專利名稱：基于谷氨酰胺酰基的dpiv抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及二肽基肽酶抑制領域，更具體而言，涉及谷氨酰胺酰基吡咯烷和谷氨酰胺酰基噻唑烷、含有上述化合物的藥物組合物以及上述化合物在抑制二肽基肽酶IV及二肽基肽酶IV樣酶活性中的應用。
背景技術：
二肽基肽酶IV(DPIV)是一種絲氨酸蛋白酶，它催化N-端二肽從肽鏈斷裂，該肽鏈優選在次末端位置含有脯氨酸殘基。盡管DPIV在哺乳動物系統內的生物作用尚未完全確定，但相信它在神經肽代謝、T-細胞激活作用、癌細胞附著于內皮以及HIV進入淋巴樣細胞中起重要作用。
同樣地，發現胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和也稱為抑胃肽(GIP)的葡萄糖依賴性胰島素釋放肽的滅活歸因于DPIV。由于GLP-1是胰腺胰島素分泌的主要刺激物，并且對葡萄糖的消除具有直接有益的作用，在WO 97/40832和US 6,303,661中公開了DPIV和DPIV樣酶活性的抑制作用，從而提供了誘人的如治療非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)的方法。
本發明的一方面提供了例如對治療由DPIV或DPIV樣酶的抑制作用介導的疾病有效的新型DPIV抑制劑、可用于如抑制DPIV或DPIV樣酶的藥物組合物以及一種抑制上述酶活性的方法。
本發明的另一方面涉及一種治療方法和用于該方法的組合物。上述方法具體而言為一種治療糖尿病，特別是非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)或2型糖尿病以及與糖尿病有關疾病的方法。
二肽基肽酶IV(DPIV)是一種脯氨酸后(較少意義上為丙氨酸后、絲氨酸后、甘氨酸后)斷裂絲氨酸蛋白酶，其可在體內許多組織如腎、肝和腸中發現。
眾所周知DPIV抑制劑可用于治療糖耐量降低和糖尿病(國際專利申請，公開號WO99/61431，Pederson RA等，Diabetes.1998 Aug；47(8)1253-8；以及Pauly RP等，Metabolism 1999 Mar；48(3)385-9)。具體而言，WO99/61431公開了包括氨基酸殘基和噻唑烷或吡咯烷基的DPIV抑制劑以及其鹽，特別是L-蘇-異亮氨酰噻唑烷、L-別-異亮氨酰噻唑烷、L-蘇-異亮氨酰吡咯烷、L-別-異亮氨酰噻唑烷、L-別-異亮氨酰吡咯烷以及它們的鹽。
低分子量二肽基肽酶IV抑制劑更多的例子為如四氫異喹啉-3-氨甲酰衍生物、N-取代2-氰基吡咯和吡咯烷、N-(N’-取代甘氨酰)-2-氰基吡咯、N-(取代甘氨酰)-噻唑烷、N-(取代甘氨酰)-4-氰基噻唑烷、硼抑制劑以及環丙基稠合吡咯烷。US 6,011,155；US 6,107,317；US 6,110,949；US 6,124,305；US 6,172,081；WO 99/61431，WO 99/67278，WO 99/67279，DE 198 34 591，WO 97/40832，DE 196 16 486 C 2，WO 98/19998，WO00/07617，WO 99/38501，WO 99/46272，WO 99/38501，WO 01/68603，WO01/40180，WO 01/81337，WO 01/81304，WO 01/55105和WO 02/02560中記載了二肽基肽酶IV抑制劑，本文引入其中所有關于抑制劑、其產品及其應用的內容作為參考。
發明內容
本發明提供如下式的化合物或其藥物學可接受的鹽
其中X＝CH2或S。
該化合物及其對應的藥物學可接受的酸加成鹽形式可用于治療由DPIV或DPIV樣酶介導的疾病，如關節炎、肥胖癥、免疫和自身免疫疾病、同種異體移植、癌癥、神經元疾病和皮膚病。
在更優選的實施方案中，本發明化合物降低了由口服葡萄糖激發引起的血糖水平升高，由此可改善葡萄糖耐受量，并因此可用于治療非胰島素依賴性糖尿病。
可參照附圖進一步理解本發明，其中圖1顯示口服和血管內給藥100mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基吡咯烷后Wistar大鼠血清中的血漿DPIV活性；圖2顯示口服和血管內給藥100mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基噻唑烷后Wister大鼠血清中的血漿DPIV活性；圖3顯示分別口服給藥5mg/kg、15mg/kg、50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基吡咯烷和安慰劑后糖尿病性Zucker大鼠的劑量依賴性血糖水平降低；圖4顯示分別口服給藥5mg/kg、15mg/kg、50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基噻唑烷和安慰劑后糖尿病性Zucker大鼠的劑量依賴性血糖水平降低；圖5顯示向Wistar大鼠口服給藥谷氨酰胺酰基噻唑烷后發現的降解產物焦谷氨酰胺酰基噻唑烷的化學結構；以及圖6顯示脂肪性Zucker大鼠口服給藥谷氨酰胺酰基噻唑烷后大鼠血漿提取物的色譜圖。2.95分鐘處的峰代表谷氨酰胺酰基噻唑烷，6.75分鐘處的峰代表焦谷氨酰胺酰基噻唑烷。
具體實施例方式
本發明涉及二肽基肽酶抑制領域，更具體而言，本發明涉及谷氨酰胺酰基吡咯烷和谷氨酰胺酰基噻唑烷、含有上述化合物的藥物組合物以及上述化合物在抑制二肽基肽酶IV及二肽基肽酶IV樣酶活性中的應用。
本發明提供了例如對治療由DPIV或DPIV樣酶的抑制作用介導的疾病有效的新型DPIV抑制劑、可用于例如抑制DPIV或DPIV樣酶活性的藥物組合物以及一種抑制DPIV或DPIV樣酶活性的方法。
本發明提供如下式的化合物 特別是式(I)的化合物或其藥物學可接受的鹽 本發明進一步優選的化合物為式(II)的化合物或其藥物學可接受的鹽 本發明化合物可以與酸成鹽，特別是藥物學可接受的酸加成鹽。藥物學可接受的鹽通常為氨基酸堿性側鏈被無機或有機酸質子化的形式。典型的有機或無機酸包括鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、羥基乙酸、乳酸、琥珀酸、馬來酸、反丁烯二酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲基磺酸、羥乙基磺酸、苯磺酸、草酸、雙羥萘酸(pamoic acid)、2-萘磺酸、對甲苯磺酸、環己烷磺酸、水楊酸、己糖酸或三氟乙酸。本發明化合物所有的藥物學可接受的酸加成鹽形式都包含在本發明范圍內。
