含eb病毒潛伏膜蛋白2基因的重組腺病毒疫苗的制作方法

專利名稱：含eb病毒潛伏膜蛋白2基因的重組腺病毒疫苗的制作方法
發明所屬領域本發明涉及含EB病毒潛伏膜蛋白2基因的復制缺陷型重組腺病毒制備方法。本發明進一步涉及所說的復制缺陷型重組腺病毒在預防和治療EB病毒相關腫瘤的疫苗中的應用。
發明的背景在惡性腫瘤中，病毒性抗原是最具免疫原性的分子，并且是一種最有意義的腫瘤抗原。作為皰疹病毒科的成員，Epstein-Barr病毒(以下簡稱EB病毒或EBV)是第一個被發現的人類腫瘤相關病毒。現已明確，EB病毒是導致人鼻咽癌(NPC)、Burkitt淋巴瘤(BL)及免疫抑制后淋巴瘤的主要病因之一。而且也已表明，EB病毒與何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤，以及外周血T細胞淋巴瘤的發生有關。此外，還發現一些其他腫瘤如胃癌、肺癌和胸腺癌等腫瘤組織中存在有EB病毒DNA。
EB病毒潛伏膜蛋白2(LMP2)是一種在鼻咽癌等EB病毒相關腫瘤組織中持續表達并且存在于腫瘤細胞的表面的病毒蛋白質。LMP2基因并不能導致B淋巴細胞的轉化并且沒有致癌性。在EB病毒誘導產生特異性細胞毒性淋巴細胞(CTL)表位的體外實驗中發現，LMP2含有多種受人類白細胞抗原(HLA)限制的CTL表位，而且其序列具有較高的保守性。因此，LMP2很有可能作為體內誘導EB病毒特異性CTL并用于預防和治療相關腫瘤的良好靶抗原。在本發明之前，臨床上曾有人使用LMP2特異性CTL治療EB病毒相關的淋巴細胞增生癥，并取得了良好的治療效果。
由于腺病毒具有宿主范圍廣泛、可感染分裂期細胞和靜止或終末分化細胞、可誘發較強的細胞免疫反應、可高效感染樹突狀細胞(DC)以及使用方便等優點，所以腺病毒載體目前已被廣泛用于基因治療和制備疫苗的外源基因載體(Kai，MA.，D.Liu，and P.Hoogerbrugge..Proc.Natl.Acad.Sci.USA1997，9412774-12776.)。例如，已有人將攜帶黑素瘤相關抗原(MART1)或多瘤病毒T抗原基因的重組腺病毒用于人的體外或小鼠的體內治療(分別參見Souberbielle，BE. & Russell，WC.，Journal of Infectious Diseases，172，1421-1422，1995；Flomenberg，P.，et al.，Journal of Infectious Diseases，171，1090-1096，1995)。甚至也有人成功地借助典型腺病毒載體表達LMP2蛋白并用所得表達產物免疫小鼠。
然而，迄今尚未見使用腺病毒作載體，成功地制備以EB病毒的潛伏膜蛋白2為靶抗原的EB病毒相關腫瘤治療性疫苗的報道。
發明的目的本發明的一個目的是提供一種復制缺陷型重組腺病毒，特征在于所說的病毒攜帶有編碼EB病毒潛伏膜蛋白2的DNA序列。
根據本發明重組腺病毒的一個優選實施方案，其中所說的復制缺陷型重組腺病毒的病毒滴度不小于109pfu/ml。
根據本發明重組腺病毒的一個優選實施方案，其中所說的復制缺陷型重組腺病毒可在體內誘導EB病毒特異性細胞毒性淋巴細胞反應。
本發明的另一個目的是提供生產如上限定的復制缺陷型重組腺病毒的方法，該方法包括(1)將編碼LMP2蛋白質的DNA序列克隆到適當的腺病毒穿梭質粒中，得到攜帶LMP2之DNA編碼序列的重組腺病毒穿梭質粒；(2)用步驟1的重組穿梭質粒和腺病毒骨架質粒共轉化適當的宿主細胞；(3)在適當條件下使步驟2的重組穿梭質粒與腺病毒骨架質粒進行同源重組的，得到攜帶LMP2之DNA編碼序列的重組腺病毒載體；(4)將步驟3的重組腺病毒載體導入適當的腺病毒包裝細胞，得到所需的復制缺陷型重組腺病毒。
根據本發明方法的一個優選實施方案，其中所說的腺病毒穿梭質粒是質粒pShuttle-CMV。
根據本發明方法的一個優選實施方案，其中所說的腺病毒骨架質粒是質粒pAdEasy-1。
根據本發明方法的一個優選實施方案，其中所說的宿主細胞是大腸桿菌BJ5183。
根據本發明方法的一個優選實施方案，其中所說的腺病毒包裝細胞是293細胞。
本發明的再一個目的是提供如上限定的復制缺陷型重組腺病毒作為EB病毒相關腫瘤治療性疫苗的應用。
根據本發明應用的一個優選實施方案，其中所說的疫苗的靶抗原是EB病毒的潛伏膜蛋白2。
根據本發明應用的一個優選實施方案，其中所說的其中所說的復制缺陷型重組腺病毒的病毒滴度不小于109pfu/ml。
根據本發明應用的一個優選實施方案，其中所說的復制缺陷型重組腺病毒可在體內誘導抗EB病毒LMP2蛋白特異性抗體反應和EB病毒特異性細胞毒性淋巴細胞反應。
