竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在化妝品中的應用的制作方法

專利名稱：竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在化妝品中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于日用化妝品領域。本發明涉及一種竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在化妝品中的應用，目的是為化妝品行業提供一種天然植物來源的抗衰老護膚因子。具體地說是具有抗自由基、抗氧化、抗輻射、抗菌、抑菌和美白、抗皺、祛斑功效的竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在日用化妝品中的應用。
皮膚是維護人體生命和健康的重要部分，直接與外界接觸，是機體的第一道屏障，極易受到環境因素的影響而導致損傷。除了年齡帶來的老化因素外，應激反應、污染、陽光和紫外線的照射都是引起皮膚出現皺紋或皺褶的重要原因。
皮膚衰老主要表現在兩個方面①皮膚逐漸失去彈性形成皺紋；②皮膚外表逐漸產生黃褐斑、老年斑等各種色斑。根據衰老的自由基理論，在皮膚衰老的過程中，自由基對皮膚的損傷是一個重要因素。體內過量的活性氧自由基與不飽和脂肪酸作用生成丙二醛(MDA)等物質，MDA與細胞膜上的蛋白質等作用生成褐色素，沉淀于皮膚上便成為各種色斑。自由基也能使皮膚內的膠原纖維、彈性纖維交鏈和變性、變脆、失去彈性，當皮膚內的水分不足時，容易使彈性纖維斷裂而形成皺紋。皮膚衰老的深層次原因還包括表皮角質形成細胞的更新代謝減慢，真皮成纖維細胞增殖分裂速度降低。老年人與青年人相比，皮膚表皮變薄，皮膚角質形成細胞和成纖維細胞明顯減少，因此促進衰老皮膚細胞的增殖是許多護膚品的追求目標之一。如果化學物既能減少皮膚自由基的生成，提高SOD的活性，又對皮膚細胞具有一定的增殖作用，就可使皮膚組織更新加快，膠原纖維生成增多，保護皮膚的水分，從而有效地減緩皮膚衰老[黃漢生，防老化護膚品，日用化學工業譯叢，1994(2)35-38]。
護膚品行業一致認為，卓有成效地護理皮膚必須注意以下兩點①應在早年開始使用潤濕護膚品；②必須防御皮膚受紫外線的傷害。盡管在減輕皮膚細紋顯現的技術方面已取得了一定的進展，但最好的方法仍然是延緩皺紋的出現和盡量減少皺紋的出現。Chanel公司的Mausner認為，社會人口的老齡化和環境的劣化將會導致人們皮膚的老化、并且日趨嚴重，人們將越來越需要長效、高效的調節性和預防性的護膚品。Elizabeth Arden公司認為，護膚品行業的動向是向Cosmeceuticals(意即功能性營養型化妝品)的方向發展。
人口老齡化的時代特征和化妝品所處的特殊行業背景為具有抗自由基、抗氧化、抗輻射、抗菌、抗炎等生理活性的植物提取物的應用提供了廣闊的空間。加之近年來瘋牛病所帶來的連鎖反應，動物源性的護膚因子極易引起人們心理上的恐慌，因此對植物化學素的需求日益增長。國內外已推出的植物性化妝美容品按添加的植物種類分有50多種，具體功效可歸納為防皺、美白、祛斑、止癢、保濕、減肥等方面。這些天然植物的提取物具有副作用小、療效佳等特點，制成的美容化妝品既保持了化妝品的特色，又具有良好的治療、保健效果。
黃酮類化合物(Flavonoids，以下簡稱類黃酮)廣泛分布于植物界，到目前為止，已發現了2000多種，多數以苷的形式存在，少數以游離態存在，其生理作用和生物活性是多種多樣的。由于其結構的共軛性，對紫外和可見光均顯示強吸收，并在可見和紫外區內高度穩定。天然來源的類黃酮還具有抗菌、抗光敏、抗氧化、解毒和增白等作用，能清除皮膚中的自由基，避免自由基對細胞的損傷，促進皮膚的新陳代謝，改善皮膚的彈性，延緩皮膚皺紋的產生，減少色素的沉著，潤澤肌膚，達到顯著的美白效果[王建國、劉海峰、王建新，防曬劑Parsol1789光分解抑制的研究，香料香精化妝品，2002(1)17-20]。例如，廣泛存在于蔬菜與水果中的槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒及抗炎、抗過敏的生物活性與藥理作用。木犀草素對H.Sui s病毒有很強的抑制作用，濃度在1∶35000時可抑制葡萄球菌和枯草桿菌的生長，對卡他、白色念珠、變形等菌也有抑制作用；有抗炎效能，與磷脂配伍可治療皮膚炎；在皮膚上的滲透力強，可抑制透明質酸酶活性，與透明質酸同用能延長該物質的生理活性；能抑制和消除皮膚色斑(如老年斑)。指甲油內用少量木犀草素(0.01％)可使指甲釉面層保持光滑。蘆丁有抗氧、抗炎、抗口炎病毒作用。蘆丁與檸檬烯以50∶1配合對活性氧有良好的抑制作用，能強力吸收紫外線，可用于防曬、增白、護發類化妝品[王建新，天然活性化妝品，中國輕工業出版社，1997214]。在增白型化妝品中加入0.1～0.2％的大豆異黃酮可預防皮膚老化、黑化以及預防褐斑；在發乳中加入2％可吸收紫外線而維持頭發光澤。花青素類中的飛燕草素有很強的抗氧與抗炎作用，可抑制頭皮或皮膚因皮脂分泌過度引發皮虛而導致的病菌感染，化妝水中用量為1％；從翠菊花中得到的紫菀苷在化妝水中加入可提供較好的稠度和柔滑感，且有祛臭、收斂的功效[汪秋安，天然黃酮類化合物的生理功能及其應用，香料香精化妝品，1999(1)28-33]。類黃酮因其所具有的多種活性及其無毒、無害的安全性而在藥品、食品及化妝品中有廣泛的應用前景[黃興余、丁認全，槲皮素及其衍生物在化妝品中的作用及機理，香料香精化妝品，1998(3)17-18]。
