專利名稱：預防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于家畜疾病預防與控制技術領域，具體涉及基因工程技術的應用，涉及制備產腸毒素的大腸桿菌K88ac菌毛抗原和特異菌毛抗原卵黃抗體，它們的制備方法以及卵黃抗體用于預防仔豬腹瀉，與仔豬的營養免疫有關。
背景技術：
大腸桿菌既是人和動物腸道中的正常寄居菌，又能夠引起疾病。在規模化養豬生產中，由大腸桿菌所引起的以仔豬腹瀉為主要癥狀的胃腸疾病所造成的經濟損失不容忽視。據報道，大腸桿菌引起的仔豬腹瀉的發病率和死亡率分別占我國整個仔豬瀉痢發病率和死亡率的56.2％和24.7％，給養豬業帶來了巨大的損失(施啟順，豬腸毒性大腸桿菌(ETEC)病抗病育種研究.國外畜牧科技，1999，26(4)51～54)。而腸道產腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起幼畜腹瀉為主要癥狀的胃腸疾病主要病原菌(Hampson.D.L.，Escherichia coil in domestic animals and humans.CAB.InternationalWallingford UK，pp629～647，1994)。我國豬、牛、羊等幼畜ETEC性腹瀉發生的比例分別為35％、26％和17％，死亡率為10％～30％(楊正時.，動物病原性大腸桿菌與大腸桿菌病。中國獸醫科技，1987(6)25～29)。豬源ETEC定居因子(colonization factor)或粘附素(adhesion)主要包括K88(F4)、K99(F5)、987P(F6)和F41，其中K88是主要致病因子。K88具有三種變異體K88ab、K88ac、K88ad。從武漢及其周邊地區規模化豬場采集的腹瀉仔豬糞樣，通過分子生物學方法進行鑒定，大腸桿菌K88占總數的9.3％，且均為K88ac變異體。
Yokoyama等首次進行用卵黃抗體控制仔豬大腸桿菌病，他們將提純的ETEC宿主特異性菌K88、K99和987P制成纖毛蛋白疫苗，胸部肌肉注射免疫產蛋母雞，抗體水平達到高效價后，收集雞蛋，分離和噴霧干燥卵黃抗體，對感染不同ETEC菌株的未吃乳初生仔豬進行卵黃抗體治療，結果顯示所有仔豬接受不同菌株感染后12小時內均發生腹瀉；用效價為625和2500的抗體治療仔豬全部存活，而對照組仔豬死亡率超過80％(Passive protective effect of chicken egg-yolk immunoglobulins against experimentalenterotoxigenic Escherichia coil infection in neonatal pigs.Infect Immun，1992，60998～1007)。Erhard等(Prophylactic effect of specific egg yolk antibodies in diarrhea of weaned piglets caused by Escherichia coil K88.J Vet Med A，1996，43217～223)、Imberechts等(chicken egg yolk antibodies against F18ab fimbriae ofEscherichia coil inhibit shedding of F18 positive E.coli by experimentally infected pigs.Vet.Microbiol.1997，54329-341)和Zuniga等(Reduced intestinal colonization with F18-positive Escherichia coil in weaned pigsfed chicken egg antibody against the fimbriae.FEMS.Immunology and Medical Microbiology，1997，18153-161)都進行了相關的研究均得到了類似的結論。胡子信等(雞抗豬大腸桿菌卵黃抗體的研制，中國畜禽傳染病，1994，226-27)用K88、K99、987P三價滅活苗試制了四批雞抗豬ETEC卵黃抗體，在北京近郊五個縣9個豬場近900頭仔豬中進行防治試驗。對于確診為大腸桿菌引起的仔豬黃痢，白痢的治療和預防有效率為100％(雞抗豬大腸桿菌卵黃抗體的研制，中國畜禽傳染病，1994，226-27)。
