專利名稱：一種硫脲衍生物在制備治療眼黃斑變性藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于一種一氧化氮供體硫脲衍生物在藥學上的應用，具體為反式硫脲衍生物在防治年齡相關性眼病方面的用途。
背景技術：
年齡相關性黃斑變性(AMD)是一種常見老年病，僅美國就有200～300萬患者，在我國人數更多，約有1200～1500萬。AMD的特征性表現是黃斑區出現玻璃疣，伴有脈絡膜新生血管(CNV)形成或地圖樣萎縮斑。近來，視網膜光凝用于低視力患者中心凹旁和復發性CNV的治療。然而，這種治療能否預防視力損害尚不清楚。至于那些視力尚好的中心凹旁CNV患者(大多數熒光血管造影為典型AMD者)通過光動力治療(PDT)，有半數患者取得了效果。目前，對地圖樣萎縮斑的AMD沒有治療辦法。換言之，只有三分之一或更少的AMD患者可以進行PDT治療，而其中只有一半患者經過治療保留視力而不至于失明。
在大多數AMD患者中，CNV形成的主要原因是AMD早期的脈絡膜循環障礙。要預防AMD發生，必須改善和促進脈絡膜血流。因此，當務之急是尋找能選擇性增加脈絡膜血流的藥物。
發明內容
本發明要解決的技術問題是尋找一種能夠防治AMD的藥物，其能夠選擇性地促進眼的脈絡膜血流，消除脈絡膜循環障礙，抑制AMD的脈絡膜新生血管形成。
為解決上述問題，本發明提供下述技術方案。
反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環-2-基]苯基}硫脲在制備治療或預防年齡相關性黃斑變性的藥物中的應用；其特征在于用于制備選擇性改善脈絡膜血流的藥物；其特征在于用于制備抑制脈絡膜新生血管形成的藥物。
前述反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環-2-基]苯基}硫脲在制備治療或預防年齡相關性黃斑變性的藥物中的應用，其特征在于用于制備外用眼藥。
反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環-2-基]苯基}硫脲在制備促使細胞釋放一氧化氮的藥物中的應用；尤其是在制備促使眼細胞釋放一氧化氮的藥物中的應用。
發明人對一氧化氮供體(NO Donor)的研究結果發現，N-苯基取代的硫脲類化合物(代號ZX-5)，化學名稱為反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環-2-基]苯基}硫脲，能引起培養細胞釋放多量NO，并能增加兔眼脈絡膜血流，但對虹膜和睫狀體血流沒有影響。其異構體(代號ZX-4)順式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環-2-基]苯基}硫脲，既不引起NO釋放，也不增加眼組織血流。
脈絡膜血流的增加可能是NO在脈絡膜釋放的結果。ZX-5點眼能選擇性改善脈絡膜血流很有價值，因為脈絡膜位于眼球后部，說明藥物點眼后，通過全身循環或鞏膜—葡萄膜—視神經途徑，能快速到達脈絡膜，對AMD的脈絡膜新生血管形成有抑制作用，可望用于早期AMD的治療或預防。
1.化學合成ZX-4和ZX-5的合成以沒食子醛1為起始原料，經相轉移催化反應得環氧化合物2，2經水解得二醇3，3與硝基芳醛縮合得二氧戊環化合物4，柱色譜分離得順反異構體5和6，它們經還原分別得相應的氨基物7和8。7和8與異硫氰酸苯酯反應得ZX-4和ZX-5。合成路線參見下頁圖示。
1-(3，4，5-三甲氧基苯基)環氧乙烷(2)的合成將沒食子醛(39.2g，200mmol)、溴化四丁基銨(1.58g，4.91mmol)、CH2Cl280mL投入圓底燒瓶中，攪拌使其溶解，滴入冷的50％NaOH溶液80mL，約15分滴畢，再加入碘化三甲基锍(40.8g，200mmol)，回流反應15h。加水180mL，分出油層，水層以CH2Cl2萃取，無水硫酸鎂干燥，蒸去溶媒，固化得微黃色固體，甲醇重結晶，得白色結晶33.98g，收率81.3％，mp54～56℃。