考慮到游離化合物與成鹽形式的化合物間的密切關系，凡本文中提到化合物時，如果在當時的環境下可能或適合，也包括相應的鹽。
本發明的范圍進一步包括本發明化合物的前藥。通常，該前藥為化合物的功能衍生物，它們在體內易于轉化為所需的治療活性化合物。因此，在這些情況下，本發明的治療方法，“給藥”一詞包括用一種或多種本發明化合物的前藥形式治療上述種種疾病，該前藥形式在患者服用后在體內轉化成上述化合物。篩選和制備合適的前藥衍生物的常規方法記載于如“Design of Prodrugs”，H.Bundgaard編輯，Elsevier，1985和專利申請DE 198 28 113、DE 198 28 114、WO 99/67228和WO 99/67279中，此處全文引用作為參考。
在本發明化合物具有至少一個手性中心的情況下，它們可相應地以對映異構體的形式存在。當化合物具有兩個或多個手性中心的情況下，它們還可以以非對映異構體的形式存在。應該懂得，所有這些異構體或其混合物都包括在本發明的范圍之內。而且，化合物的一些晶體形式可以多晶型形式存在，并且它們同樣包括在本發明之內。此外，一些化合物可以與水(即水合物)或通用有機溶劑形成溶劑化物，這些溶劑化物同樣包括在本發明范圍之內。
化合物，包括其鹽，可以它們的水合物、或包括用于其重結晶的其他溶劑的溶劑化物的形式獲得。
如前所述，本發明化合物且特別是式I和式II的化合物，以及其對應的藥物學可接受的酸加成鹽形式，可用于抑制DPIV和DPIV樣酶的活性。如實施例4和5所述，可通過用DPIV活性分析測定體外及人血漿內的Ki值來證明本發明化合物及其對應的藥物學可接受的酸加成鹽形式抑制DPIV和DPIV樣酶活性的能力。本發明化合物的Ki值測定為對豬腎DPIV，谷氨酰胺酰基噻唑烷Ki＝3.12*10-7M±5.11*10-10M，谷氨酰胺酰基吡咯烷Ki＝1.30*10-6M±8.49*10-8M。本發明化合物人血漿Ki-值測定為谷氨酰胺酰基噻唑烷預保溫5分鐘后Ki＝4.03*10-7M±2.19*10-10M，預保溫22小時后Ki＝5.13*10-7M±1.26*10-8M；谷氨酰胺酰基吡咯烷預保溫5分鐘后Ki＝1.30*10-6M±4.89*10-8M，預保溫22小時后Ki＝1.36*10-6±3.21*10-8M。
如實施例9所述，本發明化合物及其對應的藥物學可接受的酸加成鹽形式體內抑制DPIV活性的能力可以通過向Wister大鼠口服或血管內給藥證明。本發明化合物在向Wister大鼠口服和血管內給藥后均在體內抑制DPIV活性。
DPIV存在于許多種哺乳動物的器官和組織中，如腸刷狀緣(Gutschmidt S.等，“In situ”-measurements of protein contents in the brushborder region along rat jejunal villi and their correlations with four enzymeactivities.Histochemistry 1981，72(3)，467-79)、外分泌上皮細胞、肝細胞、腎小管、內皮、成肌纖維細胞(Feller A.C.等，A monoclonal antibodydetecting dipeptidylpeptidase IV in human tissue.Virchows Arch.A.Pathol.Anat.Histopathol.1986；409(2)263-73)、神經細胞、某些表面上皮細胞的側膜(如輸卵管、子宮和精囊)、(如精囊上皮細胞、十二指腸腺的粘液細胞的)魯米那細胞質中(Hartel S.等，Dipeptidyl peptidase(DPP)IV inrat organs.Comparison of immunohistochemistry and activity histochemistry.Histochemistry 1998；89(2)151-61)，生殖系統(如附睪尾和壺腹、精囊)以及它們的分泌物(Agrawal & Vanhaperttula，Dipeptidyl peptidases inbovine reproductive organs and secretions.Int.J.Androl.1986.9(6)43552)。在人血清中，存在二肽基肽酶的雙分子形式(Krepela E.等，Demonstration of two molecular forms of dipeptidyl peptidase IV in normalhuman serum.Physiol.Bohemoslov.1983，32(6)486-96)。DPIV血清高分子量形式于活性T細胞表面上表達(Duke-Cohan J.S.等，Serum highmolecular weight dipeptidyl peptidase IV(CD26)is similar to a novel antigenDPPT-L released from activated T cells.J.Immunol.1996，156(5)1714-21)。
本發明化合物及其相應的藥物學可接受的酸加成鹽形式能夠于體內抑制DPIV。在本發明的一個實施方案中，所有哺乳動物組織和器官DPIV的所有的分子形式、同系物和表位以及那些尚未被發現的，都包括在本在稀有的脯氨酸特異性蛋白酶中，DPIV起初被認為是唯一的膜結合多肽鏈氨基端次末端脯氨酸特異性酶。然而，近來確定了其它分子，雖然在結構上不是DPIV的同系物，卻具有同等的酶活性。迄今為止已被確定的DPIV樣酶為例如成纖維細胞活化蛋白α、二肽基肽酶IVβ、二肽基氨基肽酶樣蛋白、N-乙酰化α連接酸性二肽酶、靜息細胞脯氨酸二肽酶、二肽基肽酶II、吸誘素(attractin)和二肽基肽酶IV相關的蛋白質(DPP8)，它們記述于Sedo & Malik的綜述中(Sedo & Malik，Dipeptidylpeptidase IV-like moleculeshomologous proteins or homologous activities？Biochimica et Biophysica Acta 2001，365061-10)。