根據本發明應用的一個優選實施方案，其中所說的疫苗是經胃腸道外途徑投用的。
附圖簡要描述

圖1A和B是腺病毒穿梭質粒(A)和腺病毒骨架質粒(B)的結構示意圖(引自He TC，1998)。
圖2顯示充足腺病毒包裝(構建)流程圖(引自He TC，1998)。
圖3顯示以RT-PCR方法檢測的本發明重組腺病毒(rAd-LMP2)感染的293細胞中LMP2的DNA編碼序列的轉錄。其中泳道1是分子量(2000道爾頓)標記；泳道2是感染本發明重組腺病毒(rAd-LMP2)的293細胞總RNA的RT-PCR產物；泳道3是感染本發明重組腺病毒(rAd-GFP-LMP2)的293細胞總RNA的RT-PCR產物；泳道4是感染野生腺病(Ad5)的293細胞總RNA的RT-PCR產物。
圖4顯示以免疫印跡法檢測rAd-LMP2感染的293細胞內LMP2的表達。其中泳道1是B95-8細胞；泳道2是Ad5感染的293細胞；泳道3是rAd-LMP2感染的293細胞；泳道1是rAd-GFP-LMP2感染的293細胞。
圖5顯示通過不同途徑接種本發明的重組腺病毒后，被免疫動物的CTL水平的比較。
發明的詳細描述本發明涉及攜帶EB病毒潛伏膜蛋白2之DNA編碼序列的復制缺陷型重組腺病毒及其制備方法。本發明進一步涉及所說的復制缺陷型重組腺病毒作為治療性疫苗在預防和治療EB病毒相關腫瘤中的應用。
鼻咽癌是一種常見的惡性腫瘤，在中國南方一些省區具有較高的發病率。目前常用的治療方法主要是放射治療。由于鼻咽癌特別是中晚期鼻咽癌治療后的復發和轉移率很高，所以往往導致治療失敗。近幾十年來，隨著分子生物學和腫瘤免疫學的研究進展，使用分子生物學手段預防鼻咽癌復發和轉移并作為傳統治療方法的補充，已受到人們越來越多的重視。
已有充分證據表明，EB病毒與鼻咽癌(NPC)密切相關(Liu ZS，etal.，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，1243541-548，1998)，而且是導致鼻咽癌及其他一些淋巴瘤的主要病原因子。隨著對EB病毒特異性基因片段和病毒抗原決定基研究的不斷深入，人們已發現包括鼻咽癌在內的一些EB病毒II型潛伏感染相關腫瘤的瘤細胞均有EBNA1-6、LMP1和LMP2的表達。LMP2是第8個被確定的EB病毒潛伏蛋白，特別是LMP2A分子中至少有9種HLA限制的LMP2表位。進一步的研究表明，LMP2可能具有維持病毒在細胞內的潛伏感染狀態的功能(Speck p et al.，J，Gen.Virol.，802193-2203，1999)。
Rooney等人利用反轉錄病毒和單純皰疹病毒作載體，將LMP2導入樹突狀細胞(DC)并表達之，借以刺激并激發何杰金氏病病人體內的特異性細胞毒性淋巴細胞(CLT)反應，獲得有益的經驗(Rooney CM，Ann.Oncol.，9(Suppl.5)s129-s132.1997)。
林毓純等人的早期研究發現，NPC病人的T淋巴細胞對自身腫瘤細胞具有特異性殺傷作用，而且這種作用與人白細胞抗原有關(林毓純，趙文革，曾毅等，中華腫瘤學雜志，4(4)254-256，1982)。
上述這些和其他相關研究成果為利用LMP2特異性CTL治療未分化和低分化鼻咽癌提供了科學依據。本發明人試圖在建立一個適當的LMP2表達系統的基礎上，使LMP2蛋白在細胞內以內源蛋白質的形式表達，然后與組織相容性復合體(MHC)分子結合并一同呈遞到細胞表面，進而通過激活記憶性T細胞達到增強NPC病人的抗腫瘤免疫反應的目的。
為了引發針對LMP2的特異性CTL反應，必須首先須選擇一個適于治療應用的LMP2表達系統。鑒于腺病毒具有宿主范圍廣泛、能夠感染分裂期細胞和靜止或終末分化細胞并誘發較強的細胞免疫反應、可高效感染樹突狀細胞(DC)以及使用方便等優點，特別是復制缺陷型重組腺病毒更具有安全性好的優點，所以我們確定以腺病毒作為LMP2的病毒載體。
因此，本發明的一個目的是提供一種復制缺陷型重組腺病毒，特征在于所說的病毒攜帶有編碼EB病毒潛伏膜蛋白2的DNA序列。
根據本發明重組腺病毒的一個優選實施方案，其中所說的復制缺陷型重組腺病毒的病毒滴度不小于109pfu/ml，并可在體內誘導EB病毒特異性細胞毒性淋巴細胞反應。
