專利名稱：一種海洋芽孢桿菌生產抗真菌抗生素的發酵方法
技術領域：
本發明涉及海洋芽孢桿菌，具體地說是一種海洋芽孢桿菌發酵生產抗真菌抗生素活性物質的方法，選優了發酵培養基、優化了發酵條件。
背景技術：
眾所周知，抗生素對人類健康至關重要，人們不斷開發新的抗生素、免疫制劑等藥物來對付耐藥菌株、真菌感染、愛滋病等各種新老頑固疾病。由于陸地資源的長期開發，從土壤微生物中尋求能夠產生新天然生理活性物質的微生物已經越來越困難，而海洋生物資源是陸地生物資源的10倍，而且已發現產生新化合物的海洋微生物資源較陸地微生物多得多，所以人們把目光投向了海洋，海洋是新資源的寶庫，現在全世界每天都能發現一些新的海洋微生物，隨著海洋科學研究的不斷深入，應用現代生物技術開發海洋新資源已成為當今全球關注的熱點。從海洋微生物這一巨大寶庫中開發研究新的生物活性物質加以利用發展為高新技術產業，是實現海洋微生物資源持續發展利用的重要步驟之一。
有關海洋微生物產生抗菌活性物質的研究，早在四十年代就有研究報道，從海洋分離的微生物中，20～30％具有抗菌活性，頭孢霉素和硫酸小諾霉素就是海洋微生物產生而應用到臨床的。國外像美國、日本、歐洲投入很大力量對海洋生物資源進行研究開發(方金瑞等，日本從海洋微生物開發新型生物活性物質研究的新進展，中國海洋藥物，1995，40，21-25、張榮慶，海洋天然活性物質國外研究動態，中國第五屆海洋湖沼藥物學術開發研討會論文集(上冊)，1998，237-241、郭躍偉，歐洲海洋藥物的研究現狀及對我國海洋藥物研究的啟事，海洋天然產物與生化藥物論文匯編，2000，35-40)；國外一些學者(Abbanat D.et al，Cell wall active antifungal compounds producedby the marine fungus hypoxylon oceanicum LL-15G256.I.Taxonomy andfermentation.J Antibiot(Tokyo).1998；51(3)296-302.、岡見吉郎，發酵と工業，1979，37(6)504-513、Okami，Y.and Hotta，D.J.Antibiotics，1979，32964～966)從海洋微生物中獲得了新的或已知的抗生物質。我國對海洋微生物的研究多集中在廣東、福建沿海海域，黃維真、方金瑞在福建沿海海洋微生物研究中也獲得了新的和已知的抗生素(黃維真等，福建沿海底棲放線菌及其產生的抗菌物質，中國海洋藥物，1991，31～6、方金瑞等，海洋放線菌產生的抗生素2B-B的分離和鑒定，中國抗生素雜志，1991.(4)305～306)。
陸地上的芽孢桿菌和海洋芽孢桿菌都能產生抗真菌的肽類抗生素，近年來抗真菌抗生素的篩選非常活躍，其中發現芽孢桿菌屬(Bacillus)、微球菌屬(Micrococus)等能產生陸地上所未見過的抗生素(Murry，1989；William，1993；張士璀等，1998；王書錦等，1998)；申請人在中國海洋微生物資源考察中，分離得到海洋細菌318株，海洋弧菌134株，海洋芽孢桿菌71株；抑菌活性實驗表明其中多株海洋芽孢桿菌(Bacillus)的次生代謝產物能產生抗真菌抗生素，對人體病原真菌白色念珠菌、石膏樣毛癬菌、新型隱球菌、紅色毛癬菌及對植物病原真菌鐮刀菌、葡萄孢霉、稻瘟霉菌、蔬菜根腐病菌等有較強的拮抗作用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種成本低、有效組分含量高的海洋芽孢桿菌生產抗真菌抗生素的發酵方法。