更多DPIV樣酶公開于WO 01/19866、WO 02/04610、WO 02/34900和WO 02/31134中。WO 01/19866公開了新型的同DPIV和成纖維活化蛋白(FAP)結構和功能相似的人二肽基氨基肽酶(DPP8)。WO 02/04610提供調節人二肽基肽酶IV樣酶的試劑以及與人二肽基肽酶IV樣酶基因產品結合的試劑。這些試劑可用于抑制、改善或糾正功能紊亂或疾病包括但不限于癌癥和包括疼痛及神經變性病的外周和中樞神經系統疾病。WO 02/04610中公開的二肽基肽酶IV樣酶在本領域眾所周知。該酶在Gene Bank數據庫中注冊為KIAA1492(注冊于2001年2月，提交于2000年4月4日，AB040925)。WO 02/34900公開一種與DPIV和DPP8氨基酸序列具有顯著同源性的二肽基肽酶9(DPP9)。WO 02/31134公開3種DPIV樣酶DPRP1、DPRP2和DPRP3。序列分析顯示如WO 01/19866所公開，DPRP1與DPP8相同；如WO 02/04610所公開，DPRP2與DPP9相同且DPRP3與KIAA1492相同。
在本發明另一優選實施方案中，所有哺乳動物組織和器官中的DPIV的所有分子形式、同系物和表位以及那些尚未被發現的，都包括在本發明范圍之內。
如實施例6所述，本發明化合物及其對應的藥物學可接受的酸加成鹽形式抑制DPIV樣酶的能力可以通過使用酶活性分析法測定體外Ki值證明。本發明化合物對豬二肽基肽酶II的Ki值測定為谷氨酰胺酰基吡咯烷Ki＝8.52*10-5M±6.33*10-6M，谷氨酰胺酰基噻唑烷Ki＝1.07*10-5M±3.81*10-7M。所有化合物均可抑制豬二肽基肽酶II。
在本發明另一實施方案中，本發明化合物以及其相應的藥物學可接受的酸加成鹽形式對非DPIV和非DPIV樣脯氨酸特異性酶若有也僅有微弱的抑制作用。如實施例7所述，未發現谷氨酰胺酰基噻唑烷和谷氨酰胺酰基吡咯烷對二肽基肽酶I和脯氨酰寡聚肽酶的抑制。對氨酰基脯氨酸二肽酶，與DPIV相比兩種化合物都顯示出非常微弱的作用。對氨酰基脯氨酸二肽酶的IC50值測定為谷氨酰胺酰基噻唑烷IC50＞3mM和谷氨酰胺酰基吡咯烷IC50＝3.4*10-4M±5.63*10-5。
從其抑制DPIV和DPIV樣酶活性的能力看，本發明化合物，特別是式I和II的化合物，以及它們相應的藥物學可接受的酸加成鹽形式可用于治療由所述酶活性介導的疾病。因此，本發明公開的化合物可用于治療如非胰島素依賴性糖尿病、關節炎、肥胖癥、免疫和自身免疫疾病、同種異體移植、癌癥、神經元疾病如多發性硬化和皮膚病。
在本發明一個更為優選的實施方案中，本發明化合物以及其相應的藥物學可接受的酸加成鹽形式可通過降低由口服葡萄糖激發引起的血糖水平升高而改善葡萄糖耐受量，并因此可用于治療非胰島素依賴性糖尿病。本發明化合物以及其相應的藥物學可接受的酸加成鹽形式改善葡萄糖耐受量的能力可用糖尿病性Zucker大鼠測量。該方法在實施例10和11中記述。口服給藥5mg/kg b.w.、15mg/kg和50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基噻唑烷或谷氨酰胺酰基吡咯烷導致高血糖水平的劑量依賴性降低并因此改善了糖尿病性Zucker大鼠的葡萄糖耐受量。
根據實施例5，本發明化合物在人血漿內穩定。令人驚奇的是，在本發明另一優選的實施方案中，本發明化合物以及其相應的藥物學可接受的酸加成鹽形式在向哺乳動物給藥后可能在體內降解。本發明化合物以及其相應的藥物學可接受的酸加成鹽形式在體內降解的能力可以采用Wistar大鼠然后LC/MS分析加以測定。研究發現谷氨酰胺酰基噻唑烷在向Wistar大鼠口服給藥后降解為各自的焦谷氨酰胺酰基噻唑烷。
因此，本發明提供了一種治療需要治療的患者中由DPIV或DPIV樣酶活性調變介導的疾病的方法，該方法包含給藥治療疾病有效的量或劑量方案的任意本發明化合物或其藥物組合物。此外，本發明包括本發明化合物以及其相應的藥物學可接受的酸加成鹽形式在制備用于預防或治療患者DPIV或DPIV樣酶活性調變介導的疾病的藥物中的應用。該化合物可由任何常規給藥途徑給藥，包括但不限于靜脈、口服、皮下、肌肉、皮內和非胃腸道給藥。
在一個進一步的實施方案中，本發明提供了本發明化合物以及其相應的藥物學可接受的酸加成鹽形式的藥物組合物制劑。
本文所用“患者”一詞指作為治療、觀測或實驗的對象的動物，優選為哺乳動物，最優選為人類。
本文所用“治療有效量”一詞指活性化合物或藥物的劑量，該劑量引起組織系統、動物或人發生研究人員、獸醫、醫生或其他臨床醫生所努力達到的生物學或醫學反應，包括減輕所治療疾病或紊亂的癥狀。
本文所用“組合物”一詞包括含有治療有效量的本發明化合物的產品以及任意由聯用本發明化合物直接或間接得到的產品。
將一種或多種本發明化合物、特別是式I和II的化合物，以及其相應的藥物學可接受的酸加成鹽形式作為活性成分，按照常規的藥劑配伍技術與藥物載體直接混合以制備本發明組合物。根據如口服或如肌肉等非胃腸道給藥等所需給藥的劑型，該載體具有非常多的形式。制備口服劑型的組合物時，可使用任意常見的藥物介質。例如，對于液體口服制劑，例如混懸劑、酏劑和溶液劑，可優先采用的適宜的載體和添加劑包括水、二醇類、油類、醇類、芳香劑、防腐劑、著色劑等；對于固體口服制劑，例如散劑、膠囊劑、gelcaps和片劑，適宜的載體和添加劑包括淀粉、糖類、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。由于易于服用，采用固體藥物載體的片劑和膠囊劑成為最有利的口服劑量單位形式。若需要，片劑可通過通用的技術包糖衣或腸衣。對于非胃腸道給藥，載體通常包括無菌水在可能加入的其它成分中。該成分例如是為了增加溶解度或為防腐的目的。
同樣，可制備可注射混懸劑，這時，可加入適宜的液體載體、助懸劑等。此處該藥物組合物每劑量單位，如每片、每粒膠囊、每劑散劑、每針注射劑、每茶匙量等將包含釋放上述有效劑量所必需量的活性成分。此處該藥物組合物每劑量單位，如每片、每粒膠囊、每劑散劑、每針注射劑、每茶匙量等將包含約0.01mg到約1000mg(優選約5mg到500mg)，且可以每天約0.1到約300mg/kg體重(優選1到50mg/kg每天)的劑量給藥。該劑量還可基于患者、所治療疾病的病情及所應用的化合物的需要而改變。可采用每日給藥或周期后定量給藥。一般地，劑量可由醫生基于患者的特異性、他/她的病情以及所希望的治療效果加以調節。
這些組合物優選為單元劑型的，如片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、無菌非胃腸道給藥(注射)溶液或混懸液、定量氣霧劑或液體噴霧劑、滴劑、安瓿劑、自我注射裝置或栓劑；用于口腔的非胃腸道給藥、鼻腔給藥、舌下給藥或直腸給藥，或者吸入給藥或吹入給藥。作為選擇，該組合物可采取適宜每周或每月一次給藥的形式；例如活性化合物的不溶鹽如癸酸鹽可用來提供一種用于肌肉注射的長效制劑。對于制備固體組合物如片劑，理論上主要有效成分與藥物載體例如常規的成片輔料如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠類、以及其他例如水的藥物稀釋劑相混合，形成含有均一混合物的固體預制劑組合物，該混合物含有本發明化合物或其藥物學可接受的鹽。當提到這些預制劑組合物為均一時，意思是說活性成分理想地均勻分散于組合物中，從而該組合物易于分為等效的劑型如片劑、丸劑和膠囊劑。該固體預制劑組合物就可分為含有約0.1到1000mg、優選約5到500mg本發明活性成分的上述類型的單位劑型。
