環磷腺苷葡胺大輸液制劑及其制備方法和環磷腺苷葡胺含量測定方法

專利名稱：環磷腺苷葡胺大輸液制劑及其制備方法和環磷腺苷葡胺含量測定方法
技術領域：
本發明涉及一種環磷腺苷葡胺大輸液制劑及其制備方法以及該大輸液制劑中環磷腺苷葡胺含量測定方法。
目前臨床上應用的環磷腺苷葡胺注射液為小水針，規格2ml30mg；常用量60～180mg/日。因主藥作用強烈，且滲透壓過低，不能直接用來靜脈滴注，需要用5％葡萄糖或生理鹽水注射液稀釋后，方可靜脈注射，不僅給臨床使用帶來不便，也可能造成藥液感染和污染。
根據歷年收集的資料及中文生物醫學期刊數據庫(CMCC)檢索到的文獻(1984～2002年6月30日)共224篇。其中有關該品臨床應文獻統計表明，98％以上均采用以5％葡萄糖稀釋后靜脈滴注。而制備MCA葡萄糖大輸液的技術瓶頸在于(1)葡萄糖溶液的穩定pH在3.2～5.5。pH在5.5以上極不穩定，易造成顏色、5-羥甲基糠醛及澄明度不合格；而環磷腺苷葡胺MCA水針穩定的pH范圍在5.5～7.0。pH小于5.5易分解形成一磷酸腺苷及腺苷，因此兩者的穩定所需的pH范圍不同，將兩者簡單的混合不能得到穩定的具有一定保質期的MCA葡萄糖大輸液產品。(2)注射用葡萄糖本身就含有某些紫外吸收雜質，并且其溶液存儲中產生新的紫外吸收雜質和酸性物質。而現行的MCA水針環磷腺苷葡胺含量的法定測定方法無法將這些紫外雜質與環磷腺苷特征紫外吸收分離開來，這樣用現行方法無法準確測定MCA葡萄糖大輸液中環磷腺苷葡胺含量，使藥品的質量在生產中無法得到有效的保證和控制，需要一種新的適于MCA葡萄糖大輸液生產相適應的準確測定MCA葡萄糖大輸液中環磷腺苷葡胺含量，控制產品生產質量的有效檢測方法。
解決本發明技術問題是通過以下技術方案來實現的。
本發明(1)采用合適的配方和生產工藝；(2)經考察，影響制劑穩定性的關鍵因素是其保存期的pH值，本發明確定了使制劑穩定的pH范圍及其最佳穩定pH值，為生產長期穩定的制劑，提供了可靠的依據；(3)主藥環磷腺苷葡胺含量的現行測定方法是根據環磷腺苷的特征紫外吸收。經試驗，本發明分離了干擾環磷腺苷測定的一切雜質，從而建立了適于環磷腺苷葡胺-葡萄糖注射液的含量測定方法。方法的回收率為100.44±1.166，RSD1.16％。以下分別介紹1.環磷腺苷葡胺大輸液制劑配方和生產方法本發明環磷腺苷葡胺等滲輸液大輸液制劑分為環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液制劑和環磷腺苷葡胺氯化鈉注射液制劑。
a.配方環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液制劑，其特點是每100毫升制劑中含等滲介質葡萄糖4.5-5.5克，環磷腺苷葡胺54-66毫克，加檸檬酸42毫克(或不加)，其余為注射用水。其制劑穩定的pH范圍為3.5～5.5，最佳穩定pH值為4.75±0.25。本發明產品性能相當穩定，通過室溫存放穩定性考察，存放一年各項指標合格，預計有效期至少兩年。
環磷腺苷葡胺氯化鈉注射液制劑，其特點是每100毫升制劑中含等滲介質氯化鈉0.85-0.95克，環磷腺苷葡胺54-66毫克，其余為注射用水。其制劑穩定的pH范圍為5.5～7.0，其最佳穩定pH值為6.1±0.2。本發明產品性能相當穩定，通過室溫存放穩定性考察，存放一年各項指標合格，預計有效期至少兩年。
b.生產環磷腺苷葡胺大輸液制劑的方法取注射用水適量，加熱煮沸，不斷攪拌，分次加入葡萄糖，配成50～70％濃溶液(或分次加入氯化鈉，配成20～25％的濃液)。用1％鹽酸或1％氫氧化鈉溶液調pH 3.8～4.0，加入適量的0.1～1.0％的注射用活性炭。在攪拌下煮沸30分鐘，放冷至45℃～50℃濾除活性炭，按大輸液制劑全量加入環磷腺苷葡胺，用1％氫氧化鈉溶液調整pH 6.0～6.5(或加入1mol/L的檸檬酸溶液0.1～0.3ml，再用1％氫氧化鈉調pH至5.0)。再加注射用水至所需量。精濾至澄清，灌封，于115℃熱壓滅菌30分鐘。
實驗考察了滅菌工序對環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液的質量(pH值、顏色、澄清度、5-羥甲基糠醛和主藥含量)的影響，結果見表1.
