專利名稱：重組幽門螺桿菌外膜蛋白25的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組幽門螺桿菌外膜蛋白25。
背景技術：
目前人們已經知道，人體內胃粘膜中存在的螺形菌是幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)，且慢性幽門螺桿菌感染是人類最常見的慢性細菌感染之一。這種感染不可避免地導致人類細菌性胃炎(B型胃炎)的誘發(fā)。幽門螺桿菌在胃潰瘍和十二指腸潰瘍以及某些形式的胃癌(腺癌)的發(fā)展中起誘因作用(Lee等，1993；Solnick和Tompkins，1993)。更少見被視為免疫系統(tǒng)B細胞瘤的先兆的胃MALT(粘膜相關淋巴組織)淋巴瘤大概也是幽門螺桿菌感染的結果。
長期受幽門螺桿菌感染的一個后果是萎縮性胃炎，粘性、產酸或產胃蛋白酶的胃上皮細胞變性，與胃腺癌、胃粘膜相關性淋巴樣組織(MALT)惡性淋巴瘤的發(fā)生亦密切相關，被視為癌前期損害。胃癌中約有60％大概是幽門螺桿菌感染的結果。
細菌從口攝入后，首先到達極酸的胃腔(pH1-2)中。在此，通過產生脲酶這種酶使細菌可能存活，所述脲酶造成已有脲的分解，從而引起胃中酸性pH值的局部中和。借助趨化定向和依賴于鞭毛的游動性，微生物再移動到胃竇區(qū)的碳酸氫鹽緩沖的粘膜層，由于酸性屏障作用，只有幾種競爭性細菌能進入該生態(tài)環(huán)境。為到達上皮，微生物大概借助于腔(pH1-2)和上皮細胞表面(Ph6-7)之間的pH梯度進行自身定向。
既然已經發(fā)現胃十二指腸潰瘍是傳染病，治療目的之一就是用抗生素消除病原體。然而，用各種抗生素(阿莫西林、硝基呋喃、furazolidin紅霉素a.o)進行單獨治療已被證實并不令人滿意，因為甚至在這種情況下僅有0-15％病例會根除細菌。目前，把酸阻斷劑(Ompeprazol)和抗生素(阿莫西林)結合使用達到最成功的治療效果，這種療法使清除率達80％(Malfertheiner，1994)。用抗生素治療消除幽門螺桿菌并不是有前途的長期治療方案，因為細菌會迅速產生對抗生素的耐性。
受幽門螺桿菌感染會導致胃粘膜的慢性炎癥反應(胃炎)。另外，誘發(fā)對幽門螺桿菌抗原的特異性全身免疫反應；不過，分泌性抗體(sIgA)在胃中的形成尚未得到無可爭議的闡述。發(fā)炎的結果是在胃粘膜和亞粘膜中存在多種免疫細胞，例如多形核白細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和漿細胞(Blaser，1992)。此外，幽門螺桿菌在體外激活嗜中性白細胞、單核細胞和巨噬細胞(Mai等，1991)。用特異性抗體和補體進行的實驗表明，在體外嗜中性白細胞使幽門螺桿菌迅速失活。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是針對上述現有技術的不足之處，提供一種運用PCR技術克隆幽門螺桿菌基因，構建載體對其進行序列分析和蛋白表達分析，進一步通過粘膜治藥免疫防治幽門螺桿菌。
本發(fā)明的目的是這樣實現的DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內與(a)中序列相應的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；和(a)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(b)細胞被載體所轉化；及(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應的核苷酸序列。
除了序列號1所示核苷酸序列和在遺傳密碼簡并性范圍內與該序列相應的核苷酸序列之外，本發(fā)明還包括在嚴格條件下與這些序列之一雜交的DNA序列。本發(fā)明包括在些洗滌條件下與序列號1所示核苷酸序列之一雜交或與在遺傳密碼簡并性范圍內的相應核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明的DNA分子最好編碼能粘附到人細胞上、特別是人胃上皮細胞上的多肽。此外，本發(fā)明的DNA分子最好在核苷酸水平上與序列號1所示核苷酸序列有至少70％、特別優(yōu)選至少90％的同源性。而且，該DNA分子的長度最好至少為45個核苷酸，優(yōu)選至少50個核苷酸。
本發(fā)明的又一個目的是含本發(fā)明DNA分子的至少一個拷貝的載體。該載體可以是最好在表達信號(啟動子、操縱基因、增強子等)控制下本發(fā)明DNA分子位于其上的任何原核或真核載體。原核體的例子有象噬菌體(例如λ噬菌體)這樣的染色體載體以及象質粒這樣的染色體外載體，而環(huán)狀質粒載體是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的載體也可以是真核載體例如酵母載體或者是適于高等細胞的載體(例如，質粒載體、病毒載體、植物載體)。
本發(fā)明的又一目的是用本發(fā)明載體轉化的細胞。在一優(yōu)選實施方案中，該細胞是原核細胞、優(yōu)選革蘭氏陰性的原核細胞、特別優(yōu)選大腸桿菌細胞。不過，另一方面，本發(fā)明的細胞也可以是真核細胞，例如真菌細胞(如酵母)、動物或植物細胞。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明DNA分子編碼的多肽。該多肽包括(a)序列號1所示氨基酸序列，或(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應的氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽最好與序列號1所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
