甲苯胺藍o藥物及其在異常組織的體內(nèi)染色和化療中的用途的制作方法

專利名稱：甲苯胺藍o藥物及其在異常組織的體內(nèi)染色和化療中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適合于人體內(nèi)應用的新型的生物學染色診斷組合物和/或化療組合物。
更具體地說，本發(fā)明涉及新型的甲苯胺藍O(“TBO”)染料產(chǎn)物，其中含有特定比例的TBO及特定的TBO衍生物。
本發(fā)明涉及含有這些新型TBO產(chǎn)物的TBO組合物的新的制造方法。
本發(fā)明還涉及新的改進的高效液相色譜(HPLC)分析法，該方法用于確定含有這些新型的TBO產(chǎn)物的TBO組合物的組成。所述改進的HPLC法可以更明確地將對應于有機染料成分的峰與對應于降解產(chǎn)物的峰分開。另外，改進的HPLC分析方法可以顯示出活性有機染料組合物相對于降解產(chǎn)物的穩(wěn)定性。
本發(fā)明還涉及在體內(nèi)應用該新型TBO組合物來識別可疑的異常結(jié)構(gòu)即不正常組織的方法。
本發(fā)明還涉及在體內(nèi)應用該新型TBO組合物的方法，所述組合物用作治療癌性或癌前期組織的化療藥劑。
在另一方面，本發(fā)明還涉及組合物、采用該組合物進行體內(nèi)診斷的方法、采用該組合物的治療方法以及該組合物的制造方法，所述組合物特別適合于用作治療癌性或癌前期組織的化療藥劑。
背景技術(shù)：
通常，鱗狀細胞癌起初為表面病變，表現(xiàn)為紅斑和輕微隆起。這些病變被稱為增殖性紅斑，且被描述為早期紅斑樣病變，其可以是原位癌或者是浸潤癌。由于這些病變常常沒有癥狀，因此應進行活檢以確定該組織是否為惡性的。其他被稱為黏膜白斑病的病變是純白色的。在這些病變中，發(fā)現(xiàn)只有10％是原位癌或浸潤癌。
鱗狀細胞癌的常見部位是口底、舌、軟腭、扁桃體前柱、臼齒后三角區(qū)，據(jù)推測，這是因為口腔通常更易于與例如煙草中的致癌物質(zhì)相接觸。
根據(jù)近來的研究，病變越深，存活百分比越低。
＜2mm-95％2～9mm-80％＞9mm-65％此外，早期口腔癌患者的5年存活率為75％，但對于晚期患者的5年存活率僅為35％。(Emmanuella，J.，“Head and Neck CancerSquamousCell Carcinoma(頭頸部腫瘤鱗狀細胞癌)”，Medicine Journal(內(nèi)科雜志)，第3卷，第1期，2002年1月3日)。因此，為了使頭頸部腫瘤獲得良好的預后，通過多種方法進行早期檢查和治療對于頭頸部腫瘤是很重要的。
已知上皮染色便于對異常上皮細胞、顆粒、變性上皮細胞或變性顆粒進行目視檢查。
事實上，已知在早期檢查中采用染料TBO作為活檢的最佳指示物。該染料被惡性細胞的線粒體所吸收。結(jié)果，TBO可以用于篩檢試驗和定位癌組織，因為它可以有效地將惡性或癌前期病變部位染成深藍色，而不會將正常粘膜染色。Mashberg的美國專利4,321,251和Tucci等的美國專利5,372,801論述了這種體內(nèi)診斷試驗，這種試驗可識別和描繪可疑的異?？谇唤M織。
常規(guī)檢查需用間接鼻咽鏡和咽喉鏡對頭部和頸部進行完全的檢查。如果發(fā)現(xiàn)異?；蚩梢傻慕M織，通常隨后進行細針刺吸活檢以用于細胞學檢查或切除活檢。一旦確診為癌，則推薦進行全身麻醉下的內(nèi)窺鏡檢查，并對韋氏環(huán)、下咽部、鼻咽部和其他常見轉(zhuǎn)移部位及任何可疑病變部位進行隨機活檢。建議進行全身常規(guī)血液學檢查，以全面評估患者的身體狀況以及擴散到遠處器官的可能性。(Emmanuella，J.，“Head and NeckCancerSquamous Cell Carcinoma”，Medicine Journal，第3卷，第1期，2002年1月3日。)在2001年，世界知識產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)的WO 01/64110號公開文本披露，TBO是用于選擇性殺死癌細胞的有效染料。隨后，WIPO的WO01/64255 A1號公開文本披露，這些WIPO公開文本中所披露的TBO組合物的峰八或峰六所代表的化合物與對癌細胞的主要化療效果有關(guān)。因此，相對于該藥物中的其它化合物，使峰八和峰六部分所代表的化合物的產(chǎn)量最大化是合乎需要的。
