專利名稱：重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子凝膠劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種治療因燒傷、燙傷及潰瘍帶來創面損傷的凝膠劑，具體地說是將重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(以下簡稱rhGM-CSF)與適當基質混合制成外用凝膠劑，本發明還涉及該凝膠劑的制備方法。
背景技術：
rhGM-CSF是由活化的T細胞、B細胞、巨噬細胞、肥大細胞、內皮細胞及成纖維細胞等細胞產生并分泌的一種酸性蛋白。rhGM-CSF具有生白細胞作用，是一種調節造血和白細胞功能必須的細胞生長因子，它能夠全面改善慢性潰瘍的病理特征，促進創傷修復，增強粒細胞和巨噬細胞的殺菌能力，在機體內廣泛參與造血、免疫及抗感染等過程，對于傷口愈合起著重要作用。
選擇以活化巨噬細胞，中性粒細胞，內皮細胞和上皮細胞功能細胞因子rhGM-CSF促進燒傷愈合，正在臨床研究方面得到重視。目前rhGM-CSF用于燒傷的治療絕大多數的方法是通過全身注射或局部給藥，取得了一定的效果。但是rhGM-CSF的體內半衰期較短，經過體循環后到達創面的有效藥物較少，而且給患者帶來許多不便，在臨床應用方面受到限制。
因此，發明一種既保證rhGM-CSF的有效成分，又在臨床上方便使用且效果更加明顯的rhGM-CSF新劑型是十分必要的。
發明內容
本發明的目的在于提供一種可以直接涂抹在因燒傷、燙傷、潰瘍帶來的損傷創面上，具有抑制病菌感染，促進創面組織愈合，縮短愈合時間，使用方便，易于清洗等作用，且對皮膚無刺激性，無毒副作用的rhGM-CSF凝膠劑。
本發明的另一目的是提供該rhGM-CSF凝膠劑的制備方法。
本發明的關鍵在于如何保持rhGM-CSF的生物活性，這是至關重要的，各組分比例混合不同就會影響rhGM-CSF的生物活性，從而影響維持其藥效，所以本發明各組分的篩選以生物活性檢定為判斷依據，同時還對制劑進行了各項檢定，以保證其臨床用藥安全性，有效性。
本發明制備方法的關鍵在于1.制劑中使用的基質不能時皮膚有任何刺激作用和毒副作用，各成分之間不應該對人體和對rhGM-CSF活性有影響。
2.增強主要活性成分rhGM-CSF的穩定性。也就是說通過調整各種組分的比例，將rhGM-CSF在制劑中所能發生的上述的有害變化降低至最低限度，甚至是完全避免，只有這樣才能保證制劑在制備、貯存、運輸和病人使用中的藥物有效性。
3.rhGM-CSF是分子量較大的蛋白質分子，并且有一定的空間結構，容易受到空間位阻效應的影響，所以要調整制劑中各個組分的比例，使rhGM-CSF能持續有效釋放。
本發明rhGM-CSF凝膠劑，由下述原料制成凝膠基質(重量百分比)包括增稠劑0.1～10，濕潤劑0.1～20，防腐劑0.1～5，穩定劑0.1～10，水55～99.5；人血白蛋白0.1克～20克/克基質，重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子0.1微克～300微克/克基質。
增稠劑是羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙二醇、卡伯母、甲殼胺，濃度分別為0.5％～5％。濕潤劑是甘油、丙二醇，濃度分別為0.1％～10％。防腐劑是對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、苯酚、山梨酸、苯甲酸鈉，濃度分別為0.1％～3％。穩定劑是十二烷基硫酸鈉、吐溫、右旋糖苷、透明質酸、硫酸軟骨素，濃度分別為0.5％～5％。
rhGM-CSF凝膠劑的制備方法是先將增稠劑、濕潤劑、防腐劑、穩定劑和水按上述比例混合并攪拌均勻制成水溶性凝膠基質，然后在0.08～0.15MPa壓力，100～126℃條件下，將制成的水溶性凝膠基質高壓滅菌15～30分鐘，自然冷卻到室溫，再加入上述配比的人血白蛋白和重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，緩慢攪拌混合均勻，制成凝膠劑。
本發明具有以下優點和效果1、本發明選用的凝膠劑基質合理，對皮膚無毒、無刺激作用，不沾染衣物，易于清洗；2、本發明采用的凝膠劑基質為網狀結構，藥物溶解在其中，這樣可以使蛋白質類藥物rhGM-CSF更加穩定，藥物緩慢釋放，同時能吸收創面滲液形成高度親水的凝膠劑，從而控制創面的分泌和細菌的感染，同時加快藥物的溶出，在一定程度上起到緩釋作用，使其作用更加持久，促進創面組織愈合，加快愈合速度，使rhGM-CSF的作用更加直接有效，復發率低；
3、本發明凝膠劑可以直接涂抹在燒傷、燙傷、潰瘍帶來的損傷創面上，使用方便，減輕了患者的用藥痛苦，便于患者接受及使用.