本發(fā)明的多肽最好通過下述方法生產用本發(fā)明的DNA分子或載體轉化一種細胞，在多肽能得以表達的條件下培養(yǎng)轉化的細胞，從細胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離多肽。該方法中可獲得融合多肽以及非融合多肽形式的本發(fā)明多肽。
本發(fā)明的多肽也可用作免疫原來產生抗體。因此，本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明多肽的抗體。
本發(fā)明另一方面涉及一種藥用組合物，它包含作為活性物質的本發(fā)明的DNA分子、本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的抗體，選擇性地含有常見藥用輔助物質、稀釋劑、添加劑和載體。
一方面，本發(fā)明的藥用組合物可用于診斷幽門螺桿菌感染。
另一方面，該藥用組合物也可用于防止或治療幽門螺桿菌感染。對治療應用而言，將多肽或其片斷用于產生主動疫苗，或將抗體用于產生被動疫苗。
本發(fā)明具有運用PCR技術克隆幽門螺桿菌外膜蛋白25粘膜基因，并構建載體對其進行序列分析和蛋白表達分析，提高抗血清可阻止幽門螺桿菌粘附于胃粘膜上皮細胞和提高免疫原性及活性高等優(yōu)點。
從Hp陽性及陰性病人外周血中分離淋巴細胞，與重組OMP25共孵育后發(fā)現，該蛋白僅能刺激陽性病人的外周血T細胞增殖，而不能刺激陰性病人T細胞增殖，說明是幽門螺桿菌特異蛋白。
但體外試驗也證實該蛋白具有弱的誘導Th2細胞表型的作用。
應用OMP25 50ng/鼠加免疫佐劑霍亂毒素10ng，隔日一次共三次口服免疫小鼠，三周后應用幽門螺桿菌感染小鼠，繼之二周后處死動物觀察。發(fā)現可完全預防60％的小鼠感染幽門螺桿菌，而且與對照相比，可降低另外40％小鼠的細菌定植量，保護率可達100％。重組OMP25與免疫小鼠脾細胞共孵育后，發(fā)現可刺激后者增殖10倍以上，說明能產生強烈的細胞免疫。
用同樣方法經肛免疫小鼠也可取得100％的保護率，具有最高的保護率和完全保護率。
圖1是序列表。
具體實施例方式
下面將結合附圖和實施例對本發(fā)明的作進一步的詳述如圖所示，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內與(a)中序列相應的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列；在核酸水平上它與序列號1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性；它的長度至少為45個核苷酸；(a)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(b)細胞被載體所轉化；多肽，它由DNA分子所編碼，它包括(a)序列號1所示的核苷酸序列，或，(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應的核苷酸序列。產生多肽的方法，載體轉化一種細胞，在多肽得以表達的條件下培養(yǎng)轉化的細胞，并從細胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離出多肽。多肽作為免疫原產生抗體的應用和多肽的抗體。藥用組合物，(a)它包含作為活性物質的DNA分子、多肽或者抗體，選擇性地包含常見藥用輔助物質、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來診斷幽門螺桿菌感染的應用，(c)藥用組合物用于生產防止或治療幽門螺桿菌感染用的藥劑的應用。
利用基因克隆技術對外膜蛋白25的基因進行了克隆和表達并研究了其免疫防治作用。
1材料與方法1.1質粒和菌株菌株BL21(DE3)、質粒pET-22b(+)和幽門螺桿菌SS1為第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化研究所保存。
1.2工具酶及試劑限制性內切酶NotI、NcoI及T4DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶購自NewEngland Biolabs公司，Taq DNA聚合酶、DNA分子量標準λDNA/EcoR I+Hind III購自華美生物工程公司，瓊脂糖、dNTPs、DNA快速純化試劑盒購自Promega公司，測序質粒純化試劑盒購自美國Qiagen公司，其它試劑為國產分析純。
1.3Hp染色體DNA的提取從固體培養(yǎng)基上刮取生長良好的Hp菌落，按基因組DNA小量制備法制備，詳見參考文獻[1]。
1.4質粒的提取及純化質粒的快速抽提及大量制備均采用堿變性法，詳見參考文獻[2]。
1.5目的基因的PCR擴增設計引物，在其5′端加上合適的限制性酶切位點，由博亞公司合成。序列如下外膜蛋白2515′-TG GCC ATG GAT TTG CAA AAC TTT GTT TTT-3′NcoI外膜蛋白2525′-AG TGC GGC CGCTCA AAA GCC TAT G-3′NotI熱啟動法進行PCR，95℃變性30s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35個循環(huán)后再延伸10min。0.8％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果。