TBO的經(jīng)典的合成方法詳盡地描述于Dandliker等的美國專利416,055中，其授權(quán)日為1889年11月30日。這種合成方法被描述為5個連續(xù)的步驟(1)在硫代硫酸鈉存在下，用例如重鉻酸鉀將N，N-二甲基對苯二胺氧化，形成2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代硫酸(系統(tǒng)命名為“取代的S-苯基硫代硫酸根”)；(2)將硫代硫酸與鄰甲苯胺縮合，形成相應的吲達胺-硫代硫酸(系統(tǒng)命名為“取代的S-吲達胺基硫代硫酸根”)；(3)例如在沸點溫度，在氯化鋅的存在下反應約30分鐘，使吲達胺-硫代硫酸閉環(huán)，從而形成TBO；(4)然后將反應混合物冷卻，并例如通過用氯化鈉和氯化鋅處理，使閉環(huán)反應的TBO產(chǎn)物絡合和鹽析，從而沉淀出TBO絡合物，例如為TBO/ZnCl2絡合物；最后(5)可以通過重復進行再溶解和再沉淀以完成純化，例如，可以在熱的氯化鋅水溶液中進行再溶解并用氯化鈉/氯化鋅進行再沉淀。
這些TBO組合物含有若干雜質(zhì)，而且其中有機染料的含量有限。Dandliker等描述的制造方法一般得到染料含量低于80％的組合物。
典型的TBO產(chǎn)物的高效液相色譜(HPLC)分析顯示出8個主要的峰，其象征著代表組合物成分的化合物。真正的TBO指定為“峰八”，它是分子為N7，N7-二甲基化的且有一個甲基連接在C-2上的部分，如下所示
(峰八)目前已經(jīng)知道，典型的TBO產(chǎn)物的染料含量包括TBO的C-4-甲基區(qū)域異構(gòu)體(regioisomer)(與峰七對應)加上這些物質(zhì)的N-脫甲基化和N，N-二脫甲基化的衍生物。此外，TBO的N-脫甲基化衍生物(與峰五和六對應)和它的C-4-甲基區(qū)域異構(gòu)體通常占染料含量的大于20％。
明確地說，其他部分包括(1)峰七，其中分子為N7，N7-二甲基化的且有一個甲基連接在C-4上，如下所示 (峰七)(2)峰六和峰五，其分別為由峰八和峰七經(jīng)N-脫甲基化所得到的衍生物，如下所示 (峰六) (峰五)和(3)峰三和峰二，其分別為峰六和峰五進一步N-脫甲基化的產(chǎn)物。
在現(xiàn)有技術(shù)的TBO組合物中，由于其雜質(zhì)含量高、染料含量不確定以及真正的TBO含量相對較低，因此，為了得到滿足規(guī)定要求的用于人類試驗TBO組合物，需要開發(fā)可重復制備TBO藥物的方法，由該方法制備的藥物雜質(zhì)含量低，染料種類含量穩(wěn)定，有機染料總含量較高，且真正的TBO含量較高。
在開發(fā)滿足規(guī)定的TBO組合物的過程中，Burkett對TBO藥物的組成、制備方法、用途和分析方法進行了改善，如美國專利6,086,852和6,194,573中所述。
由于峰八或峰六所代表的化合物已知具有選擇性標記以及選擇性殺死癌細胞或癌前期細胞的能力，因此非常希望提供可以使這些化合物在TBO藥物中含量最大化的方法，而不會過度增加費用及制備程序的復雜程度。
本發(fā)明解決了上述問題，方法是提供使分別含有峰八和/或峰六的部分的含量最大化的TBO產(chǎn)物。于是，本發(fā)明提供人們最為期盼的組合物，該組合物用于鑒別或治療異常組織的方法中。
申請人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了該方法、該方法的產(chǎn)物以及其藥物產(chǎn)物的使用和分析方法。
根據(jù)下面的詳細描述，并結(jié)合附圖，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，本發(fā)明及其實施中的各種方式是顯而易見的。

發(fā)明內(nèi)容
用于制備TBO的最接近現(xiàn)有技術(shù)的方法包括下列步驟(1)在第一反應混合物中氧化N，N-二甲基對苯二胺；(2)向所述第一反應混合物中加入含硫親核試劑源，以形成第一中間體，即取代的S-苯基硫代硫酸根；(3)將所述第一中間體進一步氧化并將其與鄰甲苯胺縮合以形成第二中間體，即取代的S-吲達胺基硫代硫酸根；(4)進一步氧化所述第二中間體以閉合其吲達胺環(huán)，以形成存在于第三反應混合物中的含有TBO的反應產(chǎn)物；(5)在形成所述第三混合物之前向反應混合物中加入TBO的絡合劑；和(6)從所述第三反應混合物中分離含TBO的反應產(chǎn)物。本發(fā)明在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上做了改進，即在第一反應混合物中，在鄰甲苯胺的存在下，首先氧化起始物料。根據(jù)最終產(chǎn)物中需要以何種峰(峰八或峰六或其組合)作為主要成分的要求，所述起始物料可以是單個以下物質(zhì)或以下物質(zhì)的組合N-二甲基對苯二胺和/或N，N-二甲基對苯二胺。從本文的目標出發(fā)，將主要含有峰八或峰六或其組合的組合物稱為“TBO產(chǎn)物”。
以N，N-二甲基對苯二胺作為起始物料，則得到的TBO產(chǎn)物組合物中含有峰八、七、六和五，其比例約為33∶5∶5∶1。
而以N-二甲基對苯二胺作為起始物料，則得到的TBO脫甲基化產(chǎn)物組合物中含有峰六、五、三和二，其比例約為33∶5∶5∶1。