為了得到本發明的攜帶EB病毒潛伏膜蛋白2(LMP2)的DNA編碼序列的復制缺陷型重組腺病毒，我們首先由攜帶LMP2的DNA編碼序列的已知質粒(例如Psg5-LMP2)中得到LMP2的全長度cDNA序列，并將其定向克隆到腺病毒穿梭質粒中。然后使用所得到的重組腺病毒穿梭質粒與已知的腺病毒骨架質粒一起共轉染大腸桿菌宿主細胞，并借助宿主細胞的重組酶使兩質粒間發生同源重組。然后基于質粒同源重組后獲得的抗生素抗性(例如卡那霉素抗性)篩選陽性菌株，并由之得到所需的重組腺病毒質粒。最后，再借助質脂體將重組腺病毒質粒轉染已知的腺病毒包裝細胞中，并在由所說的包裝細胞提供的E1蛋白的反向作用下包裝病毒(參見圖1和2)。
因此，本發明的另一個目的是提供生產如上限定的復制缺陷型重組腺病毒的方法，該方法包括(1)將編碼LMP2蛋白質的DNA序列克隆到適當的腺病毒穿梭質粒中，得到攜帶LMP2之DNA編碼序列的重組腺病毒穿梭質粒；(2)用步驟1的重組穿梭質粒和腺病毒骨架質粒共轉化適當的宿主細胞；(3)在適當條件下使步驟2的重組穿梭質粒與腺病毒骨架質粒進行同源重組的，得到攜帶LMP2之DNA編碼序列的重組腺病毒質粒；(4)將步驟3的重組腺病毒質粒導入適當的腺病毒包裝細胞，得到所需的復制缺陷型重組腺病毒。
根據本發明方法的一個優選實施方案，其中所說的腺病毒穿梭質粒是質粒pShuttle-CMV。
根據本發明方法的一個優選實施方案，其中所說的腺病毒骨架質粒是質粒pAdEasy-1。
根據本發明方法的一個優選實施方案，其中所說的宿主細胞是大腸桿菌BJ5183。
根據本發明方法的一個優選實施方案，其中所說的腺病毒包裝細胞是293細胞。
本發明方法中所使用的腺病毒穿梭質粒pShuttle-CMV、腺病毒骨架質粒pAdEasy-1、大腸桿菌宿主細胞BJ 5183以及腺病毒包裝細胞(293細胞)均購自美國STRATAGENE公司。
本發明所涉及的核酸序列和用于實現本發明的其他核酸，包括RNA、cDNA、基因組DNA、載體均可從各種來源中分離得到并可經受遺傳操作、擴增，和/或被重組表達。
另外，也可以使用已知的化學合成技術體外合成這些(單鏈)核酸(例如參見Adams，J.Am.Chem.Soc.105661，1983；Belousov，Nucleic Acids Res.253440-3444，1997；Blommers，Biochemistry 337886-7896，1994；Narang，Meth.Enzymol.6890，1997)。然后再合成其互補鏈并在適當條件下將它們一起退火。或者使用DNA聚合酶，將互補鏈與適當的引物序列加合，以得到所需的雙鏈DNA片段。
核酸操作技術，例如亞克隆、探針標記、測序、雜交等在科學文獻和專利文獻都已有充分描述(如參見Sambrook，ed.Molecular CloningA LaboratoryManul(2nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1998)；CurrentProtocols In Molrcular Biology，Ausubel，ed.John wiley & Sons，Inc.NewYork(1997))。
可以使用許多已知的方法完成核酸、載體、多肽和蛋白質等的定性和定量分析，例如這些方法包括分光光度法、放射顯影法、電泳、高效液相層析(HPLC)、免疫沉淀、免疫擴散、免疫電泳、放射免疫、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光試驗、Southern分析、Northern分析、點印跡分析、凝膠電泳(SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其他核酸或靶或信號擴增技術等。
我們的實驗結果顯示，本發明的攜帶LMP2編碼序列的復制缺陷型重組腺病毒具有高達109pfu/ml的病毒滴度。用本發明的重組腺病毒感染小鼠后，可檢測(免疫熒光法)到動物體內特異性抗體的生成，并且可檢測(LDH方法)到動物的特異性細胞毒反應。
事實上，大量的實驗室研究已經證明，經肌肉注射、皮下注射或微粒(如膠體金包被載體)轟擊等免疫途徑接種的病毒疫苗后，被免疫的人或動物不僅可表達由之編碼的蛋白質，進而在動物體內誘發抗體生成反應(通常是通過Th2途徑)，而且可誘發包括I和II類MHC限制的CD+CTL和CD4+輔助細胞(Th1)免疫在內的細胞免疫反應(Fu，TM.etal.，J.Viral.712715-2721，1997；Lekutis，C.etal.，J.Immunol.，1584471-4477，1997；Wang R.，et al.，Science 282476-480)。