發明內容
本發明的目的是研制一種特異性卵黃抗體，它能預防由產腸毒素大腸桿菌K88ac引起的仔豬腹瀉。該抗體的制備具有產量高、特異性強、操作簡單、對環境無污染等優點，是一種綠色的抗生素替代品。
本發明通過以下技術方案實現一種預防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體，是將產腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichiacoli，ETEC)K88ac菌毛黏附素蛋白與弗氏佐劑混合制成特異免疫源，用該免疫源免疫健康開產母雞，并收集被免疫的雞所產的雞蛋，所述雞蛋蛋黃中含有預防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體。
制備預防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體的方法，其中制備特異免疫源的方法采用TSB液體培養基，37℃振蕩培養產腸毒素大腸桿菌K88ac菌株，18小時后，用60℃加熱-冰浴勻漿法及等電點連續沉淀法提取和純化菌毛黏附素蛋白，然后與弗氏佐劑混合而成。
所述的從特異免疫源免疫的健康產蛋母雞所產之雞蛋中，分離蛋黃，噴霧干燥制成卵黃粉，該雞蛋蛋黃中含有所述的能夠預防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體。
所述的免疫產蛋母雞的免疫步驟是在健康開產蛋雞胸肌兩側分別注射500μl濃度為400μg/ml的特異免疫原，2周后胸肌兩側再分別注射500μl濃度為600μg/ml的特異免疫原。
一種預防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體，它被作為抗生素的替代品應用于飼料，預防由產腸毒素大腸桿菌K88ac引起的仔豬腹瀉。
本發明的細節由下列步驟所示一、K88ac菌毛抗原的制備1.培養K88ac菌株、測定菌毛表達量產腸毒素大腸桿菌K88ac菌株(C83715(O8K88ac)購自中國獸藥監察所。菌株復活后，以1％的接種量分別接種于裝有300ml TSB培養基(即胰酶消化大豆肉湯培養基，參見房海主編，《大腸埃希氏菌》，河北科學技術出版社，1997，)培養基成分如下胰酪蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、氯化鈉5g、磷酸氫二鉀3.27g、葡萄糖2.5g，pH7.4，雙蒸餾水定溶至1000ml的三角瓶中，于37℃震蕩培養。每隔2小時取出3ml樣品于5倍稀釋后，在420nm處比色，記錄吸光值。培養18小時后，離心收取菌液，血球計數板顯微計數，調整菌液濃度為50億菌/毫升。采用甘露糖抵抗血凝反應(Mannose-resistant hemagglutination，MRHA)檢查黏附素表達情況。MRHA方法按房海主編，《大腸埃希氏菌》，河北科學技術出版社，1997，409～429報道的方法測定菌毛表達量，要求每1L菌液提取純黏附素蛋白1.0mg以上。
2.產腸毒素大腸桿菌K88ac菌毛抗原的提取和純化選擇復活的甘露糖抵抗血凝反應陽性K88ac菌株按0.5％的接種量接種于裝有500ml TSB(胰酶消化大豆肉湯)培養基的1000ml三角瓶中37℃震蕩培養18小時后，再按1％的接種量接種于裝有2500mlTSB培養基的5000ml三角瓶中37℃震蕩培養18小時。收集菌液，4℃離心(6,000×g)15分鐘，棄去上清，用適量PBS(磷酸緩沖液)懸浮菌苔。將細菌懸液置60℃水浴鍋內孵化30分鐘，間斷搖晃懸液；然后將菌液置于冰浴中低速勻漿5分鐘；在4℃下以14000×g離心15分鐘除去菌體，收集無菌體的上清液。
