專利名稱：抗sars冠狀病毒的基因疫苗及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療由SARS冠狀病毒引起的非典型性肺炎疫苗的領(lǐng)域，尤其涉及編碼SARS冠狀病毒S蛋白的核酸序列的疫苗。還涉及該疫苗在抗SARS冠狀病毒中的用途。
背景技術(shù)：
稱為非典型肺炎的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory Sydrome，SARS)已經(jīng)在全世界20多個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，截至5月22日日內(nèi)瓦時(shí)間17:00，來源全球累計(jì)報(bào)告病例8046，死亡病例682；全國內(nèi)地累計(jì)報(bào)告非典型肺炎病例5285例，死亡303例。這場突如其來的災(zāi)難給全世界人民特別是中國人民帶來了巨大的人員上和經(jīng)濟(jì)上的損失。
到5月22日為止，僅有改善癥狀的化學(xué)藥物，如“西維來司鈉”，用于改善全身性炎癥反應(yīng)綜合癥及特發(fā)性肺纖維化等引發(fā)的急性肺損傷，和提高機(jī)體免疫機(jī)能，如糖皮質(zhì)激素，以及廣譜抗病毒藥物“基因工程人ω干擾素”，未見有特異性治療和預(yù)防由SARS冠狀病毒引起的非典型性肺炎的藥物上市。這使得發(fā)展一種預(yù)防和治療由SARS冠狀病毒引起的非典型性肺炎的疫苗顯得十分緊急和重要。
在疫苗的研制上，存在著三種選擇。第一種方式是采用減毒或滅活的SARS冠狀病毒制成的非典型性肺炎疫苗，它是將SARS冠狀病毒通過物理或化學(xué)的方法減低或消除其感染性，然后直接作為疫苗使用。其仍然有毒力回復(fù)的潛在可能性，具有非常大的危險(xiǎn)性。
第二種方式是采用基因工程蛋白質(zhì)或多肽作為疫苗，是將SARS冠狀病毒的部分抗原基因在酵母、大腸桿菌等細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，得到的蛋白質(zhì)經(jīng)過純化作為疫苗。但是由于表達(dá)得到的蛋白往往不能得到正確的翻譯后加工，使用該蛋白制成的疫苗的抗原性往往較差，不能使機(jī)體產(chǎn)生良好的保護(hù)性免疫反應(yīng)；另外此種疫苗的主要成分是蛋白質(zhì)，十分不穩(wěn)定，需要在銷售和運(yùn)輸中始終保持“冷鏈運(yùn)輸”，這大大增加了其生產(chǎn)成本，而且使該種疫苗有效率大大降低。
而基因疫苗，是近幾年發(fā)展起來的第三代疫苗。它是把外源基因克隆到真核表達(dá)載體上，然后將重組的載體基因直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗體激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫應(yīng)答。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基因疫苗不僅可用于人類疾病，而且還可以廣泛應(yīng)用于人畜共患病和動(dòng)植物疾病?；蛞呙绮粌H具有預(yù)防疾病的作用，同時(shí)還具有治療疾病的作用。
與基因工程蛋白疫苗只能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫相比，基因疫苗能同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的體液免疫和細(xì)胞免疫，這在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)抗病原體感染特別是病毒性感染中，具有很大的優(yōu)勢和應(yīng)用前景—體液免疫所產(chǎn)生的抗體能中和血液和組織液中的病毒顆粒；而細(xì)胞免疫能使各類殺傷細(xì)胞識(shí)別并殺死被感染的宿主細(xì)胞，在病毒顆粒成熟之前就將其寄生的宿主細(xì)胞殺死，使得病毒無法擴(kuò)增，釋放，入侵未感染的宿主細(xì)胞，從而達(dá)到治療的目的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗SARS冠狀病毒的基因疫苗，該疫苗穩(wěn)定，在常溫下保存，能夠方便地運(yùn)輸，儲(chǔ)存，可同時(shí)引起人體針對(duì)SARS冠狀病毒體液免疫和細(xì)胞免疫。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種抗SARS冠狀病毒的基因疫苗在預(yù)防和治療非典型性肺炎中的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及多核苷酸，包括DNA，進(jìn)行免疫，使機(jī)體抵抗由SARS冠狀病毒所引起的非典型性肺炎，涉及含有用于所述目的的基因疫苗中的SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因或其片段。本發(fā)明中，構(gòu)建了若干重組質(zhì)粒，以便包括編碼SARS冠狀病毒S蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明提供的技術(shù)方案實(shí)施步驟為a.采用基因合成的方法或通過RT-PCR從病人血清中擴(kuò)增的方法得到SARS冠狀病毒S蛋白部分或全長基因片段。b.將a步驟所得到的基因片段插入到帶有人類立即早期巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子，或其它類似真核表達(dá)啟動(dòng)子的商品化的真核表達(dá)載體中。c.將所得到的帶有a步驟所得到的基因片段的重組真核表達(dá)載體，使用限制性內(nèi)切酶酶切方法或PCR方法經(jīng)過鑒定。d.在大腸桿菌中擴(kuò)增c步得到的重組真核表達(dá)載體，去除其中的雜質(zhì)，如宿主細(xì)菌染色體DNA，RNA和蛋白質(zhì)。e.將d步所得到的純化的重組真核表達(dá)載體加入到合適的制劑中，如生理鹽水，調(diào)節(jié)重組真核表達(dá)載體的濃度到合適的免疫用濃度，范圍為0-100mg/ml，即得到可用于本發(fā)明目的抗SARS冠狀病毒的基因疫苗。
