專利名稱：一種止血藥的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛇毒激凝酶止血藥，該藥物含有凝血因子十激活劑(RVV-X)和協同劑--蛇毒類凝酶(Thrombin-like Enzyme)。更優選的是，該止血藥還含有血清白蛋白、例如人血清白蛋白。
背景技術：
1934年Macfarlane等發現蝰蛇毒具有十分顯著的凝固作用，當它稀釋1000倍時能在17秒鐘使血友病人的血液凝固(參見The Lancet，“DRS.MACFARLANE & BARNETTHAEMOSTATICPOSSIBILITIES OF SNAKE-VONOM”，Nov.3，1934，第985-987頁)。國外早期一些地區將其用作外用的局部止血，例如撥牙的止血(參見The Lancet，“CLINICAL AND LABORATORY NOTES”，Feb.22，1936，第428頁)，并且使用的是全毒，即未經分離和提純的初毒，代表制品是Stypven(Wellcome UK)，該制品多用作診斷試劑(參見BloodReviews(1993)7.176-189)。
國內臨床上也有蝰蛇毒試劑合用作診斷試劑，診斷血漿中凝血因子X是否缺乏。2000年4月5日公開的中國專利申請CN1249338A，“一種高效提取凝血因子十活化酶的方法”中介紹本品用于研究腫瘤遷移機理等科研領域，而將提取純化后的RVV-X用于止血目的未見報導。
基于上述情況，發明人開發出含有RVV-X的止血藥，并篩選了協同劑，蛇毒類凝酶及穩定劑、例如人血清白蛋白等，另外篩選輔料制備了注射用蛇毒激凝酶。
國外進口的立止血(參見Hand b Exp.Pharm.52 Snake Venom andBlood Coagulation 1991，Reprinted by Sigma Chemical Company)是從巴西矛頭腹蛇(Bothrops atrox)中提取的類凝酶和凝血因子十激活劑的混合物，而在我國同時含有這兩種酶的蛇種缺乏，到現在還未發現哪種蛇毒中同時含有類凝酶及RVV-X。
國內有立止血的仿制品—巴曲亭，但需要進口原料—巴西矛頭腹蛇(Bothrops atrox)毒。
發明目的本發明的一個目的是提供具有協同作用的止血藥。
本發明的另一目的是提供具有穩定作用的止血藥。
本發明再一個目的是提供高純度RVV-X的提取方法。
本發明再一個目的是提供RVV-X的止血用途，以及RVV-X在制備治療止血藥物中的應用。
發明概述本發明提供了一種具有協同作用的止血藥物，該藥物含有RVV-X和類凝酶，在該藥物中RVV-X與類凝酶的單位比為100～1∶20～0.01，優選為50～8∶5～0.5。
本發明還提供了一種具有穩定作用的止血藥物，該藥物除含有RVV-X和類凝酶之外，還含有血清白蛋白、例如人血清白蛋白。在該藥物中RVV-X類凝酶∶血清白蛋白的單位比例為100～1∶20～0.01∶20～0.02，優選為50～1∶6～0.2∶10～0.01(單位∶單位∶毫克)。
本發明還提供了一種RVV-X的分離純化方法，該方法是用Sephacryl系列分子篩柱粗分和Q-Sepharose系列離子交換柱精分兩個步驟實現的。
本發明還提供了RVV-X的止血用途，以及RVV-X在制備治療出血藥物中的應用。
圖1RVV-X分子量測定質譜圖(MALDI-TOF-MS) 1、初毒2、3、4半提純的RVV--X圖2ARVV-X SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜 5、RVV--X對照品6、本工藝提純的RVV-X圖2BRVV-X SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量圖譜1、2、還原型的RVV--X圖3RVV-X HPLC高效液相色譜圖 3、標準蛋白4、～6、不同點樣量的RVV-X(非還原型)圖4RVV-X HPLC高效毛細管電泳圖譜發明詳述本發明提供了一種RVV-X的分離純化方法，該方法是用Sephacryl分子篩柱粗分和Q-Sepharose離子交換柱精分兩個步驟實現的。
將購買的蛇毒，直接上柱分離提取。
具體方法如下。