上清液經0.4um的濾膜過濾，在濾液中加入2.5％的檸檬酸調整pH值至4.0，在4℃下放置2小時或過夜，然后在4℃下以14000×g離心15分鐘取沉淀，重新懸浮于PBS1(磷酸緩沖液1)緩沖液中；上述步驟重復2-3次，最后將沉淀物溶解于1ml 0.1M PBS2(磷酸緩沖液2)中，用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)方法鑒定蛋白質純度。用總蛋白測定試劑盒(購自上海科欣生物技術研究所)測定蛋白質含量。純化后-20℃保存。
二、卵黃抗體的制備1.K88ac菌毛抗原的提取用接種環挑取K88ac MRHA陽性菌落接種于裝有10mlTSB培養基的50ml三角瓶，37℃震蕩培養18小時；分別取1ml培養液接種于6個裝有2500mlTSB培養基的5000ml三角瓶37℃震蕩培養18小時；重復批次培養，收集菌液，按Jin等(In vitro inhibition of adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli K88to pigletintestinal mucus by egg-yolk antibodies.FEMS Immunology and Medical Microbiology，1998 21(4)313-321)報道改進的方法提取和純化K88黏附素。用總蛋白測定試劑盒(購自上海科欣生物技術研究所)測定蛋白質含量。
2.無菌檢驗取上述提取菌毛液0.5ml接種于營養肉湯中37℃震蕩培養18小時觀察有無細菌生長。無細菌生長的K88ac菌毛懸液用于以下油乳疫苗的制備。
3.油乳疫苗的制備K88ac菌毛懸液與等體積的弗氏佐劑(弗氏完全佐劑購自Sigma公司，弗氏不完全佐劑購自北京鼎國生物技術發展中心)充分混合乳化成蛋白質濃度為400μg/ml和600μg/ml的油包水型油乳疫苗。
4.實驗動物和免疫在20周齡開產蛋雞胸肌兩側分別注射500μl濃度為400μg/ml的免疫原，22周齡胸肌兩側再分別注射500μl濃度為600μg/ml的免疫原。二免后一周開始收集雞蛋。
5.卵黃抗體效價的測定采用間接ELISA方法100μl K88ac黏附素(用包被液稀釋成15μg/ml)包被96孔聚乙烯板，4℃過夜(18h-24h)，棄去，用洗滌液沖洗3次，然后用150μl的稀釋液37℃包被1h，棄去，如前洗滌3次，每孔加入100μl卵黃液(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160……用PBSII稀釋)37℃包被1h，棄去，如前洗滌5次，每孔加入100μl鼠抗雞IgG辣根過氧化物酶(1∶15,000，洗滌液稀釋)25℃包被30min，棄去，如前洗滌5次，最后每孔加入100μl底物液，顯色后用50μl終止液終止反應。以顏色反應深于對照組判為陽性，并以出現陽性反應的最高稀釋度為抗體效價。
三、卵黃抗體應用效果的評價1.卵黃抗體體外抑制ETEC(產腸毒素大腸桿菌)K88ac黏附試驗□空腸上皮細胞的準備屠宰后30分鐘內取約50cm空腸，用37℃生理鹽水沖洗數次去除腸腔內容物，再用含1Mm二硫蘇糖醇的生理鹽水沖洗2次，然后灌入pH7.4的檸檬酸鈉緩沖液(Nacl96mM，Kcl 1.5mM，KH2PO48mM，Na2HPO45.6mM，檸檬酸鈉27mM)，在38℃下溫育10分鐘，再用pH7.4的EDTA溶液(1.5mM EDTA+PBS液)在38℃下溫育15分鐘，將收集的細胞離心5分鐘(900g)使細胞沉淀。再用pH7.4的PBS緩沖液(Nacl 130mM，Kcl 8.1mM，KH2PO41.5mM，Na2HPO48.1mM)沖洗兩次，最后將收集的細胞懸浮在PBS液(含0.2％葡萄糖，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素)中。血球計數板計數，調整細胞濃度為106個/ml。