由表1.可見，選擇調整pH的試劑不同，差別明顯。用1％NaOH或HCl，無緩沖能力，平均降低pH1.25單位，碳酸氫鈉降低1.50～1.70單位，隨著pH下降，CO2釋放增加，加溫滅菌沖塞率達20％，故不采用。而添加檸檬酸最佳，其濃度為1mmol/L，pH基本穩定，加至3mmol/L可使pH穩定。本試驗還揭示一個重要特征，即本大輸液中主藥環磷腺苷葡胺，比其等滲介質葡萄糖，更為穩定。
實施例1環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液配方 環磷腺苷葡胺 60mg葡萄糖 5g注射用水加至 100ml按處方將葡萄糖投入注射用水中，使成50～60％的濃液，按上述工藝攪拌、煮沸，加入濃溶液0.3％(克/100毫升)的活性炭，經煮沸，脫炭后加入主藥60mg，加入注射用水至全量的80％，用1％氫氧化鈉調整pH至6.2，再加注射用水至全量，精濾至澄清，灌封于50ml或100ml等法定容器中，封口，115℃，熱壓滅菌30分鐘。最后，按后面所述的環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液中環磷腺苷葡胺的定量測定方法檢測注射液中環磷腺苷葡胺的含量，含量合格即可出廠。
實施例2環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液配方 環磷腺苷葡胺60mg葡萄糖 5g檸檬酸1mol/L溶液0.2ml1％氫氧化鈉(或鹽酸) 適量(用于調整pH)注射用水加至 100ml按處方將葡萄糖投入注射用水中，使成50～60％的濃液。按工藝攪拌、煮沸，加入0.3克/100毫升活性炭，經煮沸，脫炭后加入主藥60mg、檸檬酸1mol/L溶液0.2ml，用1％氫氧化鈉調整pH至5.0，再加注射用水至全量，精濾至澄清，灌封于50ml或100ml等法定容器中，封口，115℃，熱壓滅菌30分鐘。最后，按后面所述的環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液中環磷腺苷葡胺的定量測定方法檢測注射液中環磷腺苷葡胺的含量，含量合格即可出廠。
實施例3環磷腺苷葡胺氯化鈉注射液(適于不宜使用葡萄糖的合并糖尿病患者使用)
配方環磷腺苷葡胺60mg氯化鈉 0.9g注射用水加至100ml按處方將氯化鈉投入注射用水中，制成20～25％的濃溶液，按工藝，攪拌、煮沸，加入濃濃液0.3％的活性炭，經煮沸脫炭后加主藥60mg，再加入注射用水至全量的80％，用1％氫氧化鈉(或鹽酸)，調整pH至6.1，加注射用水至全量，精濾至澄清，灌封于50ml或100ml等法定容器中，封口，115℃，熱壓滅菌30分鐘。
2.大輸液中等滲介質對主藥穩定性的影響A.等滲介質0.90％氯化鈉溶液對環磷腺苷葡胺穩定性的影響為了考察0.9％NaCl對主藥MCA穩定性的影響，實驗按實施例3的配方和工藝制成不同pH的大輸液各10瓶，每瓶150ml。調pH的溶液為1％HCl和1％NaOH，熱壓滅菌后大輸液的pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5六檔。觀測指標為MCA含量及紙色譜顯示的分解產物。MCA含量測定的方法將后面所述的大輸液精密量取125ml，60℃減壓滅菌濃縮至約3ml，轉移至10ml量瓶中，并用少量注射用水洗蒸餾瓶3次，最后加水至刻度。準確取樣10μl，按后面所述的MCA的紙譜定量測定的方法測定MCA含量。測定前先檢查紙譜上的紫外熒光斑點位置，并確定其分解產物。每個樣品做三個測定，小于0.5％的含量變化屬測定誤差。所得數據列于表2。