1-(3，4，5-三甲氧基苯基)乙烷-1，2-二醇(3)的合成將化合物2(11.2g，0.053mol)、蒸餾水(200mL)加入500mL三頸瓶中，室溫機械攪拌，緩慢滴加0.8mL高氯酸，劇烈攪拌反應5h，溶液逐漸澄清透明，停止反應。用NaHCO3調pH值約為7，用乙酸乙酯(50mL×4)提取，合并有機相，用飽和食鹽水(50mL×3)洗滌，無水MgSO4干燥過夜，濃縮，得淡黃色油狀物10.1g，收率82.2％。
順/反-2-(3-甲氧基-5-硝基-4-正丙氧基苯基)-4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環(5，6)的合成將化合物3(5.6g，24.6mmol)、5-硝基香蘭醛(3.2g，13.38mmol)、PPTS(2.8g，11.1mmol)和60mL干燥苯加入100ml三頸瓶中，氮氣保護下回流分水8小時完畢。快速蒸去大部分苯，反應液中加100mL乙酸乙酯，用飽和食鹽水(50mL×3)洗滌除去PPTS，無水硫酸鎂干燥，過濾，濾液濃縮得4，柱色譜[乙酸乙酯/石油醚(60～90℃)，V∶V＝1∶4]，得白色粉末狀固體(反式，6)1.9g，收率31.7％，mp46～48℃；順式產物(5)為淡黃色油狀物1.12g，收率18.7％。 合成路線圖順/反-2-正丙氧基-3-甲氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環-2-]苯胺(7，8)的合成將順式硝基物5(200mg，0.445mmol)溶于20mLTHF中，加入水20mL，鐵粉(56mg，1mmol)、氯化銨(53.5mg，1mmol)，加熱回流6h，稍冷，分出上層有機層，水層用乙酸乙酯(20ml×3)提取，合并有機層，用無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，蒸干濾液，得一淡黃色油狀物125.7mg，收率67.4％。參照7的合成方法得淡黃色油狀反式苯胺化合物8(104.3mg，收率56％)。
ZX-4和ZX-5的合成將化合物7和8(0.048mmol)分別與異硫氰酸酯苯酯(0.1mmol)、四氫呋喃(5mL)混合，于70℃時攪拌反應12h后，濃縮，柱色譜分離[乙酸乙酯/石油醚(60～90℃)/二氯甲烷，V∶V∶V＝1∶3∶1]即得產品ZX-4和ZX-5。
MS化合IR vmp/℃ (ESI)1HNMR(CDCl3)δ物 /cm-1(M+H)+ZX-4oil555.233110.9(t，3H，CH3，J＝7.3Hz)，1.57～1.64(m，2H，CH2)，3.63～15953.90(m，15H，4OCH3，OCH2，C-5CH)，4.27～4.32(m，1H，C-5CH)，5.12～5.16(m，1H，C-4CH)，5.87(s，1H，C-2CH)，6.71～7.82(m，9H，ArH)ZX-543～46 555.2 33190.92(t，3H，CH3，J＝6.9Hz)，1.60～1.65(m，2H，CH2)，15933.66～3.91(m，15H，4OCH3，OCH2，C-5CH)，4.48～4.52(m，1H，C-5CH)，5.12～5.16(m，1H，C-4 CH)，6.1(s，1H，C-2CH)，6.7 1～7.77(m，9H，ArH)化合物 元素分析(％)Found(Calcd.)N C HZX-4 5.04(5.05)，62.43(62.82)，6.10(6.14)ZX-5 5.13(5.05)，62.65(62.82)，6.08(6.14)
圖1ZX-5與ZX-4促使NO生成的量效曲線具體實施方式
實施例藥理試驗1、RLG細胞培養選擇永生代兔淚腺腺泡上皮細胞(RLG細胞)的原因是它的作用類似于血管上皮細胞，能增加C-GMP的生成，從而分別增加淚液和血流。細胞培養在37℃、5％CO2的孵箱中進行。培養基為DMEM/F-12，附加5％Nu血清IV、1μM地塞米松、0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑、10μl/ml胰島素、5.5μg/ml轉鐵蛋白、6.7ng/ml亞硒酸鈉、10ng/mlEGF和10μg/ml慶大霉素(Sigma，St.Louis，MO)。用襯以基質膠的培養皿結合0.25％胰蛋白酶-EDTA和刮除法進行細胞傳代。
