根霉菌干混懸劑、制備方法和用途的制作方法

專利名稱：根霉菌干混懸劑、制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及根霉菌干混懸劑、制備方法及其在治療各種感染性急性腹瀉、急性胃腸炎和消化不良過程中的用途。
背景技術：
本產品是以我國民間開發出來的祖傳驗方為基礎，用常見的食用菌-根霉菌，加淀粉培養發酵而成。民間世代相傳用根霉菌治療各種感染性急性腹瀉，包括急性菌痢、細菌性腸炎、病毒性腸炎和霍亂等。過去民間生產工藝簡陋，常有雜菌或病原菌存在，食品工業生產工藝主要采用固體發酵，廠房設備均達不到無菌要求，產品質量不夠穩定。我們根據傳統用藥習慣，結合根霉菌絲生長快，無橫隔膜，易于培養繁殖的生物學特性，對生產工藝和劑型進行改進，制備出質量穩定、效果可靠的產品。

發明內容
本申請選用的兩種根霉菌購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，米根霉Rhizopus oryzae的保藏號為AS 3.866，日本根霉Rhizopus japonicus的保藏號為AS 3.868。
根據根霉菌生長快，無橫隔膜，易于培養繁殖的生物學特性，確定了口服干混懸劑劑型(中國藥典95版二部附錄IO)，使菌絲體便于復蘇，并對生產工藝的各個環節，包括菌種篩選、鑒定、斜面條件、一、二級培養發酵條件、固培干燥以及各階段的培養基、發酵液、C、N源及其比例、pH變化、溫度時間、通氣量、轉速和方式等，均進行了實驗研究。最后根據收率、質量、成本等綜合分析，初步制定了飛克痢最佳生產工藝流程。并于1996-1998年采用新工藝生產了6批樣品，同時進行酶活力、酸度、抑菌率等質量考核。技術方案如下1.菌種 購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號分別為米根霉Rhizopus oryzaeAS 3.866，日本根霉Rhizopus japonicusAS 3.868，見附件保藏目錄。在制劑中二者用量各半。
2.生產工藝及其基本原理和依據本申請的產品是根霉活菌休眠狀態的生物制品。其生產基本原理是根霉可利用單糖-葡萄糖等增殖，而根霉增殖過程產生的α-淀粉酶和葡萄糖苷酶，可使淀粉糊精化，并逐步水解為葡萄糖。因此，生產本產品是利用根霉具有增殖和發酵的雙相生理功能，設置其培養繁殖的最佳條件，使菌絲產量高，復蘇快，繁殖迅速，粗壯，酶活力強，抑菌率高。同時要注意每個不同工藝階段的生長周期，否則不是年輕體壯的精兵，而是摻雜老弱病殘的混合體，會影響其活力。所以當菌絲長成后，立即使其在輔料中(淀粉，作為分散劑、保存劑和C源)迅速轉入干燥休眠狀態。一旦在人體胃部復蘇，則是一支精銳的生物工程兵。在完成其生物發酵過程中產生大量菌絲網絡、酶和酸，造成不利于病原菌的綜合性酸性環境，使病原菌受到抑制和殺死，從而達到治療目的(在動物模型切片中證實了這一點)。
工藝流程見附

圖1。
工藝過程及條件2.1原菌種 兩株原菌種分別接種于麥芽汁瓊脂斜面培養基上，24-40℃培養20-48小時，優選用13Bé麥芽汁+2％瓊脂，32℃培養24-32小時，取出，置0-8℃-優選3-5℃冰箱中貯存備用。
2.2傳斜面菌種 主要提供一級種子罐用菌種。從米根霉和日本根霉的原菌種斜面上，分別取豆粒大小菌種，分別接種于裝在試管中的麥芽汁瓊脂斜面上，每支試管中有10ml麥芽汁瓊脂斜面培養基，24-40℃培養20-48小時，優選用13Bé麥芽汁+2％瓊脂的培養基，32℃培養24-36h，更優選36小時，即可用于制做一級菌液。