目前已產業化開發的植物黃酮類提取物，如銀杏提取物、茶多酚、葡萄籽提取物、松樹皮提取物、甘草黃酮、大豆異黃酮、葛根異黃酮等，許多已被應用于化妝品行業。譬如，近30年來，國內外對銀杏進行了廣泛深入的研究，開發了許多專利性藥品、化妝品和保健品[劉燕、陳京華，銀杏在防衰老化妝品中的應用研究，日用化學工業，2002，32(4)79-81]。銀杏黃酮是強有力的活性氧自由基清除劑，能保護皮膚細胞不受過氧化的影響，從而延長皮膚細胞的壽命，增強其抗衰老的能力；銀杏內酯也能加速新陳代謝，改善血液循環，增強細胞活力；此外，銀杏提取物還具有廣譜殺菌作用，對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和絮狀表皮癬菌等常見侵染皮膚的致病菌均有明顯的抑制作用，且這種抗菌作用在極低濃度時便可顯示。這種高效抗菌的特征，對其作為化妝品功能性原料而言，是極為有利的條件[小除千春等，皮膚外用劑，日本特開平5-70333，1993-03-23]。
在中國，牙膏和洗發水中添加茶提取物已有十幾年的歷史。現在，日本三井農林公司已推出多種含茶多酚(茶兒茶素類)的產品，用于食品和化妝品[原征彥等，食品工業，1995，38(2)71]。茶中的類黃酮主要是黃烷醇和黃酮醇，其主要功能為抗氧化、抗癌、抗微生物和除臭。兒茶素屬于黃烷醇類，占綠茶干重的20～30％，茶中主要的黃酮醇包括槲皮素、四羥基黃酮和楊梅黃酮，約占茶水溶性提取物的2～3％。兒茶素的抗菌和除臭作用延緩了牙齒的腐爛(抗齲)，并改善了口氣清新度，因此，可在牙膏、漱口液、口香糖及口氣清新劑中添加，也可應用于其他日用品中，如許多洗發水、滋潤膏、香水和防曬劑中都含有茶提取物，人們相信它們能對皮膚起鎮靜作用，并作為抗氧化劑防止皮膚受到自由基的攻擊[賈旭東，茶類黃酮類功能及其應用，國外醫學衛生學分冊，2001，28(6)369-371]。
葛根的主要成分包括異黃酮類、三萜皂甙類和生物堿等，其中最受關注的是葛根素、大豆苷元等異黃酮成分。葛根中的異黃酮類物質能顯著抑制酪氨酸酶的催化活性，中斷黑素氧化過程，抑制黑素的發生與形成，從而防止黃褐斑、日曬斑等色素沉積。所以葛根被國際化妝品界譽為是又一種源于綠色植物的皮膚脫色組分，并被化妝品科技領先的日本用于祛斑化妝品，日本花王公司已將葛根異黃酮作為活性物質應用于增白霜[唐春紅、陳琪，國內外葛營養保健功能的研究與開發現狀，中國食品添加劑，2002，(6)56～58]。
從甘草根提制的油溶性萃取物中的甘草類黃酮，對皮膚的痤瘡有抑制活性。其水溶性制劑的開發也獲得了成功，對痤瘡、粉刺的防治作用在人體上都得到了證明對睪丸酮-5a還原酶引起的痤瘡和雄性激素引起的痤瘡(對抗雄性激素受體)都有阻止作用；對痤瘡菌引起的痤瘡也有防治作用，對脂肪酶和磷脂肪酶為原因的痤瘡也有阻止作用[山本進，化妝品的新原料信息——甘草類黃酮的水溶性制劑，2001，p12-13]。
其他類黃酮如桔皮苷能防止紫外線引起皮膚細胞脂質過氧化而導致的紅斑和皮膚癌，這意味著它可作為防曬化妝品的理想原料[歐仕益，桔皮苷的藥理作用，中藥材，2002，25(7)531-533]。草珊瑚有效成分中含有黃酮苷、香豆素類、有機酸等，江西草珊瑚集團公司已將其提取物試用于洗發水、洗面奶、沐浴露、防曬霜和牙膏等產品中[胡國順，草珊瑚流浸膏的性能及在化妝品中的應用，日用化學工業，2000(4)61-64]。
我國素有“竹子王國”之稱，擁有十分豐富的竹類資源和源遠流長的竹文化。境內有竹類40多屬400余種，竹林面積約400萬ha。據不完全統計，我國有1億多人口全部或部分從竹林和竹林產品加工中獲取生活費用。竹類植物作為森林資源的重要組成部分，不僅有著較高的經濟價值，而且具有廣泛的生態與社會效益。竹子以其獨特的生物學、生態學及多用途等特點，日益受到人們的重視，在中國可持續發展戰略中正發揮著越來越重要的作用。
我國在竹子有效成分的研究和開發方面處于國際領先水平。竹葉提取物是張英等于20世紀90年代開發的一種植物類黃酮制劑，其發明專利“一種添加竹葉黃酮提取物的保健啤酒(ZL 98 1 04563.4)”和“從竹葉中提取黃酮類化合物浸膏或粉劑的生產方法(ZL 98 1 04564.2)”分別于2000年和2001年獲得國家專利局的授權。大量的研究表明，竹葉黃酮具有優良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒及保護心腦血管、防治老年退行性疾病等生物學功效。并以其豐富的原料來源、明確的功能因子、令人信服的安全性、高效穩定的制劑品質和清新甜香的竹子風味，近年來在功能性食品和醫藥保健品領域嶄露頭角[張英，天然功能性添加劑——竹葉提取物，精細與專用化學品，2002，10(7)20～22]。
竹葉提取物的功能因子主要是C-糖苷黃酮，四種主要的竹葉碳苷黃酮分別是葒草苷(Orientin)、異葒草苷(Homoorientin)、牡荊苷(Vitexin)和異牡荊苷(Isovitexin)。碳苷黃酮與氧苷黃酮相比，具有以下幾方面的突出優點(1)結構穩定，不易被降解；(2)能深入病灶部位，直接發揮療效；(3)親水性增強，有利于食品、藥品、化妝品的開發。國際學術界從90年代起開始關注碳苷黃酮，此領域屬最新的研究前沿。