2、細胞活力測定培養細胞的活力用MTT細胞增殖法測定。MTT測定(細胞活力和細胞生長指數)原理是有活力的細胞能把MTT從水溶性黃色染料還原成不溶的深藍色Formazan。MTT溶于(5mg/ml)PBS中，無菌過濾。此后，6孔培養皿中的培養基換成500μl無酚紅培養基，每孔加入50μlMTT溶液，搖晃混勻，放入孵箱4小時后，吸去上清。每孔加1mlDMSO溶解Formazan，搖晃2分鐘混勻。用波長570nm的板式分光光度計測量培養皿每孔光吸收力，空白孔是500μl相同培養基和50μlMTT，移去培養基后加1mlDMSO。
繪制570m波長光MTT吸收力與細胞數標準曲線。把長滿的細胞從100cm培養皿平移到6孔培養皿。次日，每個培養皿中3孔做MTT測定，另3孔用Trypan blueexclusion法進行細胞計數。細胞計數前，先消化和刮離細胞。從2ml細胞混懸液中吸取500μl，加入200μl Trypan blue染料混合。取10μl混合液放在血液計數板上，在顯微鏡下放大100倍進行細胞計數。計算3孔細胞均數，使之與另3孔的MTT平均吸收力相對應。此后，對另外5個培養皿重復上述操作，測定后5天細胞生長情況，繪制6點標準曲線。
3、NO生成測定采用硝酸/亞硝酸鹽比色測定試劑盒(Cayman Chemical，AnnArbor，MI)測定培養基中NO的濃度。試劑盒中含有硝酸鹽還原酶(專用濃度)，硝酸鹽還原酶輔助因子(專用濃度)，試劑緩沖液，硝酸鈉標準，亞硝酸鈉標準和Griess試劑。在與藥物或溶媒培養24小時，6孔培養皿中80％細胞融合時，測定培養液中硝酸和亞硝酸產物含量。從6孔培養皿中每孔采80μl等量物加入96孔微量測定板，用重復進樣器將10μl硝酸鹽還原酶和10μl輔助因子制劑(按試劑盒中說明預先配制)快速加入標本孔和標準孔中。微量測定板覆膜后室溫培養3小時，隨后將50μl Griess試劑R1和R2加入每個標本孔和標準孔中，室溫培養10分鐘。用波長540nm板式分光光度計測得微量測定板的讀數。通過標定已知硝酸鹽濃度比A540，為每組實驗繪制標準曲線。每份樣本中硝酸鹽+亞硝酸鹽的最后濃度用μM/106細胞表示。
4、兔眼血流測定新西蘭白兔，重2.5～3.0公斤，用35mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪混合后肌注麻醉，每小時用起始量的一半肌注維持麻醉。升高左眼眼壓至40mmHg，這一眼壓使眼血流降至正常值的1/3。經右頸動脈插管至左心室，用于注射微球；股動脈插管用于采血。1％藥物或溶媒50μl點左眼，點藥后0、30、60和120分鐘用彩色微球技術測定高眼壓兔眼的眼血流。在每一個時間點，注入0.2ml(含2百萬)微球，微球注入后立即經股動脈采血60秒整，并置于肝素化抗凝管，記錄采血量。最后一次采血后，用100mg/kg的苯巴比妥靜注處死動物，摘取左眼球，分離視網膜、脈絡膜、虹膜和睫狀體，記錄組織重量。
標本處理和微球計數的具體操作方法由E-Z Trac公司提供。簡要敘述如下溶血因子加入血樣管，混勻后以6000rpm的轉速離心30分鐘，移去上清后，加入組織/血液消化因子I和II，加蓋混勻后，以同樣速度離心15分鐘，棄上清，微球計數因子使微球保持懸浮，用血液計數板進行微球計數。
將組織/血液消化因子I加到組織標本管，加蓋后95℃水浴15分鐘，震蕩混勻30秒后再加熱，至組織完全溶解。乘熱加入組織/血液消化因子II，加蓋混勻后，以6000rpm的轉速離心30分鐘，以后的操作和微球計數與血液標本相同。
每一個時間點組織血流的計算用以下公式Qm＝(Cm×Qr)/Cr。其中Qm代表組織血流，單位μl/分/mg；Cm是每毫克組織微球數；Qr是血液流量，單位μl/分；Cr是作為參照的血液微球數。
5、結果ZX-5使NO生成顯著增加通過RLG細胞培養，檢測到ZX-5使NO生成明顯增加，并與ZX-5的濃度相關(圖1)。另一方面，使用ZX-4時的量效曲線平坦(圖1)。實驗結果清楚顯示，反式結構有生成NO活性，而順式沒有。
