粗提取物的大小排阻層析譜，顯示CV粗提取物的碳水化合物成分的洗脫圖。在洗脫液中的碳水化合物含量通過酚硫酸測試來檢測(參見表II)。體外研究實施例III與CV粗提取物體外接觸的活鼠脾細胞的增殖通過頸位錯處死三只ICR小鼠。麻醉取出處死的小鼠的脾。通過在不銹鋼篩上溫和擠壓每個脾分離脾細胞。合并從每個小鼠分離的脾細胞，將得到的細胞懸浮液以1600rpm離心3分鐘，傾棄上清液。在細胞沉淀中加入約6毫升的溶解緩沖液，以破壞沉淀中存在的紅血球。隨后用PBS洗去殘留的溶解緩沖液。然后，在完全細胞培養基中懸浮脾細胞。
通過臺盼藍排除試驗評估細胞懸浮液的生存力(參見Parslow T.G.免疫應答，醫學免疫學；Sities D.P.，Terr A.I.，Parslow T.G.編Appletonand LangeLondon，1997；第63-73頁)。把活細胞懸浮液的細胞密度調節到2×106細胞/毫升。將100μl細胞懸浮液接種到96孔的微滴平板(NUNCTM)上。
然后，將接種的細胞與下列材料接觸(1)100μl的CV粗提取物的樣品(終濃度1-500μg/ml)，(2)100μl的伴刀豆球蛋白A(Con A)(Sigma)(終濃度為0.016-4.0μg/ml)，作為陽性對照或(3)100μl的培養基，作為陰性對照。
然后，將接觸細胞在加濕的95％O2和5％CO2空氣中37℃下溫育72小時。第54小時，用0.5μCi/10μl/孔的3H-甲基胸腺嘧啶脈沖標記細胞。然后在第72小時，用細胞收集器將細胞收集在玻璃纖維濾紙上，使用閃爍計數確定相對于DNA合成所摻入的3H-甲基胸腺嘧啶的量。通過陰性對照細胞中的CPM將接觸細胞的每分鐘計數(CPM)標準化以產生刺激指數。將接觸細胞中的3H-甲基胸腺嘧啶的細胞摻入數(每分鐘計數(CPM))除以陰性對照細胞的摻入數計算刺激指數。
在低Con A濃度時，用CV提取物處理小鼠的脾細胞的增殖活性是劑量依賴的。在ConA濃度為50μg/ml時，用CV提取物處理小鼠的脾細胞的增殖活性是對照的20倍。用濃度為100μg/ml到350μg/ml的CV粗提取物處理，并用濃度約1μg/ml到約3μg/ml的Con A刺激小鼠的脾細胞的增殖性反應是相似的。將結果表達為刺激指數(參見圖3)。實施例IV與CV粗提取物體外接觸的鼠骨髓細胞通過頸位錯處死5只ICR小鼠。麻醉取出處死小鼠的股骨。盡可能地清除與股骨連接的肌肉，取骨髓塞。用配有25G針頭的2ml針筒裝上PBS沖洗骨髓塞。合并從每個骨髓塞分離的骨髓細胞。制備細胞懸浮液，如實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。調節活細胞懸浮液的密度以產生4×106個細胞/ml的細胞懸浮液。將100μl的細胞懸浮液接種在96孔的微滴平板(NUNCTM)上。
然后，將細胞與下列材料接觸(1)100μl的CV粗提取物樣品(終濃度25-200μg/ml)，(2)100μl的脂多糖(LPS)(Sigma)(終濃度2.5-20μg/ml)，作為陽性對照，或(3)100μl的培養基，作為陰性對照。將接觸的細胞在95％O2和5％CO2的大氣中37℃下溫育120小時。第104小時，用0.5μCi/10μl/孔的3H-甲基胸腺嘧啶脈沖標記細胞。第120小時，收獲細胞，并如上實施例III確定刺激指數。
圖4說明了用CV粗提取物或LPS體外接觸分離的鼠骨髓細胞的增殖效果。將結果表示為刺激指數。CV粗提取物顯示在其濃度為200μg/ml時，骨髓增殖40倍。骨髓細胞與CV粗提取物接觸的增殖反應比相似相對濃度的LPS時的反應更大。實施例IV與CV粗提取物體外接觸的鼠巨噬細胞用lml的3％w/v的巰基乙酸鹽水溶液腹膜內注射10只ICR小鼠。3天后，通過頸位錯處死小鼠。打開腹膜并用PBS灌洗空隙來收獲巨噬細胞。合并每個處死小鼠的PBS灌洗液。制備細胞懸浮液，如實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。調節活細胞懸浮液的密度以產生4×106細胞/ml的細胞懸浮液。將100μl細胞懸浮液接種在96孔的微滴平板(NUNCTM)上。
在加濕的95％O2和5％CO2的大氣中，允許細胞37℃下于微滴平板的孔的底部附著1小時。接著，小心除去孔中的上清液。然后，將細胞與下列材料接觸(1)200μl濃度為25-200μg/ml的CV粗提取物，(2)200μl濃度為0.125-1μg/ml的LPS(Sigma)，作為陽性對照，或(3)200μl完全細胞培養基，作為陰性對照。將接觸的細胞在加濕的95％O2和5％CO2的大氣中37℃下溫育24小時。
第24小時，由Griess反應確定無細胞的培養基中存在的硝酸鹽的量(參見Green L.C.等，生物流體中的硝酸鹽、亞硝酸鹽和[15N]硝酸鹽的分析，Anal.Biochem.，1982，126131-138)。從各個微滴平板的孔中吸取150μl無細胞培養基的等分試樣，并在新鮮微滴平板的孔中與50μl的Griess試劑反應10分鐘。然后，在540nm處，利用微滴平板讀數器(BTI，ELX800)測量等分試樣的吸光度。
圖5說明了與CV粗提取物或LPS體外接觸的鼠腹膜巨噬細胞分泌一氧化氮提高。用CV粗提取物處理的鼠腹膜巨噬細胞的增殖活性導致一氧化氮分泌提高，在CV濃度小于約100μg/ml時是劑量依賴的。與濃度超過100μg/ml的CV粗提取物接觸的細胞的增殖活性沒有提高。LPS的增殖活性在低的LPS濃度時是劑量依賴的。體外研究實施例VI對正常小鼠給藥CV粗提取物研究設計20只ICR小鼠分成4組，每組各5只。如表III所示，組1用CV粗提取物腹膜內給藥處理；組2用普通鹽水腹膜內給藥處理，作為陰性對照；組3用CV粗提取物口服給藥處理；和組4用去離子水口服給藥，作為陰性對照。利用胃內管強迫喂小鼠來完成口服給藥。
表III顯示了每個組的劑量和服藥計劃。在第4天處死組1和組2的小鼠。在第8天處死組3和組4的小鼠。
第1天，稱重CV粗提取物，并溶于去離子水中，調節溶液的濃度到5mg/ml。將溶液超聲波處理30分鐘，以4000rpm離心10分鐘除去任何不溶性物質，然后通過無菌的0.22μm過濾器(IWAKI)過濾到無菌瓶中。將溶液儲存在4℃備用。
表III
