專利名稱：一種組織工程真皮及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物材料的組織工程技術領域，涉及一種組織工程真皮及其制備方法。
背景技術：
近年來，在醫學美容、創傷、燒傷外科等領域中，隨著對功能性恢復的要求及美觀的考慮，對于某些深部的皮膚缺損僅僅達到創面上皮化已遠遠不夠，必須努力探索應用更合理的方法，使植皮區最終取得與全厚皮移植相同或相近的結果。真皮替代物在皮膚重建過程中具有重要作用，可增強創面愈合后的皮膚彈性、柔韌性及機械耐磨性，減少瘢痕增生，控制攣縮，可提高表皮移植成功率和改善愈合質量。含成纖維細胞的活真皮替代物可促進角朊細胞生長、真表皮連接形成，改善移植物的機械性能和美容效果，使其柔軟度更接近正常皮膚。
真皮替代物基本分為二大類，即天然真皮與人工合成真皮。天然真皮具有完整的膠原三維結構，生物相容性好，在組織成份上與自體皮膚最相近，因此在皮膚重建中具有較高的應用價值。但異體/異種皮可引起排斥反應，表皮層及真皮中的細胞成份是引起免疫反應的主要原因。目前常采用去除異體/異種皮表皮層或所有細胞成份及可溶性蛋白的方法解決免疫排斥的問題。研究表明，經處理的天然真皮可作為永久性的真皮替代物。目前，來源于人尸體皮的無細胞真皮已由美國Lifecell公司開發為產品，商品名為Alloderm，臨床應用效果良好。將Alloderm植入深度燒傷創面，再覆蓋31的網狀斷層皮片，術后16天創面全部表皮化，異體真皮基質底部有受體成纖維細胞浸入，新生血管形成，而無明顯炎性細胞浸潤。電鏡觀察到異體真皮基質表面形成完整基底膜，并生成大量彈性蛋白，免疫學檢查證實術后60天機體對異體真皮無免疫排斥反應。Alloderm在三度和深二度燒傷中起永久性真皮替代物作用。主要缺點有缺乏活的成纖維細胞，這可能延緩真皮重建；無細胞異種真皮基質的膠原可能引起免疫反應；市售產品只達到真皮替代，沒有達到表皮重建，必須覆蓋自體皮或培養的表皮細胞片；Alloderm來源于尸體皮，來源有限，并且存在傳播病毒性疾病的危險(尤其是愛滋病)。
人工真皮系采用各種材料利用組織工程原理及方法制成的真皮基質，與天然真皮替代物相比，其組成成份及交聯物質可改變，以增加對膠原酶的耐受性，且可大量生產，長期貯存。因此人工真皮的開發亦成為皮膚組織學中的熱點。制備人工真皮的關鍵在于尋找合適的生物材料或高分子化學材料，這些材料必需符合以下基本條件(1)生物相容性好，不引起明顯排斥反應及異物反應；(2)可允許成纖維細胞、內皮細胞浸潤生長，易于血管化；(3)植入體內后不易降解。目前，人工合成真皮主要采用膠原-GAG(glycosaminoglycan，氨基葡聚糖，主要成份為硫酸軟骨素)、膠原凝膠、PGA/PLA(聚羥基乙酸/聚乳酸)網、尼龍網等作為真皮支架，結合成纖維細胞，并初步試用于臨床取得一定效果。Biobrane是合成的雙層創面敷料，外層為硅膜，內層為部分埋入其中的尼龍纖維網，網孔中充滿化學交聯的膠原，主要用于供皮區創面和淺度燒傷創面。Advanced Tissue Science公司生產的Dermagraft TC就是把新生兒成纖維細胞培養在該合成敷料的尼龍網中，臨床應用表明優于或等同于異體皮。2000年已獲美國食品與藥物管理局批準用于臨床。生物膜和Dermagraft TC為不可降解性的合成復合膜，在人體燒傷創面中起暫時性創面覆蓋物作用。該公司生產的另一種人真皮替代物Dermagraft TM，由新生兒成纖維細胞種植在可降解的聚乳酸纖維網上組成，移植后3～4周聚乳酸纖維網因生物降解而消失。臨床已成功用于治療糖尿病性潰瘍。生物可吸收網膜的主要優點有高度抵抗創面膠原酶消化，允許移植于污染的燒傷創面；允許燒傷清創后立即移植；無病毒傳染風險。但也有缺點生產合成網膜真皮替代物需要大量成纖維細胞；難改變網膜的厚度，且成本高。