ZX-5選擇性地增加眼的脈絡膜血流與對照組相比，在所有觀察時間點(30、60、120分鐘)，均測得ZX-5能顯著增加脈絡膜血流(表1)。另一方面，ZX-4點眼后，在任何觀測點均未測出其對脈絡膜血流有影響(表2)。有趣的是，ZX-5僅僅增加脈絡膜血流，而對虹膜(表3)和睫狀體(表4)血流沒有影響。一般認為，白兔子的視網膜近乎無血管組織，所以很難觀測到血流改變。ZX-5選擇性增加脈絡膜血流(表1)而不影響虹膜(表3)和睫狀體(表4)血流有重要意義，它可能被用于AMD(年齡相關性黃斑變性)的治療或預防。
表1 ZX-5(1％50μl)選擇性增加白免眼脈絡膜血流時間 TreatmentNMean±SE P值(分) (μl/分/mg) (two tails)0 對照組 514.1±1.8治療組 523.3±4.5 0.1130 對照組 58.1±1.7治療組 516.4±2.5* 0.0360 對照組 54.2±0.7治療組 514.3±2.9* 0.02120對照組 53.1±0.4治療組 510.5±1.8* 0.01*表示與對照組相比顯著增加表2ZX-4(1％50μl)對白免眼脈絡膜血流的影響時間 TreatmentN Mean±SE P值(分) (μl分/mg) (two tails)0 對照組 5 14.1±1.8治療組 5 22.4±4.9 0.1830對照組 5 8.1±1.7治療組 5 11.1±2.9 0.4060對照組 5 4.2±0.7治療組 5 11.3±3.4 0.10120 對照組 5 3.1±0.4治療組 5 6.8±1.7 0.09表3ZX-5(1％50μl)對白免眼虹膜血流的影響時間 Treatment N Mean±SE P值(分) (μl分/mg) (two tails)0 對照組 5 2.6±0.4治療組 5 3.4±0.9 0.4230 對照組 5 1.7±0.4治療組 5 2.6±0.7 0.2760 對照組 5 1.4±0.3治療組 5 2.1±0.6 0.32120對照組 5 0.9±0.2治療組 5 1.4±0.5 0.33表4 ZX-5(1％50μl)對白免眼睫狀體血流的影響時間 Treatment N Mean±SE P值(分) (μl分/mg) (two tails)0 對照組 5 3.0±0.2治療組 5 9.0±4.3 0.2430 對照組 5 2.0±0.5治療組 5 5.4±1.8 0.1360 對照組 5 1.3±0.3治療組 5 4.9±1.7 0.10120對照組 5 1.2±0.3治療組 5 3.8±1.3 0.1權利要求
1.反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環-2-基]苯基}硫脲在制備治療或預防年齡相關性黃斑變性的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述硫脲在制備治療或預防年齡相關性黃斑變性的藥物中的應用，其特征在于用于制備選擇性改善脈絡膜血流的藥物。
3.根據權利要求1所述硫脲在制備治療或預防年齡相關性黃斑變性的藥物中的應用，其特征在于用于制備抑制脈絡膜新生血管形成的藥物。
4.根據權利要求1～3之一所述硫脲在制備治療或預防年齡相關性黃斑變性的藥物中的應用，其特征在于用于制備外用眼藥。
5.反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環-2-基]苯基}硫脲在制備促使細胞釋放一氧化氮的藥物中的應用。
6.根據權利要求5所述硫脲在制備促使眼細胞釋放一氧化氮的藥物中的應用。
全文摘要
反式－1－苯基－3－{3－甲氧基－2－丙氧基－5－[4－(3，4，5－三甲氧基苯基)－1，3－二氧戊環－2－基]苯基}硫脲(ZX－5)，能引起細胞釋放一氧化氮，選擇性增加眼脈絡膜血流，對虹膜和睫狀體血流沒有影響，能對老年性常見眼病AMD(年齡相關性黃斑變性)的脈絡膜新生血管形成有抑制作用，可用于早期AMD的治療或預防。
文檔編號A61K31/357GK1437938SQ0311304
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月24日 優先權日2003年3月24日
發明者張奕華, 彭司勛, 宣波, 徐新榮, 夏曉明 申請人:中國藥科大學