重組人糖原磷酸化酶同工酶bb和應用甲醇酵母制備的方法及其應用的制作方法

專利名稱：重組人糖原磷酸化酶同工酶bb和應用甲醇酵母制備的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種應用DNA技術生產基因工程蛋白藥物，尤其是設計一種應用甲醇酵母生產重組人糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)及其生產方法和它的應用。
背景技術：
心血管病已成為國人首要死因之一，尤其是對高節奏工作的中老年人造成嚴重威脅，其中病死率最高的是急性心肌梗死(AMI)。AMI致死的重要原因是早期診斷困難而延誤了治療時期。盡管目前心電圖(ECG)檢查及血清酶學檢測可以診斷AMI，但仍有50％的AMI因不具備典型癥狀，或ECG和血清酶檢測無典型變化，在AMI發作的早期被漏診而失掉搶救時機。臨床生化學家一直不斷尋找靈敏特異的心肌損傷指標。糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase)已知有三種主要同工酶，即GPBB(腦，心肌型)，GPMM(肌型)，GPLL(肝型)。GPBB除腦細胞外，大量存于心肌細胞中。近年發現GPBB是AMI早期診斷新的靈敏特異指際，與其它目前臨床應用的心肌標記物(如CK-MB、cTnT、cTnI，肌紅蛋白等)比較，GPBB更具特異性和高敏感性。如AMI發作時，患者出現胸痛癥狀后，2-4小時內，GPBB即在外圍血中明顯增高，較其它心肌標記物更早出現且更敏感。GPBB還有助于不穩定心絞痛、冠狀動脈搭橋術(CABG)并發癥的早期診斷，尤其對于CABG并發癥更是目前唯一早期增高的生化指際。現已證實GPBB對病人的病情發展過程即隨診和予后判斷均有重要意義，具有良好的臨床應用價值。
GPBB作為糖原分解的關鍵酶，是心肌細胞中肌漿網結構(SR)中糖原分解復合物的特定成分，而這種復合物的結合和分解取決于心肌的氧及血液供給狀態。正常條件下，糖原磷酸化酶復合物與SR牢固結合，不易分解。但當心肌細胞缺血，缺氧時，這種糖原分解的關鍵酶GPBB即可加速其分解過程。糖原降解過程可被GPa(同工酶的磷酸化活性形式)和GPb(非磷酸化活性形式)及AMP依賴形式所共同催化。缺血發生后，有利于結合型GPb向GPa轉化(非活性型向活性型轉化)，從而加速糖原分解過程，亦是使GP成為可溶性二聚體的先決條件。GPBB的釋放依賴于糖原的降解，繼而隨著缺血伴有的細胞膜通透性改變，大量釋放入血液中。這就是AMI時GPBB快速釋放入血的主要機理。此外，心肌細胞缺氧、缺血時，可影響線粒體內呼吸鏈酶系的活性，各種遞氫體所帶的氫不能通過呼吸鏈氧化成水，也使氧化磷酸化進程受到影響，心肌細胞內ATP的生成大為減少，而ADP與無機磷酸鹽增多。但心肌活動仍繼續消耗ATP，因而高能磷酸化合物的儲備急劇減少。ADP與無機磷酸鹽增多，將促進磷酸化酶的活性，于是心肌細胞內糖原分解和利用加速，導致GPBB加速釋放入血，使血漿GPBB合量急劇增加。從人類心臟組織中直接分離到高度純化GPBB的實驗技術并不復雜，但心臟組織來源有限，所以該蛋白成品(天然抗原)的價格昂貴，無法應用于臨床實際。aGPBB這種新型診斷試劑，迄今國內外尚無相關報道和相應的新產品上市。

發明內容
本發明解決了現有技術對AMI不能做到快速、準確、低成本、廣譜的早期診斷的缺陷，提供一種對AMI的早期診斷具有敏感性和特異性，且使用成本低的應用甲醇酵母生產的重組人糖原磷酸化酶同工酶BB及其生產方法和它的應用。
本發明的技術方案如下本發明應用DNA技術生產基因工程蛋白藥物，尤其是應用甲醇酵母生產重組人糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)免疫顯性片段的步驟如下①按酵母嗜好的密碼子人工合成糖原磷酸化酶同工酶BB免疫顯性片段的編碼基因，融合于酵母表達調控元件，構建甲醇酵母高表達工程菌；②甲醇酵母工程菌高密度發酵表達；③采用超濾、葡剩糖凝膠層析、離子梯度凝膠層析等純化技術的順序組合，純化回收GPBB；④應用該蛋白質產生抗GPBB抗體。