1.腹膜內給藥CV粗提取物對來自正常小鼠的活鼠脾細胞體內增殖的影響當與對照小鼠(組2)比較時，對小鼠(組1)腹膜內給藥CV粗提取物提高了體內活脾細胞的數目58.6％(參見圖6A)。如上實施例III所述收獲和分離脾細胞。制備細胞懸浮液，如實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。2.腹膜內給藥CV粗提取物對來自正常小鼠的LPS刺激的鼠骨髓細胞離體增殖的影響用CV粗提取物腹膜內給藥的小鼠(組1)的骨髓細胞顯示了比對照小鼠(組2)的骨髓細胞更高的離體LPS刺激的增殖活性(參見圖6B)。如上實施例IV所述收獲和分離骨髓細胞。如上實施例IV所述測試CV粗提取物對骨髓細胞的增殖活性。3.口服給藥CV提取物對來自正常小鼠的活鼠脾細胞體內增殖的影響當與對照小鼠(組4)比較時，給小鼠(組3)口服給藥CV粗提取物提高了體內活脾細胞的數目40％(參見圖7A)。如上實施例III所述收獲和分離脾細胞。制備細胞懸浮液，并如上實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。4.口服給藥CV提取物對來自正常小鼠的LPS刺激的骨髓細胞離體增殖的影響用CV粗提取物口服給藥處理的小鼠(組3)骨髓細胞顯示了比對照小鼠(組4)的骨髓細胞更高的離體LPS刺激的增殖活性(參見圖7B)如上實施例IV所述收獲和分離骨髓細胞。如上實施例IV所述測試CV粗提取物對骨髓細胞的增殖活性。實施例VII對無免疫應答的小鼠或重度無免疫應答的小鼠給藥CV粗提取物研究設計將40只ICR小鼠分成8組，每組為5只。第1天，通過腹膜內注射20mg/kg的環磷酰胺來免疫抑制組1-4的小鼠。同樣在第1天，通過腹膜內注射100mg/kg的環磷酰胺來嚴重免疫抑制組5-8的小鼠(參見表IV的環磷酰胺劑量和服藥計劃)。在免疫抑制后第5、6和7天，組1用CV粗提取物腹膜內注射給藥處理；組2用正常的普通鹽水腹膜內給藥處理。在免疫抑制后第1-7天，組3用CV粗提取物口服給藥處理，以及組4用去離子水處理。在嚴重免疫抑制后第1-7天，組5用CV粗提取物口服給藥處理；和組6用去離子水處理。在嚴重免疫抑制后第1-14天，組7用CV粗提取物口服給藥處理；和組8用去離子水處理(參見表IV的CV粗提取物劑量、服藥計劃和給藥途徑)。組2、4、6和8是陰性對照組。第8天處死組1-6的小鼠。組7和組8的小鼠在第15天時處死。
用如下制備的環磷酰胺溶液注射組1-4。從Asta Medica購買環磷酰胺200mg/瓶(Endoxan-Asta)。按說明書指導，用無菌去離子水復溶環磷酰胺。用無菌普通鹽水調節溶液的濃度到1mg/ml，在無菌瓶中等分，并儲存在-80℃。在無菌條件下制備環磷酰胺溶液。第1天，將環磷酰胺溶液解凍，注射入組1-4的小鼠中。
用如對組1-4所述制備的環磷酰胺溶液注射組5-8，除了將溶液濃度調節到5mg/ml以外。第1天，將環磷酰胺解凍，并注射入組5-8的小鼠中。
如上實施例VI所述，制備CV粗提取物用于腹膜內或口服給藥。
表IV
1.腹膜內給藥CV粗提取物對來自無免疫應答小鼠的活鼠脾細胞體內增殖的影響與對照小鼠(組2)比較，對免疫抑制小鼠(組1)腹膜內給藥CV粗提取物顯著提高了體內活脾細胞的數目(p＜0.001)(參見圖8A)。如實施例III所述收獲和分離脾細胞。制備細胞懸浮液，如實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。2.腹膜內給藥CV粗提取物對來自無免疫應答小鼠的活鼠骨髓細胞體內增殖的影響用CV粗提取物腹膜內給藥處理的小鼠(組1)的骨髓細胞比對照小鼠(組2)的骨髓細胞顯著提高了體內活骨髓細胞的數目(p＜0.05)(參見圖8A)。如實施例IV所述收獲和分離骨髓細胞。如實施例III所述測試骨髓細胞的生存力。3.口服給藥(7天服藥計劃)CV粗提取物對來自無免疫應答的小鼠活鼠脾細胞體內增殖的影響與對照小鼠(組4)比較，對免疫抑制小鼠(組3)口服給藥CV粗提取物不會提高體內活脾細胞的數目(參見圖8B)。并且如實施例III所述收獲和分離脾細胞。制備細胞懸浮液，并且如實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。4.口服給藥(7天服藥計劃)CV提取物對來自無免疫應答的小鼠的活小鼠骨髓細胞體內增殖的影響用CV粗提取物口服給藥處理的小鼠(組3)的骨髓細胞與對照小鼠(組4)的骨髓細胞比較顯著提高了體內活骨髓細胞的數目(p＜0.005)(參見圖8B)。并且如實施例IV所述收獲和分離骨髓細胞。制備細胞懸浮液，如實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。5.口服給藥CV粗提取物(7天服藥計劃)對來自重度無免疫應答的小鼠的活鼠脾細胞體內增殖的影響與對照小鼠(組6)比較，對重度無免疫應答的小鼠(組5)口服給藥CV粗提取物提高了體內活脾細胞的數目。但是，提高的數量在統計學上不顯著(參見圖8C)。如實施例III所述收獲和分離脾細胞。制備細胞懸浮液，如實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。6.口服給藥CV粗提取物(7天服藥計劃)對來自重度無免疫應答的小鼠的活鼠骨髓細胞體內增殖的影響與對照小鼠(組6)比較，對重度無免疫應答的小鼠(組5)的口服給藥CV粗提取物顯著提高了體內活骨髓細胞的數目(p＜0.01)(參見圖8C)。并且如實施例IV所述收獲和分離骨髓細胞。制備細胞懸浮液，如實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。7.口服給藥(14天服藥計劃)CV粗提取物對來自重度無免疫應答的小鼠的活鼠脾細胞體內增殖的影響當與對照小鼠(組8)比較時，對免疫抑制的小鼠口服給藥CV粗提取物不增加體內活脾細胞的數目(參見圖9A)。如實施例III所述收獲和分離脾細胞。制備細胞懸浮液，如實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。8.口服給藥(14天服藥計劃)CV提取物對來自重度無免疫應答的小鼠的活鼠骨髓細胞體內增殖的影響當與對照小鼠(組8)比較時，用CV粗提取物口服給藥處理的小鼠(組7)的骨髓細胞顯著增加了體內活骨髓細胞的數目(P＜0.05)(參見圖9A)。