因此，含有起始物料N-二甲基對苯二胺和/或N，N-二甲基對苯二胺以及鄰甲苯胺的反應混合物在導入含硫親核試劑源之前發(fā)生氧化反應。上述改變導致產(chǎn)生了完全出乎意料的TBO產(chǎn)物組合物，這種組合物分別使峰八和峰六的產(chǎn)出最大化。人們一直在尋找這些組合物，但至今未能獲得。
對于以N，N-二甲基對苯二胺作為起始物料，本發(fā)明涉及一種新的物質(zhì)組合物，其中含有TBO和它的C-4-甲基區(qū)域異構(gòu)體及所述異構(gòu)體的N-脫甲基化衍生物。更具體地說，所述組合物的HPLC分析(在290nm)顯示，代表所述異構(gòu)體的HPLC峰的組合面積與代表所述N-脫甲基化衍生物的峰的組合面積的比至少為約7∶1。
在另一個實施方式中，代表TBO的HPLC峰面積與代表它的C-4-甲基區(qū)域異構(gòu)體的峰面積的比至少為約6∶1。
在另一個實施方式中，TBO至少占所述組合物的總有機染料含量的73重量％。
對于以N-二甲基對苯二胺作為起始物料，本發(fā)明涉及一種新的物質(zhì)組合物，其中含有TBO的N-脫甲基化衍生物和它的C-4-甲基區(qū)域異構(gòu)體。更具體地說，所述組合物的HPLC分析(在290nm)顯示，代表所述N-脫甲基化衍生物的HPLC峰的組合面積與代表所述進一步N，N-脫甲基化衍生物的峰的組合面積的比至少為約7∶1。
在另一個實施方式中，在所述組合物中，代表在環(huán)C-2位置具有甲基的N-脫甲基化衍生物的HPLC峰的面積與代表在環(huán)C-4位置具有甲基的N-脫甲基化衍生物的峰面積的比至少為約6∶1。
在另一個實施方式中，在環(huán)的C-2位置具有甲基的N-脫甲基化衍生物至少占所述組合物的總有機染料含量的73重量％。
在另一個實施方式中，所述組合物的總有機染料成分包括主要是TBO和在環(huán)的C-2位置具有甲基的N-脫甲基化衍生物的混合物。
所描述的組合物在異常組織的識別方法及化療方法中很重要。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，在光動力學療法中采用TBO產(chǎn)物以改變TBO產(chǎn)物的化療效果的強度。在此過程中，將控制入射光線與施用TBO產(chǎn)物相結(jié)合。自20世紀60年代以來，作為涉及光和藥物的綜合療法，化療中的光動力學反應是已知的。在施用藥品時，將光線照射在該區(qū)域上，并通過其特定的波長性質(zhì)和強度來改變光線，以活化或強化藥物的作用。
制造TBO產(chǎn)物的方法包括下列步驟合成吲達胺，將吲達胺轉(zhuǎn)化為S-吲達胺基硫代硫酸根，用氧化劑進一步氧化S-吲達胺基硫代硫酸根，最后用絡合試劑絡合反應物以形成TBO組合物。為了更準確地鑒別該新的TBO產(chǎn)物的組成，還披露了一種用于分析TBO染料產(chǎn)物的改進的HPLC方法，借此，流動相已經(jīng)采用特定的流動相組合物，并添加了離子對試劑。所披露的HPLC方法使得可以用全新的分辨率水平將與有機染料產(chǎn)物相關(guān)的HPLC峰和與降解產(chǎn)物相關(guān)的峰分離開來。
本發(fā)明提供了TBO的新用途，其中，將TBO產(chǎn)物例如峰八和/或峰六的更純的組合物施用于癌組織，以選擇性地消除或弱化癌細胞或癌前期細胞。此外，就我們所知，本發(fā)明提供了在已制得的TBO組合物中最純的TBO組合物的制備方法。因此，本發(fā)明提供了在用于定位癌性或癌前期組織的臨床方法中使用的更純的染料。
另外，本發(fā)明披露了一種更靈敏的HPLC方法，該方法用于在TBO與TBO衍生物組分的分離和識別中提供改善的分辨率。該改進建立在已知的用于分析TBO染料產(chǎn)物的HPLC方法的基礎(chǔ)之上，該已知方法包括制備TBO樣品溶液，形成包括有機酸的水溶性鹽的流動相，用流動相流體平衡高效液相色譜柱，向高效液相色譜柱中注射樣品溶液。所做的改進包括(1)形成包含離子對試劑的流動相組合物，和(2)形成含有50體積％醇的第二流動相組合物。


圖1是290nm處的HPLC色譜圖，描述了以N，N-二甲基對苯二胺為起始物料時，本發(fā)明的TBO產(chǎn)物組合物的特征峰；圖2是290nm處的HPLC色譜圖，描述了前述使TBO的分離和產(chǎn)出最大化的TBO產(chǎn)品組合物的特征峰；圖3是方法流程圖，描述了本發(fā)明用于制造TBO產(chǎn)物的一個優(yōu)選實施方式，其中包括用于制造本發(fā)明的以N，N-二甲基對苯二胺為起始物料的新型的TBO產(chǎn)物組合物；圖4是制備TBO組合物的方法中步驟1的化學反應，其中N，N-二甲基對苯二胺是起始物料，用反應物和中間體的化學結(jié)構(gòu)式來表示；圖5是制備TBO組合物的方法中步驟2的化學反應，其中N，N-二甲基對苯二胺是起始物料，用反應物和中間體的化學結(jié)構(gòu)式來表示；和圖6是制備TBO組合物的方法中步驟3的化學反應，其中N，N-二甲基對苯二胺是起始物料，用反應物和產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)式來表示。