日本對竹子有效成分的研發始于20世紀70年代，但大量的工作主要集中在具有日本國資源特色的一類草本型竹子[稱竹草(英)Bamboo grass，即Sasaalbomarginta Makino & Shibata等]上，少量涉及剛竹屬品種。NishinaAtsuyoshi等1991曾從毛竹的莖皮中檢出過抗菌活性成分2，6-甲氧基對苯醌[Jof Agric & Food Chem，1991，39(2)266-269]；1997年申請了專利“含有竹葉提取物的抗菌紙”[JP Patent 9961697]；1998年又申請了“含有VB1和竹提取物的食品抗菌劑”的專利[JP Patent 99269020]。Watanabe Mayumi等1997年申請了“含有竹草提取物的抗菌紙”的專利[JP Patent 98310992]。YamanakaSatoshi等(1998)報道了竹子干餾液的抗菌活性及其應用[Gekkan FudoKemikaru，1998，14(9)57-60]。Nishina Atsuro等1996年申報了“含有竹提取物的抗過敏劑”的專利[JP Patent 97278662]。Kiyooka Takatoshi(1995)申報了“用有機溶劑萃取法從竹皮中制備脫臭劑”的專利[JP Patent 9794290]。Sato T.等1986年報道了一種竹葉提取物溶液用于牙齦的治療[NipponShishubyo Gakkai Kaishi，1986，28(2)752-757]。尤為值得一提的是，KenjiMatsui等(1990年)申請的日本專利，指出用一種或多種有機溶劑，從斑竹、毛竹、金毛竹等剛竹屬的竹子中萃取的有效成分能抑制多種頭屑生成菌，防治皮膚老化，并能抑制脂質過氧化和穩定產品[JP Patent 03251518]。但在此專利文獻中，原料來源僅僅指竹(bamboo)，并未指竹葉或全竹，而且沒有說明有效成分為何種化合物。迄今為止，日本的專利和公開報道的文獻并沒有明確指出與上述用途相關的竹子有效成分是黃酮類化合物。
張英及其合作者在先前研究的基礎上，近來又對竹葉總黃酮與皮膚生理學相關的功能進行了系統研究，主要歸納為以下幾個方面。
1竹葉總黃酮的抗氧化、抗衰老作用張英等曾研究了毛金竹[Phyllostachys nigra var.hnonis(Bean)Stepf exRendle]葉提取物抗衰老的生物學功效。結果表明，高劑量組能顯著增強小鼠對非特異性刺激的抵抗能力(常壓耐缺氧試驗，p＜0.01)和抗疲勞能力(游泳試驗，p＜0.01)；對正常小鼠的學習能力有一定的促進作用(電迷路法，p＜0.05)；對老年小鼠體內的超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-px)的活性有顯著誘導作用；明顯地抑制了老年小鼠血漿過氧化脂質(LPO)的生成、降低了肝臟脂褐素(LF)的含量；通過測定小鼠皮膚和尾腱中羥脯氨酸含量的變化，低劑量時就顯示出對膠原蛋白的正效應，表明有抗氧化、抑制脂質過氧化產物、清除脂褐素和保護膠原蛋白的活性[張英、唐莉莉，毛金竹葉提取物抗衰老作用的實驗研究，竹子研究匯刊，1997，16(4)62-67]。
2竹葉總黃酮的抗自由基、抗輻射作用2001年，浙江大學生物物理學專業的碩士研究生——徐兵，通過微弱化學發光分析和熒光光度分析等實驗手段，比較研究了茶多酚、銀杏提取物和竹葉總黃酮三種植物類黃酮清除O2-和OH的活性及其對60Co-r輻照和CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA體系中OH所致DNA損傷的保護作用。
2.1 原材料2.1.1 試樣來源茶多酚含量99％，批號991227，浙江大學農業與生物技術學院楊賢強教授提供；銀杏提取物總黃酮糖苷含量≥24％，批號20000041，寧波市中藥制藥廠生產；竹葉總黃酮總黃酮糖苷含量≥24％，批號980625，浙江大學生物系統工程與食品科學學院張英教授提供。用三蒸水將上述試樣分別配制成1mg/mL的原液，待用。
2.1.2 藥品與試劑小牛胸腺DNA、次黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、魯米諾、鄰菲羅啉(Phen)、熒光探針(EB)均為美國Sigma公司產品；硝酸鉀、硫酸銅、配制PBS和CBS的藥品和試劑等均為分析純；酵母多糖懸液從活性干酵母自制；Vc和雙氧水溶液現配現用。
2.1.3 儀器RF-5000型熒光分光光度計，日本島津公司出品；BPCL-II超微弱發光儀，中科院生物物理所制造；60Co-r輻照源由浙江大學核農所輻照中心提供。
2.2 實驗方法2.1.1 清除活性氧自由基(O2-和OH)的能力測定分別采用Vc-Cu2+-H2O2-酵母多糖體系產生OH、次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶-魯米諾體系產生O2-，用適當濃度范圍的試樣進行抑制，超微弱發光儀測定空白及試驗體系的發光值，計算抑制率，并進一步通過線性回歸方程計算不同試樣對OH和O2-的半抑制濃度(IC50)。