2.3一級培養發酵 一級主要為了擴大種子量，供二級發酵用，也可在一級培養后直接進入拌粉固培升溫干燥，制備產品。一級菌液的配制和用量分別刮取已培養20-48小時，—優選已培養36h的米根霉和日本根霉的斜面菌種，分別加適量滅菌0.85％生理鹽水(通常1支斜面加10ml生理鹽水)研勻，即為一級菌液。一級培養發酵液為10Bé麥芽汁，加0.5％-1％蛋白胨，優選加0.5％蛋白胨，用乳酸調至pH4.8，高壓滅菌115℃，20分鐘。按1000ml三角燒瓶裝量為500ml計算，每個三角瓶中接種菌液量相當于各菌種的1/5斜面-1/2斜面，優選1/3斜面，混勻，如培養液量增大，依此比例擴大，即可上搖床培養發酵。條件為通氣量40-60％，溫度24-40℃，20-48h，轉速150-350轉/分，優選通氣量50％，溫度32℃，36h，轉速180-200轉/分。過篩收集菌絲，一級菌絲為直徑1-1.5cm的小球狀或散絮狀，白色，備用。
2.4二級培養發酵 二級主要擴大菌絲產量。二級菌液的配制和用量取一級菌絲加入適量滅菌0.85％鹽水研勻，再加入與一級發酵液等量的鹽水混勻，即為二級培養用菌液，接種在二級發酵液中培養，接種量為14-16％，優選14％，二級培養發酵液為12Bé麥芽汁加0.5％-1％蛋白胨，優選加0.5％蛋白胨，用前，高壓滅菌110℃，20分鐘。培養條件為通氣量40-60％，溫度24-40℃，20-48h，轉速150-350轉/分，優選通氣量為50％，溫度32℃，40小時，轉速190-200轉/分，長成的菌絲應為散絮狀，用0.85％滅菌鹽水洗3-4次，為純凈菌絲，備用。
一、二級培養發酵所用發酵液的C源可選自8-13Bé麥芽、7％土豆絲液、7％大米液、7％地瓜液、7％玉米液、7％鮮土豆絲液、糯米液、7％糊精液，N源可選自0.2％-1％蛋白胨、1％酵母、50％牛肉汁和純牛奶、30％豆餅水解液、15％花生渣水解液、黃豆粉水解液，二者的比例可任意組合，使用麥芽和蛋白胨的組合時，二者的比例可以是13Bé∶0.2％、8Bé∶0.7％、10Bé∶0.5％或5Bé∶0.9％。
2.5拌粉固培升溫干燥 此工序是從液體培養發酵轉入固培階段。首先將獲得的濕菌絲打散，拌入事先于120℃烘3小時滅菌的米粉(大米或糯米，粉碎過2-3號篩)中，菌絲與米粉重量比1∶0.5-5，拌勻，鋪在墊紙上，厚度1-2cm，稍壓平，上面蓋一層濕沙布，28-40℃培養8-17h，優選35℃培養12-15h，菌絲漸長滿在米粉上，稍富彈性，并有一定發酵香氣，說明菌絲培養階段已完成。立即翻動，通風，盡快中止菌絲繁殖，升溫40-50℃，優選45-47℃翻動至干燥，此時含水量＜9％。
2.6干收、粉碎、過篩、包裝、貯存。干燥后粉碎過10-60目篩，優選過40目篩，真空包裝。根據穩定性實驗結果，在5℃±2℃冷藏條件及室溫干燥箱條件下，分別貯存兩年半或兩年，檢查各項質量指標均符合標準，說明在以上條件貯存兩年半質量穩定，有效期暫定為二年。
3.工藝條件的選擇依據根霉菌干混懸劑培養發酵工藝正交試驗3.1正交試驗的依據生產工藝研究過程中發現斜面時間、一級時間、二級時間和二級接種量對菌絲得率影響較大，為此進行了下列預試研究。
3.1.1斜面培養時間的篩選對米根霉和日本根霉進行不同梯度時間(h)的培養，主要觀察菌絲生物學特性和長勢。結果斜面培養34-38h菌絲生長良好，以38h的更優，菌絲長勢旺，覆蓋整個斜面，48h已長出黑孢子。