基因工程和微生物工程技術的興起為合成和生產外源蛋白展示出廣闊的前景。本發明采用真核表達系統甲醇酵母(Pichia pastoris巴斯德畢赤酵母，Pp)來表達該蛋白。Pp是近年發展起來的新一代酵母表達系統，較其它蛋白表達系統如大腸桿菌表達系統、昆蟲細胞和哺乳動物細胞表達系統等，均有明顯的優點(1)具有強有力的乙醇氧化酶基因(AOX1)啟動子，可高效嚴格調控外源蛋白的表達；(2)作為真核表達系統，可對表達的蛋白進行翻譯后的加工和修飾，從而使表達出的蛋白具有很高的生物活性；(3)表達量高，可高密度發酵培養，且營養要求低，生長快，培養基廉價便于工業化生產；(4)表達的蛋白可分泌至胞外，而Pp自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有利于純化；(5)糖基化程度適當，對人體無明顯的抗原性，適合于臨床治療用途。因此，本發明從cDNA文庫中篩選出GPBB序列，并針對其是真核蛋白(全長約2.5Kb)，選擇采用Pp表達系統。為了更高效表達該目的蛋白，選擇其分布在細胞外靠近C末端的區域即免疫顯性片段(即編碼具免疫原性GPBB的核苷酸序列，約占120bp)，再根據酵母基因使用密碼子的嗜好性，定點突變重新構建該片段的序列，直接人工合成這個目的基因，并克隆到分泌型表達載體質粒pPIC9K多克隆位點上構建成重組表達載體質粒；再制備成能分泌具免疫原性GPBB的更高效表達的基因工程酵母菌株，高密度培養該菌株，純化并得到重組蛋白質。


圖1為GPBB基因優化設計圖。
圖2為核苷酸序列和氨基酸序列圖譜；其中(a)為核苷酸序列，(b)為氨基酸序列。
圖3為基因合成的電泳圖譜；其中1為148bp基因，2為PGEM 7Z Marker。
具體實施例方式酵母密碼子的嗜好性與基因表達量相關，即在酵母中表達量較高的基因往往采用的是酵母所偏愛的密碼子。有研究表明在用甲醇酵母表達植酸酶時，把在酵母中使用頻率為零的精氨酸密碼子突變為使用頻率較高的密碼子，表達水平提高了37倍。為了使GPBB免疫顯性片段在甲醇酵母中的更高效表達，本發明在人工合成DNA時將GPBB基因序列進行優化設計，如圖1、2所示把酵母中使用頻率較低的密碼子改變為酵母喜愛的密碼子，同時考慮整個基因序列C+G/A+T比例平衡，避免產生后續克隆操作時需要的酶切位點。然后將突變后的GPBB片段克隆到分泌型表達載體質粒pPIC9K多克隆位點上，構建人GPBB的表達載體質粒。本發明所指的基因序列設計還可以有許多變動和延伸，而不僅限于圖1所示序列。將人工合成的序列連接在載體的方法是本領域專業人員所熟悉的。
本發明所指的甲醇酵母表達載體質粒特指穿梭型質粒，它包括以下各種元件(1)大腸桿菌來源的質粒復制元件，如Co1E1。
(2)大腸桿菌篩選標記，如Amplcillin抗性基因(Amp)。
(3)甲醇酵母表達調控元件，特別是指可誘導表達調控元件。如甲醇酵母來源的AOX1基因啟動子5’AOX1、轉錄終止子(TT)3’AOX1。
(4)甲醇酵母分泌表達信號α因子(MFα)信號肽。
(5)多克隆位點。
(6)甲醇酵母篩選標記如酵母HiS4基因，Kanamycin抗性基因。
(7)能在甲醇酵母染色體特異位點上重組整合的特異序列，如AOX1的5’、3’序列，HIS4的5’、3’序列。
(8)其它來源于大腸桿菌和酵母的連接片段。
外源基因轉化酵母細胞可以用電轉化方法、原生質體轉化方法等。表達質粒轉化大腸桿菌受體菌DH5、GS115和KM71等，篩選陽性克隆子，用于保持、擴增質粒以及用于酶切、測序等分析檢測。
篩選高拷貝數轉化子。轉化過程有時會產生多拷貝的整合，一般占轉化子的1％-10％。這是因為一個拷貝整合到染色體上以后，整合位點依然存在，則另外的拷貝又可整合上去。在一般情況下，甲醇酵母中外源基因的拷貝數越高，則表達量越大。多拷貝常產生非常高的表達量。而篩選確定高拷貝數菌株的方法中，利用表達載體帶有卡那霉素(kanamycin)抗性基因，在酵母中表現為G418抗性，而非卡那霉素抗性的特點，設計出一套快速簡便的篩選高拷貝的方法，其作用是可以用含有梯度濃度的G418的YPD-G418板篩選多拷貝轉化子。