具體實施例方式
附解了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，其中以N，N-二甲基對苯二胺為起始物料。附圖不應當解釋為將對本發(fā)明限制而排除以N-二甲基對苯二胺作為起始物料，而是用這些附圖來提供一種對于非常相似的反應的模式，在這類反應中，可以使N，N-二甲基對苯二胺反應，形成主要含有峰六的TBO產(chǎn)物。
參考附圖1和2，本發(fā)明的組合物包括指定為峰八10(下文稱為“峰八”)的組分，所述組分在總產(chǎn)物中占有較大的重量百分比，且峰八的比例大于峰七12、峰六14、峰五16、峰三和峰二的比例。
更具體地說，本發(fā)明涉及峰八10的重量百分比最大的組合物的制備和最終分析，其中TBO和C-4-甲基區(qū)域異構(gòu)體(峰八10和峰七12)的組分的重量是TBO的N-脫甲基化組分和C-4-甲基區(qū)域異構(gòu)體(峰六14和峰五16)的重量的7倍。更具體地說，所產(chǎn)生的峰八10大于峰七12，其比例為6∶1。
峰八10和峰六14分別與TBO和相應的N-脫甲基化衍生物對應，其中甲基在環(huán)C-2的位置。相反，峰七12和峰五16分別與TBO的C-4-甲基區(qū)域異構(gòu)體和相應的N-脫甲基化衍生物對應，其中甲基在環(huán)C-4的位置。已經(jīng)確信，在癌癥患者的檢查和治療中，峰八10對于組織染色和癌癥治療比其他組分更有效。
在光動力學療法中，對于特定的癌癥類型以及患者的敏感度，TBO產(chǎn)物混合物與光線組合的最佳參數(shù)的確定是特異的。在使用內(nèi)窺鏡等器械時，可以根據(jù)波長和/或強度來調(diào)整入射光線。因此，為獲得最佳的藥物作用，本領(lǐng)域的技術(shù)人員擁有足夠的知識以確定與TBO產(chǎn)物混合物組合的最佳的光線特征。
本發(fā)明TBO組合物的制備方法是制備TBO產(chǎn)物的現(xiàn)有已知方法的改進。更具體的說，所述改進需要將美國專利6,194,573中Burkett所描述的制備方法中的第二步和第三步顛倒。步驟的顛倒使得在引入含硫親核試劑源之前，在穩(wěn)定溶液中將N，N-二甲基對苯二胺和鄰甲苯胺混合，結(jié)果產(chǎn)生完全出乎意料的TBO組合物。此外，在癌癥的檢測和治療中非常需要所得的該組合物，該組合物對于化學和藥理學領(lǐng)域的技術(shù)人員是無法預見的。
通常，該方法需要氧化含有穩(wěn)定劑的N，N-二甲基對苯二胺與鄰甲苯胺的溶液。氧化之后加入酸。隨后，加入絡合劑、氧化劑和含硫親核試劑源。此時產(chǎn)生了中間體S-吲達胺基硫代硫酸根40。然后用氧化劑將S-吲達胺基硫代硫酸根40氧化，隨后加入絡合劑、氧化催化劑和酸。
提供圖3作為下列已標記為步驟1～4的步驟參考，其中詳細描述了本發(fā)明涉及TBO組合物的制備的優(yōu)選實施方式。
步驟#1-吲達胺的合成在圓底燒瓶中將5g二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺粉末加入到155g的USP(美國藥典)純水中，并在300rpm下攪拌。該N，N-二甲基對苯二胺反應混合物20應維持≤10℃，攪拌10分鐘。
通過將6.3g鹽酸(6N)緩慢加入到2.8g的鄰甲苯胺中來制備鹽酸鄰甲苯胺。鹽酸鄰甲苯胺溶液22應攪拌至澄清，如果出現(xiàn)晶體，應加入最少量的USP純水以將鹽酸鄰甲苯胺晶體再溶解。
將鹽酸鄰甲苯胺溶液22加入至二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺反應混合物20中，隨后再加入2g HCl(6N)24。反應混合物應維持在低于約10℃，并在冰浴上攪拌45分鐘。
使用滴液漏斗將29.25g重鉻酸鹽溶液28緩慢(超過20分鐘)滴加到鹽酸鄰甲苯胺和二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺的反應混合物26中，所述重鉻酸鹽溶液28通過將9.39g重鉻酸鉀加入到108g的USP純水中制備。一旦重鉻酸鹽溶液28已全部添加完畢，應將二鹽酸吲達胺反應混合物30維持在低于約10℃，并在冰浴上攪拌60分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，反應混合物包括二鹽酸吲達胺及其衍生物。
應當理解，目前對于起始物料(N，N-二甲基對苯二胺和/或N-二甲基對苯二胺)和鄰甲苯胺，據(jù)信鹽酸均為適合的穩(wěn)定劑。因此，上一步驟描述了用鹽酸分別使其處于穩(wěn)定形態(tài)的二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺粉末成分和鹽酸鄰甲苯胺溶液。然而，本發(fā)明并不局限于任何特殊的穩(wěn)定劑，因此可以用任何適合的穩(wěn)定劑來代替鹽酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，這類穩(wěn)定劑包括一系列已知穩(wěn)定劑中的任何一個。