為了實現上述目的，本發明在以往的試驗基礎上用均勻設計方法對海洋芽孢桿菌發酵生產抗真菌抗生素進行優化試驗，最后選出發酵生產抗真菌抗生素的最佳培養基配方及發酵條件，具體技術方案為當所選取的海洋芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌時，其發酵培養基A的重量組成為玉米粉0.5～2.0％、豆餅粉0.2～0.8％、葡萄糖0.2-0.6％、磷酸二氫鉀0.01～0.05％、硫酸鋅0.01 0.05％、余量為水；當所選取的海洋芽孢桿菌為解淀粉類芽孢桿菌或凝結芽孢桿菌時，其發酵培養基B的重量組成為豆餅粉0.1～2.5％、淀粉0.1～3％、玉米粉0.1～3.0％、磷酸二氫鉀0.1～0.25％、微量元素母液0.05～0.15％，余量為水；所述微量元素母液組成為四硼酸鈉0.05％、硫酸錳0.05％、硫酸鋅0.05％、鉬酸鈉0.05％、硫酸銅0.002％，余量為水。
所述培養基A組成最好為玉米粉1％、豆餅粉0.6％、葡萄糖0.5％、磷酸二氫鉀0.04％、硫酸鋅0.04％、余量為水；所述培養基B組成最好為豆餅粉2％、淀粉0.2％、玉米粉2％、磷酸二氫鉀0.64％、微量元素母液0.05％，余量為水；當所選取的海洋芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌時，其發酵時間為18--22小時，通氣量為1.0∶0.5～1.0；當所選L的海洋芽孢桿菌為解淀粉類芽孢桿菌或凝結芽孢桿菌時，其發酵時間為20--32小時，通氣量為1.0∶0.5～1.0。
本發明采用白色念珠菌作指示菌，以制霉菌素(抗真菌抗生素)為標準單位，用二計量杯碟法對抗生素活性進行檢測鑒定。
本發明具有如下優點1.本發明的培養基所用的發酵物質均是常見、廉價的農副產品，成本低，且發酵周期短，可以大規模擴大生產。
2.本發明提供的發酵生產抗真菌活性物質的方法，產生的抗生素有效組分含量高，為進一步開發和研究海洋芽孢桿菌打下了基礎。
具體實施例方式
抗真菌海洋芽孢桿菌菌種的選取從中國沿海(大連黑石礁、三亞大東海、青島棧橋等地)選取海水和海泥樣品，海水和海泥樣品加水稀釋后涂布在1/3ZoBell2216固體選擇培養基上，經28℃培養5～7天，挑取細菌進行分離純化培養。用白色念珠菌或石膏樣毛癬菌作指示菌，通過挖塊法選出對白色念珠菌、石膏樣毛癬菌有抑制作用的海洋細菌，參照伯杰氏手冊和《常見細菌系統鑒定手冊》對海洋細菌進行鑒定，同時進行16SrRNA序列分析方法鑒定海洋細菌，獲得海洋芽孢桿菌中的地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉類芽孢桿菌(Paenibacillus amyloliquefaciens)和凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)；實施例1凝結芽孢桿菌菌種的發酵過程1)取在菌種培養基培養好的凝結芽孢桿菌一環，劃線接種在菌種培養基(培養基葡萄糖2％、蛋白胨0.3％、酵母膏0.8％、瓊脂2％，pH自然，115℃滅菌20分鐘)的平皿中，28℃恒溫培養24小時；2)活性物質的發酵將上述培養1天的菌種取幾環接入裝有無菌水和玻璃珠的三角瓶內，搖勻后按重量含量5％的量接入到發酵培養基(基礎培養基玉米粉1％、豆餅粉1％、磷酸二氫鉀0.25％、淀粉0.5％、余量為水，pH自然，121℃滅菌20分鐘)中，發酵培養基上搖床28℃、180rpm恒溫培養，發酵時間為24(可為20～32)小時；3)發酵上清液的制備將凝結芽孢桿菌發酵液用0.5mol草酸調pH值3～4，然后在70℃水浴中保溫10分鐘，取出后在高速臺式離心機上13000rpm離心1分鐘(或3500轉離心20分鐘)，取上清即得；4)抗生素濃度的測量牛津杯法根據抑菌圈的大小來計量活性物質濃度的高低；試驗菌的制備取一環新鮮培養的沙氏斜面上的白念珠菌接入裝有20ml無菌水的三角瓶中，制成菌懸液。