工程菌進行發酵生產。外源蛋白在酵母中的表達分兩步，即菌體生長和蛋白誘導表達。第一階段，先在以甘油為碳源的培養基上培養菌體，達到一定OD值后(詳見實施例)，此為菌種生長階段。第二階段，甲醇誘導蛋白表達。離心棄上清，菌體懸浮于以甲醇為碳源的培養基中誘導表達，每隔一定時間加一次甲醇，以彌補甲醇的消耗。具體表達條件如通氣狀況、pH值、培養基的組成等詳見實施例。
發酵結束后除去細菌體，收集上清液。甲醇酵母為分泌表達，目的蛋白質出現在上清液中。去除細菌可采用離心、壓濾、超濾等方法。上清經超濾脫鹽、濃縮后即可進行純化工作。
目的蛋白質純化可采用離子交換層析、疏水層析、分子篩層析、親和層析等方法，以親和層析所得到的蛋白質純度最高。濃縮后目的蛋白質在上清液中濃度較高，可以采用親和層析方法純化GPBB。但是采用其它方法純化目的蛋白質也是本領域技術人員所熟悉。
以下通過非限定性的實施例對本發明進一步的說明。
實施例一一、重組GPBB工程菌的構建1.目的基因人工合成和重組表達載體的構建選用酵母偏愛的密碼子改造人GPBB基因。所改造的GPBB基因可以是其全部或者部分，在實際改造時，對其優化，我們選擇GPBB與其它幾個同工酶不同源，但是免疫顯性片段部分進行改造。
為方便操作，在目的基因兩端加上EcoR I酶切位點。其核酸和氨基酸序列見圖1。將人工合成基因以EcoRI酶切處理，體外連接到同樣酶切處理的甲醇酵母表達質粒pPIC9K，構建成GPBB重組表達質粒，見圖2，〔圖2中的圖(a)中的黑體字母部分為rGPBB末端保守序列，其余部分為添加的便于處理的基因序列〕。重組質粒轉化大腸桿菌受體菌DH5α，經酶切、PCR、DNA測序等驗證過程，從中篩選一個結構完全正確的轉化子GP1，擴增并提取GP1的重組質粒pPIC9K-GP1(如圖3所示)。
2、工程菌株的制備將5-10微克的重組質粒pPIC9K-GP1體外以Sal I酶切線性化，電轉化法轉化甲醇酵母受體菌GS115。用MD平板篩選His4+轉化子，從中篩選多拷貝整合轉化子；1轉化子細胞分別涂板到含0.5、1、2、4、8或16mg/mlG418的YPD平板，在16mg/mlG418的YPD平板上篩選到3個克隆；RGP1。
其具體步驟如下(I)轉化DNA的制備(用堿性溶菌小量制備法抽提質粒DNA)①從過夜培養的菌液中取1.5ml于1.5ml離心管中，12000×g離心1分鐘，棄去上清。
②加100μl溶液I使沉淀重懸于溶液I中。
③加200μl溶液II劇烈振蕩5次，置冰上3min。
④加150μl溶液III溫和振蕩5次，置冰上10～30min⑤離心5min后去上青400μl于新的1.5ml離心管。
⑥加1ml 95％乙醇并混勻離心15min。
⑦倒去乙醇用1.5ml 70％乙醇洗滌冰風干。
⑧將所得的DNA溶于20～100μl水或TE中。
(II)質粒DNA的線性化①用Sac I酶消化處理質粒pPIC9K-rGP和表達載體pPIC9K。
②用瓊脂凝膠電泳來分析一小段消化產物來檢驗是否完全消化③用25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶異戊醇抽提消化產物并用乙醇沉淀消化的DNA。
④將DNA溶解于10～20μl的TE緩沖液中，保存于-20℃中備轉化用。
(III)酵母細胞制備①500ml三角瓶，加入100μ1新鮮YPD培養液，分別接種100～500μl取三個GS115、KM71和SMD1168，培養過夜，直至OD＝1.3-1.5②在4℃，離心力為1500×g下，離心細胞5min。
③用200ml冰無菌水重懸沉淀。
④重復步驟②用100ml冰無菌水重懸淀淀⑤重復步驟②用20ml 1M冰山梨醇重懸沉淀⑥重復步驟②用0.3ml 1M冰山梨醇重懸沉淀直至體積約為0.5ml。
(IV)電轉化①取上述細胞80μl和5～20μg的溶解于TE緩沖液中的線性DNA混合，將它們轉移到0.2cm冰預冷過的電穿孔小杯中。