編碼SARS冠狀病毒S蛋白的核苷酸序列見序列表，本發(fā)明所涉及的SARS冠狀病毒S蛋白的核苷酸序列包括表1所示的完整序列和其片段。
編碼SARS冠狀病毒S蛋白的核苷酸序列可操作地連接于一個(gè)啟動(dòng)子序列后，以便體內(nèi)表達(dá)所編碼的SARS冠狀病毒S蛋白的完整或部分多肽。所述啟動(dòng)子序列可以是人類立即早期巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子，也可以使用任何其它常見啟動(dòng)子，包括組成型啟動(dòng)子，如肉瘤病毒LTRs，和誘發(fā)型啟動(dòng)子，如金屬硫蛋白啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子。
運(yùn)用本發(fā)明提供的技術(shù)方案得到含SARS冠狀病毒S蛋白部分或全長基因序列的基因疫苗。其中含SARS冠狀病毒S蛋白全長基因序列的基因疫苗，即重組質(zhì)粒pCDNA-S保存于大腸桿菌Escherichia coli DH5 α-pCDNA-S中，CCTCC NoM203044。
上述重組真核表達(dá)質(zhì)粒含有若干基本骨架單位原核復(fù)制起始點(diǎn)fi origin和pPUCorigin；真核復(fù)制起始點(diǎn)SV40；新霉素抗性基因；氨卞青霉素抗性基因；以及若干個(gè)具有免疫佐劑功能的非編碼免疫刺激序列(ISS)。
本發(fā)明與采用減毒和滅活疫苗制成的非典型性肺炎疫苗和基因工程蛋白質(zhì)或多肽制成的非典型性肺炎疫苗疫苗相比，含SARS冠狀病毒S蛋白基因片段的基因疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)使其在預(yù)防和治療由SARS冠狀病毒引起的非典型性肺炎傳染病中具有很大的優(yōu)勢(1)可同時(shí)引起人體針對(duì)SARS冠狀病毒的體液免疫和細(xì)胞免疫。
(2)制備簡便，省時(shí)省力。外源抗原基因很容易克隆進(jìn)表達(dá)載體，數(shù)天內(nèi)可以擴(kuò)增并純化。
(3)比較安全。含SARS冠狀病毒S蛋白基因片段的基因疫苗接種后，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，能高水平表達(dá)病毒抗原基因，不涉及感染性因子，不依賴病毒顆粒的裝配，避免了采用活病毒疫苗的危險(xiǎn)。
(4)可提供對(duì)多種病毒株的廣譜有效的疫苗。由于載體本身不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，因此可組建含有多種抗原DNA的基因疫苗聯(lián)合接種免疫。
(5)含SARS冠狀病毒S蛋白基因片段的基因疫苗接種后，由于表達(dá)抗原蛋白的時(shí)間為1-2月，能強(qiáng)化B細(xì)胞和T細(xì)胞的記憶，引起持久的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
(6)含SARS冠狀病毒S蛋白基因片段的基因疫苗較穩(wěn)定，可以在常溫下保存，能夠方便的運(yùn)輸、儲(chǔ)存。
(7)價(jià)格便宜。
通過同源對(duì)比表明，SARS冠狀病毒S蛋白是介導(dǎo)SARS冠狀病毒識(shí)別宿主細(xì)胞以及入侵過程中的膜融合過程的關(guān)鍵蛋白，與SARS冠狀病毒入侵人體的致病過程密切相關(guān)。SARS冠狀病毒S蛋白位于病毒囊膜表面，在病毒入侵時(shí)介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜表面受體的相互作用，并留在細(xì)胞表面，成為受病毒感染細(xì)胞的表面標(biāo)志，從而成為抗體與淋巴細(xì)胞的攻擊的標(biāo)靶，因而可以用作非典型性肺炎預(yù)防與治療的重要基因。運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)SARS冠狀病毒S蛋白基因片段的抗原性進(jìn)行分析，結(jié)果表明其具有A，B，C三個(gè)抗原性評(píng)價(jià)值非常高的區(qū)域，其中B，C區(qū)位于SARS冠狀病毒S蛋白S2亞基的位于病毒外部的羧酸端多肽肽段中，長度分別為130aa，其抗原性非常強(qiáng)，分別具有4個(gè)以上MHCII分子結(jié)合位點(diǎn)，是具有強(qiáng)抗原性的疫苗基因片段。將其中一個(gè)或兩個(gè)抗原性良好的區(qū)域一起作為疫苗的抗原基因，所構(gòu)建的疫苗可以引起機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的保護(hù)性免疫作用。
本發(fā)明制得的含SARS冠狀病毒S蛋白的部分或全長氨基酸序列的基因疫苗具有熱穩(wěn)定性好，生產(chǎn)方便，價(jià)格便宜，能誘導(dǎo)人體產(chǎn)生針對(duì)引起非典傳染病的SARS冠狀病毒S蛋白的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，從而起到預(yù)防和治療由SARS冠狀病毒所引起非典傳染病的作用。
圖1為重組質(zhì)粒pCDNA-SARS-S2的構(gòu)建圖。
具體實(shí)施例方式
結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述1.構(gòu)建含SARS冠狀病毒S蛋白全長基因片段的2752bp-3162bp的核苷酸序列的真核表達(dá)載體，SARS冠狀病毒S蛋白全長基因片段的2752bp-3162bp的基因序列見表2。
合成SARS冠狀病毒S蛋白全長基因片段的2752bp-3162bp的基因片段，然后通過PCR法以引物對(duì)5’ggggaattcgacatggaatcacttacaacaacatcaactgc 3’5’cccggatcctactaagcttgctcctgggatggcacatacg 3’為引物，合成的SARS冠狀病毒S蛋白全長基因片段的2752bp-3162bp的基因片段為模板，擴(kuò)增得到兩端分別加上EcoRI和BamHI限制性酶切位點(diǎn)的SARS冠狀病毒S蛋白全長基因片段的2752bp-3162bp的基因片段。PCR反應(yīng)總體積為50μl，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘；PCR循環(huán)參數(shù)94℃60秒，58℃30秒，72℃20秒，最后一次循環(huán)在72℃延伸7分鐘。
