專利名稱：一種裂解致病菌的肽及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物化學領域，涉及一種裂解致病菌，尤其是耐藥性結核分枝桿菌的肽。該肽可以作為藥物單獨或者與適合藥物的組分一起裂解致病菌，從而治療致病菌感染。
背景技術：
結核病是嚴重危害人類健康的傳染病，是我國重點控制的重大疾病之一，也是全球關注的公共衛生問題和社會問題。近年來全球結核病疫情的回升引起了國際社會的高度重視。1993年和1998年，世界衛生組織兩個就結核病問題發出全球預警。當前我國的結核病防治工作還面臨嚴峻的挑戰。我國仍然是全球結核病嚴重流行的國家，現有結核病人占全球的1/4，死亡人數多，疫情下降緩慢，危害嚴重。在結核病人中，有3/4是最具有生產能力的青壯年。重慶市為中國結核病的第二高發區。如果我們不及時采取有效措施，結核病蔓延將進一步加劇，已取得的結核病控制成果將付之東流，給家庭和國家造成更加嚴重的損失。對此，我們要有高度的認識，否則要付歷史的責任[1]。
結核病防治的難點主要在于其致病菌-結核分枝桿菌獨特的生物學性質[2]以及對它的基礎研究還很欠缺。表現為耐藥性愈演愈烈，結核分枝桿菌幾乎對所有的一線藥物都產生了不同程度的耐藥性，同時耐兩種以上一線藥物的耐多藥菌株的出現頻率也在上升。解決結核病問題的迅速有效措施是開發特異性的新藥。
噬菌體是細菌的病毒，能夠特異性裂解宿主細菌。其特異性裂解細菌的酶可能是藥物開發的理想先導分子。噬菌體在敏感菌株中的裂解循環末期，所有雙鏈DNA噬菌體都產生一種降解細菌細胞壁的裂解系統，該系統包括holin和至少一種肽聚糖水解酶(peptidoglycanhydrolase)，也稱為裂解素(lysin)。裂解素可以是1.endo-beta-N-乙酰葡萄糖胺酶；2.N-乙酰胞壁酸酶N-acetylmuramidases(溶菌酶lysozymes)，作用在糖成分上；3.內肽酶(endopeptidases)，剪切肽鍵；4.N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase)，水解連接糖和肽的酰胺鍵。Holin在噬菌體感染晚期表達，在細胞膜上打孔，允許裂解素接近細胞壁肽聚糖，最終導致子代噬菌體釋放。只有裂解素，無需噬菌體也能夠裂解敏感宿主菌，該現象稱為“無噬菌體裂解”(lysis fromwithout)。
人體嗜中性粒細胞產生一種克隆裂解肽，對結核分枝桿菌具有裂解活性，但為非特異性，對其他細菌也具有裂解活性。Staphylococcus simulans產生的內肽酶lysostaphin能夠切除金黃色葡萄球菌肽聚糖的五甘氨酸交聯(pentaglycine cross bridge)。Lysostaphin對耐萬古霉素金黃色葡萄球菌引起的實驗性動脈管心內膜炎有效[2]。
結核分枝桿菌具有裂解性噬菌體DS6A，D29[3]。國外研究目前只從病毒學的角度進行，開發作為結核分枝桿菌分子遺傳研究的工具，沒有研究其藥物開發價值。研究這些噬菌體的lysin，可能將找到治療耐藥結核病新的抗生素。
參考文獻1.謝建平 結核分枝桿菌的后基因組研究和新型疫苗 微生物學報，2001，4151-572.Nelson D，Loomis L，Fischetti VA.Prevention and elimination of upper respiratorycolonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme.PNAS，2001，984107-41123.Hatfull GH，Methods in molecular biology-Mycobacteria protocols(，Tanya Parish，NeilG.Stoker，Humana Press Inc，Totowa，NJ.145-174)技術方案與技術效果本發明的目的之一是分離結核分枝桿菌裂解性噬菌體的裂解活性成分，本發明的另一目的在于將分離到的裂解肽用于結核分枝桿菌等致病菌感染的治療。