1.6DNA片段的酶切、連接、轉化和陽性克隆的鑒定質粒和目的基因DNA經NotI和NcoI雙酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4連接酶作用下16℃連接12h，轉化宿主菌BL21(DE3)，雙酶切鑒定篩選出陽性克隆。
1.7序列測定及分析堿裂解法大量抽提經雙酶切鑒定的重組克隆質粒，用自動測序儀進行序列分析。
1.8誘導表達和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳外膜蛋白25陽性克隆經IPTG誘導表達后，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
1.9動物實驗對已經感染幽門螺桿菌的小鼠通過黏膜途徑給予外膜蛋白25，觀察治療作用。對未感染幽門螺桿菌的小鼠先通過黏膜途徑給予外膜蛋白25，然后再用幽門螺桿菌進行攻擊，觀察保護作用。
2結果2.1外膜蛋白25基因的擴增PCR結果電泳分析發(fā)現在2100bp左右有一條帶，大小與預計相符。
2.2重組質粒的構建及酶切鑒定將PCR產物經NotI和NcoI雙酶切后，定向插入經同樣雙酶切的pET-22b(+)載體中，獲得重組質粒命名為pET-22b(+)/外膜蛋白25。經NotI和NcoI雙酶切后的重組質粒電泳結果與預計相符。
2.3外膜蛋白25基因片段的序列分析直接以重組質粒pET-22b(+)/外膜蛋白25為模板進行測序，得到了克隆片段的DNA序列，自動測序儀序列分析結果見后。
2.4外膜蛋白25基因在大腸桿菌中的表達外膜蛋白25陽性克隆株在LB培養(yǎng)液(含100ug/ml氨芐青霉素)中37℃過夜培養(yǎng)，然后按1％轉接至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至D值為0.6～0.8，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，誘導表達3h，離心收集菌體，取其周質的滲透休克液、菌體超聲后的上清以及沉淀進行10％SDS-PAGE電泳分析。結果發(fā)現，經誘導后表達相對分子量為76×103的蛋白，與預期分子量大小一致。
2.5動物實驗外膜蛋白25的治療和保護有效率均為100％。
參考文獻[1]Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloninga laboratory manua1.2nded.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989.35。
Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，et al.顏子穎，王海林譯。精編分子生物學指南。北京科學出版社，1998.39。
權利要求
1.DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內與(a)中序列相應的核苷酸序列，或(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。
2.如權利要求1的DNA分子，其特征在于在核酸水平上它與序列號1中所示核苷酸序列有至少90％的同源性。
3.權利要求1或2的DNA分子，其特征在于它的長度至少為45個核苷酸。
4.權利要求1～3之一的DNA分子，其特征在于(a)載體含有DNA分子的至少一個拷貝，(b)細胞被載體所轉化。
5.多肽，其特征在于它由權利要求1～4之一的DNA分子所編碼。
6.權利要求5的多肽，其特征在于它包括(a)序列號1所示的核苷酸序列，或(b)與(a)中序列發(fā)生免疫交叉反應的核苷酸序列。
7.產生權利要求5～6之一的多肽的方法，其特征在于用權利要求1～3之一的DNA分子或權利要求4的載體轉化一種細胞，在多肽得以表達的條件下培養(yǎng)轉化的細胞，并從細胞或/和培養(yǎng)物上清液中分離出多肽。
8.權利要求5～6之一的多肽作為免疫原產生抗體的應用和多肽的抗體。
9.藥用組合物，其特征在于(a)它包含作為活性物質的權利要求1～3之一的DNA分子、權利要求5～6之一的多肽或者權利要求8或9的抗體，選擇性地包含常見藥用輔助物質、稀釋劑、添加劑和載體，(b)藥用組合物用來診斷幽門螺桿菌感染的應用，(c)藥用組合物用于生產防止或治療幽門螺桿菌感染用的藥劑的應用。
全文摘要
重組幽門螺桿菌外膜蛋白25，DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列號1中所示的核苷酸序列，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內與(a)中序列相應的核苷酸序列，或，(c)在嚴格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明具有用PCR技術克隆幽門螺桿菌基因，構建載體對其進行序列分析和蛋白表達，進一步通過粘膜治藥免疫防治幽門螺桿菌感染的優(yōu)點。
文檔編號A61P31/00GK1654472SQ03109889
公開日2005年8月17日 申請日期2003年4月17日 優(yōu)先權日2003年4月17日
發(fā)明者王繼德, 白楊, 陳燁, 但漢雷, 周殿元, 張亞歷, 張振書 申請人:南方醫(yī)院