如實施例IV所述收獲和分離骨髓細胞。如實施例IV所述測試CV粗提取物對骨髓細胞的增殖活性。9.口服給藥CV提取物(14天服藥計劃)對來自嚴重免疫抑制的小鼠的Con刺激脾細胞離體增殖的影響用CV粗提取物口服給藥處理的小鼠(組7)的脾細胞比對照小鼠(組8)的脾細胞顯示了更大的離體增殖活性(參見圖9B)。如實施例III所述收獲和分離脾細胞。如實施例III所述測試CV粗提取物對脾細胞的增殖活性。10.口服給藥CV提取物對來自重度無免疫應答的小鼠的LPS刺激的骨髓細胞離體增殖的影響用CV粗提取物口服給藥處理的小鼠(組7)的骨髓細胞比對照小鼠(組8)的骨髓細胞顯示了更大的離體LPS刺激的增殖活性(p＜0.05)(參見圖9C)。如實施例IV所述收獲和分離骨髓細胞。如實施例IV所述測試CV粗提取物對骨髓細胞的增殖活性。實施例VIII無免疫應答的小鼠中的劑量反應研究研究設計將20只ICR小鼠分成4組，每組各5只。第1天，通過腹膜內注射20mg/kg環磷酰胺來免疫抑制組1-4的小鼠(參見表V的環磷酰胺劑量和服藥計劃)。在給藥環磷酰胺后第1-7天，用5，20和50mg/kg/天的CV粗提取物口服給藥處理組1、2和3的小鼠。在環磷酰胺給藥后第1-7天，用去離子水處理組4的小鼠(參見表V的CV粗提取物劑量和服藥計劃)。組4是陰性對照組。組1-4的小鼠在第8天處死。
制備環磷酰胺并且如實施例VII中所述給藥。
如實施例VI中所述制備用于口服給藥50mg/kg/天的CV粗提取物。如實施例VI所述制備口服給藥5mg/kg/天和20mg/kg/天CV提取物，除了將溶液濃度分別調節至0.5mg/ml和2mg/ml。
表V
1.口服給藥不同劑量的CV提取物對來自免疫抑制的小鼠的活鼠脾細胞體內增殖的影響當與對照小鼠(組4)比較時，對小鼠(組1)以5mg/kg/天和對小鼠(組2)以20mg/kg/天口服給藥CV粗提取物，以劑量依賴的方式提高了體內活脾細胞的數目(參見圖10)。當與對照小鼠(組4)比較時，以50mg/kg/天對小鼠(組3)口服給藥CV粗提取物不會增加體內活脾細胞的數目(參見圖10)。組3的小鼠中發現的數據與如上所討論的實施例VIII和圖8A中出現的結果一致。
如實施例III中所述收獲和分離脾細胞。制備細胞懸浮液，并如上實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。2.口服給藥不同劑量的CV提取物對來自免疫抑制的小鼠的活鼠骨髓細胞體內增殖的影響當與對照小鼠(組4)比較時，對小鼠(組1)以5mg/kg/天，對小鼠(組2)以20mg/kg/天，對小鼠(組3)以50mg/kg/天口服給藥CV粗提取物，以劑量依賴的方式提高了體內活骨髓細胞的數目(參見圖10)。當與對照組小鼠(組4)比較時，對組2的小鼠口服給藥CV提取物提高了骨髓細胞的增殖(p＜0.01)；和當與對照小鼠組(組4)比較時，對組3的小鼠口服給藥CV提取物提高了骨髓細胞的增殖(p＜0.001)。
如實施例IV所述收獲和分離骨髓細胞。制備細胞懸浮液，并且如實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。實施例IX對正常小鼠、無免疫應答的小鼠和重度無免疫應答的小鼠口服給藥對細胞介導的免疫應答的影響研究設計利用小鼠模型來確定細胞介導的免疫應答的增加。接觸超敏感性是細胞介導的免疫應答。這一模型的基礎是標準的接觸超敏感性研究，這依賴于對小鼠耳朵腫脹的測量來確定接觸超敏感性的表達。
然后，將36只小鼠分成6組，每組各6只。為了允許將來鑒定個體，在其尾巴上標記各個小鼠。組1和組2是正常小鼠；組3和4是無免疫應答的小鼠，和組5和6是重度無免疫應答的小鼠。在第1-7天時，組1、3和5用50mg/kg/天的CV粗提取物口服給藥處理。在第1-7天，組2、4和6用0.25ml去離子水口服給藥處理。在第3和4天，所有36只小鼠用2，4-二硝基-1-氟苯(DNFB)致敏。在第7天，用DNFB攻擊所有36只小鼠。在第8天，對所有36只小鼠進行耳朵測量(參見表VI)。
如上文實施例VI所述制備CV粗提取物用于對組1、3和5口服給藥。如上文實施例VI和表III所述給藥CV粗提取物(同時參見表VI中CV粗提取物劑量和服藥計劃)。
如上文實施例VII所討論，制備環磷酰胺用于存儲和給藥。如上文實施例VII和表IV中所述，第1天給藥20mg/kg來免疫抑制組3和4的小鼠。如上文實施例VII和表IV中所述，第1天給藥100mg/kg來嚴重免疫抑制組5和6的小鼠(參見表VI的環磷酰胺劑量和服藥計劃)。
在第3和第4天，如下用2，4-二硝基-1-氟苯(DNFB)致敏所有36只小鼠。通過用吸管將25μl的0.25％w/v的DNFB直接應用到各個小鼠剃光的腹部，并通過將5μl的0.25％w/v的DNFB直接施加到各個小鼠的腳蹼來完成接觸。在第7天，如下用2，4-二硝基-1-氟苯(DNFB)攻擊所有36只小鼠。通過用吸管將10μl的0.20％w/v的DNFB直接施加到各只小鼠每個耳朵的兩側來完成接觸。在第8天，利用數字卡尺，即Mitutoyo數字測微計對耳朵厚度進行耳朵測量。
表VI
1.用CV提取物口服給藥處理正常小鼠的結果如小鼠耳朵腫脹測量所示，正常小鼠(組1)比對照小鼠(組2)有更顯著高的超敏感性反應(p＜0.05)(參見圖11)。2.用CV提取物口服給藥處理免疫抑制小鼠的結果如小鼠耳朵腫脹測量所示，免疫抑制小鼠(組3)比對照小鼠(組4)有更顯著高的超敏感性反應(p＜0.05)(參見圖11)。
免疫抑制的小鼠(組3)的超敏感性反應與對照小鼠(組2)中的超敏感性反應顯著不同。3.用CV提取物口服給藥處理嚴重免疫抑制的小鼠的結果如小鼠耳朵腫脹測量，嚴重免疫抑制的小鼠(組5)比對照小鼠(組6)有更顯著高的超敏感性反應(p＜0.001)(參見圖11)。
嚴重免疫抑制小鼠(組5)的超敏感性反應(p＜0.001)比在免疫抑制小鼠(組3)(p＜0.05)或在正常小鼠(組1)(p＜0.05)中觀察到的超敏感性反應更大。實施例X對正常小鼠長期(30天)口服給藥CV提取物研究設計將10只ICR小鼠分成兩組，每組各5只。如表VII所示，組1用CV粗提取物口服給藥處理，以及組2用去離子水口服給藥處理，作為陰性對照。表VII顯示各個組的劑量和服藥計劃。兩個組的小鼠在第31天時處死。如上文實施例VI中所討論，制備CV粗提取物、儲存和給藥(同時參見表VII)。