柱子2.6×100(cm)。
平衡緩沖液0.05M pH 9～6.2 tris-H3PO4緩沖液。
洗脫液(A)0.05M pH9～6.2 tris-H3PO4緩沖液。
(B)0.05M pH8～5.0 tris-H3PO4緩沖液。
上樣取蛇毒500mg用8ml平衡緩沖液溶解，以3500rpm的轉速離心5分鐘，取上清液上樣。
洗脫速度2～0.1ml/min(30ml/小時)，洗脫液0.05M pH9～6.2 tris-H3PO4緩沖液。
鑒定使用LKB核酸蛋白檢測器于280mm處檢測蛋白洗脫峰。合并活性管。可收集38.0～30.0ml(含90～80mg蛋白質)。
將部分純化的酶液泵入離子交換柱。所用柱子和平衡液同上。洗脫先用0.05M pH9～6.2 Tris-H3PO4緩沖液60～30ml淋洗，除去吸附的雜蛋白，然后改用0.05M pH8～5.0 Tris-H3PO4緩沖液100～60ml淋洗，當OD280＜0.005時，改用0.05M pH6.0 Tris-H3PO4緩沖液150～90ml和0.5M NaCl的同一Tris-H3PO4緩沖液進行線性梯度洗脫(5～0.1ml/min，24ml、h)，每管8～2ml進行收集，檢測同上。
將已純化的酶對蒸餾水透析兩次(脫鹽)，除菌過濾、凍干即得。
本發明方法提供了高純度的RVV-X，其純度鑒定由以下測試證實(參見The Journal of Biololcal Chemistry.269，No 14，10644-10650，1994)。用MALDI-TOF-MS質譜儀測定分子量(見圖1)，測得分子量為92827D，與文獻一致。用ABI Procise 491序列測定儀測定N末端氨基酸序列(見下表1)。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳上呈現一條帶(見圖2A)，分子量測定為92967D(見圖2B)。HPLC高效液相色譜Progel TSK G3000SW柱上呈現一個峰(見圖3)。高效毛細管電泳儀測得一個峰(見圖4)。
氨基酸序列分析鑒定結果如下表1所示No.殘基1 Val2 Leu3 Asp4 Cys5 Pro6 Ser7 Gly8 Trp9 Leu10 Ser11 Tyr12 Glu13 Gln14 His15 Cys上樣程序PVDF測序儀ABI Procise 491從上述分析結果表明本發明方法制備的RVV-X為色譜純品。
本發明還提供了RVV-X的止血用途。所述RVV-X的止血作用可以通過以下試驗得以證實。
采用同類產品活性測定方法進行RVV-X體外凝血試驗，具體方法按下表，用50mMol/LCaCl2溶液制備RVV-X不同濃度的供試品溶液，取小試管(12×75mm)7支。預先加入人-枸櫞酸血漿(采用三人份以上的混合血漿)0.2ml，置37℃±0.5℃水浴中保溫2分鐘，加入37℃預熱的RVV-X的供試品溶液，立即混勻，計時，到血漿凝固，停止計時。結果見表2。
表2 RVV-X體外凝血試驗結果
上表表明由于血漿中因子X的濃度是固定的5μg/ml血漿，當底物反應完成后，再增加酶濃度，作用則不明顯。當蛇毒激凝酶劑量大于50ng后(稀釋2.0×107)，凝固時間不再明顯縮短。
按照臨床前研究指導原則規定的方法小鼠斷尾法進行RVV-X體內凝血試驗RVV-X和類凝酶單獨以及協同止血試驗。具體方法如下1.RVV-X分別配制0.05U/ml及0.1U/ml的供試品溶液2.類凝酶分別配置2.5×10-3U/ml，0.5×10-2U/ml及
2.類凝酶分別配置2.5×10-3U/ml，0.5×10-2U/ml及1.25×10-2U/ml的供試品溶液。
用斷尾法測定小鼠出血時間。
取健康小鼠，隨機分為7組，每組5只，按表中劑量小鼠尾靜脈注射0.1ml分別于注射后0.5、1、3小時，用剪刀在距小鼠尾尖0.5cm處剪斷，血液自行流出后立即計時，到血液凝固停止計時。以出血時間縮短作為判斷止血效果的指標。同時給予立止血0.1U/kg作為陽性對照，給予生理鹽水作為陰性對照。
結果見下表3～7注“-“為縮短出血時間，”+“為延長出血時間表3類凝酶(A)和RVV-X(B)單獨止血試驗結果
表4陽性對照及陰性對照止血試驗結果