分析表2中數據可見，0.90％NaCl對MCA的穩定性幾乎無影響，與水溶液即以前我們在小水針中觀察到的結果基本一致。MCA的等當點為pH6.20。MCA在酸性條件下易于解離成cAMP(Rf0.45～0.50)，cAMP進而水解成AMP(一磷腺苷，Rf0.18～0.20)，AMP即分解成腺苷(Rf0.60～0.66)。在堿性條件下，MCA也易于游離成cAMP，進而水解成AMP，不易形成AR。故MCA在0.90％NaCl溶液中的穩定pH范圍在5.5～7.0，與小水針完全一致。由此證明，0.9％的NaCl是一種隋性等滲介質，對大輸液中的MCA既無保護作用，也不起破壞作用。又根據我們長期考察，MCA小水針42批(1993-2001年)，發現室溫保存五年，未見水針的MCA分解，即MCA含量無可測變化，亦不見有AMP和AR的紫外斑點(可檢出0.5μg的MCA)，其pH值均在5.9～6.3之間，故MCA水針的最佳穩定pH值為6.1±0.2，室溫存放五年期間，小水針的pH值僅下降0.1單位，故水針的溶液極為穩定。同理，MCA氯化鈉大輸液的最佳穩定pH值應為6.1±0.2，在最佳pH值范圍內，預計MCA氯化鈉大輸液有效期可長達五年。
B.等滲介質5％葡萄糖對環磷腺苷葡胺穩定性的影響為了考察5％葡萄糖對主藥MCA穩定性的影響，實驗按實施例1的配方和工藝制成不同pH組的大輸液各15瓶，每瓶150ml。滅菌后的pH值分別為6.0、5.5、5.0、4.5、4.0和3.5，各種pH制劑各3瓶作對照，其余均放入80℃恒溫箱中保溫于第3、6、8、10、18天不同pH組各取二瓶，依后面所述的環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液中環磷腺苷葡胺含量測定方法，作環磷腺苷葡胺含量測定，測定前先檢查紙譜上的熒光斑點位置以確定其分解產物，所得結果列入表3。
本試驗表明，(1)在研究的pH范圍(pH6～3.5)環磷腺苷葡胺(MCA)在5％葡萄糖溶液中的化學穩定性能良好80℃pH6.0時8天紙層析圖譜未見分解，即無AMP(一磷酸腺苷斑點)，只有到10天才看到明顯的AMP紫外斑點，MCA分解約20％；pH 5.5，4.0時MCA在80℃18天才觀察到明顯分解，分別分解16.7％和5.8％；(2)MCA水溶液的最佳穩定pH為6.1±0.2，已如前述。本實驗發現，5％葡萄糖溶液使MCA最佳穩定pH值下降，最穩定范圍是pH4.5～5.0，即pH4.75±0.25。葡萄糖使MCA最佳穩定pH值下移，具有重要實際意義，使制備MCA葡萄糖大輸液的技術瓶頸得以突破，即MCA和葡萄糖二者均較為穩定的pH范圍是3.5～5.5。
3.環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液中環磷腺苷葡胺的定量測定方法(1)方法特征鑒于本品含有5％葡萄糖，而MCA60mg，只占葡萄糖總量的1.2％(百分之一點二)，其分子麾爾比為251∶1，如此懸殊的化學量差，使MCA穩定pH值下移，產生了有益的效果，已如前述。但對其含量測定則極其不利。又根據兩家公司生產的市售5％葡萄糖大輸液中的紫外吸收掃描發現同樣含有284nm、228nm和217nm三個特征吸收峰，而這些紫外吸收雜質和葡萄糖又不能用現行分離方法拆分開來，這就成為研制此大輸液首先要解決的技術瓶頸。我們通過實驗建立了適于本大輸液中環磷腺苷葡胺含量測定的方法，其特征包括以下要點a.利用堿性pH(8.0～9.0)，使環磷腺苷葡胺解離成環磷腺苷(帶負電荷)和葡甲胺(不帶電荷)。
