專利名稱：敗醬草中抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中草藥敗醬草抗病毒物質(zhì)的提取方法。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)作為全球范圍兒童病毒性呼吸道感染的重要病原之一，在呼吸道感染中占重要位置。RSV感染在1歲以下嬰幼兒中易發(fā)展成嚴(yán)重的下呼吸道感染，還可誘發(fā)哮喘，甚至引起死亡，對嬰幼兒危害較大。近年發(fā)現(xiàn)，RSV是成人免疫抑制者感染的重要病原，也可在老年人中流行，目前尚無令人滿意的預(yù)防和治療辦法。呼吸道合胞病毒疫苗研制早在上世紀(jì)60年代就已開始，但目前仍無安全有效者。原因在于①嬰兒體內(nèi)的母傳RSV抗體，可降低疫苗的免疫原性；②由于RSV自然感染激發(fā)的機(jī)體免疫是不完全免疫，因此RSV疫苗需多次接種；③RSV存在著A、B兩個(gè)亞型，兩亞型交叉中和活性低，故RSV疫苗應(yīng)對兩個(gè)亞型的RSV都具有保護(hù)作用。病毒唑(ribavirin)最早獲美國食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療重癥呼吸道合胞病毒感染。但由于其毒性較大，治療費(fèi)用昂貴，使用不方便，病毒唑的臨床應(yīng)用受到很大的限制。抗呼吸道合胞病毒的新藥研究很多，包括單克隆抗體、干擾素、反義寡核苷酸等。盡管前景比較樂觀，但短時(shí)間內(nèi)還沒有可以進(jìn)入臨床的藥物。
發(fā)明內(nèi)容
為解決已有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種敗醬草中抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)的提取方法，它應(yīng)具有提取工藝簡單，提取的抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)純度高的特點(diǎn)。它還應(yīng)具有利用細(xì)胞培養(yǎng)方法檢測和證實(shí)敗醬草抗病毒有效物質(zhì)抑制呼吸道合胞病毒的作用，為開發(fā)研制新的抗病毒二類中藥和進(jìn)一步研究敗醬草抗病毒有效成分，提供科學(xué)依據(jù)的特點(diǎn)，本發(fā)明首先制備敗醬草的水提液，將敗醬草(Herba patriniae)1kg，用自來水清洗五次，蒸餾水清洗三次，7000ml蒸餾水浸泡12小時(shí)，于100℃煮沸90分鐘后用脫脂棉過濾，藥渣加5000ml蒸餾水于100℃煮沸90分鐘，用脫脂棉過濾，將兩次濾液混合，混合濾液減壓濃縮，濃縮到濃度為1g/ml(每ml含生藥1克)。然后用水醇法制備乙醇沉淀物，向濃縮的水提液(1g/ml)中緩慢加入95％的乙醇，并不斷攪拌，直至乙醇體積達(dá)到20％-90％后，于4℃溫度下放置12小時(shí)，于3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，過濾收集沉淀。將沉淀用適量雙蒸水溶解后經(jīng)濾紙過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，干燥，得粉末。還可用大孔吸附樹脂柱層析法制備敗醬草抗呼吸道合胞病毒洗脫物，將乙醇沉淀物加水溶解后，加在預(yù)處理好的大孔吸附樹脂柱頂端，用水洗脫，洗脫液減壓濃縮，干燥，得洗脫物A。
檢驗(yàn)敗醬草乙醇沉淀物對呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用，采用藥物對比實(shí)驗(yàn)敗醬草乙醇沉淀物。陽性對照藥物病毒唑(Ribavirin)注射液，含量為100mg/ml，批號000302，煙臺(tái)第二制藥廠生產(chǎn)。人宮頸癌傳代細(xì)胞Hela，由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供。常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。呼吸道合胞病毒(RSV)Long株，由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供。在Hela細(xì)胞中的組織半數(shù)感染量(TCID50)為10-7.7。
藥物毒性試驗(yàn)用細(xì)胞維持液將藥液連續(xù)0.8倍稀釋，按常量分別加入細(xì)胞已長成單層的％孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5％CO2的溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)觀察3天。每個(gè)劑量加入四孔細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立四孔正常細(xì)胞對照。記錄藥物最大無毒劑量(TC0)。