表VII
1.長期口服給藥(30天)CV粗提取物對來自正常小鼠的活鼠脾細胞體內增殖的影響當與對照小鼠(組2)比較時，對小鼠(組1)口服給藥CV粗提取物不會顯著提高體內活脾細胞的數目(參見圖12A)。如實施例III所述收獲和分離脾細胞。制備細胞懸浮液，并如上文實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。2.長期口服給藥CV粗提取物對來自正常小鼠的LPS刺激的鼠骨髓細胞體內增殖的影響當與對照小鼠(組2)比較時，對小鼠(組1)口服給藥CV粗提取物不會顯著增加體內活骨髓細胞的數目(參見圖12A)。如實施例IV所述收獲和分離骨髓細胞。如上文實施例III所述測試骨髓細胞的生存力。3.長期口服給藥CV粗提取物對來自正常小鼠的活鼠脾細胞離體增殖的影響用CV粗提取物(組1)處理的脾細胞的增殖反應比對照小鼠(組2)的增殖反應更大(參見圖12B)。如實施例III所述收獲和分離脾細胞。制備細胞懸浮液，并如上文實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。用ConA刺激脾細胞，并且如上文實施例V所討論計算刺激指數。4.長期口服給藥CV粗提取物對來自正常小鼠的LPS刺激的骨髓細胞離體增殖的影響用CV粗提取物口服給藥處理的小鼠(組1)的骨髓細胞比對照小鼠(組2)的骨髓細胞顯示了更大的離體LPS刺激的增殖活性(參見圖12C)。
如實施例IV所述收獲和分離骨髓細胞。如上文實施例IV所述測試CV粗提取物對骨髓細胞的增殖活性。實施例XI口服給藥CV粗提取物的急性毒性第1天，用1g/kg的CV粗提取物口服給藥處理各個性別的5只ICR小鼠，觀察毒性信號14天。在觀察期，沒有小鼠死亡，并在整個觀察期，10只小鼠中沒有一只顯示任何毒性信號。
如上文實施例VI所述，制備CV粗提取物用于對10只小鼠口服給藥(除濃度以外)。一次性給藥CV粗提取物。
對10只小鼠給藥的CV粗提取物是無內毒素污染的。將2mg/ml的CV粗提取物樣品進行內毒素測試。利用Limulus AmebocyteLysate(LAL)測試試劑盒(Cape Cod Ltd.)進行測試，檢測極限是0.25EU/ml LAL。實施例XII負電荷密度對肽聯葡聚糖的免疫活性的影響將通過陰離子交換層析方法分級分離到各種負電荷密度組中的CV肽聚葡聚糖即C1D2、C1D3、C1D4和C1D5的體外免疫活性進行比較。圖13說明了與C1D2、C1D3、C1D4和C1D5體外接觸的活鼠脾細胞的增殖。在多種組分中觀察到了大的免疫力差異。高負電密度的肽聯葡聚糖比低負電密度組分和未分級分離的CV提取物展示了更高的最大活性(即平穩水平)和潛力(即在低樣品濃度時活性陡峭上升)。這表明負電密度是CV派生的肽聯葡聚糖的免疫原性的重要決定簇。如上文實施例III所述評估了體外的免疫活性。實施例XIII分子量對肽聯葡聚糖的免疫活性的影響對組分C1E8、C1E6、C1E4、C1E2和C1E0確定體外免疫活性。圖14說明鼠腹膜巨噬細胞與C1E8、C1E6、C1E4、C1E2和C1E0體外接觸后引起一氧化氮分泌增加。免疫活性沒有限定到特別的分子量范圍。C1E8、C1E6、C1E4、C1E2和C1E0提供了相似的劑量反應圖，在100和200μg/ml之間達到平穩態。最大(平穩)活性隨著組分的分子量提高而提高。如上文實施例III所述評估體外免疫活性。實施例XIV制備云芝部分純化的提取物云芝(CV)部分純化的提取物的制備方法是將通過實施例I所述方法制備的CV粗提取物溶解，進行兩步層析分離和一步乙醇分級分離。將CV粗提取物溶液進行第一步層析，例如CM纖維素柱，以除去陽離子物質。將得到的洗脫液進行第二步層析，例如DEAE纖維素柱以結合陰離子物質。然后這一洗脫液根據分子量進行分離，方案為例如乙醇分級分離或凝膠過濾。得到的洗脫液，CV部分純化的提取物，可以通過任何純化技術進一步純化，從CV部分純化的提取物中除去陽離子。
圖15說明在圖1的粗CV提取物的活性成分進一步純化方案中所用步驟的流程圖。將如實施例I方法制備的1.0g的CV粗提取物溶于去離子水中。溶解的CV粗提取物在4000rpm下離心10分鐘，除去不溶性物質。接著，通過0.45μm濾紙(IWAKI)過濾上清液進一步除去不溶性顆粒。
用0.5M NaOH洗滌3次，每次30分鐘平衡600ml的Fibrous(Sigma)CM纖維素開放玻璃柱(Bio-Rad)，然后用0.5MHCl洗滌3次，每次30分鐘。用去離子水平衡柱。
然后，將上清液過柱，收集洗脫液(參見圖15的緩沖液條件)。分析組分活性。將具有活性的組分C1過DEAE纖維素柱，收集洗脫液(參見圖15的緩沖液條件)。分析組分活性。組分C1D5進行乙醇分級分離(參見圖15的緩沖液條件)，并且如實施例III所述利用鼠脾細胞分析得到的組分的活性。CV部分純化的提取物組分C1D5E8、C1D5E7、C1D5E4和C1D5EX展示了活性。凍干組分C1D5E8、C1D5E7、C1D5E4和C1D5EX，分別稱重為5、14、49和13mg。對組分C1D5E8、C1D5E7、C1D5E4和C1D5EX另進行純化步驟，特別是除去陽離子分子的那些步驟。實施例XV在CV肽聯葡聚糖中作為抗原決定簇的肽成分的作用這一實施例與具有體外促有絲分裂活性的CV組分基本結構單元的組合物(中性糖、糖醛酸和蛋白質/肽)相關。圖16顯示了體外促有絲分裂反應的刺激指數和各個組分的基本結構單元的含量之間的關系。對于分析的CV組分，肽含量與促有絲分裂活性密切相關(r＝0.99，p＜0.05)。促有絲分裂活性和糖醛酸含量之間的相關系數在10％水平幾乎不顯著(r＝0.61)，與中性糖的關系不顯著。如上文實施例III所述評估體外免疫活性。實施例XVICV部分純化組分的物理化學和生物學特征確定組分C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的分子量范圍和平均分子量(參見表A)。
表AC1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的分子量范圍