□細菌培養物的制備細菌培養物經離心沉淀，用PBS洗滌兩次，沉淀物懸浮于PBS中，調節菌體濃度約為109個/ml。
□黏附試驗1ml上皮細胞懸液+1ml菌體細胞懸液，37℃作用30分鐘，取一小滴制成壓滴標本片，于顯微鏡下觀察。記錄20個上皮細胞上吸附的總菌數，計算平均每個細胞黏附的細菌數，上述試驗重復三次。
□卵黃抗體體外抑制黏附試驗將1ml菌液與1ml卵黃抗體混合(效價11280)，37℃作用30分鐘，再加入1ml上皮細胞懸液，37℃作用30分鐘，如前觀察，記錄結果，上述試驗重復三次。
2.預防斷奶仔豬腹瀉試驗選擇30±2日齡斷奶仔豬120頭，按血緣、體重、胎次、日齡等相對一致的原則隨機分成4組，每組30頭。日糧中分別給予0％、0.5％、1％、2％的噴霧干燥卵黃粉。試驗結束后添加1％的卵黃抗體粉雖然對仔豬的生長性能有較顯著影響(p＝0.059)，但顯著降低了料肉比和腹瀉率(p＜0.05)，同時對仔豬的后期生長有一定促進作用。
圖1是本發明的工藝流程圖。
具體實施例方式
實施例1制備產腸毒素大腸桿菌K88ac菌毛抗原一、材料與方法1.1.菌株K88ac菌株購自中國農科院獸藥監察所1.2.培養基和試劑TSB培養基(pH7.4)胰酪蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、氯化鈉5g、磷酸氫二鉀3.27g、葡萄糖2.5g。雙蒸餾水定溶至1000ml；緩沖液PBS1(pH 7.2)NaCL 10g、KH2PO40.25g、Na2HPO412H2O 3.58g、KCL 0.25g，雙蒸餾水定溶至1000ml；0.1M緩沖液PBS2(pH7.2)NaH2PO42H2O 4.37g、Na2HPO412H2O 25.81g，雙蒸餾水定溶至1000ml；1.3產腸毒素大腸桿菌K88ac菌株菌毛黏附素表達效果的測定菌株復活后，以1％的接種量分別接種于裝有300ml TSB培養基的1000ml三角瓶，于37℃震蕩培養。每隔2小時取出3ml樣品于5倍稀釋后，在420nm處比色，記錄吸光值。培養18小時后，離心收取菌液，血球計數板顯微計數，調整菌液濃度為50億菌/毫升。采用甘露糖抵抗血凝反應(Mannose-resistanthemagglutination，MRHA)檢查黏附素表達情況。MRHA方法按房海(大腸埃希氏菌。河北科學技術出版社，1997，409～429)報道方法測定菌毛表達量，要求每1L菌液提取純黏附素蛋白1.0mg以上。
2.產腸毒素大腸桿菌K88ac菌毛抗原的提取和純化選擇復活的甘露糖抵抗血凝反應陽性K88ac菌株按0.5％的接種量接種于裝有500mlTSB培養基的1000ml三角瓶中37℃震蕩培養18小時后，再按1％的接種量接種于裝有2500mlTSB培養基的5000ml三角瓶中37℃震蕩培養18小時。收集菌液，4℃離心(6,000×g)15分鐘，棄去上清，用適量PBS懸浮菌苔。將細菌懸液置60℃水浴鍋內孵化30分鐘，間斷搖晃懸液；然后將菌液置于冰浴中低速勻漿5分鐘；在4℃下以14000×g離心15分鐘除去菌體，收集無菌體的上清液。
上清液經0.4um的濾膜過濾，在濾液中加入2.5％的檸檬酸調整pH值至4.0，在4℃下放置2小時或過夜，然后在4℃下以14000×g離心15分鐘取沉淀，重新懸浮于PBS1緩沖液中；上述步驟重復2-3次，最后沉淀物溶解于1ml 0.1M PBS2中，用SDS-PAGE鑒定蛋白質純度。雙縮脲法測定蛋白質含量，-20℃保存。
二、實施效果在振蕩培養條件下，K88ac在接種后4-6小時進入對數生長期，16-20小時結束；培養18小時后收集的菌體其菌毛血凝效價為26。
采用TSB液體培養基振蕩培養18小時，用60℃加熱與冰浴勻漿法及等電點連續沉淀法提取、純化菌毛蛋白，從2.5毫升的菌液中提取純化的菌毛蛋白3.75毫克，平均一毫升菌液收獲純菌毛蛋白1.5毫克。
實施例2制備抗產腸毒素大腸桿菌K88ac特異菌毛抗原卵黃抗體1.1試劑弗氏完全佐劑購自Sigma公司弗氏不完全佐劑購自北京鼎國生物技術發展中心0.02 MPBS(pH7.4)Nacl8g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、Kcl 0.2g，雙蒸水定溶至500ml；