然后用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI將該P(yáng)CR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pCDNA3.1(-)進(jìn)行雙酶切，使兩者兩端成為粘端。其后于16℃在T4 DNA連接酶的作用下將兩個(gè)片段連接起來，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化處于感受態(tài)的大腸桿菌DH5α。從轉(zhuǎn)化平皿上挑取單菌落，接種于5mL含100μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。次日按Sambrook等人描述的小量堿法提取質(zhì)粒[Sambrook J，et al，1989]。用限制性內(nèi)切酶EcoRI作酶切鑒定，選出含有片段較大的重組質(zhì)粒，然后用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI作酶切鑒定，挑出其中能切出SARS冠狀病毒S蛋白全長基因片段的2752bp-3162bp的基因片段的重組質(zhì)粒。按照前述給片段兩端加上EcoRI和BamHI位點(diǎn)的PCR方法進(jìn)行PCR，對(duì)含有SARS S2片段的重組質(zhì)粒進(jìn)一步鑒定，將能夠擴(kuò)增出SARS冠狀病毒S蛋白全長基因片段的2752bp-3162bp的基因片段的重組質(zhì)粒定名為pCDNA-SARS-S2。
2.編碼SARS冠狀病毒S蛋白全長基因片段的2752bp-3162bp的基因片段的基因疫苗即重組質(zhì)粒pCDNA-SARS-S2免疫制劑及陽性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品的制備以重組質(zhì)粒pCDNA-SARS-S2為SARS冠狀病毒基因疫苗候選樣品；以帶有乙肝表面抗原的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-S為陽性對(duì)照；以不含有SARS冠狀病毒S蛋白全長基因片段的2752bp-3162bp的基因片段的空載體pCDNA3.1(-)為陰性對(duì)照以0.9％生理鹽水為另一陰性對(duì)照；將含有各質(zhì)粒的重組大腸桿菌按Sambrook等人描述的小量堿法按等比例擴(kuò)大提取200mL培養(yǎng)液中的質(zhì)粒[Sambrook J，et al，1989]。在用RNaseA消化RNA后，依次用酚、酚氯仿、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。往上清中加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉，兩倍體積無水乙醇，-20℃沉淀過夜。次日，10000g離心15min收獲質(zhì)粒。經(jīng)洗滌干燥后用生理鹽水溶解。用分光光度計(jì)，測定A260/A280比值確定質(zhì)粒純度，A260值確定樣品的濃度，用生理鹽水調(diào)節(jié)濃度至1.0μg/μL，作為DNA免疫注射樣品。
3.以四種免疫方式進(jìn)行免疫BALB/c小鼠四種免疫方式為a.肌肉注射；b.基因槍皮下注射；c.噴霧劑鼻腔粘膜免疫；d.基因槍皮下注射初次免疫，噴霧劑鼻腔粘膜加強(qiáng)每種免疫方式選取40只六周齡雌性BALB/c小白鼠，其中10只作為陰性對(duì)照組以生理鹽水免疫，10只作為陽性對(duì)照組以重組質(zhì)粒pCMV-S免疫，10只作為試驗(yàn)組以重組質(zhì)粒pCDNA-SARS-S2免疫；10只作為陰性對(duì)照組以空載體pCDNA3.1(-)免疫。每只注射100μgDNA免疫注射樣品。初次免疫十四天后，再次加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫兩次后隔七天眼眶采小鼠外周血，加肝素抗凝。
4.免疫效果的檢測BALB/c小鼠在接受免疫后第7，14，21，28，35天，通過定量PCR檢測小鼠機(jī)體內(nèi)質(zhì)粒存在狀況，通過免疫印跡檢測目的抗原表達(dá)狀況，通過ELISA檢測體液免疫狀況，通過流式細(xì)胞儀檢測小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞狀況以評(píng)價(jià)特異性細(xì)胞免疫狀況。
結(jié)果表明BALB/c小鼠在接受多種方式的免疫后，在不同程度上都能在較長時(shí)間內(nèi)在機(jī)體內(nèi)保留基因疫苗即重組質(zhì)粒，并表達(dá)重組質(zhì)粒中的SARS冠狀病毒S蛋白全長基因片段的2752bp-3162bp的基因片段，使小鼠機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)SARS冠狀病毒S蛋白的細(xì)胞免疫和體液免疫，使小鼠獲得對(duì)抗引起非典型性肺炎的SARS冠狀病毒感染的保護(hù)性免疫。
序列表表1 SARS冠狀病毒S蛋白的完整基因序列表<110>武漢大學(xué)<120>抗SARS冠狀病毒的基因疫苗及應(yīng)用<130>抗SARS冠狀病毒的基因疫苗及應(yīng)用<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3768<212>DNA<213>SARS coronavirus<300><301>Marra，M.A.，Jones，S.J.，Astell，C.R.，Holt，R.A.，Brooks-Wilson，A.，<302>The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus<303>Science<304>2003<305>0<306>13<307>2003-05-01<308>GI29836496<309>2003-05-22<313>(1)..