藥物對呼吸道合胞病毒抑制作用的試驗(yàn)采用細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)(CPEI)對敗醬草乙醇沉淀物進(jìn)行藥效學(xué)檢測。將呼吸道合胞病毒連續(xù)十倍稀釋加入已長成單層的細(xì)胞，置于37℃、5％CO2的溫箱內(nèi)孵育2小時(shí)后加入藥物(藥物濃度根據(jù)最大無毒劑量確定)，再置于37℃、5％CO2的溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)觀察3天，記錄細(xì)胞病變(CPE)程度。CPE程度0表示無明顯CPE，1表示CPE為0％～25％，2表示CPE為25％～50％，3表示CPE為50％～75％，4表示CPE為75％～100％。同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對照、病毒對照和陽性藥物對照各四孔。
統(tǒng)計(jì)方法Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法比較藥物對不同滴度呼吸道合胞病毒的抑制作用與病毒對照細(xì)胞病變程度。
藥物毒性測定結(jié)果根據(jù)藥物毒性試驗(yàn)結(jié)果，敗醬草乙醇沉淀物TC0為0.3125mg/ml；病毒唑TC0為11.52ug/ml。
敗醬草乙醇沉淀物對呼吸道合胞病毒抑制作用的試驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1敗醬草乙醇沉淀物抗呼吸道合胞病毒的作用
用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法比較敗醬草沉淀物對不同滴度呼吸道合胞病毒的抑制作用與病毒對照細(xì)胞病變程度。結(jié)果表明，病毒滴度為10-6、10-7、10-8時(shí)，敗醬草沉淀物對呼吸道合胞病毒均有明顯的抑制作用(P＜0.01)。說明敗醬草沉淀物具有明顯的抑制呼吸道合胞病毒的作用。檢驗(yàn)敗醬草抗病毒有效物質(zhì)(洗脫物A)對呼吸道合胞病毒的抑制作用實(shí)驗(yàn)藥物洗脫物A(敗醬草抗呼吸道合胞病毒有效物質(zhì))。陽性對照藥物病毒唑(Ribavirin)注射液，含量為100mg/ml，批號000302煙臺(tái)第二制藥廠生產(chǎn)。人宮頸癌傳代細(xì)胞Hela，由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供。常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。呼吸道合胞病毒(RSV)Long株，由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供。在Hela細(xì)胞中的組織半數(shù)感染量(TCID50)為10-7.7。
藥物毒性試驗(yàn)用細(xì)胞維持液將藥液連續(xù)0.8倍稀釋，按常量分別加入細(xì)胞已長成單層的％孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5％CO2的溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)觀察3天。每個(gè)劑量加入四孔細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立四孔正常細(xì)胞對照。記錄藥物最大無毒劑量(TC0)，計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TC50)。
藥物對呼吸道合胞病毒的抑制作用試驗(yàn)采用細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)(CPEI)對藥物進(jìn)行藥效學(xué)檢測。已長成單層的細(xì)胞接種劑量為50TCID50的呼吸道合胞病毒，置于37℃、5％CO2的溫箱內(nèi)孵育2小時(shí)。然后棄去含病毒維持液，加入含不同濃度含藥物的維持液，置于37℃、5％CO2的溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)觀察3天，記錄CPE程度。CPE程度0表示無明顯CPE，1表示CPE為0％～25％，2表示CPE為25％～50％，3表示CPE為50％～75％，4表示CPE為75％～100％。同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對照、病毒對照和陽性藥物對照各四孔。計(jì)算藥物半數(shù)有效劑量(EC50)和治療指數(shù)(TI)。