圖4中提供了上述步驟1中的化學反應圖式，并用分子的形式對反應物和產(chǎn)物進行了說明。
步驟#2-S-吲達胺基硫代硫酸根的合成通過將8.75g十六水合硫酸鋁加入至15g的USP純水中來制備硫酸鋁溶液32，進而得到酸。將該酸添加到二鹽酸吲達胺反應混合物30中并攪拌10分鐘。除了十六水合硫酸鋁以外的酸也是適合的。
通過將12.22g氯化鋅加入至15g的USP純水中來制備氯化鋅溶液34，進而利用氯化鋅溶液34得到絡合劑。將該絡合劑添加到二鹽酸吲達胺反應混合物30中并攪拌10分鐘。應當理解，雖然所述優(yōu)選實施方式包括氯化鋅，但其它絡合劑也是適合的，并包含在本發(fā)明中。
通過將9.39g重鉻酸鉀加入到108g的USP純水中制備重鉻酸鹽溶液36，進而通過準備29.25g的該重鉻酸鹽溶液36而得到氧化劑。用滴液漏斗將該氧化劑緩慢(超過20分鐘)加入至二鹽酸吲達胺反應混合物30中，并在冰浴上攪拌20分鐘。
通過將6.53g五水合硫代硫酸鈉加入到15g的USP純水來制備硫代硫酸鈉溶液38，進而得到含硫親核試劑源。將該含硫親核試劑源緩慢加入到二鹽酸吲達胺反應混合物30中，并在冰浴上攪拌60分鐘。所形成的沉淀含有S-吲達胺基硫代硫酸根40及其衍生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，也可用其他的含硫親核試劑源來代替硫代硫酸鈉溶液38。
圖5中提供了上述步驟2中的化學反應圖式，用分子的形式對反應物和產(chǎn)物進行了說明?？梢杂^察到用虛線將S-SO3-與兩個碳原子相連接，虛線表示S-SO3-可以連接在任意一個碳上。
步驟#3-TBO和TBO鋅復鹽的合成將S-吲達胺基硫代硫酸根40維持在10℃以下。用滴液漏斗將氧化劑緩慢(超過20分鐘)加入S-吲達胺基硫代硫酸根40中，并攪拌20分鐘。目前相信，29.25g的重鉻酸鹽溶液42適合于用作氧化劑。
向經(jīng)氧化的S-吲達胺基硫代硫酸根反應混合物44中加入絡合劑，優(yōu)選加入27.0g的氯化鋅溶液46，并攪拌5分鐘，所述氯化鋅溶液46通過將12.22g氯化鋅加入到15g的USP純水中制備。加入氧化催化劑，優(yōu)選為17.3g的硫酸銅溶液48，并攪拌5分鐘，所述硫酸銅溶液48通過將2.38g硫酸銅加入到15g的USP純水中制備。
將溫度設定點變?yōu)?0℃。一旦反應達到60℃，加入酸，將pH值降到2.9，所述酸優(yōu)選為硫酸溶液50(9N)。每次加酸后攪拌5分鐘。將溫度設定點變?yōu)?7℃。一旦反應混合物達到97℃，攪拌35分鐘。將反應混合物52緩慢冷卻至室溫。達到室溫后，將含有粗TBO產(chǎn)物混合物54的產(chǎn)物放入5℃冷卻器中。保存5～15小時。取出，并將部分粗TBO產(chǎn)物混合物54通過0.45μm的過濾器過濾。將經(jīng)過濾的溶液放入小瓶中以通過RP-HPLC(反相高效液相色譜)TBO分析方法進行分析。
圖6中提供了上述步驟3中的化學反應圖式，用分子的形式對反應物和產(chǎn)物進行了說明。
應當理解，可以采用其它絡合劑、含硫親核試劑、氧化劑、氧化催化劑和/或酸，并且上述步驟應當解釋為，其中披露了目前據(jù)信為本發(fā)明優(yōu)選實施方式的絡合劑、還原劑、氧化劑、氧化催化劑和/或酸。
步驟#4-純化本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，最終反應混合物含有TBO和C-4-甲基區(qū)域異構(gòu)體及其衍生物。如美國專利6,194,573中所述的溶液的純化方法56對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，因此，在此以參考的方式將其引入。
為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解并采用合適的實驗室裝備和安全規(guī)程。美國專利6,086,852中所述的實驗室裝備適合于進行上述操作，因此，在此以參考的方式將其引入。
上述用于制備TBO的步驟與在先披露的方法的不同之處在于鹽酸鄰甲苯胺溶液22與起始物料二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺溶液20的結(jié)合發(fā)生在用于制備二鹽酸吲達胺反應混合物30的初始步驟中，且該結(jié)合步驟發(fā)生在加入硫代硫酸鈉38之前。此外，上述用于制備TBO的步驟與在先披露的方法的不同之處在于，在向鹽酸鄰甲苯胺22和起始物料二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺20的反應混合物中添加任何其他試劑之前，加入鹽酸24和重鉻酸鉀28。