(3768)<400>1atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag 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coronavirus<300><301>Marra，M.A.，Jones，S.J.，Astell，C.R.，Holt，R.A.，Brooks-Wilson，A.，<302>The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus<303>Science<304>2003<305>0<306>13<307>2003-05-01<308>GI29836496<309>2003-05-22<313>(1)..(411)<400>1gaatcactta caacaacatc aactgcattg ggcaagctgc aagacgttgt taaccagaat 60gctcaagcat taaacacact tgttaaacaa cttagctcta attttggtgc aatttcaagt120gtgctaaatg atatcctttc gcgacttgat aaagtcgagg cggaggtaca aattgacagg180ttaattacag gcagacttca aagccttcaa acctatgtaa cacaacaact aatcagggct240gctgaaatca gggcttctgc taatcttgct gctactaaaa tgtctgagtg tgttcttgga300caatcaaaaa gagttgactt ttgtggaaag ggctaccacc ttatgtcctt cccacaagca360gccccgcatg gtgttgtctt cctacatgtc acgtatgtgc catcccagga g 41權(quán)利要求
1.一種抗SARS冠狀病毒的基因疫苗，其特征在于含有SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因序列的全部或部分基因片段的真核表達(dá)質(zhì)粒；編碼SARS冠狀病毒S蛋白的核苷酸序列可操作地連接于一個(gè)啟動(dòng)子序列后，以便體內(nèi)表達(dá)所編碼的SARS冠狀病毒S蛋白的完整或部分多肽。
2.一種抗SARS冠狀病毒的基因疫苗，其特征在于包含編碼SARS冠狀病毒S蛋白全長基因的部分片段或者完整片段，SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因序列為atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat600caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt660aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct720gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact780acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa840aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac900cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca960aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg 1020gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt 1080ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc 1140aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga1200caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc1260cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat1320aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc1380tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat1440tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct1500tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt1560aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct1620tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat1680tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgcgc ttttgggggt1740gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat1800gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc1860atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag1920catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg tgctagttac1980catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta tactatgtct2040ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc tactaacttt2100tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc cgtagattgt2160aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca atatggtagc2220ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga tcgcaacaca2280cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa atattttggt2340ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag gtcttttatt2400gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa gcaatatggc2460gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt caatggactt2520acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc tgctctagtt2580agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca aatacctttt2640gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt tctctatgag2700aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca agaatcactt2760acaacaacat caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa tgctcaagca2820ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag tgtgctaaat2880gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca2940ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc 3000agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg acaatcaaaa 3060agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat 3120ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg 3180ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat 3240ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac 3300aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat 3360gatcctctgc aacctgagct tgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat 3420catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac 3480attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt 3540gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc 3600ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg ttgcatgact 3660agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa gtttgatgag 3720gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataa 3768
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗SARS冠狀病毒的基因疫苗，其特征在于所述的動(dòng)子序列可以是人類立即早期巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子，也可以使用其它常見啟動(dòng)子，包括組成型啟動(dòng)子，如肉瘤病毒LTRs和誘發(fā)型啟動(dòng)子，如金屬硫蛋白啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子。
4.權(quán)利要求1所述的一種抗SARS冠狀病毒的基因疫苗在預(yù)防和治療非典型肺炎中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗SARS冠狀病毒的基因疫苗及應(yīng)用，含有SARS冠狀病毒S蛋白的全長基因序列的全部或部分基因片段的真核表達(dá)質(zhì)粒；編碼SARS冠狀病毒S蛋白的核苷酸序列可操作地連接于一個(gè)啟動(dòng)子序列后，以便體內(nèi)表達(dá)所編碼的SARS冠狀病毒S蛋白的完整或部分多肽。將所述基因疫苗用于包括人類和嚙齒類動(dòng)物如小鼠在內(nèi)的宿主進(jìn)行免疫，使其產(chǎn)生特異性保護(hù)性的體液免疫和細(xì)胞免疫，以抵抗引起非典型性肺炎傳染病的SARS冠狀病毒的感染。本發(fā)明穩(wěn)定性好，生產(chǎn)方便，價(jià)格便宜，能誘導(dǎo)機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)引起非典傳染病的SARS冠狀病毒S蛋白的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，為治療和預(yù)防非典型性肺炎提供了有效且價(jià)廉的疫苗。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1449826SQ0312804
公開日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2003年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月27日
發(fā)明者葉凱, 丁虹 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)