Burke和Yannas等研制的雙層人工皮膚商品名為Integra TM，現由美國Integra Life Sciences公司制造。由戊二醛交聯的牛I型膠原與硫酸軟骨素構成“真皮”，“表皮”為硅橡膠薄膜。應用于創面后“真皮”可逐漸自行降解，而患者自己的內皮細胞和成纖維細胞長入形成新的真皮結構，幾周后用薄層網狀自體皮代替硅膜。Integra TM是異種來源的永久性真皮替代物。缺點是血管化較慢、抗感染能力差，價格昂貴。目前，國內由于種種原因尚未見有理想的人工真皮問世。
發明內容
針對現有技術狀況，本發明的目的之一是提供一種具有止血、抗炎、防止體液流失和保護創面功能的、可用于修復較小皮膚缺損或頜面部軟組織大量缺損造成的顏面凹陷畸形的組織工程真皮產品；并使其具有可立即應用、允許移植超薄自體皮、產生的瘢痕少、形狀大小和厚度易于改變的優點。本發明的目的之二是提供上述組織工程真皮產品的制備方法。
本發明所提供的組織工程真皮產品的特征在于其包括皮膚成纖維細胞、細胞外基質復合物、生物支架材料；是由皮膚成纖維細胞復合于生物支架材料表面來構建具有活性的組織工程真皮。所述的生物支架材料指尼龍膜、或脫細胞異種真皮基質、或混合膠原膜、或殼聚糖、或硫酸軟骨素、或是其中的任意組合。所述的皮膚成纖維細胞為自體或同種異體來源的包皮成纖維細胞，或可向成纖維細胞分化的干細胞，包括胚胎干細胞和成體干細胞，如骨髓間充質干細胞，造血干細胞、皮膚干細胞、間充質干細胞、肌肉干細胞，肝臟干細胞、神經干細胞中的一種或幾種；所述的細胞外基質復合物，包含有I、III型膠原、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白等成分，與人體真皮成分接近；所述組織工程真皮中成纖維細胞有數層排列，與天然真皮結構有高度的一致性，同時具有一定的彈性與韌性。
本發明所提出組織工程真皮的制備方法，包括皮膚成纖維細胞的獲取和擴大培養、細胞外基質復合物的制備、生物支架材料的準備、培養基的配制，其特征在于組織真皮的三維培養包括以下步驟步驟1在無菌條件下，將細胞外基質復合物、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素等膠原物質溶于0.1％醋酸中，配制成0.5％-10％(m/v)的溶液，冰浴下紫外線照射10-60分鐘，再加入10％(m/v)的DMEM培養液、10％(v/v)的胎牛血清，調節pH值為7.2-7.4，成為凝膠溶液。
步驟2將準備好的生物支架材料(尼龍膜或混合膠原膜)浸透該凝膠溶液后，置于37℃環境下固化10-60分鐘。
步驟3將體外培養的皮膚成纖維細胞按104-106個/ml的濃度混合于上述凝膠溶液中，滴加到預固化的生物支架材料上，置于5％CO2環境中37℃條件下10-60分鐘，待其凝固后，加入組織工程真皮培養基，每天換液，六天后組織工程真皮即可使用。
具體實施例方式
現結合實驗將本發明作進一步詳細說明1、成纖維細胞的獲得和擴大培養取新生兒包皮切除術后皮膚組織，已證實此來源的成纖維細胞免疫反應較低，不會引起明顯的排斥反應。獲取的包皮使用新潔爾滅或酒精消毒后，使用酶分離法或組織塊法進行成纖維細胞培養，細胞匯合后用酶消化傳代，擴大培養。具體過程為將消毒后的材料用含1％青/鏈霉素的0.1M的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，去除皮下脂肪及肌肉層，將皮膚剪成條狀，加入蛋白酶(Dispase)4U/ml，在37℃下消化60-120分鐘。去除表皮層，將真皮組織剪碎，加入625U/ml的膠原酶37℃消化90-160分鐘，將收獲的成纖維細胞種至培養瓶培養；將原代培養的成纖維細胞使用細胞工廠、旋轉瓶培養系統或生物反應器等方法進行擴大培養。
