專利名稱:毛蕊花甙的新用途的制作方法
技術領域:
本發明涉及多酚類化合物毛蕊花甙的一種用途。
氫譜1HNMR(400MHz,DMSO-d6,TMS)δppm0.97(d,J=6.0Hz,3H,鼠李糖的甲基),2.70(t,J=7.0Hz,2H,Ar-CH2-CH2),4.36(d,J=7.2Hz,1H,葡萄糖的H-1),4.72(t,J=9.6Hz,1H,葡萄糖的H-4),5.03(d,J=1.1Hz,1H,鼠李糖的H-1),6.21(d,J=15.8Hz,1H,Ar-CH=CH),6.49-7.01(6H,芳環H),7.47(d,J=15.8Hz,1H,Ar-CH=CH),8.69,8.75,9.19,9.62(4×OH)。
碳譜13CNMR(100MHz,DMSO-d6,TMS)δppm129.1(C-1),116.3(C-2),145.0(C-3),143.5(C-4),115.8(C-5),119.5(C-6),70.2(C-α),35.0(C-β),125.5(C-1’),114.7(C-2’),145.5(C-3’),148.4(C-4’),113.6(C-5’),121.4(C-6’),115.5(C-α’),145.5(C-β’),165.7(C=O)。葡萄糖102.3(C-1),74.5(C-2),79.1(C-3),69.1(C-4),74.5(C-5),60.7(C-6)。鼠李糖101.2(C-1),70.5(C-2),70.4(C-3),71.7(C-4),68.7(C-5),18.1(C-6)。
質譜FABMS(m/s)631[M+Li]+,64.7[M+Na]+。
其分子結構如下 中國發明專利申請99123015.9公開了毛蕊花甙的提取方法。在中國發明專利申請99123009.4中曾公開了毛蕊花甙在治療肌肉疲勞的藥物中的應用。但毛蕊花甙在藥物中的其它應用尚未有披露。
在本發明中,毛蕊花甙是在口服的,或者在靜脈注射的,或者在肌肉注射的,或者在腹腔注射的癌癥治療藥物中的應用。
現所用的各類治療癌癥的藥物一般會對正常的組織都有破壞作用,甚至有部分治療癌癥的藥物有較大的毒性,正是由于這些原因,使其在臨床應用中受到很大的限制,同時也使其治療效果受到影響。但經發明人研究表明,采用毛蕊花甙于治療癌癥治療基本上不會對正常組織產生破壞或負面的影響,也基本上沒有毒副作用。本發明還驚奇地發現毛蕊花甙還具有使已癌變的組織誘導逆轉為正常組織的現象,而這一現象在已披露的研究中還未見過報道。本發明將結合具體實施例詳細說明。
先將人肝癌細胞(MHCC97-H)接種到一只健康裸鼠皮下,待長成瘤塊后,把瘤塊剝離下來,切成多個3mm3的小塊。取健康的裸鼠12只,在每只裸鼠的左側背部接種一個小塊。然后對受試鼠正常飼養10天。10天后受試鼠身上的瘤塊長大,再將受試裸鼠隨機分為給藥組和對照組,每組6只鼠。將毛蕊花甙用生理鹽水溶解,給藥組鼠按200mg/kg劑量,用腹腔注射方式給藥,每天一次,連續給藥17天;對照組腹腔注射與給藥組等量的生理鹽水。待第18天,處死受試鼠,剝離瘤塊,并測其體積和重量,同時測血清的甲胎蛋白含量,所測數據見表1
*p<0.05,**p<0.01,n為實驗鼠的只數結果表明本發明的藥物可以明顯抑制瘤塊的生長,對瘤塊體積和重量,分抑制了74.2%和67.7%。并且本發明還可使作為肝癌惡性標志的血清甲胎蛋白有明顯的減少,使甲胎蛋白降低了69.4%。這表明本發明可使肝癌的惡性大大降低。