本發明所涉及到的檢定實驗和相關實驗包括1、穩定性實驗活性用TF-1依賴細胞株/MTT比色法進行，4℃條件下，放置一年后仍保持活性。同時，對制劑的外觀、PH值、失水、均勻性作長期觀察，均無明顯變化，說明發明的制劑具有良好的穩定性。
2、微生物限度實驗沒有檢出綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌，符合要求。
3、皮膚過敏實驗重組人巨噬細胞粒細胞集落刺激因子凝膠劑分別以每克含量0.4mg、0.8mg、1.6mg、1.0g(相當于人臨床用量的1倍、2倍、4倍)涂于豚鼠正常及破損皮膚受試區，面積均為20cm2，結果表明，一次給藥和多次給藥，對照組與給藥組比較觀察，皮膚刺激反應強度均＜0.5分，說明重組人巨噬細胞粒細胞集落刺激因子凝膠劑一次給藥和多次給藥對豚鼠完整和破損皮膚均無刺激性。
試驗方法一次性給藥刺激試驗取白色健康豚鼠72只，分為完整皮膚組和破損皮膚組。完整皮膚組分為6組，每組6只，雌雄各半，對照BFGF噴霧劑組，羧甲基纖維素鈉基質對照組及空白對照組，在試驗前24小時，將動物背部脊柱右側剪毛，面積為4cm×5cm，完整皮膚組重組人巨噬細胞粒細胞集落刺激因子凝膠劑三個劑量按1g/只分別涂于受試區，陽性對照組BFGF噴霧劑劑量為3600AU/只，羧甲基纖維素鈉基質對照組用量為1g/只，涂抹區域均為20cm2，空白對照組剪毛作為對照，不給任何藥物和基質，破損皮膚組剪毛后消毒皮膚并用注射針頭劃“#”字型破口，以滲血為度，破損面積4cm×5cm，劃痕間距0.5cm，分細及給藥方法、劑量同完整皮膚組，各試驗組涂藥后用紗布、膠布固定，24小時后用溫水去除殘留受試物，去除受試物后1h、24h、48h和72h觀察涂抹部位有無紅斑和水腫等變化，以及恢復時間。
多次給藥刺激試驗取白色健康豚鼠72只，方法同前，每天涂藥，連續觀察涂抹藥物部位有無紅斑和水腫等變化，連續給藥10天后，將動物處死，取皮膚標本作鏡下病理觀察。
試驗結果和評價每只動物評分法和評價法按《新藥(西藥)臨床及臨床前研究指導原則》中皮膚刺激試驗項的評分標準進行。結果見表1、表2及表3，由表中可見，一次給藥和多次給藥，對照組與受試組比較觀察，未見紅斑及水腫，動物全身狀況良好，無行為改變，皮膚刺激反應強度均＜0.5分，鏡下病理觀察未見異常，說明重組人巨噬細胞粒細胞集落刺激因子凝膠劑一次給藥和多次給藥對豚鼠完整皮膚和破損皮膚均無刺激性，試驗證明局部皮膚用藥頗安全。
表1 一次性給藥皮膚刺激評分結果
表2 多次給藥皮膚刺激評分結果
表3 皮膚刺激強度評價
在豚鼠皮膚刺激實驗中，將本發明的rhGM-CSF凝膠劑涂抹于脫毛區，間隔1周連續三次，最后一次致敏后14天，將制劑涂抹于激發區，觀察到無發紅、發疹、水泡等現象，結果表明制劑無過敏反應。
4、體外釋放實驗參照DiBase MD等(Pharm Acta Helv， 1991，66(5-6)165)的方法進行，體外釋放符合零級動力學模式。
為表明本發明rhGM-CSF凝膠劑對因燒傷、燙傷、潰瘍帶來的創面損傷的治療效果，本發明臨床應用情況如下以增稠劑、穩定劑、濕潤劑、防腐劑制成的水溶性rhGM-CSF凝膠劑，直接涂抹于疾患處，利用藥物滲透而發揮治療作用，使用本制劑無不良反應，適用于燒傷、燙傷及潰瘍等疾病療效較好。同時，凝膠劑所用輔料少，工藝簡單，便于操作，適用于臨床。
用法與用量將患處充分拭凈后，按損傷皮膚面積大小，用0.1～0.3μg/cm2，涂于患處，適當包扎，即可。每日1～2次。