不同給藥時(shí)間對病毒抑制的影響已長成單層的細(xì)胞中加入呼吸道合胞病毒，感染劑量為50 TCID50，置4℃1小時(shí)，棄去病毒液，于0小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)，8小時(shí)分別加入同濃度洗脫物A及病毒唑，培養(yǎng)觀察，記錄CPE程度。
統(tǒng)計(jì)方法Reed-Muench法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TC50)和半數(shù)有效濃度(EC50)、治療指數(shù)(TI)＝半數(shù)中毒濃度(TC50)/半數(shù)有效濃度(EC50)；Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法比較藥物各劑量組與病毒對照組細(xì)胞病變程度的總體分布及不同給藥時(shí)間各組藥物與病毒對照組細(xì)胞病變程度的總體分布。數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SAS軟件完成。
敗醬草抗病毒物質(zhì)對呼吸道合胞病毒抑制作用的試驗(yàn)結(jié)果見表2。
Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法比較藥物各劑量組與病毒對照組細(xì)胞病變程度。結(jié)果表明，敗醬草水提液的5、2.5、1.25、0.625mg/ml劑量組，敗醬草洗脫物A的2、1、0.5、0.25mg/ml劑量組，病毒唑10、5、2.5ug/ml劑量組，對呼吸道合胞病毒均有明顯抑制作用(P＜0.01)。
采用Reed-Muench法計(jì)算，敗醬草水提液半數(shù)中毒濃度(TC50)為32mg/ml，敗醬草水提液的EC50為125mg/ml、治療指數(shù)(TI)為25.6；敗醬草洗脫物A半數(shù)中毒濃度(TC50)為11.52mg/ml，半數(shù)有效濃度(EC50)為0.0986mg/ml，治療指數(shù)(TI)為116.84；病毒唑半數(shù)中毒濃度(TC50)為76.43ug/ml，半數(shù)有效濃度(EC50)為1.43μg/ml，治療指數(shù)(TI)為53.45。
表2 敗醬草水提液與洗脫物A對呼吸道合胞病毒的抑制作用分組每孔CPE 平均 CPE抑制 累積 CPE抑制率CPE 程度 CPE抑制CPE (％)敗醬草5 10110.753.25 14.50 3.2581.69水提液2.5 11211.252.75 11.25 6.0065.22mg/ml 1.2512121.502.50 8.50 8.5050.000.625 21121.502.50 6.00 14.50 29.27
0.3125 3223 2.501.503.5018.00 16.280.1562332 2.501.502.0020.00 9.090.0783434 3.500.500.5020.50 2.38敗醬草 20000 0.004.0019.25 0.00100.00洗脫物 11010 0.503.5015.25 0.5096.82A0.5 1100 0.503.5011.75 1.0092.16mg/ml 0.25 1110 0.753.258.251.7582.500.1253211 1.752.255.003.5058.820.0625 1322 2.002.002.755.5033.330.0312 4343 3.500.500.759.007.690.0162 4344 3.750.250.2512.75 1.9210 0000 0.004.0013.50 0.00100.00病 51010 0.503.509.500.5095.00毒 2.5 1221 1.502.506.002.0075.00唑 1.25 1323 2.251.753.504.2545.16μg/ml 0.6253233 2.751.251.757.0020.000.3125 4433 3.500.500.5010.50 4.54正常細(xì)胞0000 0 4.00病毒對照4434 3.750.25不同給藥時(shí)間對病毒抑制的影響敗醬草洗脫物A不同給藥時(shí)間對病毒抑制作用的試驗(yàn)結(jié)果見表3。
Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法比較不同給藥時(shí)間各組藥物與病毒對照組細(xì)胞病變程度。結(jié)果表明，感染呼吸道合胞病毒后0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)，6小時(shí)加入洗脫物A，有抑制呼吸道合胞病毒的作用(P＜0.01)；感染后0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)加入病毒唑，均有抑制呼吸道合胞病毒的作用(P＜0.01)。
表3 敗醬草洗脫物A不同給藥時(shí)間對病毒抑制作用的影響藥物分組 CPE病變 藥物分組 CPE病變程度 程度0h 0000 0h 0000洗脫物A 2h 0000 毒唑 2h 1101(2mg/ml)4h 1111 (10ug/ml) 4h 13216h 1223 6h 23348h 4334 8h 4443病毒對照 4444本發(fā)明采用生物活性為導(dǎo)向的化學(xué)提取方法，從中草藥敗醬草中提取到抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)(洗脫物A)。洗脫物A，Molish反應(yīng)陽性，確認(rèn)為多糖類物質(zhì)。
用體外細(xì)胞培養(yǎng)法，以病毒唑?yàn)殛栃詫φ账帣z測了敗醬草抗病毒物質(zhì)對呼吸道合胞病毒的抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，敗醬草抗病毒物質(zhì)具有明顯的抗呼吸道合胞病毒的作用。
敗醬草抗病毒物質(zhì)的半數(shù)中毒濃度(TC50)為11.52mg/ml，半數(shù)有效濃度(EC50)為0.0986mg/ml，治療指數(shù)(TI)為116.84。
病毒唑(陽性對照藥)半數(shù)中毒濃度(TC50)為76.43ug/ml，半數(shù)有效濃度(EC50)為1.43μg/ml，治療指數(shù)(TI)為53.45。
本發(fā)明還得知，感染病毒0-6小時(shí)加洗脫物A，均能明顯抑制呼吸道合胞病毒增值，并延緩CPE的出現(xiàn)，根據(jù)病毒復(fù)制周期推測，洗脫物A能作用于呼吸道合胞病毒的RNA復(fù)制過程而發(fā)揮其抗病毒活性。
同時(shí)，還檢測了敗醬草水提液、敗醬草乙醇沉淀物對呼吸道合胞病毒的抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，敗醬草水提液、敗醬草乙醇沉淀物也具有明顯的抗呼吸道合胞病毒的作用。
本發(fā)明化學(xué)提取方法采用了水提取法、用水醇法和大孔吸附樹脂柱層析法。在藥物提取過程中避免使用對人體有毒的化學(xué)試劑，而是采用乙醇沉淀的方法，減少了加工過程中有毒物質(zhì)的污染，提高藥物使用的安全性。大孔吸附樹脂柱層析的洗脫物抗病毒試驗(yàn)結(jié)果表明，水洗脫部分具有明顯的抗呼吸道合胞病毒的作用。大孔吸附樹脂柱層析分離敗醬草抗病毒物質(zhì)，以水作為洗脫劑，這就使生產(chǎn)工藝過程簡單易行，生產(chǎn)成本大幅度下降。具有提取工藝簡單，提取的抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)純度高的優(yōu)點(diǎn)，它還具有利用細(xì)胞培養(yǎng)方法檢測和證實(shí)敗醬草抗病毒有效物質(zhì)抑制呼吸道合胞病毒的作用，為開發(fā)研制新的抗病毒二類中藥和進(jìn)一步研究敗醬草抗病毒有效成分而提供了科學(xué)依據(jù)的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
一本實(shí)施方式首先制備敗醬草的水提液，將敗醬草(Herba patriniae)1kg，用自來水清洗五次，蒸餾水清洗三次，7000ml蒸餾水浸泡12小時(shí)，于100℃煮沸90分鐘后用脫脂棉過濾，藥渣加5000ml蒸餾水于100C煮沸90分鐘，用脫脂棉過濾，將兩次濾液混合，混合濾液減壓濃縮，濃縮到濃度為1g/ml(每ml含生藥1克)。然后用水醇法制備乙醇沉淀物，向濃縮的水提液(1g/ml)中緩慢加入95％的乙醇，并不斷攪拌，直至乙醇體積達(dá)到20％～90％后，于4℃溫度下放置12小時(shí)，于3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，過濾收集沉淀。將沉淀用適量雙蒸水溶解后經(jīng)濾紙過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，干燥，得粉末。還可用大孔吸附樹脂柱層析法制備敗醬草抗呼吸道合胞病毒洗脫物，將乙醇沉淀物加水溶解后，加在預(yù)處理好的大孔吸附樹脂柱頂端，用水洗脫，洗脫液減壓濃縮，干燥，得洗脫物A。
具體實(shí)施例方式
二本實(shí)施方式中，乙醇的體積為20％～34％。
具體實(shí)施例方式