無論是用于免疫預防還是用于免疫治療，其目的都是為了在體內誘導產生保護性抗體和/或細胞毒性淋巴細胞，以通過不同的免疫機制發揮其抑制EB病毒相關腫瘤發生和發展的目的。既然本發明的重組腺病毒疫苗可在體內誘發體液免疫反應，就有可能利用所說的重組DNA作為免疫原，借助某些已知的表達、轉錄或加工機制和相應元件，在宿主動物體內可調控地表達由所說的重組病毒DNA編碼的相應的具有天然構象的蛋白質。
這就是說，通過直接肌肉內注射、皮內注射、微粒轟擊甚至口服途徑給宿主動物投用攜帶于適當載體如腺病毒載體上的編碼特定蛋白質如LMP2蛋白的核苷酸序列，即可在宿主體內有效地復制所說的重組病毒DNA，并表達由之編碼的抗原蛋白質，進而刺激宿主免疫系統，以誘導抗這些潛在的病原體抗原如特異性病毒蛋白或靶特異性蛋白質的免疫反應。
根據本發明，所說的編碼特定蛋白質的核苷酸序列可以是編碼任何病毒、細菌或寄生蟲蛋白質的核苷酸序列，或者是編碼任何腫瘤相關抗原或致癌基因的核苷酸序列，也可以是編碼B或T細胞相關CD分子的核苷酸序列。
例如，僅就腫瘤治療而言，當從某些腫瘤組織中找到并克隆了腫瘤相關的特異性序列(即腫瘤相關基因，例如突變的P53基因、鼻咽癌相關LMP2等)后，可按本發明的方法以相關蛋白質的編碼序列作為免疫原，在適當的載體攜帶下接種人或哺乳動物以在體內誘導抗相應腫瘤的體液和細胞免疫反應。或者，也可以使用所說的DNA免疫原制備抗由之表達的抗原蛋白質的單克隆抗體，并可以將這樣的單克隆抗體直接用于治療目的。或者，亦可將所說的單克隆抗體連接到毒素分子或其部分上，制成以單克隆抗體為導向部分的靶特異性細胞毒性劑(嵌合毒素)。可以制備抗T淋巴細胞表面膜上CD2(T11)、CD3、CD4、和CD8等抗原，以及抗B淋巴細胞表面膜上CD10、CD19和CD20等抗原的單克隆抗體，并可使用這些抗體與毒素分子融合得到的雜交蛋白質作為靶特異性免疫毒性劑，用于治療移植物抗宿主反應、器官移植排斥、I型糖尿病、多發性硬化癥、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡及重癥肌無力等由T細胞引起的自身免疫病。
因此，本發明的再一個目的是提供一種基本上由如上限定的攜帶LMP2編碼序列的復制缺陷型重組腺病毒，以及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑組成的疫苗組合物。
根據本發明應用的一個優選實施方案，其中所說的復制缺陷型重組腺病毒的病毒滴度不小于109pfu/ml。
根據本發明應用的一個優選實施方案，其中所說的復制缺陷型重組腺病毒可在體內誘導抗EB病毒LMP2蛋白特異性抗體反應和EB病毒特異性細胞毒性淋巴細胞反應。
可按照制藥工業中已知的方法(如參見Remington’s PharmaceuticalScience.15th ed.，Mack Publishing Company，1980)將如上限定的攜帶LMP2編碼序列的復制缺陷型重組腺病毒與一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑按適當的比例混合，并按已知方法除菌后制備本發明的疫苗組合物。
根據給藥途徑的不同，可將本發明的疫苗組合物配制成適于靜脈內、肌肉內、體腔內、組織內、皮內或皮下給藥的可注射的溶液劑或分散劑；或適于口服給藥的粉末劑、片劑、顆粒劑、丸劑、乳劑、懸浮劑、膠囊劑、酏劑；或適于局部給藥和通過皮膚或粘膜吸收給藥的噴霧劑、霜劑、乳劑、軟膏劑、凝膠劑等。
為了制備適于胃腸道外途徑給藥的可注射溶液劑，例如可以使用無菌蒸餾水、注射用水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、以及含有乙醇、多元醇(如乙二醇、丙二醇及液態聚乙二醇等)的溶劑或分散介質作為載體或稀釋劑。在任何情況下，所說的可注射制劑均應是無菌和可流動并適于通過注射器注射給藥的。另外，在生產、運輸和儲存條件下，所說的制劑還必須是穩定的，并能夠對抗細菌和真菌等微生物的污染。
另外，也可使用制藥工業中已知的方法和輔助成份，將本發明的疫苗組合物制成微膠囊劑或脂質體包裹劑。
為了制備適于外用或局部給藥的制劑，例如可以將槐定堿或其衍生物或類似物溶解于含水介質或其他適當的載體或基質中，并與適當的透皮透黏膜吸收劑混合，制成噴霧劑或氣霧劑。另外，也可使用適當的基質或賦形劑將本發明的疫苗組合物制成適于局部或通過皮膚或粘膜吸收給藥的乳劑、霜劑、軟膏、凝膠劑或栓劑。
另外，雖然本發明的疫苗可以通過胃腸道外途徑或胃腸道途徑給藥，但我們的動物接種(比較)實驗顯示，胃腸道外途徑接種可比經胃腸道途徑接種獲得更好的免疫效果。推測這可能與經胃腸道途徑接種造成胃酸對病毒破壞，以及腸淋巴組織對抗原缺乏敏感性等因素有關。