0.01 MPBS(pH7.4)Nacl8g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O2.9g、Kcl0.2g，雙蒸水定溶至1000ml；包被液0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6，NaHCO32.93g、Na2CO31.95g，雙蒸水定溶至1000ml)；洗滌液(PBS-T)含0.05％吐溫-20的0.01MPBS；稀釋液(PBS-BSA含3％牛血清白蛋白的0.01 MPBS；底物液鄰苯二胺40mg，溶于pH5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(0.2MNa2HPO4(28.4g/l)51.4ml，0.1M檸檬酸(19.2g/l)48.6ml，加雙蒸餾水100ml混勻)100ml，在加入30％H2O20.15ml即可，現配現用。
終止液2M H2SO4溶液(濃硫酸22.2ml，蒸餾水177.8ml，混勻即可)1.2K88ac菌毛抗原的提取用接種環挑取K88acMRHA陽性菌落接種于裝有10mlTSB培養基的50ml三角瓶，37℃震蕩培養18小時；分別取1ml培養液接種于6個裝有2500mlTSB培養基的5000ml三角瓶37℃震蕩培養18小時；重復批次培養，收集菌液，按Jin等(In vitro inhibition of adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli K88to pigletintestinal mucus by egg-yolk antibodies.FEMS Immunology and Medical Microbiology，1998 21(4)313-321)報道改進的方法提取和純化K88黏附素。用總蛋白測定試劑盒(購自上海科欣生物技術研究所)測定蛋白質含量。
1.3無菌檢驗取上述提取菌毛液0.5ml接種于營養肉湯中37℃震蕩培養18小時觀察有無細菌生長。無細菌生長的K88ac菌毛懸液進行油乳疫苗的制備1.4油乳疫苗的制備K88ac菌毛懸液與等體積的弗氏佐劑(弗氏完全佐劑購自Sigma公司，弗氏不完全佐劑購自北京鼎國生物技術發展中心)充分混合乳化成蛋白質濃度為400μg/ml和600μg/ml的油包水型油乳疫苗。
1.5實驗動物和免疫20周齡開產蛋雞胸肌兩側分別注射500μl濃度為400μg/ml的免疫原，22周齡胸肌兩側再分別注射500μl濃度為600μg/ml的免疫原。二免后一周開始收集雞蛋。
1.6卵黃抗體效價的測定采用間接ELISA方法100ulK88ac黏附素(用包被液稀釋成15μg/ml)包被96孔聚乙烯板，4℃過夜(18h-24h)，棄去，用洗滌液沖洗3次，然后用150μl的稀釋液37℃包被1h，棄去，如前洗滌3次，每孔加入100μl卵黃液，用PBSII稀釋(稀釋倍數1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160……)，37℃包被1h，棄去，如前洗滌5次，每孔加入100μl鼠抗雞IgG辣根過氧化物酶(1∶15,000，洗滌液稀釋)25℃包被30min，棄去，如前洗滌5次，最后每孔加入100μl底物液，顯色后用50μl終止液終止反應。以顏色反應深于對照組判為陽性，并以出現陽性反應的最高稀釋度為抗體效價。
實施例3卵黃抗體應用效果的評價一、材料與方法1.卵黃抗體體外抑制ETEC K88ac黏附試驗