2.1.2 對DNA損傷的保護作用測定2.1.2.1 EB-DNA體系熒光強度檢測法在1mL熒光杯中，加入25μg NDA和2μg EB，再加入一定濃度的試樣溶液，不足部分用10mmol/L的硝酸鉀溶液補足，靜置10min后進行熒光強度的測定。測試條件為狹縫Ex＝5nm，Em＝5nm，激發波長520nm，中等掃描速度，掃描范圍為550～720nm，測定不同條件下最大發射的熒光強度(在580.8nm附近)，并計算試樣對熒光強度的抑制率I。
2.1.2.2 超微弱發光檢測法用0.1mol/L CBS(pH＝10.5)配制CuSO4-Phen-DNA溶液10mL(加入10-2mol/L的鄰菲羅啉490μl、10-2mol/L的CuSO470μl、4×10-4g/mL的DNA 35μl)，取上述溶液858μl，加10-2mol/L Vc溶液42μl，得到體積為900μl的混合液。在混合液中加入不同濃度的試樣后，用CBS補足使總體積為1000μl，置入發光儀測量室中。最后以200μl3％的H2O2啟動反應，記錄化學發光的動力學曲線。
2.1.3 抗DNA的輻照損傷實驗在5mL指形塑料離心管中加入0.4mL的DNA溶液(含DNA100μg)，加入0、20、40、80、160μg/mL的不同試樣，以雙蒸水補齊至2mL。每一試樣的不同濃度均設三個平行樣，對上述系列指管進行γ-射線照射。60CO的源強度約為144000Ci(2001年4月12日)。實驗共設五個劑量，分別為0、0.8、2、8、20Gy，但所有的處理均采用相同的劑量率，為0.5Gy/min。輻照完成后2.5h內迅速按2.1.1中的方法測定。
2.3 結果2.3.1 清除O2-和OH能力的比較表1 三種植物黃酮類提取物試樣清除活性氧自由基的性能比較

比較三種試樣清除O2-和OH的能力，竹葉總黃酮與銀杏提取物非常接近，茶多酚略強于它們，推測與其高純度有關(表1)。
2.3.2 對EB-DNA系統熒光特性的影響三種植物黃酮類提取物對EB-DNA系統熒光強度的抑制呈顯著的濃度依賴關系，從IC50值比較，竹葉總黃酮與銀杏提取物十分接近，均強于茶多酚(表2)。表2三種天然植物黃酮類提取物試樣對EB-DNA系統熒光強度的抑制率

黃酮類化合物可能與EB競爭在DNA分子上的結合位點，將嵌入在DNA堿基對上的EB分子拉下來，這樣，試樣的濃度越高，結合DNA上的EB分子就越少，EB-DNA的熒光強度就越低。
2.3.3 對DNA輻射損傷的保護作用表3 不同劑量的γ-輻照對EB-DNA熒光特性的影響

表3顯示，輻照對DNA溶液可產生直接效應和間接效應。直接效應能引起DNA分子氫鍵破壞、雙螺旋解開、堿基脫落、單雙鏈斷裂等；間接效應主要是由于輻照時所產生的自由基，尤其是OH，攻擊DNA鏈，導致DNA分子的損傷。結果造成EB與DNA結合位點減少，熒光強度值也就降低。
表4、表5和表6分別顯示了不同種類、不同濃度試樣在不同劑量下對EB-DNA熒光強度的影響。類黃酮能有效清除自由基，因此對輻照引起的DNA分子的自由基損傷有顯著的保護作用。茶多酚、銀杏提取物、竹葉總黃酮在20～160μg/mL的濃度范圍內，在不同的劑量下，均能使EB-DNA的熒光強度保持在較高的水平，說明它們具有防護DNA輻照損傷作用，并顯示濃度依賴關系。從三種提取物的保護作用大小看，茶多酚略強于銀杏提取物和竹葉總黃酮，后二者相接近。
表4不同濃度的茶多酚對不同劑量輻照時EB-DNA熒光強度的影響

表5不同濃度的銀杏提取物對不同劑量輻照時EB-DNA熒光強度的影響

表6不同濃度的竹葉總黃酮對不同劑量輻照時EB-DNA熒光強度的影響

2.3.4 對CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA化學發光動力學的影響CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA的化學發光體系在堿性介質中，鄰菲羅啉(Phen)在金屬離子的催化下，能與H2O2作用產生化學發光，其最大發射波長在445～450nm范圍內。據相關文獻報道，O2是引起Phen生成化學發光物的主要因素，在發光動力學曲線上處于前峰位置。同時，體系中產生的OH引起DNA損傷斷裂，產生一延遲于Phen本身發光的慢的化學發光，最大發射波長在380～420nm之間，此發光是游離鳥嘌呤的特征反應，在發光動力學曲線上處于后峰位置。
本發光體系在茶多酚、銀杏提取物、竹葉總黃酮三種試樣存在的情況下，前峰、后峰峰值下降相當明顯，其半抑制濃度約在0.2μg/mL。造成發光峰值的下降是由于抗氧化劑清除了啟動鏈式反應的OH等，減少了.OH等造成的DNA損傷，認為類黃酮起到了預防型抗氧化劑的作用。同時也看出，前峰峰值的出現時間幾乎沒有變化，而后峰峰值滯后，且隨抗氧化劑濃度的增加，峰值后移時間延長。認為造成后峰發光峰值延時是由于試樣清除了自由基鏈式反應的中間態自由基，使鏈式反應中斷，起到防護DNA自由基損傷的作用，說明類黃酮是起斷鏈作用的抗氧化劑。證明了茶多酚、銀杏提取物、竹葉總黃酮等類黃酮化合物同時作為一級抗氧化劑和二級抗氧化劑而起作用[徐兵，幾種天然抗氧化劑對DNA的保護作用及其分子放射生物學機制的研究，浙江大學碩士學位論文，2001]。