確定組分C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX中中性糖、糖醛酸和蛋白質的含量(參見表B)。
表BC1D5E8、C 1D5E7和C1D5EX的化學組成
如實施例II所述，對于組分C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX確定中性糖、糖醛酸和蛋白質的含量。根據GC/MS分析，葡萄糖是唯一可檢測的單糖。葡萄糖分子是通過1→3鍵連接的。
確定組分C1D5E7的蛋白質/肽成分的氨基酸序列是Asp-Cys-Pro-Pro-Cys-Glu(SEQ ID NO1)。利用氨基酸測序儀(裝有HPLC系統的Hewlett Packard 1000A蛋白質測序儀)確定了SEQ ID NO1。
確定CV部分純化的組分C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的免疫活性(參見圖15)。圖17顯示三個部分純化的活性CV組分即C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX對鼠腹膜巨噬細胞分泌一氧化氮的刺激活性。發現所有CV部分純化的組分與LPS具有同樣的活性和效力(參見圖17)。實施例XVIICV粗提取物和CV部分純化的提取物的分子量對腸通透性的影響在體外利用Caco-2細胞單層Transwell方法確定CV粗提取物和CV部分純化的提取物組分C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的腸通透性。比較天然CV樣品及其可滲透Caco-2細胞的化合物的分子量分布。利用與Supedex 75 10/30柱偶聯的HPLC系統進行分析。洗脫緩沖液是200mM氯化鈉溶液、pH7.0，洗脫液在UV210nm處監測。
所有實驗是在溫控條件下37℃時進行的。將摻有80mM氯化鎂和90mM氯化鈣的磷酸緩沖鹽(PBS)用作所有通透性測量的轉運緩沖液。實驗前，用轉運緩沖液洗滌細胞單層兩次。將1.5ml含有待測樣品的轉運緩沖液加入到Caco-2細胞單層的基底外側。37℃平衡30分鐘后，將樣品溶液與Transwell一起轉移到先用2.6ml轉運緩沖液填充的成簇的平板上。實驗結束時，在基底外側收集透過細胞的成分。將收集的樣品脫鹽和凍干，用于隨后的化學和生物鑒定。1.CV粗提取物下面表C顯示可透過Caco-2細胞單層的CV粗提取物成分(kDa)。
圖18A是CV粗提取物的大小排阻層析譜，以及圖18B說明在轉運研究后收集的CV粗提取物可滲透Caco-2細胞的內容物。按實施例I制備的CV粗提取物，分子量范圍為0.5-40kDa，平均為2.6kDa。如圖18B所示，7.07和8.89ml處洗脫的峰存在于基底室中收集的每個樣品(包括對照，即不含CV粗提取物)中。這一結果表明，峰對于CV粗提取物樣品不是天生的，但可能是由于從Caco-2細胞中侵蝕掉的大分子。17.67ml組分中洗脫的峰似乎是由于CV粗提取物中存在的小分子，而不是生物活性葡聚糖。根據圖18A和18B中所示的分子量圖，我們得出結論，低分子量成分比高分子量成分更容易跨越單層。另外，我們還得出結論，3kDa可能是腸吸收CV粗提取物的分子量上限。
表CC1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的分子量范圍
2.CV部分純化的提取物C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX下面表D顯示可滲透Caco-2細胞單層的組分C1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的成分(kDa)。
圖19A是C1D5E8中可以滲透Caco-2細胞的物質的大小排阻層析譜。C1D5E8的平均分子量是0.8kDa。如圖19B所示，肽聯葡聚糖的主要量洗脫在16.73ml組分中，表明在C1D5E8中存在的約0.7kDa的成分轉運跨過體外吸收模型的單層。
圖20A是在C1D5E7中可滲透Caco-2細胞的物質的大小排阻層析譜。C1D5E7具有的平均分子量為2.6kDa(參見圖20A)。在轉運研究結束時，在Caco-2細胞單層的基底側只有更低分子量的成分可以檢測到(即平均分子量為1.2kDa)(參見圖20B)。
圖21A是C1D5EX中可滲透Caco-2細胞的物質的大小排阻層析譜。C1D5EX的平均分子量估計約為6kDa(參見圖21A)。圖21B表明除了在17.67ml處洗脫的小分子量以外，非常少量的其他成分也通過腸屏障滲透到單層的基底外側。
表DC1D5E8、C1D5E7和C1D5EX的分子量范圍
實施例XVIII與CV部分純化的提取物的可滲透Caco-2細胞的成分體外接觸的鼠巨噬細胞圖22說明用CV部分純化提取物的可滲透Caco-2細胞的成分或LPS接觸的鼠腹膜巨噬細胞對一氧化氮分泌的體外影響。所有CV部分純化的樣品的可滲透細胞的成分是免疫活性的，并且所有樣品比LPS有更大的活性。較低分子量組分和中等分子量組分C1D5E8、C1D5E7分別比更高分子量組分C1D5EX顯示有更強的活性。在C1D5E8和C1D5E7中的肽聯葡聚糖具有的平均分子量小于約3kDa。實施例XIX對正常小鼠給藥CV部分純化的提取物研究設計將25只ICR小鼠分成5組，每組各5只。如表VIII所示，如下處理各組。組1用CV部分純化的提取物C1D5E8腹膜內給藥處理；組2用CV部分純化的提取物C1D5E7腹膜內給藥處理；組3用CV部分純化的提取物C1D5E4腹膜內給藥處理；組4用CV部分純化的提取物C1D5EX腹膜內給藥處理；和組5用普通鹽水腹膜內給藥處理，作為陰性對照。
表VIII表明每個組的劑量和服藥計劃。在第8天處死組1-5的小鼠。
制備和儲存CV粗提取物，如上文實施例VI所述，用于腹膜內或口服給藥。
表VIII
1.腹膜內給藥CV部分純化的提取物對來自正常小鼠的活鼠脾細胞體內增殖的影響當與對照小鼠(組5)比較時，所有組(組1-4)(p＜0.001)顯示體內活脾細胞的數目增加(參見圖23A)。組1-3中，C1D5E8、C1D5E7和C1D5E4分別顯示脾細胞數提高了約100％。組4中，C1D5EX(最高分子量的CV部分純化的提取物)表明脾細胞數提高約64％。