b.用強堿性陰離子交換樹脂吸附環磷腺苷及可能分解形成的一磷腺苷。
c.上柱流出液和水洗流出液，可除去注射液中的葡萄糖、葡甲胺及其他一切紫外吸收雜質。
d.再用紙色譜法在95％乙醇-4％乙酸銨(5∶2)展開劑中分離環磷腺苷及一磷腺苷，并用環磷腺苷的特征紫外吸收測定其含量，據此計算出環磷腺苷葡胺的含量。
(2)具體操作步驟精密量取本品125ml，用1mole/L氫氧化鈉溶液調節pH至8-9，上已處理好的強堿性陰離子交換樹脂(Dowex 1(美國)或國產717等)，100-200目，Cl型柱(柱徑約12mm，樹脂床4ml)，上柱流速3～4ml/min，樣品流至柱面時，改用蒸餾水80ml洗柱，流速同前，棄去流出液，然后用0.075mole/L鹽酸溶液-0.2mole/L氯化鈉溶液洗脫，流速0.7ml/min。收集洗脫液約80ml，用碳酸氫銨顆粒調節pH值至6.5。然后在60℃以下減壓濃縮至約3ml，轉移至10ml量瓶中，用注射用水洗滌蒸餾瓶數次，一并加入量瓶中，并加注射用水稀釋至刻度，作為供試品溶液。另取環磷腺苷對照品適量，加60℃的水制成每1ml中含10mg的溶液，作為對照品溶液，照紙色譜法(中國藥典2000年版二部附錄V A)試驗，分別精密吸取上述溶液10μl，點于長約30cm的層析濾紙上，以95％乙醇-4％乙酸銨(5∶2)為展開劑，展開約15小時后，干燥，置紫外光燈(254nm)下檢視，在對照品的斑點位置相同處，劃出供試品紫色斑點。將此斑點剪下，并剪成細條狀，放入試管中，精密加0.01mole/L鹽酸溶液5ml，振搖，放置1小時后，取上清液，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IV A)，在257nm的波長處測定吸收度。同時，以5％葡萄糖溶液代替供試品溶液，同法操作，作為空白校正，按環磷酸腺苷的吸收系數為447乘以0.6278(0.6278為環磷腺苷與環磷酸腺苷葡甲胺的分子量比值)計算，即得環磷腺苷葡胺含量。
(3)方法的回收率試驗依實施例1，將葡萄糖濃配、加針用炭、煮沸攪拌、冷卻后，脫炭，加注射用水稀釋至全量的80％，再加入MCA結晶粉制成的15mg/ml的溶液(用國家藥品標準規定的方法標定)。按全量加入540mg MCA/L，用1％的鹽酸或1％氫氧化鈉調整pH至6.1。再按全量加水至90％。取出180ml，加水至200ml(1號樣)，分別再取出此液三份，每份各180ml，分別加入MCA 12mg，24mg，36mg，最后分別加水至200ml(相應為2號樣、3號樣、4號樣)，分別通過0.22μ微孔濾膜，熱壓滅菌115℃30分鐘，取樣100ml作MCA含量測定，其余作其它檢查及測定用。詳細數據收于表4。回收試驗，共二批(分甲、乙二組)，共計8次測定。總的回收率為100.44±1.166，在紙層析測定誤差范圍內。并且，線性關系良好，線性方程Y(MCA mg％)＝a+b*ΔA257，式中甲組a＝-0.0658，b＝142.546；乙組a＝0.00236，b＝142.483。甲乙二組b的均值142.516，兩組均值與計算值142.538前四位數相同。相關系數為0.99999。表4所列計算式的計算常數(142.538)與線性方程實測的142.516，前四位數相同，為分光光度法本身所能達到的最佳水平。