3.1.2不同培養、發酵時間對一二級菌絲得率的影響進行了不同梯度時間(12-50h)菌絲得率的預試工作。結果表明，一、二級發酵36-40h的得率高，其中以36h最高。一級菌絲得率從40-44h明顯降低，48-50h處于低平狀況。二級菌絲則從40-50h呈緩慢降低趨勢。
3.1.3二級接種量的對比試驗在預試過程發現不同接種量的菌絲得率不太穩定，有時14％接種量得率高，有時16％得率高，具體接種量有必要再通過正交試驗來篩選。
3.2正交試驗根據上面預試結果選用正交表L9(34)進行表頭設計和實驗安排，試驗結果采用直觀分析和方差分析，加以討論和結論，現分析如下。
3.2.1一、二級培養、發酵的因素和水平設置四個因素三個水平(見表1)。
表1.一二級發酵的因素水平表因素水平A BCD一級發酵時間 二級發酵時間 斜面時間 二級發酵接種量1 24h36h 24h 12％2 36h40h 36h 14％3 40h42h 46h 16％3.2.2L9(34)表頭的設計將四個因素和列號排上，根據所設三個水平，將9個實驗號排好，并將考察結果列上，根據實驗結果計算K、K值和R值(見表2)。
3.2.3直觀分析(見表2)3.2.3.1四因素極差(R)分析結果D＞A＞C＞B。即D因素(二級接種量)為影響產量的主要因素。A、C為次要因素，B為影響最小的因素。
3.2.3.2主要因素D(二級接種量)所設三個水平對產量影響順序為K2＞K3＞K1，因此K2水平(二級接種量取14％)的菌絲產量最高。
3.2.3.3 A、B、C三因素分別所設三水平均以K2的菌絲產量最高。此外，值得一提的是A、B、C三因素的K3水平，其菌絲產量均有下降趨勢。這一結果可以提示，斜面培養和一、二級發酵時間不是愈長愈好。與我們進行的預試結果也是一致的。
表2L9(34)試驗計劃及分析計算表試因素與列號菌絲得率％驗號 A(1)B(2)C(3)D(4) y1 1(24h) 1(36h) 1(24h) 1(12％) 1.902 1(24h) 2(40h) 2(36h) 2(14％) 2.85
3 1(24h) 3(42h) 3(46h) 3(16％) 2.004 2(36h) 1(36h) 2(36h) 3(16％) 2.805 2(36h) 2(40h) 3(46h) 1(12％) 2.206 2(36h) 3(42h) 1(24h) 2(14％) 3.207 3(40h) 1(36h) 3(46h) 2(14％) 2.608 3(40h) 2(40h) 1(24h) 3(16％) 2.509 3(40h) 3(42h) 2(46h) 1(12％) 2.30K16.757.307.606.40 ∑y＝22.35K28.207.557.958.65 9K37.407.506.807.35 ∑yi2＝56.95i＝1K12.252.432.532.13K22.732.522.652.88K32.462.502.272.45R 0.480.090.380.753.2.4方差分析 從方差分析表(表3)上的F比值(73.20)和P值(0.0135)＜0.025，可以看出，D(接種量)為較顯著性因素，用D2(接種量14％)比用D1(接種量12％)的收率會顯著性提高。此外，A、C因素的P值分別為0.032和0.048均＜0.05。說明A因素(一級發酵時間)和C因素(斜面時間)均為顯著性因素，用A2、C2其收率比用A1、C3的收率會顯著增高。因此，D、A、C三因素均有顯著性差異，而B因素不顯著。方差分析結果表明本工藝采用D2A2C2B2為最佳選擇。即二級接種量14％，一級發酵時間36小時，斜面時間36小時，二級發酵時間40小時。