如實施例III所述收獲和分離脾細胞。制備細胞懸浮液，并如上文實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。2.腹膜內給藥CV部分純化的提取物對來自正常的小鼠的活骨髓細胞體內增殖的影響所有組(組1-4)表明了當與對照組(組5)比較時，體內活骨髓細胞數增加(參見圖23B)。只有組4中的C1D5EX表現出活骨髓細胞數在統計學上顯著增加(p＜0.002)。
如實施例IV所述收獲和分離骨髓細胞。制備細胞懸浮液，并如上文實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。實施例XX對無免疫應答的小鼠給藥CV部分純化的提取物一般材料和方法將25只ICR小鼠分成5組，每組各5只。如表IX所示，如下處理各組。如上文實施例VII所述免疫抑制組1-5的小鼠。組1用CV部分純化的提取物C1D5E8口服給藥處理；組2用CV部分純化的提取物C1D5E7口服給藥處理；組3用CV部分純化的提取物C1D5E4口服給藥處理；組4用CV部分純化的提取物C1D5EX口服給藥處理；和組5用去離子水口服給藥處理，作為陰性對照。表IX表明各個組的劑量和服藥計劃。組1-5的小鼠在第8天處死。
如實施例VII所述制備和給藥環磷酰胺。如上文實施例VI所述，制備和儲存CV粗提取物用于腹膜內或口服給藥。
表IX
1.口服給藥CV部分純化的提取物對來自無免疫應答的小鼠的活鼠脾細胞體內增殖的影響當與對照小鼠(組5)比較時，對組1-4的小鼠口服給藥CV部分純化的提取物提高了體內活脾細胞的數目(參見圖24A)。當與對照小鼠(組5)比較時，對組1給藥C1D5E8顯著提高了(p＜0.01)體內活脾細胞的數目(增加了66％)。當與對照小鼠(組5)比較時，對組2給藥C1D5E7顯著提高了(p＜0.01)體內活脾細胞的數目。當與對照小鼠(組5)比較時，對組3給藥C1D5E4顯著提高了(p＜0.05)體內脾細胞的數目。當與對照小鼠(組5)比較時，對組4給藥C1D5EX沒有顯著增加體內活脾細胞的數目。
如實施例III所述收獲和分離脾細胞。制備細胞懸浮液，并且如實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。2.口服給藥CV部分純化的提取物對來自無免疫應答的小鼠的活骨髓細胞體內的增殖的影響所有組(組1-4)表明了當與對照小鼠(組5)比較時，體內活骨髓細胞的數目增加(參見圖24B)。
當與對照小鼠(組5)比較時，對組1給藥C1D5E8顯著增加了(p＜0.001)體內活骨髓細胞的數目。當與對照小鼠(組5)比較時，對組2、組3和組4分別給藥C1D5E7、C1D5E4、C1D5EX顯著增加了(p＜0.05)體內的活骨髓細胞的數目。
如實施例IV所述收獲和分離骨髓細胞。制備細胞懸浮液，并如上文實施例III所述測試細胞懸浮液的生存力。1.物種維持由香港中文大學的動物房提供了癌癥研究所(ICR)的小鼠(近交系)。每個籠子飼養的小鼠不到20只。在溫度維持在18-26℃、相對濕度維持在約40-70％的設備中飼養小鼠。光/暗循環維持在12小時的間隔。以嚙齒動物食物飲食標準喂養小鼠。用于上述實施例的小鼠重量在25-30g，且是8-12周齡。2.Caco細胞培養物將Caco-2細胞(購自美國典型培養物保藏中心，Rockwille，Md.)在補充有25mM D-葡萄糖，含有10％FBS、1％必需氨基酸、1％L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的DMEM培養基(所有試劑來自Gibbs BRL，生命技術公司，Gaithersburg，Md.)中，37℃、5％CO2和90％O2大氣下生長和日常維持。在約70％匯合時，用0.05％胰蛋白酶-EDTA收獲細胞，并以細胞密度3×105細胞/濾器接種在聚碳酸酯濾器上，其先用I型膠原蛋白包被(3.0μm孔，4.71cm2生長區域)，位于Transwell細胞培養室內(購自Costar-Coming，Rockwille，MD)。每48小時置換培養基(在Transwell插入體(insert)中1.5ml，和在成簇平板中2.6ml)。接種后第21到25天時，利用單層。3.緩沖液溶解緩沖液8.29g NH4Cl1.002g NaHCO329.2mg EDTA所有試劑都溶于1L去離子水中，pH調節到7.2，并通過0.22μm無菌濾器過濾滅菌。4.完全細胞培養基用10％的v/v胎牛鹽水(FBS)、100IU/ml青霉素和100μg/ml的鏈霉素摻入RMPI 1640培養基(Gibco)中。
所有上面引證的出版物和專利申請是以全文引入作為參考的，對于所有目的都相同，就象單個出版物或專利申請都特定和單獨地在引入作為參考。雖然為清晰和理解目的，通過說明和實施例本發明已經詳細敘述了，但很顯然在所附權利要求書的范圍內，某些變化和修改是可以進行的。除非另從上下文中可以明了，否則本申請書中所述的發明的元素、步驟、特征和實施方案可以相互結合利用。
參考文獻1.Parslow T.G.免疫應答，醫學免疫學(Medical Immunology)；Stites D.P.，Terr A.I.，Parslow T.G.編，Appleton and LangeLondon，1997；第63-73頁。
2.Tsukagoshi S.Krestin(PSK).癌癥治療綜述(Cancer treatmentreview)1984，11，第131-155頁。
3.Descotes J.細胞介導的免疫性分析，免疫毒性入門(AnIntroduction to Immunotoxicity)；Taylor & Francis Ltd；London，1999；第103-110頁。
4.Descotes J.免疫抑制的評估策略，免疫毒性入門(AnIntroduction to Immunotoxicity)；Taylor & Francis Ltd；London，1999；第125-136頁。
5.Lennernas H.人腸的通透性，J.Pharm.Sci.，1998，87(4)，第403-410頁。