3竹葉總黃酮的抑菌、抗炎作用3.1 實驗原材料3.1.1 菌株來源糞腸球菌(E.faecalis)、化膿性鏈球菌(S.pyogenes)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、普通變形桿菌(P.vulgaris)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)來自浙江省人民醫院臨床泌尿生殖道標本中，實驗前3個月內分離所得。標準菌種金黃色葡萄球菌S.aureus(ATCC25923)、大腸埃希菌E.coli(ATCC25922)由浙江省臨床檢驗中心提供。
3.1.2 實驗動物ICR小鼠(清潔級)、體重18～21g、雄性，由浙江省實驗動物中心提供。
3.1.3 試樣竹葉總黃酮總黃酮糖苷含量≥50％，為冷凍干燥的棕褐色結晶樣粉末，置干燥器內儲存，臨用時以蒸餾水配制，超聲波助溶。
3.1.4 藥品及試劑2％巴豆油臨用時以2％巴豆油、20％無水乙醇、5％蒸餾水和73％乙醚配制而成；消炎痛原料藥，由寧波制藥廠惠贈，臨用時以1％CMC-Na混懸配制而成；二甲苯杭州化學試劑廠；M-H肉湯、M-H瓊脂購自浙江省軍區后勤檢驗所工廠；0.22μm的細菌濾膜為美國Milipore公司產品；新生小牛血清超級無支原體，購自杭州四季青生物工程材料研究所。
3.1.5 儀器設備Shell/JB 3200型CO2培養相，美國Sheldon公司產品；DG-3022A型酶聯免疫檢測儀，華東電子管廠出品；COIC型生物倒置顯微鏡，重慶光學儀器廠制造；SC-1型水平層流凈化工作臺，蘇州潔凈技術研究所制造；CQ250超聲波清洗器，中船總公司七院七二六所超聲儀器廠出品。
3.2 方法與結果
3.2.1 抑菌作用參照《中華人民共和國衛生部醫政司全國臨床檢驗操作規程》第二版有關內容進行。
化膿性鏈球菌按藥物液體稀釋法進行在滅菌M-H肉湯中加入10％量滅活的小牛血清，再加入試樣制成25mg/mL濃度后，經滅菌大注射器裝細菌濾膜除菌過濾處理。其無菌濾液按2倍遞次以滅菌M-H血清培養基液稀釋，每管1mL。各管加入經4～6小時培養的幼齡化膿鏈球菌液0.05mL(總含菌量為104c.f.u)置35℃恒溫箱培養20～24h后，以其不出現細菌生長之最低藥物含量管作為其MIC值。
其他細菌以藥物對倍稀釋法進行將各小瓶分裝之M-H瓊脂、高壓滅菌溶化后，冷卻至55℃左右，加入不同量的試樣，使之分別成為25.0、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78和0.39mg/mL濃度，設一不加藥的M-H瓊脂作為加菌后陽性生長對照皿。然后在各皿中滴加6種(見3.1.1菌株來源)經比濁定菌濃度之菌液0.05mL(總含菌量為104c.f.u)，用接種環涂成小園斑(均為4～6h幼齡菌)，干后覆皿，置35℃恒溫培養16～20h后，以其不出現細菌生長之最低試樣濃度管作為其MIC值。
表7 竹葉總黃酮的抑菌作用

結果表明竹葉總黃酮對上述7種細菌均有不同程度的抑制作用(表7)。
3.2.2 抗炎作用3.2.2.1 對小鼠巴豆油致耳廓腫脹的影響小鼠按體重隨機分成5組，每組12只，設置如下①對照組等體積生理鹽水，0.8mL/20g；②消炎痛組消炎痛10mg/kg；③高劑量組10mg/mL的BLTF-01，劑量為400mg/kg；④中劑量組5mg/mL的BLTF-01，劑量200mg/kg；⑤低劑量組2.5mg/mL的BLTF-01，劑量100mg/kg。動物每天p.o.給藥1次，連續7d(消炎痛僅給藥1次)，末次給藥后1h，小鼠右耳涂2％巴豆油0.02mL/只、致炎，4h后處死，沿耳廓剪下左右耳，以9mm環鉆沖下左右耳片，稱重，以左右耳片重量之差值記作腫脹率。
實驗結果表明，小鼠灌胃給予200mg/kg和400mg/kg劑量的竹葉總黃酮連續7天后，對巴豆油所致耳廓腫脹具有顯著(*p＜0.05)和極顯著(p＜0.01)的抑制作用，并呈明顯的劑量依賴關系(表8)。表8 竹葉總黃酮對小鼠巴豆油所致耳廓腫脹的影響

注與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
3.2.2.2 對小鼠二甲苯致耳廓腫脹的影響小鼠按體重隨機分成5組，每組10只，設置同3.2.2.1。動物每天p.o.給藥1次，連續7d(消炎痛僅給藥1次)，末次給藥后30min，小鼠右耳涂二甲苯0.05mL/只、致炎，15min后處死，沿耳廓剪下左右耳，以9mm環鉆沖下左右耳片，稱重，以左右耳片重量之差值記作腫脹率。并與對照組比較，判斷療效。
表9 竹葉總黃酮對小鼠二甲苯所致耳廓腫脹的影響

注與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
實驗結果表明，小鼠灌胃給予400mg/kg劑量的竹葉總黃酮連續7天后，對二甲苯所致耳廓腫脹具有顯著(*p＜0.05)的抑制作用(表9)。
4 竹葉總黃酮的皮膚生理活性4.1 實驗材料與方法4.1.1 試樣竹葉總黃酮棕黃色粉末，總黃酮含量為28.7％。試樣用DMSO溶解，經0.22μm濾膜抽濾除菌，以無血清DMEM稀釋為受試濃度，終濃度為0.5％、0.05％和0.005％，-4℃保存。以無血清DMEM作為對照。