實施例2先將人胃腺癌細胞(MGc80-3)溫育(即在溫度為37℃,5%二氧化碳的細胞培養箱中進行培養)于濃度為20μmol/L毛蕊花甙的RPMI-1640培養液中,同時將等量的人胃腺癌細胞溫育于不含藥物,卻含有DMSO的RPMI-1640培養液中作為對照組。溫育7天后收集細胞,常規清洗3次后,制成5×107/mL的細胞溶液。取健康裸鼠8只,在每只鼠臀部一側用注射器注入經藥處理過的5×106個細胞,再在每只鼠臀部另一側用注射器注入等量的對照組的細胞作為對照。正常飼養四周后8只裸鼠的對照側部位均長出較重的瘤塊,其平均重量約1g,而經藥物處理側只有一只鼠長出約0.5g重的瘤塊。這一實驗表明本發明能使人胃癌細胞丟失惡性,向正常細胞逆轉。
實施例3用人胃腺癌細胞(MGc80-3)和人胃癌細胞(MKN45)作為本實施例的實驗材料。
將5×104/mL的人胃腺癌細胞放入RPMI-1640培養液中,在37℃,5%的二氧化碳條件下培養24小時。棄去培養液后,將這些胃腺癌細胞分成兩份,一份放入含20μmol/L的毛蕊花甙的RPMI-1640培養液進行培養,另外一份放入不含毛蕊花甙,但含200mmol/LDMSO的RPMI-1640培養液中作為對照進行培養。溫育7天后收獲細胞,用D-Hank’s溶液洗三次,配成1×106個細胞/mL的細胞液。測細胞表面電荷和細胞數倍增時間。另取部分細胞置蓋玻片上培養,用含2.5%戊酰醛,pH值為7.4的0.1mol/L的磷酸緩沖液在4℃固定樣品,然后用乙醇脫水,置于臨界干燥器內干燥處理,再給細胞鍍金。用日立產S-520掃描電鏡觀察細胞表面形態變化。
將人胃癌細胞(MKN45)分為等量的若干組,分別置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中,給藥組分別加入不同濃度的的毛蕊花甙水溶液,對照組不加入任何藥物,僅加入等量的蒸餾水。將各組在前述溶液中,37℃,5%的二氧化碳條件下溫育48小時。收獲細胞,用SDS溶解劑使細胞溶解,置于冰上30分鐘后,在4℃ 1600rpm轉速下離心20分鐘,再用PCR ELISA端粒酶試劑盒測端粒酶活性。用端粒酶半抑制濃度的毛蕊花甙(17.7μg/ml)溫育人胃癌細胞8周后進行離心處理,再分離細胞基因組DNA,按常規程序測端粒長度;并用流式細胞儀測癌細胞凋亡。
經上述實驗后的分析表明本發明有如下效果1、可使人胃腺癌細胞生長減慢。對照組的細胞倍增時間為48.2小時,而經藥物處理組的細胞倍增時間延長到68.5小時。
2、可使癌細胞表面電荷減少。經藥物處理組細胞的表面電荷比對照組細胞的表面電荷減少28.4%以上。
3、對細胞表面形態的觀察表明,本發明可使癌細胞表面微纖毛脫落,變得接近正常細胞那樣光滑。
4、可使人胃癌細胞的端粒酶活性降低50%以上。
5、可使端粒長度明顯縮短。對照組的癌細胞端粒長度為7.31kb,而經本發明的藥物處理過的癌細胞的端粒長度則縮短到6.20kb。
6、適度的藥物濃度可使癌細胞凋亡。在上述的實驗中發現,當藥物濃度為17.8μg/ml時癌細胞凋亡18.3%,而對照組不發生癌細胞的凋亡現象。
以上的結果表明毛蕊花甙可使癌細胞趨向于逆轉,成為正常細胞,同時還可使癌細胞凋亡。上述效果的1和4還表明本發明可以使癌細胞永久分裂能力明顯降低,這也表明經毛蕊花甙處理后癌細胞的惡性變弱了。