表3方差分析表方差來源 離均差平方和(SS)自由度n均方(MS) F值P值A 0.3522 0.17630.143 0.032＜0.05B 0.0122 0.0061.000 0.500＞0.05C 0.2322 0.11619.857 0.048＜0.05
D0.85520.42873.2860.013＜0.025誤差 0.012總計 1.4638F0.05(2，2)＝39F0.1(2，2)＝19.004.實施例例1原菌種兩株原菌種[米根霉Rhizopus oryzae(3.866)和日本根霉R.japonicus(3.868)]分別接種于13Bé麥芽汁+2％瓊脂的斜面培養基上，32℃培養32小時，取出，置4℃冰箱中貯存備用。
傳斜面菌種從米根霉和日本根霉的原菌種斜面上，分別取豆粒大小菌種，分別接種于裝在試管中的麥芽汁瓊脂斜面上，每支試管中有10ml 13Bé麥芽汁+2％瓊脂斜面培養基，34℃培養32小時，即可用于制做一級菌液。
一級培養發酵一級菌液的配制和用量分別刮取已培養32h的米根霉和日本根霉的斜面菌種，對每支斜面的菌種加10ml生理鹽水，研勻，即為一級菌液。一級培養發酵液為10Bé麥芽汁，加0.5％蛋白胨，用乳酸調至pH4.8，高壓滅菌115℃，20分鐘。在各裝有10ml麥芽汁瓊脂斜面培養基的試管中，分別在34度已培養32h的米根霉和日本根霉的根霉菌種，用接種針分別刮下于乳缽內，加生理鹽水10ml，研細，混勻，取6ml菌液，加至1000ml含10Bé麥芽汁加0.5-1％蛋白胨的培養液內(用2000ml三角瓶裝)，上搖床培養發酵。條件為通氣量50％，溫度34℃，32h，轉速180-200轉/分。過篩收集菌絲，得到的一級菌絲為直徑1-1.5cm的小球狀或散絮狀，白色，備用。
二級培養發酵二級菌液的配制和用量取一級菌絲加入適量滅菌0.85％鹽水研勻，再加入與一級發酵液等量的鹽水混勻，即為二級培養用菌液；二級培養發酵液為12Bé麥芽汁加0.5％，用前高壓滅菌110℃，20分鐘；在每100ml培養發酵液中接種14ml二級用菌液，培養條件為通氣量為50％，溫度32℃，40小時，轉速190-200轉/分，長成的菌絲應為散絮狀，用0.85％滅菌鹽水洗3-4次，為純凈菌絲，備用。
拌粉固培升溫干燥首先將從液體培養發酵獲得的濕菌絲打散，拌入事先于120℃烘3小時滅菌的大米粉(粉碎過2-3號篩)中，菌絲與米粉重量比1∶3，拌勻，鋪在墊紙上，厚度1-2cm，稍壓平，上面蓋一層濕沙布，優選35℃培養12-15h，菌絲漸長滿在米粉上，稍富彈性，并有一定發酵香氣，說明菌絲培養階段已完成。立即翻動，通風，盡快中止菌絲繁殖，升溫45-47℃，翻動至干燥，此時含水量＜9％。
干收、粉碎、過篩、包裝、貯存干燥后粉碎過40目篩，真空包裝。根據穩定性實驗結果，在5℃±2℃冷藏條件及室溫干燥箱條件下，分別貯存兩年半或兩年，檢查各項質量指標均符合標準，說明在以上條件貯存兩年半質量穩定，有效期暫定為二年。
5.連續生產6批樣品及其質量考察為了驗證篩選出來的最佳工藝流程和生產條件是否科學可行，3年間我們采用這些條件連續生產了6批產品(商品名飛克痢)，并對每批產品進行了質量考察，包括菌絲形態，菌絲得率(2.5-4％)、酶活力、酸度、水分、抑菌作用等6項指標。同時對其穩定性進行了考察，結果表明，用新工藝生產的產品，菌絲得率穩定，重現性好，抑菌率高，酶活力強，其它各項指標均符合質量標準要求，是生產飛克痢的可行工藝。