4.1.2試劑、器皿、儀器DMEM培養基、角質形成細胞(K-SFM)培養基(Gibco BRL公司)，胰島素(美國Sigma公司)、胰蛋白酶(美國Difco公司)小牛血清(NBS，杭州四季青公司)，四甲基偶氮唑(MTT，美國Fluka公司)，二甲亞砜(DMSO，上海生物化學研究所)；化可的松、青霉素、鏈霉素、Ficoll、96孔板及24孔板、及35mm培養皿和25cm2培養瓶(美國Corning公司)。酶標儀(BIO-TEK公司)、pH計、超凈臺、培養箱、722分光光度計。
4.1.3 細胞培養4.1.3.1 皮膚角質形成細胞的原代培養在無菌條件下剝離SD大鼠(3日齡)背部皮膚，將皮片置于4℃冰箱中30～60min貼壁，垂直緩慢地加入0.25％胰酶，于4℃冰箱過夜(10～11h)，然后用PBS漂洗，并用含10％NBS的DMEM培養液中和胰酶。分離表皮與真皮，刷取表皮基地層角質形成細胞，離心去除成纖維細胞。用K-SFM培養基將細胞密度調整至1×106/mL，接種于96孔板及24孔板，24h后換第一次液，以后每隔1d換液。待細胞生長至亞融合狀態，饑餓處理24h后加入各濃度試樣。
4.1.3.2 皮膚成纖維細胞的原代培養將分離的真皮繼續消化90min，以含10％NBS的DMEM中和胰酶，于DMEM中剪碎并吹打，100目濾網過濾，洗細胞2次，用含10％NBS的DMEM培養液調整細胞密度至2×106/mL，接種于96孔板。24h后換第一次液，以后每2～3d換液。當細胞生長至80％融合時，饑餓處理24h后加入各濃度受試物。
4.1.3.3 B-16黑素瘤細胞培養用含15％NBS的DMEM培養基調整細胞數目至1×104個/ml，接種于培養瓶及35mm培養皿。
4.1.4 細胞增殖活力測定
96孔板每孔接種2×105個細胞，當培養達亞融合狀態后換液并加入各濃度受試物，每一濃度為4個樣本。加藥后24h各孔加10μl MTT，繼續培養4h，棄上清，加100μl溶解液后，在酶標儀上于570mm、630nm處檢測。
4.1.5 脂質過氧化產物(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)測定MDA測定采用TBA比色法，SOD測定采用亞硝酸鹽還原法，試劑盒由南京建成生物公司提供。
4.1.6 黑素細胞酪氨酸酶活性及合成黑素測定4.1.6.1 酪氨酸酶活性測定將B16細胞密度調成1.0×104個細胞，每個35mm培養皿接種1.0mL細胞懸液，培養24h.。細胞處倍增期時加入各濃度受試物，24h時收獲細胞，用PBS沖洗兩遍，加入2.0Ml PBS(內含0.1％Triton-X)，37℃、30min后，取出細胞碎片液0.1mL，進行蛋白質測定。在剩余液中加入含有0.1％L-DOPA的PBS 2.0mL，37℃孵育1h，400nm處比色測定。
4.1.6.2 黑素合成測定將細胞密度調稱1.0×104個細胞，接種于培養瓶中培養24h，加入受試物，48h換L液，受試液作用72h收獲細胞。將細胞用PBS沖洗，用胰蛋白酶消化。搜集細胞溶解在2mL PBS中，取出0.2mL測定蛋白質含量。在剩余0.9mL細胞液中，加入1.8mL、4mol/L的NaOH，100℃下加熱20min，于400nm處比色測定。
4.1.7安全性評價測試根據1999年國家衛生部頒布的《化妝品衛生規范》中的安全性評價程序和方法進行。受試物濃度為10％。皮膚刺激試驗取受試物0.2ml涂于皮膚上。每天一次，每次1h，連續14天；眼刺激試驗將受試物0.1ml滴入結膜囊中，于染毒后1、24、48、72h以及第4天、第7天對動物眼睛進行檢查。
4.2 結果4.2.1 對皮膚細胞的增殖作用表10顯示竹葉總黃酮在0.005％～0.05％劑量范圍內具有促進皮膚細胞增殖的作用，其中對皮膚角質形成細胞的增殖作用在0.005％濃度時顯著(p＜0.05)、在0.05％濃度時極顯著(p＜0.01)；對皮膚成纖維細胞的增殖能力與對照組相比也有顯著性差異(0.005％時，p＜0.05)。
表10 竹葉總黃酮對兩種皮膚細胞增殖能力的影響

注*p＜0.05，**p＜0.01，與對照相比。
4.2.2 對皮膚細胞MDA生成量與SOD活性的影響表11可見，竹葉總黃酮在0.0005％～0.005％劑量范圍內具有減低脂質過氧化產物MDA生成、提高抗氧化酶SOD活性的作用，其中0.005％劑量組與對照相比具有顯著性(p＜0.05)。
4.2.3 皮膚美白功效B16黑素腫瘤細胞酪氨酸酶抑制試驗結果表明，竹葉總黃酮對該酶活性無明顯影響；而由黑素合成試驗結果得知，0.005％～0.05％濃度時對黑素合成具有顯著的抑制作用(見表12)。
表11竹葉總黃酮對皮膚角質形成細胞MDA生成與SOD活性的影響

注*p＜0.05，與對照相比。表12 竹葉總黃酮對B16黑素腫瘤細胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影響

注*p＜0.05，**p＜0.01，與對照相比。
4.2.4 皮膚安全性評價測試竹葉總黃酮的皮膚刺激試驗及眼刺激試驗結果均為陰性，顯示無皮膚及眼刺激性。