液體沙氏培養基葡萄糖4％、蛋白胨1％，調PH 5.4，115℃滅菌20分鐘；固體沙氏培養基即在液體沙氏培養基中加入2％瓊脂。
發酵時間對活性物質產生的影響
在基礎培養基中按重量含量5％的量接入凝結芽孢桿菌菌懸液，在28℃、180rpm恒溫培養，不同時間取樣測活性物質隨時間的變化見表1；從表1可以看出活性物質濃度隨著發酵時間增加而升高，并在24小時達到最高值，接著開始下降。
表1凝結芽孢桿菌活性物質隨時間變化結果
實施例2采用均勻設計方法對培養基進行優化試驗，發酵培養基的具體組成見表2所示，培養基需調PH6.0～6.5、121℃滅菌20分鐘；其余反應條件與實施例1相同；根據優化實驗方案對培養基優化的結果如表2所示，利用微機對所得結果進行回歸處理得到如下方程Y＝0.4261+3.1010*X3+4.2308*X4+0.2594X1*X1-0.0102*X2*X2+1.4036*X3*X3-2.9738*X4*X4-0.1287*X1*X4-0.0661*X2*X3其中N＝10，R2＝1.0000，S＝0.0006，F＝808151.8700，查表得F＞F0.018.1，F檢驗通過，利用微機進行多元回歸，處理優化條件如下X1＝2.0000、X2＝0.2000、X3＝0.2000、X4＝0.6400、X5＝0.0500，Ymax＝34.51，按優化配方發酵，抑菌圈直徑為34.70mm，接近理論值。
從而得凝結芽孢桿菌發酵培養基最佳配方為玉米粉2.0％，豆餅粉2.0％、磷酸二氫鉀0.64％、淀粉0.2％、微量元素母液0.05％、余量為水。
微量元素母液組成如下四硼酸鈉0.05％、硫酸錳0.05％、硫酸鋅0.05％、鉬酸鈉0.05％、硫酸銅0.002％，余量為水；上述各元素分別配制，用時混合在一起，按培養基溶液重量(或體積)百分比加入。
表2凝結芽孢桿菌優化發酵培養基實驗方案和結果
上述實施例中所得的凝結芽孢桿菌菌體及發酵液經遼寧省衛生防疫站檢測其急性毒理和皮膚刺激實驗，表明凝結芽孢桿菌菌體及發酵液無毒，LD50＞15g/kg體重，對皮膚無刺激作用；其發酵液中的活性物質對人體皮膚致病真菌石膏樣毛癬菌，白色念珠菌有很強的抑制作用。如應用中國科學院沈陽應用生態研究所分離純化的海洋凝結芽孢桿菌B02效果更好。
實施例3按常規方法制取海洋地衣芽孢桿菌發酵種子液，然后進行搖瓶發酵培養；海洋地衣芽孢桿菌發酵培養基配方的選優(其中以磷酸二氫鉀0.04％和硫酸鋅0.04％為常量，余量為水)，采用均勻設計進行，以確定培養基最基本成分，如表3所示。
表3地衣芽孢桿菌碳、氮源均勻設計及結果因素1 2 3 4 5 6 7 8 9玉米粉0 0.20.40.60.81.01.21.41.6％豆餅粉0.20.61.01.40 0.40.81.21.6％葡萄糖0.61.40.41.20.21.00 0.81.6％蛋白胨0.60.40.20 0.70.50.30.10.8％活性(抑菌圈直徑34.20 38.70 34.94 39.00 32.80 36.84 33.90 35.00 37.50mm)經計算機進行逐步線性回歸得到方程Y＝35.1760+2.0558x32-6.0590x42-1.4795x1x2+1.5295x1x4+1.0906x2x3R＝0.9888，S＝0.5398，F＝26.2466，F5，3(α＝0.05)＝9.01，F＞F5，3檢驗通過，置信度＞95％。