6.Borchardt R.T.，Hidalgo I.J.，Hillgren K.M.，Hu M.細胞培養物的藥物應用綜述，Pharmaceutical Applications of Cell and TisssueCulture to Drug Transport；Wilson G.編；Plenum pressNew York，1991；第1-14頁。
7.Lee V.H.L.肽和蛋白質的藥物遞送，Trends and FuturePerspectives，Peptide and Protein Drug Dilivery；Lee V.H.L.，Hashida M.，Mizushima Y.編；哈佛學術出版社London，1995；第3-15頁。
8.Ueno S.，Yoshikumi C.，Omura Y.，Fujii T.，Wada T.，TakahashiE.，Hirose F.美國專利4,699,787；含氮多糖，1987年11月13日。
9.Ueno S.，Yoshikumi C.，Omura Y.，Fujii T.，Wada T.，TakahashiE.，Hirose F.美國專利4,851，395含氮多糖，1989年7月25日。
10.Ikuzawa M.，Oguchi Y.，Matsunaga K.，Toyoda N.，Furusho T.，Fujii T.，Yoshikumi C.美國專利4,820,689含有糖蛋白的藥物組合物，1989年4月11日。
11.Ikuzawa M.，Oguchi Y.，Matsunaga K.，Toyoda N.，Furushe T.，Fujii T.，Yoshikumi C.美國專利5,008,243含有糖蛋白的藥物組合物，1991年4月6日。
12.Suguira M.，Ohno H.，Sasaki Y.，Hama K.美國專利4,225,673具有抗腫瘤活性的葡聚糖，1980年9月30日。
13.Yang M.P.，Chen G.美國專利5,824,648Rnase-CV(云芝)，1998年10月20日。
14.Yang M.P.，Chen G.美國專利6,087,335Rnase-CV(云芝)，2000年7月11日。
序列表<110>香港中文大學(THE CHINESE UNIVERSTITY OF HONG KONG)<120>制備和檢定具有可檢驗的口服吸收性云芝的免疫調節的肽聯葡聚糖(PREPARATION AND STANDARDIZATION OF IMMUNOMODULATORY PEPTIDE-LINKEDGLUCANS WITH VERIFIABLE ORAL ABSORBABILITY FROM CORIOLUS VERSICOLOR)<130>SPI031063-47<150>USP 60/383,339<151>2002-05-22<150>USP 10/236,996<151>2002-09-06<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6<212>PRT<213>未知<220><223>云芝提取物組分C1D5E7中的蛋白/肽成分<400>1Asp Cys Pro Pro Cys Glu 權利要求
1.一種云芝的純化的提取物，其包括至少一種含有通過(1→3)鍵連接的葡萄糖分子的肽聯葡聚糖，具有由大小排阻層析確定的0.3kDa到5kDa的分子量，并且具有免疫刺激活性。
2.權利要求1所述的純化的提取物，其中分子量是0.7kDa。
3.權利要求1所述的純化的提取物，其中平均分子量是2.6kDa。
4.權利要求2所述的純化的提取物，其中肽聯葡聚糖能夠進行由Caco-2細胞單層Transwell方法確定的腸吸收。
5.權利要求3所述的純化的提取物，其中肽聯葡聚糖能夠進行由Caco-2細胞單層Transwell方法確定的腸吸收。
6.權利要求1所述的純化的提取物，其制備步驟如下用堿處理云芝，并分離上清液；將上清液進行陽離子交換；將來自陽離子交換的洗脫物進行陰離子交換；將來自陰離子交換的洗脫物通過大小分級分離技術進行分離，并且收集含有至少一種肽聯葡聚糖的組分。
7.權利要求6所述的純化的提取物，其中大小分級分離技術是分子排除層析或乙醇分級分離。
8.權利要求6所述的純化的提取物，其中陽離子交換是在CM纖維素柱上進行的。
9.權利要求6所述的純化的提取物，其中陰離子交換是在DEAE纖維素柱上進行的。
10.權利要求1所述的純化的提取物，其中肽聯葡聚糖可溶于水、乙醇和丙酮，不溶于氯仿和二氯仿，并且是非吸濕的。
11.一種云芝的分離的肽聯葡聚糖，其包括通過(1→3)鍵連接的多個葡萄糖分子，分子量由大小排阻層析確定為0.7kDa到3.0kDa；以及分離的肽聯葡聚糖及其活性成分具有免疫刺激活性。
12.權利要求11所述的活性成分，其是肽聯葡聚糖的肽成分。
13.權利要求11所述的活性成分，其是肽聯葡聚糖的葡聚糖成分。
14.權利要求1的純化的提取物，其中肽聯葡聚糖能夠進行由Caeo-2細胞單層Transwell方法確定的腸吸收。
15.權利要求11所述的多個肽聯葡聚糖，其中平均分子量為0.8kDa。
16.權利要求11所述的肽聯葡聚糖，其中分子量是0.7kDa。
17.權利要求11所述的多個肽聯葡聚糖，其中平均分子量為2.6kDa。
18.權利要求11所述的多個肽聯葡聚糖，其中平均分子量為6.2kDa。
19.權利要求11所述的多個肽聯葡聚糖，其中平均分子量小于3.0kDa。
20.權利要求11所述的肽聯葡聚糖，其中肽聯葡聚糖能夠進行由Caco-2細胞單層Transwell方法確定的腸吸收。
21.權利要求12所述的活性成分，其中活性成分能夠進行由Caco-2細胞單層Transwell方法確定的腸吸收。
22.權利要求13所述的活性成分，其中活性成分能夠進行由Caco-2細胞單層Transwell方法確定的腸吸收。
23.權利要求11所述的肽聯葡聚糖，其制備步驟如下用堿處理云芝，并分離上清液；將上清液進行陽離子交換；將來自陽離子交換的洗脫物進行陰離子交換；和將來自陰離子交換的洗脫物通過大小分級分離技術進行分離并收集含有一種肽聯葡聚糖的組分。
24.權利要求23所述的肽聯葡聚糖，其中大小分級分離技術是分子排除層析或乙醇分級梯度。