最后應特別指出的是，作為另一種常用的接種方法，也可以將所說的病毒固定于載體上，制成微顆粒如膠體金包被的載體微粒，以微粒轟擊方法接種于被免疫宿主體內。
下列實施例旨在進一步舉例說明而不是限制本發明。應明確指出的是，在不違背本發明的精神和原則的前提下，對本發明的個別非必要技術特征所作的任何改動和改變都將落入本發明的待批權利要求范圍內。另外，如前所述，由于用于實現本發明的核酸序列，包括RNA、cDNA、基因組DNA、載體或相關病毒等起始材料均是已知的，可從各種來源直接得到或者可經受遺傳操作、擴增，和/或重組表達等方法間接得到，并且本說明書的詳細描述部分和相關實施例部分也已對本發明的方法作了完整、清楚的描述，所以申請人相信本領域技術人員在仔細閱讀了本說明書后完全可以重復和再現本發明。
實施例實施例1EBV-LMP2重組腺病毒的構建以下按分步驟詳細描述EBV-LMP2重組體腺病毒的構建流程(參見圖2)。
1、EBV-LMP2重組腺病毒穿梭質粒的構建
(1)大腸桿菌感受態細胞的的制備首先將大腸桿菌DH5α/DH10B細胞接種于不含抗生素的LB培養基(3ml)中，37℃過夜后再將1∶100稀釋的此培養物轉入新的同樣培養基中繼續培養約2.5小時，直至OD600達到0.6左右。然后離心(4℃，4000rpm，10分鐘)收集細胞并反復(2次)用的0.1M CaCl2(10ml)溶液洗滌后重新懸浮細胞。再次離心并將致敏的感受態細胞懸浮在小體積(2ml)0.1M CaCl2溶液中，-70℃保存備用。
(2)質粒的小量制備、酶切和電泳分析及去磷酸化為了小量制備攜帶LMP2基因和氨卞青霉素抗性的質粒pSG5-LMP2(美國哈佛大學贈送)，首先按已知方法用質粒(1μl)轉化如上致敏的大腸桿菌細胞(將質粒與細胞的混合物冰浴30分鐘、熱休克90分鐘后加入不含抗生素的培養基并保溫，然后鋪板)。轉化并培養過夜后從平板上挑選單個菌落，接種于含有相應抗生素的LB培養基中并震蕩(37℃)培養過夜。過夜培養后，離心收集細胞并向細胞沉淀物中加入溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-HCL(pH8.0)和10mMEDTA(pH8.0))(100μl)以震蕩懸浮細胞。然后再加入新鮮配制的溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)(200μl)并冰浴3分鐘。最后再加溶液III(100ml中含60ml5M乙酸鉀，11.5ml冰乙酸，28.5ml水)(150μl)并冰浴5分鐘。處理后離心(12000rpm，10分鐘)收集上清并用等體積苯酚和氯仿混合溶劑以及單純的氯仿各抽提一次，取分離面上層水相，加入2倍體積的無水乙醇-20℃沉淀2小時再用70％乙醇洗滌。離心(12000rpm，3分鐘)并加入含RNase A(100μg/ml)的TE溶液(30μ)l溶解沉淀后，-20℃保存備用。
按照供應商提供的條件，用限制性內切酶EcoRI消化如上小量制備的質粒pSG5-LMP2和Bluescript，然后分別用1％瓊脂糖凝膠電泳分離兩種酶切產物。為此，用3倍體積的溶膠液溶化凝膠后，按比例加入適當體積(見使用說明書)的玻璃奶冰浴10分鐘，離心(12000rpm，30秒)并反復漂洗沉淀后，置于37℃溫箱干燥15～20分鐘，加入TE(50μl)并于60℃下水浴5分鐘，再次離心并回收上清，以電泳法估計產物的收率及純度。
在10×堿性磷酸酶緩沖液(2μl)中，用堿性磷酸酶(0.5μl)處理(55℃水浴45分鐘)如上得到的載體DNA(10μl)。向反應體系中加入1/10體積的0.5M EDTA(PH8.0)(2μl)并于65℃下滅活1小時，然后依次用等體積飽和苯酚/氯仿和氯仿/異戊醇各抽提一次。收集上層水相并加入1/2體積醋酸銨(7.5mol/L)，然后用2倍體積無水乙醇-70℃沉淀30分鐘。離心(12000rpm，15分鐘)收集如此去磷酸化的DNA沉淀，用70％乙醇洗滌一次并干燥后，加水稀釋至DNA濃度為0.5μg/μl，于-20℃下保存備用。
(3)重組中間質粒的構建和酶切鑒定將去磷酸化的載體Bluescript M13的酶消化片段與回收的目的基因(LMP2基因)片段按1∶5比例混合，45℃水浴5分鐘后迅速置于冰浴中，加入10×T4DNA連接酶緩沖液和T4DNA連接酶(總反應體積10μl)，16℃過夜連接。然后，用所得到的連接反應混合物轉化致敏的大腸桿菌DH5α細胞。