本發(fā)明還包括用于對經(jīng)改善的組合物進行分析的改進的HPLC法。用于分析的改進的HPLC法更明確地顯示出基于通過新的HPLC法所測定的各個峰的面積的重量比。下列比例與以N，N-二甲基對苯二胺為起始物料的TBO產(chǎn)物有關(guān)a.)峰八10/峰七12為約6∶1。
b.)峰(八10+七12)/峰(六14+五16)為約7∶1。
c.)峰五16+峰六14+峰七12+峰八10約占染料含量的95重量％。
d.)峰五16+峰六14+峰七12+峰八10約占包含雜質(zhì)的總產(chǎn)物的75重量％。
e.)峰(三+六14+八10)/峰(二+五16+七12)為約7∶1。
類似地，下列比例與以N-二甲基對苯二胺為起始物料的TBO產(chǎn)物有關(guān)a.)峰六/峰五為約6∶1。
b.)峰(六+五)/峰(三+二)為約7∶1。
c.)峰二+三+五+六約為染料含量的95重量％。
d.)峰二+三+五+六約為包含雜質(zhì)的總產(chǎn)物的75重量％。
e.)峰(三+六)/峰(二+五)為約7∶1。
圖1和2分別為由本文所披露的經(jīng)改進的HPLC分析法和由在先已知的HPLC分析法所得到的色譜圖。對圖1和2的觀察顯示了通過各個方法所得出的不同流動梯度的比較，還可以看出，在本發(fā)明的圖1中，相對于峰七12、峰六14和峰五16，峰八10的面積增加了。色譜領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以觀察到，本發(fā)明產(chǎn)生了對TBO產(chǎn)物組合物的高分辨率，以及具有穩(wěn)定性指示。此外，本文所披露的HPLC分析法的高的分辨率使得能夠進一步對TBO降解產(chǎn)物進行鑒別。到目前為止，這種鑒別很難通過現(xiàn)有的方法來實現(xiàn)。
HPLC分析的新方法該實驗室方法描述了用于對TBO產(chǎn)物混合物及其衍生物進行檢測和定量分析的分析程序。色譜領(lǐng)域的技術(shù)人員應當理解，除了柱子和HPLC分析儀，各種不同種類的移液管和容量瓶也是必要的。關(guān)于柱子和HPLC分析儀，合適的是具有5μm填料的250×4.6mm的C18 WaterSymmetry Column(水勻柱)和HP1100、1050或等同的HPLC分析儀。
經(jīng)改進的HPLC分析是對已知的現(xiàn)有方法進行改進，改進之處是在流動相中添加庚磺酸、鈉鹽作為離子對試劑。這里，離子對試劑特別有助于TBO組合物的分離。另外，庚磺酸、鈉鹽可有助于其他化合物的分離，尤其是酸性或陽離子化合物的分離。在先技術(shù)披露的離子對試劑無法達到與TBO有機染料相關(guān)的峰和與降解產(chǎn)物相關(guān)的峰之間的分辨率。
相對于在先已知的HPLC分析方法，另一個重要的改進為包括含有醇和流動相溶劑的第二流動相，其中HPLC流動相溶劑/醇流動相為50∶50。
而且，另一個重要改進包括將流速從1.5mL/min調(diào)整到1.0mL/min(毫升/分鐘)，以提高活性物峰與降解產(chǎn)物之間的分辨率。
色譜領(lǐng)域的技術(shù)人員理解，使HPLC分析的分辨率和精確度最優(yōu)化的其他特定參數(shù)隨操作條件而變化。由于這些參數(shù)會隨分析環(huán)境狀況的不同而變化，因此它們包括在本發(fā)明中。
盡管不能將優(yōu)選實施方式解釋為對本發(fā)明的限制，但涉及TBO產(chǎn)物的HPLC分析的優(yōu)選實施方式包括下列特定的參數(shù)(1)290nm波長；(2)1.0mL/min流速；(3)注射體積20μL；(4)溫度40℃；(5)雙流動相[A]10mM乙酸銨，其pH值為3.5，且含有1.0g/L的1-庚磺酸，鈉鹽；和[B]50∶50乙氰/甲醇；和(6)下列流動梯度

HPLC的準備下面對HPLC分析的優(yōu)選實施方式進行描述，所述HPLC分析是用于對TBO組合物的分離成分進行分析。實施經(jīng)改進的HPLC法所必須的試劑包括純水、流動相溶劑(例如HPLC級乙腈(ACN))、緩沖鹽(例如乙酸銨(CH3COONH4))、試劑級的酸(例如冰醋酸)、試劑級的堿(例如氫氧化銨(NH4OH))、二級標準物質(zhì)(Secondary Standard)(Z97231A.DS)或等同物質(zhì)、以及庚磺酸、鈉鹽。
通常通過將適當?shù)木彌_鹽與水混合來制備流動相A，優(yōu)選將約0.77g乙酸銨溶解在1.0L水中并混合。用酸或堿調(diào)整pH為3.5，例如加入冰醋酸或鈉鹽并混合。最后，將溶液通過0.45μm的過濾器過濾。