②讓小杯中的細胞在冰上孵化5min。
③根據Bio-Rad Gene Pulser公司提供的參數充電電壓1500V，電容25μF，電阻200Ω來電擊細胞。
④立即往小杯中加入1ml 1M冰山梨醇，轉移電擊后的產物于無菌的1.5ml離心管中。
⑤將其分成200～600ul等分涂布于MD板上。
(V)篩選多拷貝①在|MD板上加1～2ml無菌水，用涂布棒將所有酵母菌落溶于水中。
②測其OD600值(1 OD60＝5×10 7個細胞/ml)。
③稀釋上述菌液，分別取約105個細胞涂布于2.0、3.0的YPD-G418板上。
④將YPD-G418板置于30℃烘箱中培養，G418耐受菌將在2～5天出現。
⑤挑取G418耐受菌，純化，并用30％甘油冷凍保存。
(VD PCR篩選甲醇酵母克隆根據Linder et al(1996)應用PCR簡單直接的檢驗酵母的克隆。
①取10μl酵母液于1.5ml離心管。
③加5μl的5U/μl溶菌酶，并在35℃孵育10min。
③-80℃冰凍樣品10min。
④建立50微升熱啟動PCR體系10×反應緩沖液 5μl25mM MgCl25μl25mM dNTP 1μl5′AOX1引物(10pmo1/μl)1μl3′AOX1引物(10pmol/μl)1μl無菌水 31.5μl細胞裂解液 5μl5U/μl Taq酶 0.5μl總體積 50μl混勻置于PCR儀95℃溫育5min(加入0.5μl的5U/μl Taq酶)進行如下30循環95℃變性 1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，最終72℃延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳分析。
3、搖瓶表達在50ml離心管中倒入10mlBMGY培養液，挑取3.0YPD-G418板上的單克隆。在28～30℃搖床中培養，直至OD600＝2-6(大約16～18小時)。在4℃，離心力為1500g，離心9分鐘。去上清，加入10ml BMGY+1％CA(酷氮氨基酸)培養液，重懸后繼續培養8小時后，同前離心(離心條件4℃，離心力為1500g，離心9分鐘)，去上清，加入10ml BMMY+1％CA培養液，重懸后繼續培養。每培養24小時，往50ml離心管中添加5微升100％甲醇，保持誘導。培養5天后取出，同前離心(離心條件4℃，離心力為1500離心力為1500×g下，離心9分鐘)，去沉淀，在-80℃儲存上清，直至準備測定。
各種培養基配方YPD培養液(1L)10g yeast extract+20g trypton+20g agar+900ml H2O(高壓滅菌)10×D 20g葡萄糖+100ml H2O(高壓滅菌)混合搖勻。YPD-G418板配YPD 20ml，高壓滅菌，若濃度為2.0，加入0.4ml G418，若濃度為3.0，加入0.6ml G418，立即倒平板。MD板(1L)15g agar+H2O 800ml，高壓滅菌，冷卻至60℃左右，加入用濾膜過濾滅菌的100ml 10×YNB、2ml500×B、100ml 10×D，立即倒板，密封好，可在4℃保存幾個月。
BMGY和BMMY培養液取10g酵母提取物，20g胰蛋白胨于700ml水中，高壓滅菌。冷卻至室溫后加入100ml 1MpH＝6.0磷酸緩沖液、100ml 10×YNB及2ml 500×B。
若配制BMGY，加入100ml 10×G，若配制BMMY，則加入100ml 10×M，4℃保存。
LB培養液(1L)5g酵母提取物+10g trypton+10g NaCl，加水至1000ml，高壓滅菌。
實施例二高密度表達rGPBB將保存的RGP1于平板上活化，轉接于YPD液體培養基，30℃、300rpm振蕩培養至OD600＝20作為種子液上發酵罐。
發酵培養基為半合成培養基，配方如下六偏磷酸鈉25g/L，CaSO4·2H2O 176g/L，K2SO418.2g/L，MgSO47.28g/L，EDTA0.925g/L，甘油40g/L，PTMI 4.35ml/L，(NH4)2SO49g/L，泡敵0.02％。