效力或活性測定方法和結論飛克痢干混懸劑中的主要菌種根霉菌含有多種糖化酶，其中α-淀粉酶能使淀粉糊精化，又含有很強的葡萄苷酶，而且不含糖苷轉移酶；因此根霉在生長的同時進行糖化，能將淀粉完全水解為葡萄糖。
淀粉萄萄糖苷酶活性測定方法目前主要采用碘量法(中國藥典2000年版二部淀粉酶測定方法)和斐林試劑定糖法。本研究進行了兩種測定方法的正交試驗。結果證明，中藥藥典采用的碘量法比斐林試劑法更適用，更穩定，重現性好，便于操作，也較完善。故決定采用碘量法。
碘量法測定酶活性的基本原理淀粉酶能使淀粉水解具有還原性的葡萄糖，糖的醛基，在堿性碘液中，定量的被次碘酸鈉氧化成羧酸，過量的碘用硫代硫酸鈉滴定，終點藍色消失。
計算式如下每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當于9.008mg無水葡萄糖； 在上述條件下，每1g供試品水解淀粉生成1Hmol葡萄糖的酶量為1活力單位(μ)。
每1g供試品的淀粉葡萄糖苷酶活力單位不得少于550μ。
適應癥與用法適應癥 用于治療急性感染性腹瀉(包括急性細菌性痢疾、急性細菌性腸炎和病毒性腸炎)，急性胃腸炎和消化不良引起的厭食等癥。
用法用量 微溫(接近人體溫)開水沖服，一次1-2g，重癥第一次2-3g，日服2-3次。
飛克痢436例的臨床療效初步觀察結果1.輪狀病毒急性腸炎40例療效觀察，經輪狀病毒核酸電泳(PAGE)檢測及酶聯免疫吸附試驗診斷為輪狀病毒陽性者(山東省防疫站檢測)，用本品治療總有效率95％，痊愈率92.5％，病程短，1-3日內痊愈率占98.75％，用抗生素無效，只能對癥療法和補液，療程需拖延7天。
2.痢治療急性菌痢80例，結果本品總有效率92.5％，陽性慶大霉素治療組有效率73.3％(兩組P＜0.01)。
3.飛克痢治療急性細菌性腸炎265例，對照組為慶大霉素。結果兩組療程有非常顯著性差異(P＜0.005)，飛克痢2日內痊愈率為84.88％，而慶大霉素僅為15.79％。總有效率相近，分別為飛克痢91.7％，慶大霉素為88％。
權利要求
1.一種藥物組合物，含有米根霉(Rhizopus oryzae)AS 3.866和日本根霉(Rhizopusjaponicus)AS 3.868的菌絲體各半及米粉。
2.根據權利要求1所述的產品，其特征在于劑型為干混懸劑。
3.備權利要求1所述組合物的方法，其特征在于按以下步驟進行(1)兩株原菌種分別接種于麥芽汁瓊脂斜面培養基上，24-40℃培養20-48小時；(2)傳斜面菌種從(1)的米根霉和日本根霉原菌種斜面上，分別取豆粒大小菌種，接種于麥芽汁瓊脂斜面上，24-40℃培養20-48小時；(3)一級培養發酵分別刮取已培養20-48小時的米根霉和日本根霉的斜面菌種，分別加適量滅菌0.85％生理鹽水研勻，即為一級菌液，一級培養發酵液為麥芽汁加蛋白胨，用乳酸調至pH4.8，在發酵液中接種菌液后，上搖床培養發酵，條件為通氣量40-60％，溫度24-40℃，20-48h，轉速150-350轉/分，過篩收集菌絲，備用；(4)二級培養發酵取一級菌絲加入適量滅菌0.85％鹽水研勻，再加入與一級發酵液等量的鹽水，混勻，即為二級用菌液，接種在二級發酵液中培養，二級培養發酵液為麥芽汁加蛋白胨，培養條件為通氣量40-60％，溫度24-40℃，20-48h，轉速150-350轉/分，收集菌絲，備用；(5)拌粉固培升溫干燥將從(4)獲得的濕菌絲打散，拌入米粉中，28-40℃培養8-17h，立即翻動，通風，升溫至40-50℃，翻動至干燥。