該新型組合物的片劑或丸劑可優先包衣或以其他方式配制以提供具有持久作用的劑型。例如，片劑或丸劑可以由內部劑量和外部劑量成分組成，后者包裹前者。這兩種成分由抵制在胃中崩解且可使內層成分完整無缺地進入十二指腸或延緩釋放的腸衣隔開。許多材料可用于形成類似腸衣或包衣，如包括許多聚合酸及蟲膠、鯨蠟醇和醋酸纖維素等的材料。
優先含有本發明的新型組合物用于口服或注射給藥的液體形式包括水溶液、適當加香的糖漿、水或油性混懸液和含有如棉子油、芝麻油、椰子油或花生油的加香乳劑，以及酏劑和類似的藥物傳遞系統。適宜用于水混懸液的分散或助懸劑包括合成和天然樹膠，如西黃蓍膠、阿拉伯膠、藻酸鹽、右旋糖酐、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或明膠。
如果制備本發明化合物的過程生成立體異構體，該異構體可由常規方法如制備色譜法分離。該化合物可以外消旋形式制備，或者由對映體特異性合成法或通過拆分制備單個的對映異構體。該化合物例如可由通用的方法拆分為其對映異構體成分。如通過與如(-)-二-p-甲苯酰-d-酒石酸和/或(+)-二-p-甲苯酰-1-酒石酸的旋光性酸成鹽，然后分步結晶、用游離堿再生生成非對映對。該化合物還可以通過生成非對映酯或酰胺、然后用色譜法分離和除去手性助劑拆分。作為選擇，該化合物可使用手性HPLC色譜柱拆分。
在任一本發明化合物的制備過程中，可能需要和/或希望保護任一有關分子的敏感或活性基團。可以使用常規保護基達到這一目的，該常規基團如下述文獻所述Protective Groups in Organic Chemistry，J.F.W.McOmie編輯，Plenum Press，1973；和T.W.Greene & P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley & Sons，1991，此處全文引用作為參考。保護基可在之后方便的階段使用本領域周知的方法除去。
本發明所述的治療由二肽基肽酶IV和DPIV樣酶介導的疾病的方法同樣可以使用由一種或多種本文所述的化合物以及藥物學可接受的載體組成的藥物組合物而實施。該藥物組合物含有約0.01mg到1000mg，優選為約5到500mg化合物，可構成任意適于所選給藥方式的形式。載體包括必要的和惰性藥物賦形劑，包括但不限于粘合劑、助懸劑、潤滑劑、食用香料、甜味劑、防腐劑、染料和包衣。適于口服給藥的組合物包括固體形式如丸劑、片劑、膠囊藥片、膠囊劑(每種都包括速釋、定時釋放和緩釋劑型)、顆粒劑、和散劑，以及液體形式如溶液劑、糖漿劑、酏劑、乳劑和混懸劑。可用于非胃腸道給藥的形式包括滅菌溶液、乳劑和混懸劑。
優先地，本發明化合物可以單一的每日劑量或將總劑量分為每日2、3或4次給藥。此外，本發明化合物可通過適宜的局部應用鼻腔載體，或者通過本領域普通技術人員熟知的透皮皮膚貼片以鼻腔形式給藥。若以透皮傳遞系統的形式給藥，給藥劑量將理所當然地在整個給藥方案期間連續而不是間斷，劑量規格將需要相應調整以獲得所需的治療效果。
更優選地，以片劑或膠囊劑口服給藥時，活性藥物成分可同口服、無毒的藥物學可接受的惰性載體混合，如乙醇、甘油、水等。此外，如果希望或者必需，可向混合物中加入適宜的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑。適宜的粘合劑包括但不限于淀粉、明膠、天然糖類如葡萄糖或β乳糖、玉米甜味劑、天然和合成的樹膠如阿拉伯膠、西黃蓍膠或油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括但不限于淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等。
液體形式適于加香助懸劑或分散劑如合成和天然樹膠，例如西黃蓍膠、阿拉伯膠、甲基纖維素等。如果用于非胃腸道給藥，需要為滅菌混懸液和溶液。當需要血管內給藥時，通常采用含有適宜的防腐劑的等滲制劑。
本發明化合物還可以脂質體傳遞系統的形式給藥，如小單層脂質體、大單層脂質體和多層脂質體。脂質體可采用本領域所述的方法由多種磷脂制成，如膽固醇、硬脂胺或磷脂酰膽堿。
本發明化合物還可結合使用可溶性聚合物作為靶向藥物載體。該聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羥乙基天冬氨酰胺苯酚或棕櫚酰殘基取代的聚環氧乙烷聚賴氨酸。此外本發明化合物可結合使用一類可用于實現藥物控釋的生物可降解聚合物，如聚乳酸、聚ε己內酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯類、聚縮醛類、聚二氫吡喃類、聚氰基丙烯酸酯類以及水凝膠的交聯或兩性嵌段共聚物。
在需要治療任意所述疾病的情況下，本發明化合物可以任意前述組合物的形式根據本領域所確定劑量方案給藥。
產品的每日劑量可在成年人每人每天0.01mg到1.000mg范圍內變動。對于口服給藥，組合物優選采用片劑形式含有0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0，50.0，100，150，200，250，500和1000毫克活性物質以根據所治療患者的癥狀調節劑量。有效量的藥物通常以每天約0.1mg/kg到約300mg/kg體重的劑量水平供給。優選地，該范圍從約1到50mg/kg體重每天。該組合物可以每天1到4次的方案給藥。
最優的給藥劑量易于由本領域技術人員確定，并隨所應用的特定化合物、給藥方式、制劑的規格、給藥方式的生物利用度以及疾病病情的發展程度而變化。此外，調整劑量通常需要考慮到與所治療特定患者相關的因素，包括患者年齡、重量、飲食和給藥時間。
本發明化合物或組合物可在餐前、就餐時或餐后服用。
如果在餐前服用，本發明化合物或組合物可在就餐前1小時、優選30甚至15或5分鐘時服用。
如果在就餐時服用，本發明化合物或組合物可同膳食混合或以上述獨立的劑型服用。
如果在餐后服用，本發明化合物或組合物可在結束就餐5、15分鐘甚至1小時后服用。
實施例實施例1谷氨酰胺酰基吡咯烷游離堿的合成酰化N-苯甲基-氧基羰基谷氨酰胺(2.02g，7.21mmol)溶于35ml THF，降溫至-15℃。向該混合物中加入CAIBE(氯甲酸異丁基酯)(0.937ml，7.21mmol)和4-甲基嗎啉(0.795ml，7.21mmol)，攪拌15分鐘。所得混合酸酐用TLC(展開劑氯仿/甲醇9/1)檢查。升溫至-10℃后加入吡咯烷(0.596ml，7.21mmol)。將混合物升至室溫，攪拌過夜。