4.3 結論皮膚刺激試驗與眼刺激試驗是了解外來物在與皮膚或粘膜接觸的情況下，是否對皮膚產生刺激損害作用或導致粘膜發生炎性病變，是化妝品及其生產原料安全性評價的必檢項目。測試結果顯示，竹葉總黃酮的皮膚和眼結膜刺激反應均為陰性，表明在皮膚外用條件下，對人體皮膚及粘膜不會產生刺激作用。試驗表明，竹葉總黃酮對皮膚細胞具有良好的生物學作用，能夠促進皮膚角質形成細胞及成纖維細胞的增殖能力，同時提高SOD活性，降低氧化損傷，提示竹葉總黃酮可作為延緩皮膚衰老的活性物質應用到化妝品中。皮膚美白功效測試發現，竹葉總黃酮能夠降低黑色素細胞合成黑素的含量，提示可能具有對皮膚的美白功效。
竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子應用在化妝品中。
本發明的優點是提供了一種來源廣闊、安全高效、經濟適用的抗衰老護膚因子——竹葉總黃酮，對其與皮膚生理功能相關的特性進行了系統研究，表明其具有抗自由基、抗氧化、抗輻射，抗菌、抑菌，促進皮膚細胞增殖，防止皮膚的氧化損傷，減少黑素合成，延緩皮膚衰老等美容功效，并能賦予產品以竹子特有的清香，在諸如營養滋潤劑、防曬護膚劑、抗皺美白劑、潔面乳、洗發水、沐浴露等日用化妝品領域有著廣闊的應用前景。


圖1是竹葉總黃酮的紅外譜圖(經溴化鉀壓片)；圖2是竹葉總黃酮的紫外譜圖(溶于光譜純的甲醇)。
具體實施方法本發明所指的竹葉總黃酮是從禾本科(Graminae)、竹亞科(Bambusoideae)、剛竹屬(Phyllostachys Sieb.et Zucc)品種的葉子中得到的不同精度的黃酮制劑，其生產工藝在張英以前的二項發明專利(專利號分別為ZL 98 1 04564.2和ZL 98 1 04563.4)中已有涉及。需要指出的是，本專利所指的竹葉總黃酮既可以是采用上述專利工藝得到的產品，也可以是在此基礎上進一步運用吸附～解吸、膜分離、超臨界流體萃取等高新技術及其組合方法精制得到的竹葉黃酮制品。
竹葉總黃酮的外觀為黃色或棕黃色粉末(也可以浸膏形式存在)，總黃酮糖苷含量(以干基計)可以變化在10～90％之間，其中葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷四種主要碳苷黃酮的含量占總黃酮糖苷含量的50％以上。經溴化鉀壓片后的紅外光譜圖顯示，竹葉總黃酮在3400、2925、1610、1118、1077cm-1等附近有特征性吸收(見附圖I)；將其溶于光譜純甲醇后，在200～600nm的波長范圍內進行掃描，譜圖顯示在240～280nm之間有一強吸收峰，在340～380nm之間有一次強吸收峰，符合黃酮類化合物的典型特征(見附圖II)。
竹葉總黃酮的化學試劑鑒別取試樣0.5g溶于100mL95％的乙醇中，①取上述溶液1 mL，加1％FeCl3-乙醇溶液2～3滴，應顯深藍色或蘭紫色。②取上述溶液1mL，加1％AlCl3-乙醇溶液2～3滴，應呈鮮黃色。③取BLTF0.5g，加入10mL乙醚，超聲波輔助萃取30s，過濾。取濾液1mL，置70～90℃的水浴中揮干乙醚后，依次加入2％的間二硝基苯溶液(用95％乙醇配制)和2.5mol/L的KOH水溶液各1mL，應立即出現微紅色，放入上述熱水浴中，迅速變成深紫紅色。
本發明所涉的最新研究表明，竹葉總黃酮對皮膚和粘膜無刺激、過敏性反應；具有可與茶多酚和銀杏提取物相媲美的抗自由基、抗氧化和抗輻射活性；在0.005％～0.05％的劑量范圍內即能顯著地促進皮膚細胞的增殖，并能顯著地抑制黑素的合成；在0.0005％～0.005％劑量范圍內即能顯著減低MDA生成，并提高SOD的活性，具備了作為一種安全、高效、經濟的植物化學素用作抗衰老護膚因子的充分和必要的條件。
鑒于竹葉總黃酮所具有的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗菌、抑菌、消炎、美白、抗皺等多重生物學等功效，同時符合作為化妝品添加劑的安全性要求，可作為抗衰老護膚化妝品的功能性因子，應用在諸如營養滋潤劑、防曬護膚劑、抗皺美白劑、潔面乳、洗發水、沐浴露等多種日用化妝品中。
除了竹葉總黃酮中的功效成分外，本發明的護膚因子可以與通常用于化妝品中的組分適當地配合、制成各種不同用途的產品。這些其他的組分可以包括各種維生素及其衍生物、透明質酸、表面活性劑、潤濕劑、螯合劑、pH調節劑、賦形劑、其他紫外線吸收劑、防腐劑、染料、香料等。
本發明的化妝品可以制成各種形式，如油質化妝品、乳劑化妝品、水質化妝品。
本發明化妝品具有美白、抗皺、防曬、消炎、祛斑和祛豆等美容護膚效果。
本發明將通過下列非限制性實施例進行舉例說明。以下配方實例中的單位均為重量百分比(w/％)。
實施例1營養美容露(霜)蜂蠟 13～17精制地蠟 13～17凡士林15～20羊毛脂 3～7橄欖油 8～12聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯 2～6香料 0.1～1竹葉總黃酮0.005～0.05水加至100。
本產品對皮膚有抗菌、美容、改善血液循環、促進新陳代謝、增強皮膚活力、潤濕表皮、抑制異狀皮脂分泌，以及活化細胞、抗組織毒等作用。
實施例2抗皺增白蜜L-抗壞血酸及其衍生物 1～3橄欖油 10～20肉豆蔻酸異丙酯3～7壬基酚聚氧乙烯醚 0.1～1甘油 3～7透明質酸 1～3竹葉總黃酮 0.005～0.05乙醇 5～10水 加100。
本品具有抗皺、美白、保濕、祛斑等作用。
實施例3防曬霜十六～十八醇 6～10白油26#3～6棕櫚酸異丙酯 3～6二甲基硅油 1～2單甘酯 2～3