其中PTMI的配方為CuSO4·5H2O 6g/L，NaI 0.08g/L，MnSO4·2H2O 3g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，硼酸0.02g/L，CoCl30.5g/L，ZnCl220g/L，FeSO4·7H2O 65g/L，生物素 0.2g/L，硫酸5ml。
發酵過程采用二步生長法。起始生長以甘油為碳源，溫度30℃，pH5、0，空氣流量為30L/分鐘，溶氧40％，經過18～24小時培養，菌濃度達到OD600＝100，補甘油約4小時，甘油補液濃度500g/L，補液速度2ml/分鐘，同時設定pH在4小時內降至pH3，補料完畢菌濃度為OD600＝160，此為甘油批培養階段。誘導表達階段，甲醇補料至濃度為0.5％～5％，溶氧控制為30％，誘導至54小時以上表達到達最高峰，放罐，此菌濃度OD600≥300。
菌體生長曲線及誘導表達曲線見圖。
實施例三rGPPP純化離心收集發酵上清，或以30000～50000截留量的超濾膜收集發酵上清。上清經1000～10000截留量的外壓式中空纖維柱超濾濃縮、脫鹽。濃縮上清直接經親和層析純化。應用固相化的抗體(抗GPBB抗體)，通過常規的一步法可將GPBB純化1000～10000倍。該方法可分為三個主要步驟①抗體的固相化；③抗原與含抗體的介質結合；③洗脫抗原。
(I)基質固相化抗體的制備①抗體溶液對0.1mol/L pH7.4磷酸緩沖液透析，4℃，過夜；②將20ml濕潤的凝膠小珠移入燒結玻璃漏斗；用3～5個柱體積的重蒸餾水洗，然后再以0.1mol/L pH7.4磷酸緩沖液洗兩次；③將凝膠移入適當的燒杯中，在通風櫥內，分別加入50ml重蒸餾水，10ml 1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)，及20ml 25％戊二醛；④燒杯加蓋，放入37℃恒溫振蕩器中，緩慢振蕩過夜；⑤將凝膠轉移到燒結玻璃漏斗中，用20～40倍于凝膠體積的0.1mol/L pH7.4磷酸緩沖液充分洗滌，以除去多余的戊二醛，得到活化的凝膠；⑥每10ml活化的凝膠，加入含10-20mg抗體的10ml 0.1mol/L pH7.4磷酸緩沖液；⑦上述混合物在37℃，用攪拌器緩慢攪拌18h；⑧混合物轉入50ml離心管中，離心(4℃，300×g離心20分)，收集凝膠，再加10-20ml PBS離心洗滌，直至其上清液的A280nm＜0.05；⑨取凝膠，加入50ml含0.1mol/L甘氨酸的0.1mol/L磷酸緩沖液，室溫放置2小時，以中和殘余的醛基。然后在300×g離心20分，棄上清；⑩將含有固相化抗體的凝膠裝入適當的層析柱中，依次用洗脫緩沖液及PBS洗滌，開始使用。也可以在含0.1g/L疊氮鈉的PBS中，4℃長期保存。
(II)rGPBB與含抗體的固相化介質結合①將層析柱與蠕動泵及部分收集器連接，如無此類設備可用手工操作；②將含待純化rGPBB的混合物緩慢上樣(大約10ml/h)，如果混合物的體積大于柱體積，可將混合物過柱后再循環上樣；③室溫或4℃孵育1～2小時，參照抗原的穩定性來選擇溫度；④在4℃，用PBS洗柱。直至其流出液A280nm＜0.05。
(III)rGPBB洗脫①在4℃，用0.2mol/L pH2.8鹽酸-甘氨酸緩沖液洗脫rGPBB，按1～2ml/管收集洗脫液。測定每一管的A280nm；②當A280nm＜0.05時，先后用2mol/L pH2.2鹽酸-甘氨酸緩沖液及含0.1g/L疊氮鈉的PBS洗柱；③含有rGPBB組分的各管，每管按100～200μl/ml加入1mol/L K2HPO4，以中和其酸性；④用SDS-PAGE或功能檢測法(如RIA，ELISA)檢測，以確定各管有無rGPBB的存在；⑤將含有rGPBB的各管合并，在4℃對PBS透析。如果需要，可對rGPBB液進行濃縮。
4.親和層析條件的選擇(1)支持物與抗原或抗體結合后，還可能有多余的活性基團，為了封閉這些殘留基團，必須用無關蛋白質或三乙醇胺過一次柱，以封閉活性基團。