提純濾去所生成沉淀并蒸發溶劑。所得油用乙酸乙酯(20ml)吸收，且依次用飽和硫酸氫鈉溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、水和鹽水洗滌。分離有機層，干燥、蒸發。所得產品用TLC檢驗純度(展開劑氯仿/甲醇9/1)。
產量1.18g，蠟狀固體斷裂所得1.18克固體Z-保護的化合物溶于40mg無水乙醇。向溶液中加入約20mg鈀碳催化劑(10％，FLUKA)，在氫氣環境下振搖混懸液3小時。反應過程用TLC(展開劑氯仿/甲醇9/1)監測。反應結束后除去溶劑，得到游離堿。
產率99％用TLC法檢測純度正丁醇/乙醇/水/乙酸乙酯1/1/1/1，Rf＝0.4。
反應產物用NMR分析鑒定。
實施例2鹽酸谷氨酰胺酰基噻唑烷的合成酰化N-叔丁基-氧基羰基谷氨酰胺(2.0g，8.12mmol)溶于5ml THF中并降溫至-15℃。向該混合物中加入CAIBE(氯甲酸異丁基酯)(1.06ml，8.12mmol)和4-甲基嗎啉(0.895ml，8.12mmol)，攪拌15分鐘。所得混合酸酐用TLC法(展開劑氯仿/甲醇9/1)檢查。升溫至-10℃后再加入等量的4-甲基嗎啉(0.895ml，8.12mmol)與鹽酸噻唑烷(1.02ml，8.12mmol)。將混合物升至室溫，攪拌過夜。
提純濾去所生成沉淀并蒸發溶劑。所得油用氯仿(20ml)吸收，且依次用飽和硫酸氫鈉溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、水和鹽水洗滌。分離有機層，干燥、蒸發。所得產品用TLC檢驗純度(展開劑氯仿/甲醇9/1)。
產量1.64g，固體斷裂640mg所得固體Boc-保護的化合物在二氧六環(12.98M，20當量)中溶于3.1ml冰HCl，并置于冰上。反應過程用TLC(展開劑氯仿/甲醇9/1)監測。反應結束后除去溶劑，所得油用甲醇吸收并再次蒸發。所得油在五氧化磷上干燥后并用二乙醚研磨2次。用HPLC檢驗純度。
產量0.265g用HPLC檢測純度。
反應產物用NMR分析鑒定。
實施例3鹽酸谷氨酰胺酰基吡咯烷的合成酰化N-叔丁基-氧基羰基谷氨酰胺(3.0g，12.18mmol)溶于7mlTHF中并降溫至-15℃。向該混合物中加入CAIBE(氯甲酸異丁基酯)(1.6ml，12.18mmol)和4-甲基嗎啉(1.3ml，12.18mmol)，攪拌15分鐘。所得混合酸酐用TLC法(展開劑氯仿/甲醇9/1)檢查。升溫至-10℃后加入1當量的吡咯烷(1.0ml，12.18mmol)。將混合物升至室溫，攪拌過夜。
提純濾去所生成沉淀并蒸發溶劑。所得油用氯仿(20ml)吸收，且依次用飽和硫酸氫鈉溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、水和鹽水洗滌。分離有機層，干燥、蒸發。所得產品用TLC檢驗純度(展開劑氯仿/甲醇9/1)。
產量2.7g，固體斷裂所得2.7g固體在二氧六環(12.98M，20當量)中溶于13.0ml冰HCl，并置于冰上。反應過程用TLC(展開劑氯仿/甲醇9/1)監測。反應結束后除去溶劑，所得油用甲醇吸收并再次蒸發。所得油在五氧化磷上干燥后并用二乙醚研磨2次。
產量980mg用HPLC檢測純度。
反應產物用NMR分析鑒定。
實施例4Ki值的測定使用37.5U/mg對甘氨酰基脯氨酰基-4-硝基苯胺有特異活性的豬腎二肽基肽酶IV與儲備液中1.41mg/ml濃度的酶測定谷氨酰胺酰基吡咯烷和谷氨酰胺酰基噻唑烷的Ki值。
試驗混合物100μl濃度為1*10-5M到1*10-7M(谷氨酰胺酰基吡咯烷)和1*10-6M到1*10-8M(谷氨酰胺酰基噻唑烷)的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷分別與50μl不同濃度(0.4mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM)的甘氨酰基脯氨酰基-4-硝基苯胺及100μl HEPES(40mM，pH7.6；離子強度＝0.125)混合。該試驗混合物在30℃預熱30分鐘。預熱后，加入20μl DPIV(1∶600稀釋)并在30℃及λ＝405nm處用讀板器(plate reader)(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)測定10分鐘由4-硝基苯胺釋放引起的黃色顯色。
用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)基于谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷對DPIV競爭性抑制計算Ki值。Ki值計算為谷氨酰胺酰基噻唑烷Ki＝3.12*10-7M±5.11*10-10M，谷氨酰胺酰基吡咯烷Ki＝1.30*10-6M±8.49*10-8M。
實施例5人血漿Ki值的測定人血漿包含N-端Xaa-Pro釋放活性70μl濃度為1*10-5M到1*10-7M(谷氨酰胺酰基吡咯烷)和1*10-6M到1*10-8M(谷氨酰胺酰基噻唑烷)的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷分別與50μl不同濃度(0.4mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM)的甘氨酰基脯氨酰基-4-硝基苯胺及100μl HEPES(40mM，pH7.6)混合。試驗混合物在30℃分別預熱5分鐘和22小時。預熱后，加入50μl人血漿并在30℃及λ＝405nm處用讀板器(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)測定10分鐘由4-硝基苯胺釋放引起的黃色顯色。
用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)基于谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷對DPIV競爭性抑制計算Ki值。Ki值計算為谷氨酰胺酰基噻唑烷預熱5分鐘后Ki＝4.03*10-7M±2.19*10-10M、預熱22小時后Ki＝5.13*10-7M±1.26*10-8M，谷氨酰胺酰基吡咯烷預熱5分鐘后Ki＝1.30*10-6M±4.89*10-8M、預熱22小時后Ki＝1.36*10-6M±3.21*10-8M。