流動相B通常通過在量筒中加入相同體積的流動相溶劑和醇并混合來制備，優(yōu)選在1000mL的量筒中加入500mL的乙氰和500mL的甲醇。雖然在優(yōu)選實施方式中規(guī)定流動相溶劑與醇的體積比為50∶50，但應當清楚，本發(fā)明包括了這樣一種第二流動相，其中，根據(jù)操作條件和其他參數(shù)的不同，流動相溶劑與醇的體積比不同。
根據(jù)90∶10的流動相A∶流動相溶劑溶液，樣品稀釋劑通常通過將10.0mL乙氰加入到90.0mL純流動相A(不含庚磺酸、鈉鹽)中并混合來制備。應當理解，樣品稀釋劑并不局限于含有乙氰，本領(lǐng)域已知的各種流動相溶液都是適合的。
根據(jù)步驟1～3，為了分析，稱出約150mg的TBO產(chǎn)物加入到100mL的容量瓶中，在樣品稀釋劑中制備0.15mg/mL的樣品溶液。用樣品稀釋劑稀釋至刻度并混合。用移液管將10mL該初始儲備溶液移至第二個100mL的容量瓶中，并用該樣品稀釋劑稀釋至刻度并混合。
制備質(zhì)量控制標準樣品，方法是稱出約150mg的TBO，并加入100.0mL的容量瓶中，制備在樣品稀釋劑中的0.15mg/mL的樣品溶液。用樣品稀釋劑稀釋至刻度并混合。用移液管將10mL該初始儲備溶液移至第二個100mL的容量瓶中，并用樣品稀釋劑稀釋至100.0mL體積并混合。從標準操作程序和質(zhì)量控制方面考慮，通常制備兩個標準樣品。
為了評估HPLC系統(tǒng)的適用性，首先將20μL的標準溶液注射入HPLC中，以得到峰五16的容量因子(k)≥峰八10。對于任何活性峰(五16、六14、七12和八10)拖尾因子均應小于等于2.5。此外，任何活性峰及其最近的峰之間的分辨率不低于1.0。
分析第二標準溶液并用工作標準對配制精度進行評估；第二標準溶液必須為理論濃度的97.0～103.0％。
在運行結(jié)束時注射兩次標準溶液，確保其落入初始標準總面積的96.0～104.0％之內(nèi)。
HPLC分析首先，向HPLC儀中注射至少5份20μL的標準溶液以對于重復注射，得到總峰面積相應于活性峰面積具有≤2.0％的相對標準偏差(RSD)。隨后，在與標準溶液校準時所使用的相同的色譜條件下，將各個樣品的多份配制物注射入HPLC儀中。
在樣品配制物中，TBO產(chǎn)物混合物峰的相對保留時間(RRT)應該與標準配制物中TBO產(chǎn)物混合物活性峰的相對保留時間相一致。峰之間的比例必須在0.98～1.02的范圍內(nèi)。
計算單個峰的重量/總重量的百分數(shù)的方法如下*峰五16[TBO]，％w/w＝(Cn/Csx)(Rsx/Rstd)(標準溶液中峰五16的重量％)其中Cn＝在標準配制物中TBO的濃度(mg/mL)。
Csx＝在樣品配制物中TBO產(chǎn)物混合物的濃度(mg/mL)。
Rsx＝在樣品配制物中TBO產(chǎn)物混合物的峰五16的平均面積。
Rstd＝在標準配制物中TBO的峰五16的平均面積。
*用峰六14、峰七12和峰八10在標準溶液中的相應的重量百分比對這些峰進行重復計算。
通過將全部4個主要峰(五16、六14、七12和八10)的總量相加來計算TBO產(chǎn)物混合物的總重量百分比的方法如下總檢測值＝峰五16的重量％+峰六14的重量％+峰七12的重量％+峰八10的重量％
計算色譜純度(面積％純度)的方法如下面積％純度＝[樣品中峰(五16、六14、七12、八10)之和的平均值]/(樣品中所有峰之和的平均值)×100％本發(fā)明已經(jīng)在以上方面進行了描述，并且明確提出了目前優(yōu)選的最佳模式，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解并實施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.制造甲苯胺藍O產(chǎn)物的方法，該方法順序包括以下步驟(a)在第一反應混合物中氧化起始物料N，N-二甲基對苯二胺；(b)向所述第一反應混合物中加入含硫親核試劑源，以形成第一中間體，即取代的S-苯基硫代硫酸根；(c)將所述第一中間體進一步氧化，并將其與鄰甲苯胺縮合，以形成第二中間體，即取代的S-吲達胺基硫代硫酸根；(d)進一步氧化所述第二中間體，以形成存在于第三反應混合物中的含有甲苯胺藍O的反應產(chǎn)物；(e)向至少其中一種所述反應混合物中加入甲苯胺藍O的絡合劑；和(f)從所述第三反應混合物中分離含甲苯胺藍O的反應產(chǎn)物；在上述步驟的基礎(chǔ)上所做的改進為，按順序包括以下步驟(a)在第一反應混合物中，在鄰甲苯胺的存在下，氧化包括選自由N，N-二甲基對苯二胺和N-二甲基對苯二胺所組成的組中的至少一種化合物的起始物料，以形成第一中間體吲達胺，而沒有形成S-苯基硫代硫酸根；然后(b)向所述第一反應混合物中加入含硫親核試劑源，以形成第二中間體S-吲達胺基硫代硫酸根。
2.一種新的組合物，其中包括在環(huán)的C-2位置具有甲基的甲苯胺藍O，該甲苯胺藍O至少占所述組合物的總有機染料含量的73重量％。