效價評價臨床應用效果由醫師按自覺癥狀和查體所見綜合評定，分為痊愈、顯效、有效、無效四類，痊愈、顯效、有效合計為有效，治療組與對照組比較，結果見表4、表5。
表4 治療組臨床觀察結果類型例數痊愈顯效有效無效治愈率％有效率％深淺二度燒傷43 37 3 2 1 86 95.34燙傷85 78 6 1 0 91.76 100糖尿病引起潰瘍 23 20 1 1 1 86.96 95.65靜脈功能引起潰瘍52 47 2 1 2 90.496.15
表5 對照組臨床觀察結果類型用藥品種例數 痊愈 顯效 有效 無效 治愈率％ 有效率％深淺二度燒傷bFGF35302 1 2 85.71 94.28燙傷磺胺嘧啶鋅 36193 2 1252.78 66.67糖尿病引起潰瘍 FGF 118 1 0 2 72.73 81.82靜脈功能引起潰瘍紅霉素軟膏 24181 1 4 7583.33從表4、表5可見，rhGM-CSF凝膠劑臨床驗證，在治療燒傷、燙傷及潰瘍。有效率分別在95％以上，證明rhGM-CSF凝膠劑是可行的，較合理。而對照組有效率在75％。
具體實施例方式
實施例1取甲基纖維素1g，甘油2g，對羥基苯甲酸乙酯1g，硫酸軟骨素1g，加入溶解水至100g，混合均勻，然后在0.1MPa，121℃條件下，高壓滅菌15分鐘，冷卻到室溫，制成基質部分。在基質中加入人血白蛋白5g，rhGM-CSF100μg，同時緩慢攪拌均勻，制成rhGM-CSF凝膠劑。
實施例2取羧甲基纖維素鈉2g，丙二醇5g，對羥基苯甲酸甲酯3g，十二烷基硫酸鈉2g，加入溶解水至100g，混合均勻，然后在0.1MPa，121℃條件下，高壓滅菌25分鐘，冷卻到室溫，制成基質部分。在基質中加入人血白蛋白1g，rhGM-CSF300μg，同時緩慢攪拌均勻，制成rhGM-CSF凝膠劑。
實施例3取聚乙二醇5g，丙二醇5g，山梨酸3g，吐溫3g，加入溶解水至100g，混合均勻，然后在0.1MPa，121℃條件下，高壓滅菌15分鐘，冷卻到室溫，制成基質部分。在基質中加入人血白蛋白5g，rhGM-CSF 300μg，同時緩慢攪拌均勻，制成rhGM-CSF凝膠劑。
實施例4取卡伯母2g，甘油5g，對羥基苯甲酸甲酯1g，右旋糖苷1g，上述原料混合后成酸性，為保證蛋白不變性，加入三乙醇胺1g，調ph值，加入溶解水至100g，混合均勻，然后在0.1MPa，121℃條件下，高壓滅菌15分鐘，冷卻到室溫，制成其質部分。在基質中加入人血白蛋白3g，rhGM-CSF 100μg，同時緩慢攪拌均勻，制成rhGM-CSF凝膠劑。
實施例5取甲殼胺2g，丙二醇5g，苯甲酸鈉0.5g，吐溫5g，加入溶解水至100g，混合均勻，然后在0.1MPa，121℃條件下，高壓滅菌25分鐘，冷卻到室溫，制成基質部分。在基質中加入人血白蛋白3g，rhGM-CSF 100μg，同時緩慢攪拌均勻，制成rhGM-CSF凝膠劑。
實施例6取羧甲基纖維素鈉5g，丙二醇10g，苯甲酸鈉0.5g，透明質酸1g，加入溶解水至100g，混合均勻，然后在0.15MPa，126℃條件下，高壓滅菌15分鐘，冷卻到室溫，制成基質部分。在基質中加入人血白蛋白5g，rhGM-CSF 300μg，同時緩慢攪拌均勻，制成rhGM-CSF凝膠劑。
權利要求