2、細胞外基質復合物的制備本發明使用牛皮中提取的細胞外基質復合物，包含I、III型膠原、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白等成分，與人體真皮成分接近。其制備方法為取新鮮胎牛皮剪碎絞成肉泥，2.5倍體積中性液攪拌過夜，離心取上清，1g/L冰醋酸反復抽提，用1mol/L NaCl沉淀，將沉淀物溶解于0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-Hcl)，用2.5mol/LNaCl鹽析，再用1g/L冰醋酸溶解后透析純化。真空凍干，環氧乙烷消毒。
3、生物支架材料的準備本發明所涉及的支架材料有不可降解的合成材料，如尼龍膜；或可降解的高分子材料，如細胞外基質復合物、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素，將其混合物稱為混合膠原膜。經真空凍干后，還氧乙烷熏蒸消毒。
4、培養基的配制。
組織工程真皮培養基成份(及百分比) 500ml體積商用最低必需培養液(DMEM)(65.7％)337.5ml商用培養液F12(22.5％) 112.5ml胎牛血清(5-15％)25-75ml胰島素 1-50ng氫化可的松 10-500ng表皮細胞生長因子1-10μg霍亂毒素0.50～10×10-10M腺嘌呤 0.2-0.25mM抗生素 200-1000i.u轉鐵蛋白1-10mg5、組織工程真皮的準備和三維培養包括以下步驟準備凝膠溶液1)在無菌條件下，將膠原物質溶于0.1％醋酸中，濃度為6mg-10mg/ml，4℃儲存，以防止膠原降解。
2)使用前將上述溶液注入培養皿中，置于冰上，暴露于紫外線下30-60分鐘，確保溶液處于冷卻狀態。
3)在該溶液中加入10％的胎牛血清和DMEM培養液，用1M的NaOH調節pH值至7.2-7.4成為凝膠溶液。
4)將消毒好的尼龍膜或混合膠原膜浸濕凝膠溶液后，置于37℃下固化30分鐘。
5)組織工程真皮的三維培養在凝膠溶液中加入成纖維細胞懸液，使終濃度為104-106個細胞/ml，將膠原-成纖維細胞混合物加至預處理的尼龍膜或混合膠原膜上，置于37℃，CO2孵箱中固化30分鐘后，加入組織工程真皮培養基，每天換液，六天后組織工程真皮即可使用。
本發明所制備的組織工程真皮，不僅具有一定的彈性、韌性，而且具有培養時間短、無明顯免疫排斥反應，與天然真皮結構類似的特點。在臨床治療中主要功能有(1)結合自體表皮移植修復深度皮膚缺損；(2)作為組織充填材料而使局部豐滿。(3)主要用于顏面部凹陷畸形的修復，如顳部、頰部凹陷；(4)充當組織加強物，替代筋膜，修復膜性缺損；修復營養不良和感染創面；不穩定瘢痕及難治性潰瘍病灶清除后，真皮移植可促進愈合，防止復發；(5)構成復合組織移植。
本發明中來自新生兒的成纖維細胞生長于膠原凝膠中，呈三維方向生長，與天然真皮結構類似。在培養過程中，成纖維細胞仍然繼續增殖，在增殖過程中，吸收膠原，分泌基質成分，最終形成真皮組織。通過形態學及組織學觀察結果表明，組織工程真皮中成纖維細胞有數層排列，與天然真皮結構有高度的一致性。同時具有一定的彈性與韌性，有利于臨床操作。
權利要求
1.一種組織工程真皮，其特征在于包括皮膚成纖維細胞、細胞外基質復合物、生物支架材料；是由皮膚成纖維細胞復合于生物支架材料表面構建而成。