以堿裂解法提取如上得到的中間質粒Bluescript-LMP2，分別用單一EcoRI、SalI酶消化和KpnI-Xbal雙酶消化，根據酶切片段的大小判定重組質粒的大小和方向。酶切分析表明，正向插入且不存在串聯現象的重組體經SalI酶消化后得到兩條大小分別為788bp和4128bp的片段，而反向插入外來片段的重組體則得到兩條大小分別為1169bp和3748bp的片段。然后用玻璃奶回收KpnI-Xbal雙酶消化的LMP2片段。經EcoRI單一酶和KpnI-Xbal雙酶消化后所得到的片段大小分別為2960和2000bp。(所使用的內切酶均購自日本TAKARA公司)(4)重組腺病毒穿梭質粒的構建分別KpnI-Xbal用雙酶消化帶有CMV啟動子的穿梭質粒pShuttle-CMV和帶有CMV啟動子和綠色熒光蛋白的質粒pAdTrack-CMV。然后將所回收的片段與KpnI-Xbal雙酶切的LMP2片段按1∶4比例混合。45℃水浴5分鐘后迅速置于冰浴中，加入10×T4DNA連接酶緩沖液和T4DNA連接酶(反應體積40μl)，16℃過夜連接。取5μl連接反應物轉化致敏的DH10B細胞。然后小量制備質粒并分別進行酶消化，根據酶切片段的大小鑒定連接產物。酶切分析顯示，經EcoRI單酶消化和KpnI-Xbal雙酶消化后，前者裂解成兩條大小分別為7452bp和2000bp的片段；后者裂解成兩條大小分別為9220bp和2000bp的片段。表明所得產物為正確連接的重組穿梭質粒pShuttle-LMP2和pAdTrack-LMP2(參見圖1)。
2、EBV-LMP2重組腺病毒的構建(1)穿梭質粒和骨架質粒DNA的制備以堿裂解法從宿主細胞中提取攜帶LMP2之編碼序列的穿梭質粒，用PmeI單酶消化后回收酶切片段，-20℃下保存備用。
同時，挑取單個含pAdEasy-1質粒的細菌菌落，接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養液中，37℃下震蕩培養24小時。將培養物冰浴10分鐘后離心收集細菌細胞。依次加入上述的溶液I、溶液II和溶液III并進行相似處理后離心(12000rpm、10分鐘)收集上清。用等體積異丙醇-20℃沉淀過夜后，用70％乙醇反復洗滌沉淀2-3次。然后加入含RNaseA(100μg/ml)的TE溶液(30μl)溶解沉淀，完全溶解后于-20℃下保存備用。
(2)大腸桿菌BJ5183宿主細胞的制備將大腸桿菌BJ5183細胞接種于含鏈霉素(30μg/ml)LB培養液(3ml)中，37℃保溫過夜后再將1∶1000稀釋的此培養物轉入新的含鏈霉素LB(200ml)中繼續培養4～5小時，直至OD550達到0.8左右。離心(4℃、3000rpm、10分鐘)收集細胞后再用體積冰預冷的WB溶液(10％甘油，90％的去離子水)重新懸浮細菌細胞。用WB溶液反復洗滌3次后-70℃下保存備用。
(3)BJ5183細胞的轉化和腺病毒重組體的生產與鑒定向上述PmeI線性化的穿梭質粒(攜帶卡那酶素抗性)各6μl中分別加入腺病毒骨架質粒pAdEasy-1(1μl)。將如上得到的BJ5183細胞(20μl)置于無水乙醇浸泡處理并預冷卻的電轉化儀(Bio-Rad)的小杯中，在2500V，200Ω，25μFD條件下進行電轉化。然后，快速加入不含抗生素的SOC培養液(參見《分子克隆》第---章)0.5ml重新懸浮細胞。37℃保溫10分鐘后將被轉化的細胞接種于4個卡那霉素陽性的LB培養皿中(100μl/皿)，37℃培養過夜。
培養后，挑選最小的10～20個克隆，接種于2ml卡那霉素陽性(25μg/ml)的LB培養液中，繼續于37℃下振搖過夜。然后用堿裂解法提取質粒，并進行EcoRI和PacI單酶切鑒定。用鑒定正確的重組體轉化DH10B感受態細胞，堿裂解法提取質粒并于-20℃下保存備用。
所得到的重組體經EcoRI酶切后，得到兩條大小分別為2000bp和15kb以上的片段；并且經PacI酶切后，得到兩條大小分別為大約30kb和3000-4500kb的片段。因此，限制性酶切分析結果表明穿梭質粒和骨架質粒已在宿主細胞內重組酶的介導下發生了同源重組，并且宿主細胞也獲得了卡那酶素抗性。
3、重組腺病毒的包裝
(1)重組腺病毒DNA的制備用7％瓊脂糖凝膠電泳分離PacI酶切的重組腺病毒質粒(1～4μg)，切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠備用。
用透析袋夾將預先在2％(w/v)碳酸氫鈉和1mmol/L EDTA(PH8.0)中煮沸(10分鐘)處理過的透析袋一端封住，充入1×TAE電泳液和瓊脂糖凝膠進行電泳，直到將DNA從凝膠中洗脫出來。然后將緩沖液轉移至1.5ml的離心管中并加入1/10體積3mol/L醋酸鈉。用2倍體積無水乙醇-20℃沉淀DNA過夜，并離心收集DNA沉淀。再用70％乙醇洗滌并干燥后，加水至DNA濃度為0.2μg/μl備用。