實施例6DPIV樣酶-二肽基肽酶II的抑制若N-端未質子化，DPII(3.4.14.2)由寡肽釋放N-端二肽(McDonald，J.K.，Ellis，S.& Reilly，T.J.，1966，J.Biol.Chem.，241，1494-1501)。P1-位的脯氨酸與丙氨酸為優選的殘基。酶活性由DPIV樣酶活性表征，而DPII具有酸性的最適pH值。所使用的酶由豬腎純化而來。
測定100μl濃度為1*10-4M到5*10-8M的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷與100μl緩沖溶液(40mM HEPES，pH7.6，0.015％Brjj，1mMDTT)、50μl賴氨酰丙氨酰氨基甲基香豆素溶液(5mM)以及20μl豬DPII(以緩沖液稀釋250倍)相混合。在30℃、λ激發＝380nm及λ發射＝465nm處用讀板器(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)進行熒光測定。
用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)計算Ki值。Ki值計算為谷氨酰胺酰基吡咯烷Ki＝8.52*10-5M±6.33*10-6M，谷氨酰胺酰基噻唑烷Ki＝1.07*10-5M±3.81*10-7M。
實施例7交叉反應酶測定谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷對二肽基肽酶I、脯氨酰寡肽酶和氨酰基脯氨酸二肽酶的交叉反應能力。
二肽基肽酶I(DPI，組織蛋白酶C)DPI或組織蛋白酶C是溶酶體半胱氨酸蛋白酶，它從其底物的N-端斷裂二肽(Gutman，H.R.& Fruton，J.S.，1948，J.BiolChem.，174，851-858)。其為半胱氨酸蛋白酶類。
所用酶購自Qiagen(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)。為了使酶活性完全，將酶在MES pH5.6(40mM MES，4mM DTT，4mM KCl，2mMEDTA，0.015％ Brjj)緩沖液中稀釋1000倍并在30℃保溫30分鐘。
測定50μl濃度為1*10-5M到1*10-7M的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷與110μl緩沖液-酶混合物相混合。試驗混合物在30℃下預熱15分鐘。預熱后，加入100μl組氨酰絲氨酰-β-硝基苯胺(2*10-5M)并在30℃、λ激發＝380nm及λ發射＝465nm處用讀板器(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)測定10分鐘由β-硝基苯胺釋放引起的黃色顯色。
用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)計算IC50值。未發現谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷對DPI酶活性的抑制。
脯氨酰寡肽酶(POP)脯氨酰寡肽酶(EC 3.4.21.26)是從Xaa-Pro鍵的N-端部分斷裂下肽的絲氨酸型內蛋白酶(Walter，R.，Shalank，H.，Glass，J.D.，Schwartz，I.L.&Kerenyi，T.D.，1971，Science，173，827-829)。底物是分子量最高為3000Da的肽。
所用酶為重組人脯氨酰寡肽酶。重組表達在E.coli中于本領域別處所述的標準條件下進行。
測定100μl濃度為1*10-4M到5*10-8M的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷與100μl緩沖溶液(40mM HEPES，pH7.6，0.015％Brjj，1mMDTT)以及20μl POP溶液相混合。試驗混合物在30℃下預熱15分鐘。預熱后，加入50μl甘氨酰脯氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺溶液(0.29mM)并在30℃及λ＝405nm處用讀板器(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)測定10分鐘由4-硝基苯胺釋放引起的黃色顯色。
用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)計算IC50值。未發現谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷對POP活性的抑制。
氨酰基脯氨酸二肽酶(X-Pro二肽酶)氨酰基脯氨酸二肽酶(EC 3.4.13.9)首先由Bergmann & Fruton進行描述(Bergmann，M.& Fruton，JS，1937，J.Biol.Chem.189-202)。氨酰基脯氨酸二肽酶從Xaa-Pro二肽酶釋放N-端氨基酸且最適pH為6到9。
從豬腎獲得的氨酰基脯氨酸二肽酶(ICN Biomedicals，Eschwege，Germany)溶于(1mg/ml)試驗緩沖液(20mM NH4(CH3COO)2，3mMMnCl2，pH7.6)中。為使酶活性完全，將溶液在室溫下保溫60分鐘。
測定450μl濃度為5*10-3M到5*10-7M的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷與500μl緩沖液(20mM NH4(CH3COO)2，pH7.6)以及250μl Ile-Pro-OH(在試驗混合物中濃度為0.5mM)。試驗混合物在30℃下預熱5分鐘。預熱后，加入75μl氨酰基脯氨酸二肽酶(在試驗緩沖液中稀釋為1∶10)，并在30℃及λ＝220nm處用紫外/可見分光光度計UV1(Thermo Spectronic，Cambridge，UK)測定20分鐘。
用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)計算IC50值。測定結果為谷氨酰胺酰基噻唑烷IC50＞3mM，谷氨酰胺酰基吡咯烷IC50＝3.4*10-4M±5.63*10-5M。
實施例8血漿穩定性為研究谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷在人血漿中的穩定性，在限定時間測定DPIV的活性。在人血漿中DPIV的平均活性測定為43.69U/ml。在工作溶液中，血漿用0.9％NaCl稀釋以固定DPIV活性水平在25U/ml。