2.根據權利要求1所述的組織工程真皮，其特征在于所述的生物支架材料指尼龍膜、或脫細胞異種真皮基質、或混合膠原膜、或殼聚糖、或是硫酸軟骨素、或是其中的任意組合。
3.根據權利要求1所述的組織工程真皮，其特征在于所述的皮膚成纖維細胞為自體或同種異體來源的包皮成纖維細胞，或可向成纖維細胞分化的干細胞，包括胚胎干細胞和成體干細胞；所述的細胞外基質復合物，包含有I、III型膠原、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白成分；所述組織工程真皮中成纖維細胞有數層排列，與天然真皮結構有高度的一致性，同時具有一定的彈性與韌性。
4.根據權利要求1所述的組織工程真皮的制備方法，包括皮膚成纖維細胞的獲取和擴大培養、細胞外基質復合物的制備、生物支架材料的準備、培養基的配制，其特征在于組織工程真皮的三維培養包括以下步驟步驟1在無菌條件下，將膠原物質溶于0.1％的醋酸中，配制成0.5-10％(m/v)溶液，冰浴下紫外線照射，再加入DMEM培養液和胎牛血清，調節pH值為7.2-7.4，成為凝膠溶液；步驟2將準備好的生物支架材料，浸透該凝膠溶液后，置于37℃環境下固化；步驟3將體外培養的皮膚成纖維細胞按104-106個/ml的濃度混合于上述凝膠溶液中，滴加到預固化的生物支架材料上，待其凝固后，加入組織工程真皮培養基，每天換液，六天后組織工程真皮可使用。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的皮膚成纖維細胞的獲取和擴大培養的方法為取新生兒包皮切除術后皮膚組織，消毒后進行成纖維細胞培養，細胞匯合后用酶消化傳代，擴大培養。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的細胞外基質復合物的具體制備方法為取新鮮胎牛皮剪碎，絞成肉泥，中性液攪拌浸泡，離心取上清，冰醋酸反復抽提，沉淀，將沉淀物溶解、鹽析，再用冰醋酸溶解后透析純化，真空凍干，環氧乙烷消毒。
7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的生物支架材料可采用不可降解的合成材料，如尼龍膜；或可降解的高分子材料，如細胞外基質復合物、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、或其混合物。
8.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的組織工程真皮培養基的成分如下商用最低必需培養液(DMEM)65.7％、商用培養液(F12)22.5％、胎牛血清5-15％；此外，還有微量胰島素、氫化可的松、表皮細胞生長因子、霍亂毒素、腺嘌呤、轉鐵蛋白。
全文摘要
本發明屬于生物醫學的組織工程技術領域，涉及一種組織工程真皮及其制備方法。方法特征包括皮膚成纖維細胞的獲取和擴大培養、細胞外基質復合物的制備、生物支架材料的準備、培養基的配制、組織工程真皮的制備和三維培養。所制備的組織工程真皮由皮膚成纖維細胞復合于生物支架材料表面構建而成。本發明所制備的組織工程真皮，不僅有一定的彈性、韌性，而且培養時間短、無明顯免疫排斥反應，與天然真皮結構類似。在臨床治療中將可發揮多方面的作用。
文檔編號A61L27/00GK1493261SQ0313453
公開日2004年5月5日 申請日期2003年9月2日 優先權日2003年9月2日
發明者金巖, 張勇杰, 聶鑫, 王新文, 董蕊, 金 巖 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學口腔醫學院, 陜西艾爾膚生物工程有限責任公司, 中國人民解放軍第四軍醫大學口腔醫學