1.一種重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子凝膠劑，其特征在于它是由下述原料制成的凝膠劑凝膠基質(重量百分比)增稠劑 0.1～10 濕潤劑 0.1～20 防腐劑 0.1～5穩定劑 0.1～10 水 55～99.5人血白蛋白0.1克～20克/克基質重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子0.1微克～300微克/克基質。
2.根據權利要求1所述的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子凝膠劑，其特征在于增稠劑是羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙二醇、卡伯母、甲殼胺，濃度分別為0.5％～5％。
3.根據權利要求1所述的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子凝膠劑，其特征在于濕潤劑是甘油、丙二醇，濃度分別為0.1％～10％。
4.根據權利要求1所述的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子凝膠劑，其特征在于防腐劑是對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、苯酚、山梨酸、苯甲酸鈉，濃度分別為0.1％～3％。
5.根據權利要求1所述的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子凝膠劑，其特征在于穩定劑是十二烷基硫酸鈉、吐溫、右旋糖苷、透明質酸、硫酸軟骨素，濃度分別為0.5％～5％。
6.根據權利要求1所述的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子凝膠劑的制備方法，其特征在于先將增稠劑、濕潤劑、防腐劑、穩定劑和水按上述比例混合并攪拌均勻制成水溶性凝膠基質，然后在0.08～0.15MPa壓力，100～126℃條件下，將制成的水溶性凝膠基質高壓滅菌15～30分鐘，自然冷卻到室溫，再加入上述配比的人血白蛋白和重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，緩慢攪拌混合均勻，制成凝膠劑。
全文摘要
本發明公開了一種重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子凝膠劑及其制備方法。它是按一定比例將增稠劑、濕潤劑、防腐劑、穩定劑和水混合，攪拌均勻，制成水溶性凝膠基質，然后在0.08～0.15MPa壓力，100～126℃條件下，將制成的水溶性凝膠基質高壓滅菌15～30分鐘，自然冷卻至室溫，加入一定濃度的重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子蛋白溶液和人血白蛋白溶液，制成外用凝膠劑。本發明配方及制備方法獨特，治療因燒傷、燙傷及潰瘍帶來的創面損傷效果顯著；本發明使用方便，易清洗，對皮膚無刺激性，無毒副作用；本發明為重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的應用提供了一種新的劑型。
文檔編號A61K9/00GK1517125SQ0310044
公開日2004年8月4日 申請日期2003年1月14日 優先權日2003年1月14日
發明者李樹奇 申請人:北京邁德康醫藥技術有限公司