(2)重組腺病毒的包裝將A液[(DNA溶液(PacI酶切重組腺病毒質粒后得到的大片段)20μl(1～4μg))加Opti-MEM培養液(GIBCO BRL)共100μl]和B液[Lipofectamine試劑(GIBCO BRL)20μl加Opti-MEM培養液共100μl]輕輕混勻作為轉染液，并于室溫下放置40分鐘。取0.8ml Opti-MEM培養液與轉染液混勻后輕輕加到預培養的293細胞(2×106)上，于37℃和5％CO2環境下保溫4小時以在293細胞之E1蛋白的幫助下實現病毒的包裝(參見圖1)。然后加入含10％小牛血清的DMEM完全液(6ml)，繼續保溫過夜后換液觀察熒光蛋白的表達。
轉染后7～10天，刮取并離心(800rpm，5分鐘)收集細胞，然后將細胞重新懸浮于PBS(2ml)中。于-70℃和37℃下反復凍融4次后，離心(800rpm，5分鐘)收集上清。用1ml上清接種293細胞并保溫(37℃，5％CO2)1小時。然后加入含2％小牛血清的DMEM維持液(6ml)并觀察細胞病變。
觀察結果可見，被轉染的細胞有熒光蛋白表達并且出現細胞腫脹和圓縮等細胞病變。
實施例2EBV-LMP2重組腺病毒的鑒定和病毒滴度分析(1)病毒DNA的PCR檢測使用如上在293細胞中傳代增殖的并在蛋白酶K純在下加熱并煮沸的病毒上清(2μl)作為模板，并使用上游引物P15’CGGGATCCATATGCTTTTAACATTGGCAGC’；和下游引物P25’CGGGATCCAGTGTAAGGCAGTAGTAG3’進行30次PCR擴增循環。然后對擴增的病毒DNA進行電泳分析。結果顯示只有重組腺病毒DNA中有長度為520bp的LMP2特異性擴增條帶。
(2)被感染的細胞內LMP2 DNA基因的存在收集如上得到的重組腺病毒和腺病毒野毒株，分別感染293細胞。裂解細胞后用常規方法提取細胞染色體DNA。同時，制備地高辛標記探針并用以標記編碼LMP2的特異性DNA片段。然后在雜交條件下，使地高辛探針標記的LMP2特異性DNA片段與如上制備的被感染細菌細胞的染色體DNA雜交。樣品在硝酸纖維素膜上雜交后，以免疫顯色法檢測特異性雜交斑點的存在。結果可見，被本發明的重組腺病毒(rAd-LMP2)感染之293細胞的染色體DNA可與地高辛探針標記的LMP2特異性DNA片段雜交，而被野生型腺病毒(Ad5)感染之293細胞的染色體DNA則不與地高辛探針標記的LMP2特異性DNA片段雜交。
(3)重組腺病毒感染的293細胞中LMP2基因的轉錄收集如上得到的重組腺病毒(rAd-LMP2)和腺病毒野毒株(Ad5)并分別感染293細胞。裂解細胞后用常規方法提取細胞總RNA。對所得到的細胞RNA進行反轉錄反應，然后以反轉錄產物為模板進行PCR擴增。用1％瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產物后，對所得到的片段進行反轉錄酶-聚合酶鏈式反應檢測。結果可見，使用LMP2特異性引物從兩種重組腺病毒感染的細胞中擴出一條520bp的條帶，而野生型腺病毒(Ad5)感染的細胞中沒有出現相應的擴增條帶(參見圖3)。此結果從RNA水平上進一步證實了LMP2基因在細胞中得以有效轉錄。
(4)重組腺病毒感染的293細胞中LMP2的表達以LMP2特異性單克隆抗體14B7，17F9，4E11為第一抗體(英國伯明翰大學贈送)，并以辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠IgG(北方同正試劑公司)為第二抗體，對細胞樣品進行免疫引跡分析(Western-blot)。結果表明，rAd-LMP2感染的293細胞中顯示有大約54KD的蛋白帶，而Ad5感染的細胞中沒有出現相似大小的帶(參見圖4)。
(5)重組腺病毒滴度的測定用本發明的重組腺病毒感染293細胞，37℃和5％CO2環境下將細胞孵育1小時，然后加入含2％小牛血清的DMEM維持液繼續保溫，3～4天后待細胞出現典型病變時收獲細胞。反復凍融(4次)后離心(12000rpm，30分鐘)并過濾上清液即得到所需的病毒原液。
將此病毒原液作梯度稀釋，以10-4～10-9稀釋度各2ml接種于六孔板上的Hela細胞，保溫15小時后在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達并按下列公式計算病毒滴度病毒滴度(pfu/ml)＝平均每孔熒光數×稀釋倍數/接種毫升數結果可見，本發明的重組腺病毒滴度不小于109pfu/ml。