羊毛酯 0.1～1聚乙二醇-6000 0.1～1甘油 2～6竹葉總黃酮 0.005～0.05SPP-200(磷酯季胺化物陽離子乳化劑) 2～3香精、防腐劑 0.1～1水 加至100。本品具有防曬、抗衰老及護膚功效。
本品具有抑制皮膚表面的有害菌，活化皮膚細胞，調理皮膚及預防皮膚癌的作用，并使浴后的身體長時間帶有一種怡人的清香。實施例6洗發香波十二烷基硫酸鈉 40～60羥丙基纖維素0.5～1.5油基二乙醇酰胺 3～7陽離子型動物蛋白3～7
聚乙二醇羊毛酯 1～3尼泊金甲酯 0.1～0.3季胺化合物-15 0.05～0.15聚氨基丙基雙胍氯代二甲苯酚0.05～0.15大豆磷脂0.1～1竹葉總黃酮 0.01～0.5水 加至100。
本品除可使頭發發亮、柔軟、易梳外，還可防止洗發過程中角蛋白的流失，防止頭發的枯黃分叉，防治頭皮瘙癢，從而起到保護頭發的功效，并使洗后的頭發長時間帶有一種淡雅的香味。
顯然，根據上述的實例，本發明可以有許多的改良和變更。因此，應當明白，在所附權力要求的范圍內，除這里描述的外，本發明也可以用其他方法實施。
權利要求
1.一種竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在化妝品中的應用，其特征在于竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子應用在化妝品中。
2.根據權利要求1所述的竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在化妝品中的應用，其特征在于所說的化妝品為營養美容露(霜)、抗皺增白蜜、防曬霜、洗面奶、沐浴露、洗發香波。
3.根據權利要求2所述的竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在化妝品中的應用，其特征在于所說的營養美容露(霜)的重量百分組成為蜂蠟 13～17精制地蠟 13～17凡士林15～20羊毛脂 3～7橄欖油 8～12聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯 2～6香料 0.1～1竹葉總黃酮 0.005～0.05水 加至100。
4.根據權利要求2所述的竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在化妝品中的應用，其特征在于所說的抗皺增白蜜的重量百分組成為L-抗壞血酸及其衍生物 1～3橄欖油 10～20肉豆蔻酸異丙酯3～7壬基酚聚氧乙烯醚0.1～1甘油 3～7透明質酸 1～3竹葉總黃酮0.005～0.05乙醇 5～10水加100。
5.根據權利要求2所述的竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在化妝品中的應用，其特征在于所說的防曬霜的重量百分組成為十六～十八醇 6～10白油26#3～6棕櫚酸異丙酯 3～6二甲基硅油 1～2單甘酯 2～3羊毛酯 0.1～1聚乙二醇-6000 0.1～1甘油 2～6竹葉總黃酮0.005～0.05SPP-200(磷酯季胺化物陽離子乳化劑) 2～3香精 防腐劑 0.1～1水 加至100。
6.根據權利要求2所述的竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在化妝品中的應用，其特征在于所說的洗面奶的重量百分組成為維生素E及其衍生物 0.05～0.5三硬脂酸甘油酯 6～10鯨蠟醇 1～3液體石蠟 8～16竹葉總黃酮0.01～0.05三乙醇胺 1～3丙二醇 4～8水 加至100。
7.根據權利要求2所述的竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在化妝品中的應用，其特征在于所說的沐浴露的重量百分組成為兩性月桂酸基羥丙基磺酸鹽 20～30椰子油酸酰胺丙基羥丙基磺化甜菜堿7～13月桂基醚硫酸鹽(30％) 8～12月桂酰胺基二乙醇胺0.5～1.5竹葉總黃酮 0.01～0.5水 加至100。
8.根據權利要求2所述的竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在化妝品中的應用，其特征在于所說的洗發香波的重量百分組成為十二烷基硫酸鈉 40～60羥丙基纖維素 0.5～1.5油基二乙醇酰胺3～7陽離子型動物蛋白 3～7聚乙二醇羊毛酯1～3尼泊金甲酯0.1～0.3季胺化合物-15 0.05～0.15聚氨基丙基雙胍氯代二甲苯酚 0.05～0.15大豆磷脂 0.1～1竹葉總黃酮0.01～0.5水加至100。
全文摘要
本發明公開了一種竹葉總黃酮作為抗衰老護膚因子在化妝品中的應用，目的是為化妝品行業提供一種天然植物來源的抗衰老護膚因子。竹葉總黃酮具有抗自由基、抗氧化、抗輻射、抗菌、抑菌、促進皮膚細胞增殖、防止皮膚的氧化損傷、減少黑素合成、延緩皮膚衰老等美容功效，且對皮膚和粘膜無刺激、過敏性反應，并能賦予產品以竹子特有的清香，可應用在諸如營養滋潤劑、防曬護膚劑、抗皺美白劑、潔面乳、洗發水、沐浴露等多種日用化妝品中。
文檔編號A61K8/49GK1436524SQ0311565
公開日2003年8月20日 申請日期2003年3月3日 優先權日2003年3月3日
發明者張英, 吳曉琴, 陸柏益 申請人:杭州浙大力夫生物科技有限公司