1.1空腸上皮細胞的準備屠宰后30分鐘內取約50cm空腸，用37℃生理鹽水沖洗數次去除腸腔內容物，再用含1Mm二硫蘇糖醇(DTT)的生理鹽水沖洗2次，然后灌入pH7.4的檸檬酸鈉緩沖液(Nacl 96mM，Kcl1.5mM，KH2PO48mM，Na2HPO45.6mM，檸檬酸鈉27mM)，在38℃下溫育10分鐘，再用pH7.4的EDTA溶液(1.5mM EDTA+PBS液)在38℃下溫育15分鐘，將收集的細胞離心5分鐘(900g)使細胞沉淀。再用pH7.4的PBS緩沖液(Nacl 130mM，Kcl 8.1mM，KH2PO41.5mM，Na2HPO48.1mM)沖洗兩次，最后將收集的細胞懸浮在PBS液(含0.2％葡萄糖，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素)中。血球計數板計數，調整細胞濃度為106個/ml1.2細菌培養物的制備細菌培養物經離心沉淀，用PBS洗滌兩次，沉淀物懸浮于PBS中，調節菌體濃度約為109個/ml1.3黏附試驗1ml上皮細胞懸液+1ml菌體細胞懸液，37℃作用30分鐘，取一小滴制成壓滴標本片，于顯微鏡下觀察。記錄20個上皮細胞上吸附的總菌數，計算平均每個細胞黏附的細菌數，上述試驗重復三次。
1.4卵黃抗體體外抑制黏附試驗將1ml菌液與1ml卵黃抗體混合(效價11280)，37℃作用30分鐘，再加入1ml上皮細胞懸液，37℃作用30分鐘，如前觀察，記錄結果，上述試驗重復三次。
3.預防斷奶仔豬腹瀉試驗4.2.1試豬的選擇和分組選擇30±2日齡斷奶仔豬120頭，按血緣、體重、胎次、日齡等相對一致的原則隨機分成4組，每組30頭，每組分三欄飼養。
2.2試驗設計和試驗日糧組成試驗采用單因子設計。對照組用商品日糧，在基礎配方中分別添加0.5％、1％、2％的噴霧干燥卵黃粉形成試驗一組、試驗二組和三組的試驗日糧。
2.3飼養管理飲水器自由飲水，干粉料自由采食，日喂4次，次日晨稱剩余料，按欄統計料量。閹割、防疫注射等其他管理照常規進行。病程超過3天，程度嚴重不能繼續參加試驗的豬及時退出試驗，并扣除其耗料量。
2.4稱重仔豬斷奶重作為入試重，斷奶后14天和21天，逐頭空腹稱重1次，共稱重3次。
2.5腹瀉情況每日晨記錄仔豬糞便狀況，按干、軟、稀、水樣分成0、1、2、3四級記錄。統計時干便及軟便為正常，稀便和水樣便記為腹瀉。
2.6.數據處理和分析對平均日增重、采食量和料肉比進行方差分析，腹瀉率用卡方檢驗二、結果與分析1卵黃抗體對細菌體外細胞黏附的抑制作用從表1可以看出在K88ac體外細胞黏附試驗中，平均每個上皮細胞黏附16.4個K88ac；在卵黃抗體抑制黏附試驗中，抗體效價分別為640和1280的卵黃抗體較對照組均極顯著抑制了K88ac對腸上皮細胞的黏附作用，平均每個上皮細胞僅黏附8.5和2.4個細菌(p＜0.01)，二者之間也存在極顯著差異(p＜0.01)。抗體效價為320的抗體組相對對照組有一定抑制細菌粘附作用，但差異不顯著(p＝0.15)。
表1卵黃抗體對細菌體外細胞黏附的抑制作用抗K88ac抗體滴度 黏附細菌數0 16.4±9.6aA32013.7±7.4aAB6408.5±5.7bB1280 2.4±1.1C2卵黃抗體對斷奶仔豬腹瀉情況的影響從表2可以看出，試驗二組和試驗三組腹瀉頭數和頭次數均低于對照組和試驗一組；相對對照組和試驗一組，試驗二組和試驗三組的腹瀉率極顯著降低(p＜0.01)，對照組和試驗一組，試驗二組和試驗三組之間腹瀉率差異不顯著(p＞0.05)。
表2試驗期各組腹瀉情況組別豬頭數腹瀉頭次腹瀉率對照組28 54(22*)13.8％A1 28 48(21) 12.2％A2 28 20(14) 5.1％B3 28 26(14) 6.7％B*括號內數字為發生過腹瀉的仔豬數3卵黃抗體對斷奶仔豬生長性能的影響3.1.卵黃抗體對斷奶仔豬平均日增重的影響從表3中可以看出，在整個試驗期中，各組平均日增重均沒有顯著差異；但試驗后期試驗二組相對對照組、試驗一組和試驗三組平均日增重均有一定的改善作用(p＝0.078，p＝0.059，p＝0.132)。
表3試驗期各組平均日增重(g/d)斷奶后階段組別豬頭數前期后期全期對照 28306.2±62.4 469.2±108.4385.4±56.51 28290.8±50.6 466.4±92.2 378.6±49.12 28295.1±73.9 522.1±80.4 409.5±61.23 28291.6±51.4 476.9±105.6384.3±67.33.2卵黃抗體對斷奶仔豬平均采食量的影響從表4中可以看出，無論是試驗前期、后期或全期，各組平均采食量均無顯著差異，但隨著卵黃抗體添加量的增加，平均采食量有遞減趨勢。在試驗后期，試驗三組相對對照組和試驗一組有明顯減少(p＝0.071，p＝0.195)。