表5小鼠斷尾法測定止血時間(秒)
表6小鼠斷尾法測定止血時間(秒)
結果表明隨著RVV-X劑量由0.01U/kg增加到0.015U/kg，小鼠出血時間縮短，由16.4秒增加至32.2秒，；兩者相比出血時間又縮短了15.8秒。明顯優于立止血。證明RVV-X具有很好的止血作用。注“-”代表縮短出血時間；“+”代表延長出血時間蛇毒激凝酶在劑量明顯小于立止血的情況下(相差10倍)，其止血作用(縮短出血時間)相當，效力基本一致。
表7 RVV-X與類凝酶的協同止血試驗結果
注“-“為縮短出血時間，”+“為延長出血時間本發明提供了具有協同作用的止血藥物。該藥物含有RVV-X和類凝酶。當RVV-X與類凝酶配制成組合給藥制劑時，RVV-X的止血作用得到協同，作用得到提高。通過以下的對比試驗可以說明其協同止血作用。
從表7看出本發明提供了具有協同作用的止血藥物。該藥物含有RVV-X和類凝酶。當RVV-X與類凝酶配制成組合給藥制劑時，RVV-X的止血作用得到協同提高。通過以下試驗可以說明其協同止血作用。
從表“3”和“7”得到的結論為0.00025U/kgA+0.005U/kgB具有協同作用。如下表8所示。
表8
本發明還提供了具有穩定作用的止血藥物。該藥物含有RVV-X、類凝酶和血清白蛋白、例如人血清白蛋白。當在含有RVV-X和類凝酶的藥物中加入血清白蛋白時，RVV-X的穩定作用得到加強。通過以下的對比試驗可以說明血清白蛋白對于本發明協同止血藥物的穩定作用。
表9注射用蛇毒激凝酶穩定劑篩選
從表中數據看出處方2最穩定，凝固時間變化最小，從而確定以人血清白蛋白作為穩定劑，并且其含量優選為8mg/ml。
實施例1按照上表中處方2的組成制備蛇毒激凝酶止血藥按照常規方法取類凝酶1U/ml、RVV-X 5U/ml、人血清白蛋白20mg、甘露醇30mg，將其制成凍干粉針，規格為1ml/支的注射用蛇毒激凝酶止血藥。
實施例2按照上表中處方2的組成制備蛇毒激凝酶止血藥按照常規方法取類凝酶0.8U/ml、RVV-X 1U/ml、人血清白蛋白10mg、甘露醇30mg，將其制成凍干粉針，規格為1ml/支的注射用蛇毒激凝酶止血藥。
實施例3按照上表中處方2的組成制備蛇毒激凝酶止血藥按照常規方法取類凝酶0.01U/ml、RVV-X 0.1U/ml、人血清白蛋白1mg、甘露醇30mg，將其制成凍干粉針，規格為1ml/支的注射用蛇毒激凝酶止血藥。
實施例4按照上表中處方2的組成制備蛇毒激凝酶止血藥按照常規方法取類凝酶1U/ml、RVV-X 0.1U/ml、人血清白蛋白10mg、甘露醇30mg，將其制成凍干粉針，規格為1ml/支的注射用蛇毒激凝酶止血藥。
權利要求
1.一種協同止血藥物，其特征在于含有凝血因子十激活劑和類凝酶，在該藥物中凝血因子十激活劑與類凝酶的單位比為100～1∶20～0.01。
2.按權利要求1所述的止血藥物，其中凝血因子十激活劑與類凝酶的單位比為50～8∶5～0.5。
3.按權利要求1所述的止血藥物，其中還含有血清白蛋白
4.按權利要求1所述的止血藥物，其中所述血清白蛋白是人血清白蛋白。
5.按權利要求3所述的止血藥物，其中凝血因子十激活劑∶類凝酶∶血清白蛋白為100～1∶20～0.01∶20～0.02單位∶單位∶毫克
6.按權利要求5所述的止血藥物，其中凝血因子十激活劑∶類凝酶∶血清白蛋白為50～1∶6～0.2∶10～0.01單位∶單位∶毫克。
7.按權利要求1所述的止血藥物，其凝血因子十激活劑的分離純化方法，是用Sephacryl系列分子篩柱粗分和Q-Sepharose系列離子交換柱精分兩個步驟實現的。
8.凝血因子十激活劑在制備止血藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開一種蛇毒激凝酶止血藥，該藥物含有凝血因子十激活劑(RVV－X)和協同劑——蛇毒類凝酶。更優選的是，該止血藥還含有血清白蛋白、例如人血清白蛋白。此外，本發明還公開了高純度RVV－X的制備方法，以及RVV－X的止血用途。
文檔編號A61P7/04GK1520880SQ0310188
公開日2004年8月18日 申請日期2003年1月29日 優先權日2003年1月29日
發明者熊時澤 申請人:熊時澤