血漿與不同濃度(血漿中濃度為5*10-5、2.5*10-5和1.25*10-5M)的谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷在37℃下保溫。在限定時間點用自動移液器(pipette roboter)(Gilson 215，Liquid handler，Gilson)取樣，并轉移至微量滴定板中。微量滴定板每孔含有5*10-5M于0.9％NaCl+0.15％Brjj中的甘氨酰脯氨酰氨基甲基香豆素。反應6分鐘后加入異亮氨酰噻唑烷(0.9％NaCl溶液中濃度為5*10-5M)。
用讀板器(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)對血漿中0.9％NaCl(參考標準)進行熒光測定。谷氨酰胺酰基吡咯烷或谷氨酰胺酰基噻唑烷抑制活性的半衰期通過以酶活性對反應時間作圖求算。
兩種化合物的半衰期都不能夠測定。認為該物質在人血漿內可穩定22小時以上。
實施例9谷氨酰胺酰基吡咯烷和谷氨酰胺酰基噻唑烷向Wistar大鼠血管內和口服給藥后的DPIV抑制活性動物雄性Wistar大鼠(ShoeWist(Sho))，體重為250到350g，購自TierzuchtSchonwalde(Schonwalde，Germany)。
飼養條件在通常條件下每籠一只飼養，控制溫度(22±2℃)，光照/黑暗周期為12/12小時(光照自上午06:00始)。自由飲食丸狀固體食物(ssniffSoest，Germany)和HCl酸化自來水。
頸總動脈插管適應飼養條件≥1周后，對Wistar大鼠全身麻醉(i.p.注射0.25ml/kg b.w.Rompun[2％]，BayerVital，Germany和0.5mg/kg b.w.Ketamin 10，AtarostGmbH & Co.，Twistringen，Germany)，頸總動脈插管。使動物恢復一周。導管用肝素-生理鹽水(100IU/ml)每周沖洗3次。如果導管失效，在相應大鼠的相反一側的頸總動脈再次插管。術后恢復一周后，該動物參與試驗。若第二支管無效，該動物退出試驗。采用一只新的動物且試驗按照計劃的順序進行，在管埋植最少7天后開始試驗。
試驗設計口服或血管內途徑向導管功能完好的大鼠給藥安慰劑(1ml生理鹽水，0.154mol/l)或100mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基吡咯烷或100mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基噻唑烷。
整夜禁食后，在-30、-5和0分鐘采集100ml加入肝素的動脈血樣。試驗物質剛溶解于1.0ml鹽水(0.154mol/l)即在0分鐘通過使用飼管(75mm；Fine Science tools，Heidelberg，Germany)口服或血管內途徑給藥。如果口服給藥，再次向頸總動脈注射1ml生理鹽水。如果動脈給藥，導管直接用30μl生理鹽水沖洗，再通過飼管口服1ml生理鹽水。
在應用安慰劑或試驗物質后，從清醒無約束大鼠動脈插管中在2.5、5、7.5、10、15、20、40、60和120分鐘時采集動脈血樣。所有血樣收集在裝有用于測定血漿DPIV活性的10μl 1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0)的Eppendorf管(Eppendorf-Netheler-Hinz，Hamburg，Germany)中。將Eppendorf管馬上離心(12000rpm，2分鐘，Hettich Zentrifuge EBA 12，Tuttlingen；Germany)。血漿部分在分析前儲藏于冰上或在-20℃冰凍。所有的血漿樣品都貼上具有下列信息的標簽●編碼●動物號碼●取樣日期●取樣時間分析方法用于測定血漿DPIV活性的試驗混合物含有80μl試劑和20μl血漿樣品。30℃預熱2分鐘后，在309nm、30℃測定1分鐘黃色產物4-硝基苯胺由底物甘氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺生成的動力學。DPIV活性用mU/ml表示。
統計方法統計學評價及統計圖表由PRISM3.02(GraphPad Software，Inc)制作。所有的參數以說明性形式包括平均值和標準差進行分析。
結果與安慰劑參比，100mg/kg b.w.劑量的化合物谷氨酰胺酰基吡咯烷和谷氨酰胺酰基噻唑烷在口服和血管內給藥后抑制血漿DPIV活性(見圖1和2)。
實施例10脂肪性Zucker鼠口服谷氨酰胺酰基吡咯烷的劑量擴大試驗動物30只雄性Zucker大鼠(fa/fa)，平均年齡為11周(5-12周)，平均體重為350克(150-400g)，購自Charles River(Sulzfeld，Germany)。在交付之后，保存12周以上直至所有的脂肪性大鼠都表現出明顯的糖尿病特征。每組8只動物用于考查3種谷氨酰胺酰基吡咯烷對安慰劑(生理鹽水)的擴大劑量。
飼養條件在通常條件下每籠一只飼養，控制溫度(22±2℃)，光照/黑暗周期為12/12小時(光照自上午06:00始)。自由飲食無菌標準的丸狀固體食物(ssniffSoest，Germany)和HCl酸化自來水。
頸總動脈插管年齡在24-31周(平均25周)脂肪性大鼠，適應飼養條件后，為試驗進行充分準備。
對脂肪性Zucker大鼠全身麻醉(i.p.注射0.25ml/kg b.w.Rompun[2％]，Bayer Vital，Germany和0.5mg/kg b.w.Ketamin 10，Atarost GmbH & Co.，Twistringen，Germany)，頸總動脈插管。使動物恢復一周。導管用肝素-生理鹽水(100IU/ml)每周沖洗3次。
試驗設計向每組8只的脂肪性Zucker大鼠給藥安慰劑(1ml生理鹽水，0.154mol/l)或擴大劑量的谷氨酰胺酰基吡咯烷(5、15和50mg/kg b.w.)。將375mg谷氨酰胺酰基吡咯烷溶于1000μl DMSO(E.Merck，Darmstadt；Germany[二甲基亞砜p.a.])。加入10mg生理鹽水，1ml含有34.09mg谷氨酰胺酰基吡咯烷的每等份儲藏于-20℃。為制備試驗物質，在生理鹽水中稀釋由劑量而定的等份。
整夜禁食后，在-10分鐘向脂肪性Zucker大鼠通過飼管(15G，75mm；Fine Science Tools，Heidelberg，Germany)口服安慰劑或試驗物質。在±0分鐘時，通過第二根飼管給藥含有2g/kg b.w.葡萄糖(40％溶液，B.Braun Melsungen，Melsungen，Germany)的口服葡萄糖耐受量試劑(OGTT)。用20μl玻璃毛細管在-30、-15、±0、5、10、15、20、30、40、60、90及120分鐘從尾靜脈采集靜脈血樣。將玻璃毛細管置于裝有1ml用于測定血糖的溶液的標準試管中。