(2)去掉未結合及結合不牢固的蛋白質。先用0.2mol/L NaHCO3(含0.1mol/LNaCl，pH9.0)洗脫2～3個柱體積，再用解脫劑處理一次親和層析柱。
(3)解脫劑有許多種。常用的有0.2mol/L pH2.8甘氨酸-鹽酸緩沖液、0.1mol/L pH2.4甘氨酸緩沖液、7mol/L脲、5mol/L NaI、3mol/L硫氰酸鉀(或鈉)、1mol/L乙酸、6mol/L鹽酸胍、0.2mol/L KCL等。作為抗原抗體解脫劑，最多用的是3mol/L硫氰酸鉀(或鈉)及0.1mol/L pH2.4甘氨酸緩沖液。
純化后的目的蛋白質因含量低，失去保護作用，應及時凍干保存，亦可放-20℃保存。
實施例四抗體制備抗體分單克隆抗體和多克隆抗體兩種。本實施例以多克隆抗體制備為例說明，但是制備單克隆抗體的技術也是本專業領域的技術人員所熟悉的。
(1)抗原是rGPBB純化品，該純品在12.5％的PAG電泳后，僅出現一條區帶，即認為可用于免疫抗原純品。
(2)免疫 動物的選擇通常選擇壯年、成熟且健壯的豚鼠、雞、兔、山羊、綿羊、馬等動物。一般多用大白兔。免疫時，取完全佐劑3份加入含抗原的緩沖液1份，混勻，振搖或研磨，使其成為乳化狀態，因為含SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化復合物，注射入動物體內時一定要保持乳化狀態。抗原用量視抗原分子量不同及免疫原性及免疫動物不同而有一定差異，無統一標準和固定模式。一般是每兔(約2kg重)或每羊(約20kg重)第1次注射抗原1mg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超過3mg。
(3)免疫途徑及方法免疫部位可分別選用皮內、皮下或淋巴結。第1次免疫采用皮內結合皮下多點注射，常注射在背部或腿部。許多作者介紹在后足蹠皮下或皮內注射，因為四足落地的關系很易造成感染，使第1次免疫失效，并使動物行走不便，造成傷害。整個免疫過程以2～3個月為宜。一般是第1次免疫后的3～4周再進行第2次免疫，不完全佐劑為乳化劑。2周后加強1次(不完全佐劑)，2周后又加強1次(不完全佐劑或完全佐劑)，1周后再免疫1次。待最后一次免疫后的7～10天，取靜脈血測試抗體效價(試血)，效價達到要求后即可一次性放血，采用頸動脈放血，得抗血清。
(4)抗血清的保存免疫成功的動物放血過程，所有用具均嚴格消毒，并按無菌操作方式進行放血。抗血清的防腐劑以0.05％疊氮鈉為宜；也可采用加入20％～30％無菌甘油保存的方法。若時間較長，不用可采用-20℃低溫保存。一般在0～8℃保存1年，抗體效價幾乎無改變，保存2年，其效價稍有降低。抗體切忌反復凍融，否則抗體效價很快降低，以頸動脈一次性放血為宜。
權利要求
1.一種應用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于①按酵母使用頻率高的密碼子人工合成糖原磷酸化酶同工酶BB的編碼基因，融合于酵母表達調控元件，構建甲醇酵母高表達工程菌；②甲醇酵母工程菌高密度發酵表達；③采用超濾、葡聚糖凝膠層析、離子梯度凝膠層析、親和層析等純化技術的順序組合，純化回收GPBB。
2.根據權要求1所述的應用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于重組人糖原磷酸化酶同工酶BB構建甲醇酵母高表達工程菌的方法為人工合成優化的重組人糖原磷酸化酶同工酶BB編碼基因，構建重組表達載體，選用酵母使用頻率較高的密碼子改造人GPBB基因。
3.根據權要求2所述的應用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于在人工合成DNA時將GPBB基因序列進行優化設計，把酵母中使用頻率較低的密碼子突變為酵母使用頻率較高的密碼子，然后將突變后的GPBB片段克隆到表達載體質粒的多克隆位點上，構建人GPBB的表達載體質粒。