3.制造權(quán)利要求2所述組合物的方法，該方法包括下列步驟(a)合成吲達胺；和(b)合成S-吲達胺基硫代硫酸根。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的合成吲達胺的步驟還包括在酸和氧化劑的存在下，氧化鄰甲苯胺溶液和N，N-二甲基對苯二胺溶液的步驟。
5.鑒別異常組織的方法，該方法包括對人體組織應用權(quán)利要求2所述的甲苯胺藍O產(chǎn)物的步驟。
6.治療異常組織的方法，該方法包括對人體組織應用權(quán)利要求2所述的甲苯胺藍O產(chǎn)物的步驟。
7.如權(quán)利要求6所述的治療異常組織的方法，該方法還包括調(diào)整光線入射以控制光毒性作用。
8.如權(quán)利要求6所述的治療異常組織的方法，該方法還包括將化療試劑與權(quán)利要求4所述甲苯胺藍O產(chǎn)物混合的步驟。
9.一種新的組合物，該組合物包括在環(huán)C-2位置具有甲基的甲苯胺藍O的N-脫甲基化衍生物，該衍生物至少占所述組合物的總有機染料含量的73重量％。
10.制備權(quán)利要求9所述組合物的方法，該方法包括下列步驟(a)合成吲達胺；和(b)合成S-吲達胺基硫代硫酸根。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的合成吲達胺的步驟還包括在酸和氧化劑的存在下，氧化鄰甲苯胺溶液和N-二甲基對苯二胺溶液的步驟。
12.鑒別異常組織的方法，該方法包括對人體組織應用權(quán)利要求9所述的甲苯胺藍O產(chǎn)物的步驟。
13.治療異常組織的方法，該方法包括對人體組織應用權(quán)利要求9所述的甲苯胺藍O產(chǎn)物的步驟。
14.如權(quán)利要求13所述的治療異常組織的方法，該方法還包括調(diào)整光線入射以控制光毒性作用。
15.如權(quán)利要求13所述的治療異常組織的方法，該方法還包括將化療試劑與權(quán)利要求9所述甲苯胺藍O產(chǎn)物混合的步驟。
16.一種新的組合物，該組合物包括在環(huán)的C-2位置具有甲基的甲苯胺藍O；在環(huán)的C-2位置具有甲基的甲苯胺藍O的N-脫甲基化衍生物；其中所述甲苯胺藍O和所述的N-脫甲基化衍生物至少占所述組合物的總有機染料含量的73重量％。
17.制造權(quán)利要求16所述組合物的方法，該方法包括下列步驟(a)合成吲達胺；和(b)合成S-吲達胺基硫代硫酸根。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的合成吲達胺的步驟還包括在酸和氧化劑的存在下，氧化鄰甲苯胺溶液及N，N-二甲基對苯二胺和N-二甲基對苯二胺溶液的步驟。
19.鑒別異常組織的方法，該方法包括對人體組織應用權(quán)利要求16所述的甲苯胺藍O產(chǎn)物的步驟。
20.治療異常組織的方法，該方法包括對人體組織應用權(quán)利要求16所述的甲苯胺藍O產(chǎn)物的步驟。
21.如權(quán)利要求20所述的治療異常組織的方法，該方法還包括調(diào)整光線入射以控制光毒性作用。
22.如權(quán)利要求20所述的治療異常組織的方法，該方法還包括將化療試劑與權(quán)利要求16所述甲苯胺藍O產(chǎn)物混合的步驟。
23.用于分析甲苯胺藍O染料產(chǎn)物的高效液相色譜方法，所述方法包括(a)形成甲苯胺藍O樣品溶液；(b)形成含有有機酸的水溶性鹽的流動相；(c)用流動相流體平衡高效液相色譜柱；和(d)向高效液相色譜柱中注射樣品溶液，其改進是為了鑒別樣品染料組分和分析并測定所述樣品的純度，所述改進包括形成包含庚磺酸的組合物作為所述的流動相；和形成含有50體積％醇的第二流動相組合物。
全文摘要
本發(fā)明包括制備TBO藥物產(chǎn)物的改進方法，該方法包括以下步驟(1)合成吲達胺；(2)將所述吲達胺轉(zhuǎn)化為S－吲達胺基硫代硫酸根；(3)向所述S－吲達胺基硫代硫酸根中加入氧化催化劑、絡合劑和酸以制備TBO和C－4－甲基區(qū)域異構(gòu)體及其衍生物。本發(fā)明還包括新的組合物，所述組合物用于檢測和治療異常組織，即TBO產(chǎn)物主要含有峰八和/或峰六。以N，N－二甲基對苯二胺為起始物料獲得的TBO產(chǎn)物組合物中含有峰八、七、六和五，其比例約為33∶5∶5∶1。以N－二甲基對苯二胺作為起始物料獲得的TBO脫甲基化產(chǎn)物組合物中含有峰六、五、三和二，其比例約為33∶5∶5∶1。本發(fā)明還包括分析改善的TBO藥物產(chǎn)物的HPLC改進方法，其改進包括在第一流動相中加入離子對試劑和形成含有50體積％醇的第二流動相組合物。
文檔編號A61K49/00GK1627961SQ02829090
公開日2005年6月15日 申請日期2002年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月4日
發(fā)明者卡爾·奧克洛托維茨 申請人:日拉生物技術(shù)公司