實施例3EBV-LMP2重組腺病毒的免疫學活性分析常規培養DBA肥大細胞瘤細胞(H-2d)(P815細胞)。當細胞生長到對數中期時(1×107/ml)收獲細胞，并在1000V/cm電壓和20-100ms沖擊條件下以電轉化法用攜帶LMP2基因序列的重組質粒轉染之。轉染后，用含10％牛血清的完全培養基37℃培養24小時，然后換成含600μg/ml G418的選擇培養基繼續。兩周后得到有穩定抗性的陽性細胞。繼續擴增培養后，將其用作靶細胞。
4～5周齡Balb/c(H-2d)雌性小鼠隨機分為6組，每組8只。乙醚麻醉下，按每只動物107pfu的劑量經肌肉注射、滴鼻和灌胃途徑三種不同的途徑分別用本發明的重組體腺病毒(rAd-LMP2)和野生型腺病毒(Ad5)免疫動物。第4周加強免疫一次。第6周采血并分離血清進行抗體檢測，然后處死動物分離脾細胞進行CTL活性分析。
(1)EBV-LMP2重組腺病毒誘發的小鼠LMP2特異性抗體生成使用P815-LMP2抗性細胞涂片作為陽性抗原片，以常規間接免疫熒光法檢測被免疫小鼠血清內抗LMP2特異性抗體的存在及其滴度。結果如下列表1中所示。
表1被免疫Balb/c小鼠血清中LMP2抗體的檢測
從表1所示的結果可以看出，無論使用何種給藥途徑，接種本發明的攜帶EB病毒LMP2蛋白之DNA編碼序列的復制缺陷型重組腺病毒均可誘導被免疫動物產生抗LMP2蛋白的特異性抗體反應。與經胃腸道途徑相比，似乎經非胃腸道途徑可獲得更好的免疫效果。
(2)EBV-LMP2重組腺病毒誘發的小鼠LMP2特異性CTL反應使用吸附了攜帶LMP2蛋白之DNA編碼序列的重組反轉錄病毒的正常同齡Balb/c(H-2d)小鼠脾淋巴細胞作為刺激細胞，使用被免疫小鼠的脾淋巴細胞作為效應細胞，并使用P815-LMP2抗性細胞作為靶細胞，以乳酸脫氫酶法檢測接種了本發明的重組腺病毒之小鼠的LMP2特異性細胞毒性淋巴細胞(CTL)活性(％殺傷率)。結果如下列表2中所示。
表2 免疫小鼠產生的LMP2特異性CTL平均活性(殺傷率％)
從表1圖5所示的結果可以看出，無論使用何種給藥途徑，接種本發明的攜帶EB病毒LMP2蛋白之DNA編碼序列的復制缺陷型重組腺病毒均可誘導被免疫動物產生CTL反應。效∶靶＝100∶1時，效應細胞對靶細胞的殺傷率約為30％～50％，顯然高于接種野生病毒的對照組。而且與經胃腸道途徑相比，似乎經非胃腸道途徑可獲得更好的免疫效果。
權利要求
1，一種復制缺陷型重組腺病毒，特征在于所說的病毒攜帶有編碼EB病毒潛伏膜蛋白2的DNA序列。
2，根據權利要求1的復制缺陷型重組腺病毒，其中所說的復制缺陷型重組腺病毒可在體內誘導EB病毒潛伏膜蛋白2特異性抗體生成反應和細胞毒性淋巴細胞反應。
3，生產如權利要求1限定的復制缺陷型重組腺病毒的方法，該方法包括(1)將編碼LMP2蛋白質的DNA序列克隆到適當的腺病毒穿梭質粒中，得到攜帶LMP2之DNA編碼序列的重組腺病毒穿梭質粒；(2)用步驟1的重組穿梭質粒和腺病毒骨架質粒共感染適當的宿主細胞；(3)在適當條件下使步驟2的重組穿梭質粒與腺病毒骨架質粒進行同源重組的，得到攜帶LMP2之DNA編碼序列的重組腺病毒載體；(4)將步驟3的重組腺病毒載體導入適當的腺病毒包裝細胞，得到所需的復制缺陷型重組腺病毒。
4，根據權利要求3的方法，其中所說的腺病毒穿梭質粒是質粒pShuttle-CMV。
5，根據權利要求3的方法，其中所說的腺病毒骨架質粒是質粒pAdEasy-1。
6，根據權利要求3的方法，其中所說的宿主細胞是大腸桿菌BJ5183。
7，根據權利要求3的方法，其中所說的腺病毒包裝細胞是293細胞。
8，如權利要求1限定的復制缺陷型重組腺病毒作為EB病毒相關腫瘤的治療性疫苗的應用。
9，根據權利要求8的應用，其中所說的疫苗的靶抗原是EB病毒的潛伏膜蛋白2。
10，根據權利要求8的應用，其中所說的復制缺陷型重組腺病毒可在體內誘導抗EB病毒潛伏膜蛋白2特異性抗體生成反應和特異性細胞毒性淋巴細胞反應。
全文摘要
本發明涉及復制缺陷型重組腺病毒，特別是涉及攜帶EB病毒潛伏膜蛋白2的DNA編碼序列的復制缺陷型重組腺病毒及其制備方法。本發明進一步涉及所說的復制缺陷型重組腺病毒或其組合物在生產用于預防和治療EB病毒相關腫瘤的疫苗中的應用。
文檔編號A61K39/235GK1548532SQ0312874
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月8日 優先權日2003年5月8日
發明者曾毅, 周玲, 左建民, 姚家偉, 王 琦, 曾 毅 申請人:曾毅, 曾 毅