4.根據權要求3所述的應用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于將人工合成基因以限制性內切酶酶切處理，體外連接到同樣酶切處理的甲醇酵母表達質粒，構建成GPBB重組表達質粒。
5.根據權要求4所述的應用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于甲醇酵母表達載體質粒，穿梭型質粒，它包括以下各種元件(1)大腸桿菌來源的質粒復制元件，(2)大腸桿菌篩選標記，(3)甲醇酵母表達調控元件，特別是可誘導表達調控元件，(4)甲醇酵母分泌表達信號α因子信號肽，(5)多克隆位點，(6)甲醇酵母篩選標記，(7)能在甲醇酵母染色體特異位點上重組整合的特異序列，(8)其它來源于大腸桿菌和酵母的連接片段。
6.根據權要求5所述的應用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于利用表達載體帶有抗生素的抗性基因，設計出一套快速簡便的篩選高拷貝的方法，用含有梯度濃度的抗生素培養篩選多拷貝轉化子。
7.根據權要求6所述的應用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于外源蛋白在酵母中的表達分兩個階段，第一階段，菌種生長階段，先在以甘油為碳源的培養基上培養菌體，達到一定OD值；第二階段，發酵階段，離心棄上清，菌體懸浮于以甲醇為碳源的培養基中誘導表達，每隔一定時間加一次甲醇，以彌補甲醇的消耗；發酵結束后采用離心或壓濾或超濾的方法除去細菌體，收集上清液；上清液經超濾脫鹽、濃縮后采用離子交換層析或疏水層析或分子篩層析或親和層析的方法進行純化處理。
8.根據權要求4所述的應用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于重組質粒轉化大腸桿菌受體菌，經限制性內切酶酶切、PCR、DNA測序驗證過程，從中篩選一個結構完全正確的轉化子，擴增并提取含轉化子的重組質粒。
9.根據要求2所述的應用甲醇酵母制備重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的方法，其特征在于將人GPBB基因3’末端與肌型和肝型兩種同工酶不同源部分進行改造。
10.根據上述權利要求所述的方法制備的重組人糖原磷酸化酶同工酶BB，其特征在于基因片段是人GPBB基因3’末端，包含111個核苷酸，其所編碼的氨基酸序列為IRNIACSGKFSSDRTITEYAREIWGVEPSDLQIPPPNIPRD。
11.一種重組人糖原磷酸化酶同工酶BB的應用，其特征在于將權利要求1-10所述的應用甲醇酵母所制備的重組人糖原磷酸化酶同工酶BB應用于生產抗GPBB抗體。
全文摘要
本發明涉及應用甲醇酵母生產重組人糖原磷酸化酶同工酶BB及其生產方法和它的應用。提供一種對AMI的早期診斷具有敏感性和特異性，且使用成本低的應用甲醇酵母生產的重組人糖原磷酸化酶同工酶BB及其生產方法和它的應用。本發明的方法為①按酵母嗜好的密碼子人工合成糖原磷酸化酶同工酶BB免疫顯性片段的編碼基因，融合于酵母表達調控元件，構建甲醇酵母高表達工程菌；②甲醇酵母工程菌高密度發酵表達；③采用超濾、葡聚糖凝膠層析、離子梯度凝膠層析等純化技術的順序組合，純化回收GPBB；④應用該蛋白質產生抗GPBB抗體。本發明的優點(1)具有強有力的乙醇氧化酶基因(A0X1)啟動子，可高效嚴格調控外源蛋白的表達；(2)作為真核表達系統，可對表達的蛋白進行翻譯后的加工和修飾，從而使表達出的蛋白具有很高的生物活性；(3)表達量高，可高密度發酵培養，且營養要求低，生長快，培養基廉價便于工業化生產；(4)表達的蛋白可分泌至胞外，而Pp自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有利于純化；(5)糖基化程度適當，對人體無明顯的抗原性，適合于臨床治療用途。
文檔編號A61P9/10GK1456664SQ03128128
公開日2003年11月19日 申請日期2003年6月6日 優先權日2003年6月6日
發明者高健民, 王滔 申請人:福建師范大學