本發明主要通過分離裂解包括結核分枝桿菌在內的分枝桿菌的噬菌體。大規模培養分離到的噬菌體，提取其裂解活性成分并鑒定其結構和相應功能。
實施方式菌株和培養實驗所用菌株Mycobacterium tuberculosis H37Ra(ATCC 25 177)由重慶市肺科醫院檢驗科MTB檢驗室提供。快生型分枝桿菌為發明人分離并保存。細菌在Middlebrook7H10(Difco)添加OADC(0.5％BSA，0.2％glucose，0.06％oleic acid，140mMNaCl)的液體培養基中，37℃培養。在7H10固體培養基上連續稀釋后觀察CFU，測定細菌存活力和噬菌斑。分離噬菌體 采用環境土樣，按照文methods in molecular biology-Mycobacteria protocols(，Tanya Parish，Neil G.Stoker，HumanaPress Inc，Totowa，NJ.145-174)分離裂解性噬菌體。采集環境土樣，溶解于噬菌體緩沖液中，4℃過夜，5000g離心10min去除不可溶的碎片，上清液先后經0.45μm和0.2μm濾膜滅菌，確定噬菌體的滴度；將100ml上清液與2L生長到對數早期OD＝0.2的結核分枝桿菌混合，培養細菌到對數晚期OD＝0.6。大規模制備噬菌體蛋白培養細菌，稀釋的噬菌體點雙層平板，過夜培養，加入噬菌體緩沖液，吸取溶解噬菌體的緩沖液，離心去除碎片，1M氯化鈉沉淀噬菌體，3500g離心5min，氯化銫密度梯度離心收集蛋白質組分。
分離裂解素分離離心的各組分，逐個檢測對分枝桿菌的裂解活性。純化具有裂解活性的組分，進行氨基酸序列測定。
裂解素作用特異性的檢測分別以大腸桿菌、啤酒酵母、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌為模式，檢測裂解素對其他細菌的裂解效果。
結果分離到序列為EVTXXXSGCASECTXXTDKCNRARGG，其中X為任意氨基酸的肽對結核分枝桿菌和快生型分枝桿菌具有裂解活性，其對結核分枝桿菌的MIC值為100ug/ml。
權利要求
1.一種分離自分枝桿菌噬菌體的裂解肽，包括下列氨基酸EVTXXXSGCASECTXXTDKCNRARGG，其中X為任意氨基酸。
2.權利要求1所述的肽，肽含有至少一個修飾過的氨基酸。
3.權利要求2所述的肽，其中修飾的氨基酸在羧基末端。
4.權利要求1所述的肽，該肽對包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和病毒具有裂解活性。
5.權利要求4所述的肽，該肽對結核分枝桿菌具有裂解活性。
6.權利要求4所述的肽，該肽對耐藥結核分枝桿菌具有裂解活性。
7.權利要求4所述的肽，該肽對S.aureus，E.coli，C.albicans，S.typhimurium和C.neoformans具有裂解活性。
8.一種裂解致病菌，減少致病菌數量的方法，該方法包括將有效劑量的權利要求1所述的肽作為組分之一處理致病菌或感染致病菌的宿主。
9.權利要求8所述的致病菌減少包括減少90％-99％。
全文摘要
本發明提供了來自結核分枝桿菌噬菌體的新抗菌肽。該肽命名為結核分枝桿菌裂解肽MBL－1。從分枝桿菌噬菌體純化了MBL－1。本發明提供了相關的氨基酸序列。純化的MBL－1能夠裂解分枝桿菌。
文檔編號A61K31/06GK1535981SQ0311765
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月10日 優先權日2003年4月10日
發明者謝建平, 胡昌華, 談鋒 申請人:西南師范大學