4.本發明產品的性能指標見表5。
本發明確定了環磷腺苷葡胺大輸液制劑穩定的關鍵條件及其制備方法、并解決了環磷腺苷葡胺含量測定方法，有利于對環磷腺苷葡胺大輸液制劑生產質量的控制，從而制定合適的生產工藝，使環磷腺苷葡胺大輸液制劑得以工業化大批量生產成為可能。使用本制劑，可避免從小針抽取藥液注入葡萄糖或氯化鈉大輸液的中間環節，杜絕了用藥過程中的交叉感染和污染，使用藥更為安全、方便。本發明可制成多種規格，一般可制成為50ml、100ml、250ml、500ml等規格的大制劑，供醫護人員酌情選用。
表1.滅菌工序對環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液的質量影響大輸液按本劑型的配方和工藝，于115℃熱壓滅菌30分鐘，放冷至約50～60℃用自來水降至室溫，測定各質量指標，觀察指標有pH值、顏色、澄清度、A284為5-羥甲基糠醛檢查和主藥含量。調pH用溶液均屬生理物質，按表中所示濃度配制。每種制劑作三個平行檢測。

表2.環磷腺苷葡胺氯化鈉大輸液的高溫穩定性考查

*cAMP為環磷腺苷，AMP為一磷腺，AR為腺苷表3.葡萄糖溶液pH對環磷腺苷葡胺穩定性的影響制作方法按實施例1，溶液置80℃恒溫箱中保溫，于0、3、5、8、10、18天取樣，取樣作MCA含量測定。含量無明顯變化者(＜3％)未列出。

表4.MCA葡萄糖注射液的MCA回收試驗依上法，分別作紙譜法測定二次，定為甲乙二組，每組平行測定樣品三個 0.6278＝cAMP分子量/MCA分子量*統計學處理甲乙二組合并后，MCA的回收率均值＝100.44；RSD＝1.166％；甲組回收率均值＝100.67；RSD＝1.356％；乙組回收率均值＝100.22；RSD＝1.098％
表5

權利要求
1.一種環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液制劑，其特征在于每100毫升制劑中含有葡萄糖4.5-5.5克，環磷腺苷葡胺54-66毫克，其余為注射用水，其制劑穩定的pH范圍為3.5～5.5。
2.根據權利要求1所述的環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液大輸液制劑，其特征在于每100毫升制劑中含有檸檬酸42毫克。
3.根據權利要求1或2所述的環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液大輸液制劑，其特征在于制劑穩定的pH范圍為4.75±0.25。
4.一種環磷腺苷葡胺氯化鈉注射液制劑，其特征在于每100毫升制劑中含有氯化鈉0.85-0.95克，環磷腺苷葡胺54-66毫克，其余為注射用水，其制劑穩定的pH范圍為5.5～7.0。
5.根據權利要求1或2所述的環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液大輸液制劑，其特征在于制劑穩定的pH范圍為6.1±0.2。
6.一種制取環磷腺苷葡胺大輸液制劑的方法，其特征在于取注射用水，加熱煮沸，不斷攪拌，分次加入葡萄糖，配成50～70％濃溶液，或分次加入氯化鈉，配成20～25％的濃液，用1％鹽酸或1％氫氧化鈉溶液調pH 3.8～4.0，每100ml溶液中加入0.1～1.0克的注射用活性炭，在攪拌下煮沸30分鐘，放冷至45°～50℃濾除活性炭，按大輸液制劑全量加入環磷腺苷葡胺，用1％氫氧化鈉溶液調整pH 6.0～6.5，或加入1mol/L的檸檬酸溶液0.1～0.3ml，再用1％氫氧化鈉調pH至5.0，再加注射用水至所需量，精濾至澄清，灌封，于115℃熱壓滅菌30分鐘。