其中Y為抑菌圈直徑(mm)，X1玉米粉濃度，X2豆餅粉濃度，X3葡萄糖濃度，X4蛋白胨濃度。
確定發酵培養基成分中最好為玉米粉1％，豆餅粉0.6％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0，磷酸二氫鉀0.04％、硫酸鋅0.04％、余量為水；為驗證該條件，應用上述培養基發酵罐(在7L發酵罐，70L發酵罐)發酵；在發酵培養基初始PH8.0，通風量1∶0.5～1.0，發酵時間18～22小時的條件下，發酵罐發酵中國科學院沈陽應用生態研究所分離純化的海洋地衣芽孢桿菌9912，其產生抗真菌抗生素可達到5800制霉菌素單位/ml發酵液。
權利要求
1.一種海洋芽孢桿菌生產抗真菌抗生素的發酵方法，其特征在于當所選取的海洋芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌時，其發酵培養基A的重量組成為玉米粉0.5～2.0％、豆餅粉0.2～0.8％、葡萄糖0.2-0.6％、磷酸二氫鉀0.01～0.05％、硫酸鋅0.01-0.05％、余量為水；當所選取的海洋芽孢桿菌為解淀粉類芽孢桿菌或凝結芽孢桿菌時，其發酵培養基B的重量組成為豆餅粉0.1～2.5％、淀粉0.1～3％、玉米粉0.1～3.0％、磷酸二氫鉀0.1～0.25％、微量元素母液0.05～0.15％，余量為水；所述微量元素母液組成為四硼酸鈉0.05％、硫酸錳0.05％、硫酸鋅0.05％、鉬酸鈉0.05％、硫酸銅0.002％，余量為水。
2.按照權利要求1所述的海洋芽孢桿菌生產抗真菌抗生素的發酵方法，其特征在于所述培養基A組成為玉米粉1％、豆餅粉0.6％、葡萄糖0.5％、磷酸二氫鉀0.04％、硫酸鋅0.04％、余量為水。
3.按照權利要求1所述的海洋芽孢桿菌生產抗真菌抗生素的發酵方法，其特征在于所述培養基B組成為豆餅粉2％、淀粉0.2％、玉米粉2％、磷酸二氫鉀0.64％、微量元素母液0.05％，余量為水。
4.按照權利要求1所述的海洋芽孢桿菌生產抗真菌抗生素的發酵方法，其特征在于當所選取的海洋芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌時，其發酵時間為18-22小時，通氣量為1.0∶0.5～1.0。
5.按照權利要求1所述的海洋芽孢桿菌生產抗真菌抗生素的發酵方法，其特征在于當所選取的海洋芽孢桿菌為解淀粉類芽孢桿菌或凝結芽孢桿菌時，其發酵時間為20-32小時，通氣量為1.0∶0.5～1.0。
全文摘要
本發明涉及海洋芽孢桿菌，具體的說是一種海洋芽孢桿菌生產抗真菌抗生素的發酵方法，當所選取的海洋芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌時，其發酵培養基的重量組成為A.玉米粉0.5～2.0％、豆餅粉0.2～0.8％、葡萄糖0.2－0.6％、磷酸二氫鉀0.01～0.05％、硫酸鋅0.01－0.05％、余量為水；當所選取的海洋芽孢桿菌為解淀粉類芽孢桿菌或凝結芽孢桿菌時，其發酵培養基的重量組成為B.豆餅粉0.1～2.5％、淀粉0.1～3％、玉米粉0.1～3.0％、磷酸二氫鉀0.1～0.25％、微量元素母液0.05～0.15％，余量為水。本發明為海洋芽孢桿菌生產抗真菌抗生素的進一步開發和應用打下了基礎。
文檔編號A61P31/10GK1472327SQ03133499
公開日2004年2月4日 申請日期2003年6月25日 優先權日2003年6月25日
發明者胡江春, 王烈, 馬成新, 劉全永, 薛德林, 王書錦 申請人:中國科學院沈陽應用生態研究所