表4試驗期各組平均采食量(g/d)斷奶后階段組別豬頭數前期 后期 全期對照28 35.5±45.8 873.1±78.3646.9±53.61 28 433.0±50.3845.5±44.9639.3±47.62 28 429.1±38.8797.3±18.8618.7±22.33 28 411.0±11.7787.1±41.4597.5±22.42.3.卵黃抗體對斷奶仔豬料肉比的影響從表5中可以看出，試驗各組試驗前期(斷奶后兩周)料肉比無顯著差異；但從試驗后期和試驗全期來看，試驗二組和試驗三組相對其他兩組料肉比均均顯著降低(其中試驗二組達到極顯著水平(p＜0.01)。
表5試驗期各組料肉比斷奶后階段組別豬頭數前期 后期全期對照28 1.40±0.071.82±0.04aA1.70±0.02A1 28 1.48±0.061.80±0.05aAC 1.71±0.05A2 28 1.40±0.151.54±0.05bB1.51±0.03aB3 28 1.47±0.171.68±0.06bC1.60±0.05bB
權利要求
1.一種預防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體，其特征是將產腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC)K88ac菌毛黏附素蛋白與弗氏佐劑混合制成特異免疫源，用該免疫源免疫健康開產母雞，并收集被免疫的雞所產的雞蛋，所述雞蛋蛋黃中含有預防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體。
2.實現權利要求1產品的方法，其特征在于制備特異免疫源的方法采用TSB液體培養基，37℃振蕩培養產腸毒素大腸桿菌K88ac菌株，18小時后，用60℃加熱-冰浴勻漿法及等電點連續沉淀法提取和純化菌毛黏附素蛋白，然后與弗氏佐劑混合而成。
3.權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的從特異免疫源免疫的健康產蛋母雞所產之雞蛋中，分離蛋黃，噴霧干燥制成卵黃粉，該雞蛋蛋黃中含有所述的能夠預防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體。
4.權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的免疫產蛋母雞的免疫步驟是在健康開產蛋雞胸肌兩側分別注射500μl濃度為400μg/ml的特異免疫原，2周后胸肌兩側再分別注射500μl濃度為600μg/ml的特異免疫原。
5.一種預防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體其特征在于，作為抗生素的替代品應用于飼料，預防由產腸毒素大腸桿菌K88ac引起的仔豬腹瀉。
全文摘要
本發明涉及預防仔豬腹瀉的特異性卵黃抗體及其制備方法與應用。采用TSB液體培養基培養菌株和純化獲得特異菌毛黏附素蛋白，與弗氏佐劑混合制成免疫源，將該免疫原免疫產蛋雞，獲得了預防仔豬腹瀉的K88ac特異性卵黃抗體。使用本發明的卵黃抗體能極顯著地抑制了產腸毒素大腸桿菌K88ac對腸上皮細胞的黏附作用(p＜0.01)；添加1％的卵黃抗體粉能顯著地降低了仔豬的料肉比和腹瀉率(p＜0.05)，同時對仔豬的生長有一定促進作用。
文檔編號A61P31/04GK1569895SQ03128310
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月11日 優先權日2003年7月11日
發明者彭健, 程學慧, 蔣思文, 詹志春 申請人:華中農業大學