7.一種環磷腺苷葡胺葡萄糖大輸液中環磷腺苷葡胺的含量測定方法，其特征在于包括以下步驟a.利用堿性pH(8.0～9.0)，使環磷腺苷葡胺解離成帶負電荷的環磷腺苷和不帶電荷的葡甲胺；b.用強堿性陰離子交換樹脂吸附環磷腺苷及可能分解形成的一磷腺苷；c.上柱流出液和水洗流出液，可除去注射液中的葡萄糖，葡甲胺及其他一切紫外吸收雜質；d.再用紙色譜法在95％乙醇-4％乙酸銨(5∶2)展開劑中分離環磷腺苷及一磷腺苷，并用環磷腺苷的特征紫外吸收測定其含量，據此計算出環磷腺苷葡胺的含量。
8.根據權利要求7所述的環磷腺苷葡胺葡萄糖大輸液中環磷腺苷葡胺的含量測定方法，其特征在于包括以下具體操作步驟精密量取環磷腺苷葡胺葡萄糖注射液125ml，用1mole/L氫氧化鈉溶液調節pH至8-9，上已處理好的強堿性陰離子交換樹脂，100-200目，Cl型柱，上柱流速3～4ml/min，樣品流至柱面時，改用蒸餾水80ml洗柱，流速同前，棄去流出液，然后用0.075mole/L鹽酸溶液—0.2mole/L氯化鈉溶液洗脫，流速0.7ml/min。收集洗脫液約80ml，用碳酸氫銨顆粒調節pH值至6.5。然后在60℃以下減壓濃縮至約3ml，轉移至10ml量瓶中，用注射用水洗滌蒸餾瓶數次，一并加入量瓶中，并加注射用水稀釋至刻度，作為供試品溶液。另取環磷腺苷對照品適量，加60℃的水制成每1ml中含10mg的溶液，作為對照品溶液，照紙色譜法試驗，分別精密吸取上述溶液10μl，點于長約30cm的層析濾紙上，以95％乙醇-4％乙酸銨(5∶2)為展開劑，展開約15小時后，干燥，置紫外光燈254nm下檢視，在對照品的斑點位置相同處，劃出供試品紫色斑點。將此斑點剪下，并剪成細條狀，放入試管中，精密加0.01mole/L鹽酸溶液5ml，振搖，放置1小時后，取上清液，照分光光度法，在于257nm的波長處測定吸收度，同時，以5％葡萄糖溶液代替供試品溶液，同法操作，作為空白校正，按環磷酸腺苷的吸收系數為447乘以0.6278(0.6278為環磷腺苷與環磷酸腺苷葡甲胺的分子量比值)計算，即得環磷腺苷葡胺的含量。
9.根據權利要求8所述的環磷腺苷葡胺葡萄糖大輸液中環磷腺苷葡胺的含量測定方法，其特征在于強堿性陰離子交換樹脂采用美國的Dowex 1或國產717，Cl型柱為柱徑12mm，樹脂床4ml。
全文摘要
本發明涉及一種環磷腺苷葡胺大輸液制劑及其制備方法以及該大輸液制劑中環磷腺苷葡胺含量測定方法。環磷腺苷葡胺的等滲大輸液制劑，其配方為100ml制劑中含主藥環磷腺苷葡胺54－66mg，等滲介質葡萄糖4.5－5.5g或氯化鈉0.85－0.95g。本發明確定了環磷腺苷葡胺大輸液制劑穩定的關鍵條件pH值范圍及其大輸液制劑制備方法、并解決了環磷腺苷葡胺含量測定方法，有利于對環磷腺苷葡胺大輸液制劑生產質量的控制，從而制定合適的生產方法，使環磷腺苷葡胺大輸液制劑得以工業化大批量生產成為可能。使用本制劑，可避免從小針抽取藥液注入葡萄糖或氯化鈉大輸液的中間環節，杜絕了用藥過程中的交叉感染和污染，使用藥更為安全、方便。本發明可制成多種規格，供醫護人員酌情選用。
文檔編號A61P9/04GK1459288SQ03124559
公開日2003年12月3日 申請日期2003年6月18日 優先權日2003年6月18日
發明者趙升皓, 趙琛 申請人:趙琛