所有的血樣都貼上標有下列信息的標簽●編碼●動物號碼●取樣日期●取樣時間分析方法葡萄糖水平用葡萄糖氧化酶法測定(Super G Glucose analyzer；Dr.Müller Gertebau，Freital，Germany)。
統計方法統計學評價及統計圖表由PRISM3.02(GraphPad Software，Inc)制作。所有的參數以說明性形式包括平均值和標準差進行分析。
藥劑對葡萄糖耐受量的作用給藥安慰劑的糖尿病Zucker大鼠顯示出顯著的高血糖偏移，說明具有明顯糖尿病葡萄糖耐受性不良。給藥5mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基吡咯烷可有限改善糖尿病Zucker大鼠的葡萄糖耐受量。給藥15和50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基吡咯烷后實現了升高的血糖水平的顯著降低以及葡萄糖耐受量的顯著改善(見圖3)。
實施例11脂肪性Zucker鼠口服谷氨酰胺酰基噻唑烷的劑量擴大試驗動物30只雄性Zucker大鼠(fa/fa)，平均年齡為11周(5-12周)，平均體重為350克(150-400g)，購自Charles River(Sulzfeld，Germany)。在交付之后，保存12周以上直至所有的脂肪性大鼠都表現出明顯的糖尿病特征。每組8只動物用于考查3種谷氨酰胺酰基吡咯烷對安慰劑(生理鹽水)的擴大劑量。
飼養條件在通常條件下每籠一只飼養，控制溫度(22±2℃)，光照/黑暗周期為12/12小時(光照自上午06:00始)。自由飲食無菌標準的丸狀固體食物(ssniffSoest，Germany)和HCl酸化自來水。
頸總動脈插管年齡在24-31周(平均25周)脂肪性大鼠，適應飼養條件后，為試驗進行充分準備。
對脂肪性Zucker大鼠全身麻醉(i.p.注射0.25ml/kg b.w.Rompun[2％]，Bayer Vital，Germany和0.5mg/kg b.w.Ketamin 10，Atarost GmbH & Co.，Twistringen，Germany)，頸總動脈插管。使動物恢復一周。導管用肝素-生理鹽水(100IU/ml)每周沖洗3次。
試驗設計向每組8只的脂肪性Zucker大鼠給藥安慰劑(1ml生理鹽水，0.154mol/l)或擴大劑量的谷氨酰胺酰基噻唑烷(5、15和50mg/kg b.w.)。相應量的谷氨酰胺酰基噻唑烷溶于1000μl生理鹽水中。整夜禁食后，在-10分鐘向脂肪性Zucker大鼠通過飼管(15G，75mm；Fine ScienceTools，Heidelberg，Germany)口服安慰劑或試驗物質。在±0分鐘時，通過第二根飼管給藥含有2g/kg b.w.葡萄糖(40％溶液，B.BraunMelsungen，Melsungen，Germany)的口服葡萄糖耐受量試劑(OGTT)。用20μl玻璃毛細管在-30、-15、±0、5、10、15、20、30、40、60、90及120分鐘從尾靜脈采集靜脈血樣。將玻璃毛細管置于裝有1ml用于測定血糖的溶液的標準試管中。
所有的血樣都貼上標有下列信息的標簽●編碼●動物號碼●取樣日期●取樣時間分析方法葡萄糖水平用葡萄糖氧化酶法測定(Super G Glucose analyzer；Dr.Müller Gertebau，Freital，Germany)。
統計方法統計學評價及統計圖表由PRISM3.02(GraphPad Software，Inc)制作。所有的參數以說明性形式包括平均值和標準差進行分析。
藥劑對葡萄糖耐受量的作用給藥安慰劑的糖尿病Zucker大鼠顯示出顯著的高血糖偏移，說明具有明顯糖尿病葡萄糖耐受性不良。給藥5mg/kg b.w.、15mg/ml以及50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰基噻唑烷可劑量依賴性降低糖尿病Zucker大鼠升高的血糖水平以及改善葡萄糖耐受量(見圖4)。
實施例12Wistar大鼠口服給藥谷氨酰胺酰基噻唑烷后的體內滅活動物/試驗設計如實施例9所述，向Wistar大鼠口服給藥谷氨酰胺酰基噻唑烷。
分析方法在應用安慰劑或谷氨酰胺酰基噻唑烷后，從清醒無約束的大鼠的頸動脈插管中在2.5、5、7.5、10、15、20、40、60和120分鐘時采集動脈血樣，用以測定谷氨酰胺酰基噻唑烷降解產物的生成。
采用C18盒(cartridge)以簡單固相萃取法由血漿中分離所需的化合物用于分析。萃取物用Lichrospher 60 RP Select B柱以反相液相色譜法串連APCI正狀態下工作的質譜分析進行分析。采用內標法定量。
結果Wistar大鼠口服給藥谷氨酰胺酰基噻唑烷后，發現化合物的降解產物。采用LC/MS法可確定該降解產物為焦谷氨酰胺酰基噻唑烷。見圖5和6。
權利要求
1.一種下式的化合物或其酸加成鹽 其中X＝CH2或S。
2.一種藥物組合物，其包括藥物學可接受的載體和/或稀釋劑以及如權利要求1所述的化合物。
3.如權利要求1所述的化合物或如權利要求書2所述的藥物組合物在制備藥劑中的應用，其中該藥劑用于抑制二肽基肽酶IV或二肽基肽酶IV樣酶活性以預防或治療與二肽基肽酶IV或二肽基肽酶IV樣酶相關的疾病或紊亂。
4.如權利要求3所述的應用，其是用于降低哺乳動物由攝入食物引起的血糖水平提高。
5.如權利要求3或4所述的應用，其是用于預防或治療非胰島素依賴性糖尿病、關節炎、肥胖癥、免疫和自身免疫疾病、同種異體移植、癌癥、神經元疾病和皮膚病。
6.一種抑制二肽基肽酶IV或二肽基肽酶IV樣酶活性以預防或治療與二肽基肽酶IV或二肽基肽酶IV樣酶相關的疾病或紊亂的方法，其包括向需要該治療的哺乳動物給藥治療有效量的如權利要求1所述的化合物或權利要求2所述的組合物。
7.如權利要求6所述的方法，其是用于降低哺乳動物由攝入食物引起的血糖水平提高。
8.如權利要求6或7所述的方法，其是用于預防或治療選自非胰島素依賴性糖尿病、關節炎、肥胖癥、免疫和自身免疫疾病、同種異體移植、癌癥、神經元疾病和皮膚病的疾病或病癥。
全文摘要
本發明提供一種式(I)的化合物其中X＝CH
文檔編號A61P19/02GK1622941SQ02828407
公開日2005年6月1日 申請日期2002年6月27日 優先權日2002年2月28日
發明者漢斯-烏爾里希·德穆特, 托爾斯滕·赫夫曼, 烏爾里希·海澤 申請人:普羅西迪恩有限公司