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于各步驟為(1)兩株原菌種分別在麥芽汁瓊脂斜面培養基上32℃培養24-32小時；(2)傳斜面菌種，條件為接種于13Bé麥芽汁+2％瓊脂的培養基上，32℃培養24-36h；(3)一級培養發酵，條件為一級培養發酵液為10Bé麥芽汁，加0.5％-1％蛋白胨，接種的米根霉和日本根霉的斜面菌種一級菌液量為按1000ml三角燒瓶裝量為500ml計算，每個三角瓶中接種的一級菌液量相當于各菌種的1/5斜面-1/2斜面，混勻，如培養液體積增大，依此比例擴大加入的一級菌液量，培養條件為通氣量40-60％，溫度24-40℃，20-48h，轉速150-350轉/分；(4)二級培養發酵，條件為二級培養發酵液為12Bé麥芽汁，加0.5％-1％蛋白胨，接種量為14％-16％，培養條件為通氣量40-60％，溫度24-40℃，20-48h，轉速150-350轉/分，收集菌絲，備用；(5)拌粉固培升溫干燥，其中二級發酵菌絲與米粉比例為1∶0.5-5，培養條件為28-40℃培養8-17h，立即翻動，通風，升溫至40-50℃，翻動至干燥，并過10-60目篩，即得。
5.據權利要求4所述的方法，其特征在于各步驟的條件為傳斜面菌種的培養時間為32℃培養36h；一級培養發酵一級培養發酵液為10Bé麥芽汁，加0.5％蛋白胨，用乳酸調至pH4.8，在發酵液中接種一級菌液的量為按1000ml三角燒瓶裝量為500ml計算，每個三角瓶中接種的一級菌液量相當于各菌種的1/3斜面，上搖床培養發酵，條件為通氣量50％，溫度32℃，36h，轉速180-200轉/分，過篩收集菌絲，備用；二級培養發酵的條件為二級培養發酵液為12Bé麥芽汁，加0.5％蛋白胨，接種量為14％，培養條件為通氣量50％，溫度32℃，40小時，轉速190-200轉/分收集菌絲，備用；拌粉固培升溫干燥時，培養條件為優選35℃培養12-15h，立即翻動，通風，升溫至45-47℃，翻動至干燥，過40目篩。。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于一級培養發酵得到的菌絲體可以直接進行拌粉固培升溫干燥過程，制得產品。
7.根據權利要求3-6中任一權利要求所述的方法，其特征在于將步驟(2)斜面得到的菌種用常規方法保存，在需要時從一級培養發酵步驟直接進行制備過程。
8.根據權利要求3-6中任一權利要求所述的方法，其特征在于一、二級培養發酵的C源選自8-13Bé麥芽、7％土豆絲液、7％大米液、7％地瓜液、7％玉米液、7％鮮土豆絲液、糯米液或7％糊精液，N源選自0.2％-1％蛋白胨、1％酵母、50％牛肉汁和純牛奶、30％豆餅水解液、15％花生渣水解液或黃豆粉水解液，二者的比例可任意組合，采用麥芽和蛋白胨時，二者的組合是13Bé0.2％、8Bé0.7％、10Bé0.5％或5Bé0.9％。
9.根據權利要求1或2所述的組合物在制備治療感染性急性腹瀉、急性胃腸炎和消化不良的藥物中的用途。
10.根據權利要求9所述的用途，其中的感染性急性腹瀉包括急性細菌性痢疾、急性細菌性腸炎、病毒性腸炎和霍亂。
全文摘要
本發明涉及用毛霉科根霉屬的米根霉(Rhizopusoryzae)AS 3.866菌株和日本根霉(R.japonicus)AS 3.868菌株制備的干混懸劑、制備方法及其在治療各種感染性急性腹瀉、急性胃腸炎和消化不良過程中的用途。
文檔編號A61P31/00GK1526413SQ0310510
公開日2004年9月8日 申請日期2003年3月3日 優先權日2003年3月3日
發明者蔡劍前 申請人:蔡劍前