三本實(shí)施方式中，乙醇的體積為35％～48％。
具體實(shí)施例方式
四本實(shí)施方式中，乙醇的體積為49％～62％。
具體實(shí)施例方式
五本實(shí)施方式中，乙醇的體積為63％～76％。
具體實(shí)施例方式
六本實(shí)施方式中，乙醇的體積為77％～90％。
權(quán)利要求
1.敗醬草中抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)的提取方法，它首先制備敗醬草的水提液，將敗醬草(Herba patriniae)1kg，用自來水清洗五次，蒸餾水清洗三次，7000ml蒸餾水浸泡12小時(shí)，于100℃煮沸90分鐘后用脫脂棉過濾，藥渣加5000ml蒸餾水于100℃煮沸90分鐘，用脫脂棉過濾，將兩次濾液混合，混合濾液減壓濃縮，濃縮到濃度為1g/ml，其特征在于用敗醬草水提液制備乙醇沉淀物，向濃縮的水提液(1g/ml)中緩慢加入95％的乙醇，并不斷攪拌，直至乙醇體積達(dá)到20％～90％后，于4℃溫度下放置12小時(shí)，于3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，過濾收集沉淀。將沉淀用雙蒸水溶解后經(jīng)濾紙過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，干燥，得粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的敗醬草中抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)的提取方法，其特征在于用大孔吸附樹脂柱層析法制備敗醬草抗呼吸道合胞病毒洗脫物，將乙醇沉淀物加水溶解后，加在預(yù)處理好的大孔吸附樹脂柱頂端，用水洗脫，洗脫液減壓濃縮，干燥，得洗脫物A。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的敗醬草中抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)的提取方法，其特征在于乙醇的體積為20％～34％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的敗醬草中抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)的提取方法，其特征在于乙醇的體積為35％～48％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的敗醬草中抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)的提取方法，其特征在于乙醇的體積為49％～62％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的敗醬草中抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)的提取方法，其特征在于乙醇的體積為63％～76％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的敗醬草中抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)的提取方法，其特征在于乙醇的體積為77％～90％。
全文摘要
敗醬草中抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)的提取方法，它涉及中草藥敗醬草抗病毒物質(zhì)的提取方法。呼吸道合胞病毒(RSV)作為全球范圍兒童病毒性呼吸道感染的重要病原之一，在呼吸道感染中占重要位置。本發(fā)明用水醇法制備乙醇沉淀物，向濃縮的水提液(1g/ml)中緩慢加入95％的乙醇，并不斷攪拌，直至乙醇體積達(dá)到20％～90％后，于4℃溫度下放置12小時(shí)，于3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，過濾收集沉淀。用大孔吸附樹脂柱層析法制備敗醬草抗呼吸道合胞病毒洗脫物，將乙醇沉淀物加水溶解后，加在預(yù)處理好的大孔吸附樹脂柱頂端，用水洗脫，洗脫液減壓濃縮，干燥，得洗脫物A。本發(fā)明具有提取工藝簡單，提取的抗呼吸道合胞病毒物質(zhì)純度高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61P31/00GK1515277SQ0310018
公開日2004年7月28日 申請日期2003年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月9日
發(fā)明者李洪源 申請人:李洪源