實施例4取健康的昆明小白鼠40只,雌雄各半,分為對照組(10只鼠)、實驗一組(15只鼠)和實驗二組(15只鼠)等三組,每3-5只鼠一籠,雌雄分養。在禁食24小時后按預設藥物劑量進行注射,各組實驗如下對照組生理鹽水注射,0.4ml/只,每天腹腔注射一次,共14天。
實驗一組0.8g(毛蕊花甙)/kg(鼠體重),0.4ml/只,每天腹腔注射一次,共14天,累計毛蕊花甙總劑量為11.2g/kg。
實驗二組2.0g(毛蕊花甙)/kg(鼠體重),0.4ml/只,每天腹腔注射一次,共14天,累計毛蕊花甙總劑量為28.0g/kg。
實驗中在每次腹腔注射后30~40分鐘內觀察受試鼠有無肉眼可見之異常反應,在實驗的14天內觀測鼠的飲食、糞便、行為、皮毛等情況。于第15天將鼠處死,進行尸檢,肉眼檢測鼠的心、肝、脾、腎、肺等器官,并做病理切片進行鏡檢和染色體檢查。實驗結果如下(1)每次注射后的30~40分鐘中對照組雌鼠嗜舔皮膚針口,稍后開始正常進食和飲水,鼠行動自如;實驗組(包括實驗一組和實驗二組)注射后鼠縮在一角不動,約5分鐘后開始行動,似略有不適;食欲不如對照組強,約10分鐘后各鼠行動基本正常,皮毛干燥,同時雌鼠嗜舔皮膚針口。
(2)連續注射14天期間兩個實驗組鼠體重與對照組相當,參見表2。鼠的皮毛干燥、光滑,無出汗和倒毛現象,飲食、糞便和行動均正常,詳細情況見表3。在實驗期間無一鼠死亡。
(3)尸檢結果肉眼觀察各受試鼠的心、肝、脾、腎、肺等器官均無可見異常,各器官色澤正常,無斑點等病態反應見表3(4)病理組織切片鏡檢心臟心肌組織正常,心肌細胞核染色清晰,心肌纖維形態正常,無肥大等異常現象。
肝肝組織結構正常,肝細胞核染色清晰,形態與正常對照組相同,肝細胞結構完整,無腫脹現象。
胃胃粘膜上皮組織正常,胃腺正常。
腎腎組織結構正常,腎小體及腎小管各段與正常對照組無區別。
結論依據我國衛生部藥政局頒布的《新藥(西藥)臨床前研究指導原則匯編》中關于大鼠長期毒性指導原則中有關限度實驗的要求“如小鼠急性毒性的口服給予藥劑量大于5g/kg體重,注射劑量大于20g/kg重仍未產生毒性反應和死亡或僅個別有毒性反應時,可考慮只做一個高于擬用于臨床劑量50倍的劑量組”可以看出毛蕊花甙基本是屬于無毒的。完全可以作為口服用藥,或者局部肌肉注射用藥,或者是靜脈注射用藥,或者是腹腔注射用藥。
權利要求
1.毛蕊花甙的新用途,其特征是在癌癥治療藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的毛蕊花甙的新用途,其特征是在口服的癌癥治療藥物中的應用。
3.根據權利要求1所述的毛蕊花甙的新用途,其特征是在靜脈注射的癌癥治療藥物中的應用。
4.根據權利要求1所述的毛蕊花甙的新用途,其特征是在肌肉注射的癌癥治療藥物中的應用。
5.根據權利要求1所述的毛蕊花甙的新用途,其特征是在腹腔注射的癌癥治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開多酚類化合物毛蕊花甙在癌癥治療的藥物中的應用。本發明中,毛蕊花甙是在口服的,或者在靜脈注射的,或者在肌肉注射的,或者在腹腔注射的癌癥治療藥物中應用。
文檔編號A61K31/7028GK1478479SQ0311445
公開日2004年3月3日 申請日期2003年1月16日 優先權日2003年1月16日
發明者賈忠建, 鄭榮梁 申請人:蘭州大學, 蘭州愛德華實業有限公司