25.權利要求23所述的肽聯葡聚糖，其中陽離子交換是在CM纖維素柱上進行的。
26.一種藥物組合物，其含有前述權利要求任一項所述的提取物或分離的肽聯葡聚糖。
27.一種純化肽聯葡聚糖的方法，其包括如下步驟用堿處理云芝，并分離上清液；將上清液進行陽離子交換；將來自陽離子交換的洗脫物進行陰離子交換；和將來自陰離子交換的洗脫物通過大小分級分離技術進行分離，并收集含有肽聯葡聚糖、分子量為0.7-5kDa的組分。
28.權利要求27所述的方法，其中處理步驟包括浸軟云芝的果實體；用堿提取浸軟的云芝果實體，以得到提取物；從提取物中除去不溶性物質；澄清第一提取物的上清液；和濃縮上清液得到第三提取物，其中將第三粗提取物進行陽離子交換。
29.權利要求28所述的方法，其中堿提取步驟包括將浸軟的云芝果實體在堿性水溶液中煮沸。
30.權利要求29所述的方法，其中堿性水溶液選自氫氧化鈉和氫氧化鉀。
31.權利要求29所述的方法，其中堿性水溶液的當量濃度小于或等于0.1N。
32.權利要求29所述的方法，其中堿性水溶液的當量濃度為0.01N。
33.權利要求27所述的方法，其中不溶性物質是通過過濾從第一提取物中除去的。
34.權利要求29所述的方法，其中含有肽聯葡聚糖、分子量為0.7-5kDa的組分是通過離心澄清的。
35.權利要求29所述的方法，其中含有肽聯葡聚糖、分子量為0.7-5kDa的組分是通過旋轉蒸發、冷凍或凍干濃縮的。
36.權利要求27所述的方法，其中含有肽聯葡聚糖的組分的分子量是0.7kDa到約3.0kDa。
37.一種刺激免疫應答的方法，其包括將免疫系統的細胞與權利要求1、6或11任一項所述的提取物、肽聯葡聚糖或其活性成分接觸。
38.權利要求37所述的方法，其中細胞是脾細胞或骨髓細胞，以及接觸引發細胞的增殖反應。
39.權利要求37所述的方法，其中細胞是巨噬細胞，以及接觸引發細胞分泌一氧化氮。
40.權利要求37所述的方法，其中接觸是在體內發生的。
41.權利要求37所述的方法，其中接觸是在體外發生的。
42.一種治療需要免疫系統刺激的患者的方法，其包括對患者給藥有效量的權利要求1、6、11或23所述的提取物、純化的肽聯葡聚糖或其活性成分，以刺激免疫應答。
43.權利要求42所述的方法，其中患者是免疫缺陷的。
44.權利要求42所述的方法，其中患者是無癥狀但易受免疫缺陷影響的。
45.權利要求42所述的方法，其中免疫缺陷是感染、惡性腫瘤疾病、自身免疫疾病、蛋白質損失狀態、免疫抑制治療、外科手術或麻醉的結果。
46.權利要求45所述的方法，其中感染選自風疹、先天性風疹、麻疹、麻風病、結核病、球孢子菌病、慢性感染、急性病毒感染、巨細胞病毒、多重病毒感染和反復病毒感染。
47.權利要求45所述的方法，其中惡性腫瘤疾病選自霍奇金病、急性白血病、慢性白血病、非淋巴癌和骨髓瘤。
48.權利要求45所述的方法，其中自身免疫疾病選自全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎和慢性活動肝炎。
49.權利要求45所述的方法，其中蛋白質損失狀態選自腎病綜合癥和蛋白質損失性腸病。
50.權利要求45所述的方法，其中免疫抑制治療選自皮質類固醇、胞毒藥物、烷基化試劑、抗代謝物、抗胸腺細胞球蛋白、輻射、環孢菌素、phenytoin和青霉胺。
51.權利要求45所述的方法，其中免疫缺陷是選自下組一種病癥的結果糖尿病、酒精肝硬變、營養不良、灼傷、結節病、脾切除術、鐮狀細胞性貧血、尿毒癥、衰老、亞急性硬化性全腦炎、唐氏綜合征、新生兒和早產兒。
52.權利要求42所述的方法，其中免疫應答包括脾細胞或骨髓細胞的增殖，或巨噬細胞分泌一氧化氮。
53.權利要求42所述的方法，其進一步包括監測患者的癥狀以檢測對給藥步驟反應的癥狀的改善或預防。
54.權利要求42所述的方法，其中免疫缺陷是患者的獲得性免疫缺陷。
55.權利要求54所述的方法，其中獲得性免疫缺陷是人免疫缺陷病毒(HIV)感染的結果。
56.權利要求55所述的方法，其中患者正患有或易受選自下組的紊亂的影響1型皰疹病毒、2型皰疹病毒、巨細胞病毒、水痘、腺病毒(adenovirus)、EB病毒、HTLV-1、HTLV-III、白色假絲酵母(Candida albicans)、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、諾卡氏菌種(Nocardia sps.)、Pneumocystis carinii、鼠弓形體(Toxoplasmagondii)、Isospora sp、Cyptosporidium、Giardia lamblia、Entamoebahistolytica、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、細胞內鳥分支桿菌(Mycobacterium avium-intracellulare)、堪薩斯分支桿菌(Mycobacterium kansasii)、軍團菌(Legionella sp)、密螺旋體(Treponema sp)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、唾液彎曲螺桿菌(Campylobacter sp)、奈瑟氏球菌(Neisseria sp)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、志賀氏菌(Shigella)、沙門氏菌(Salmonella sp)和衣原體(Chlamydia)。
57.權利要求42所述的方法，其進一步包括監測患者中的脾細胞和/或骨髓細胞的增殖以檢測對給藥步驟反應的免疫刺激。
58.權利要求11所述的肽聯葡聚糖，其特征還在于氨基酸序列為SEQ ID NO1。
全文摘要
本發明提供了刺激免疫系統的組合物和方法。這樣的方法包括給藥云芝的提取物、純化的肽聯葡聚糖或其活性成分。該方法特別可用于次級免疫缺陷的預防和治療性處理，其中免疫缺陷是感染、惡性腫瘤疾病、自身免疫疾病、蛋白質損失狀態、免疫抑制治療、外科手術或麻醉的結果。
文檔編號A61P37/02GK1459459SQ0314100
公開日2003年12月3日 申請日期2003年5月22日 優先權日2002年5月22日
發明者周喜林, 朱家榮 申請人:香港中文大學