由毛囊間充質細胞制備的真皮替代品的制作方法

專利名稱：由毛囊間充質細胞制備的真皮替代品的制作方法
專利說明由毛囊間充質細胞制備的真皮替代品 本發明一般地涉及活的真皮替代品，并且更具體地涉及由毛囊間充質細胞制備的真皮替代品。外科手術切除燒傷創面并應用取自該患者完整厚度(full-thickness)的未燒傷皮膚的自體移植物是治療深度燒傷患者的理想方法。然而，由于皮膚給位首先要縫合，可用于創傷皮膚的自身未燒傷皮膚的量非常有限。因此，部分厚度(spilt-thickness)的真皮移植物被認為是最好的治療方法，并且冷凍保藏的(cryopreserved)或者新鮮的皮膚也可作為當前的生物敷料，用以覆蓋廣泛切除的燒傷創面(Atnip和Burke，1983，Curr Prob.Surg.20623-83)。冷凍保藏的同種移植物皮膚與新鮮皮膚相比對傷口的功效較次，很可能是由于在冷凍保藏、凍結和隨后解凍后角質細胞和成纖維細胞喪失了存活力。此外，冷凍保藏對皮膚某些物理組分如基底膜的破壞，可能也促成了細胞存活力的下降。
因此，已進行了可用于上述情況的人造皮膚的研究。盡管首先分別研發出人造皮膚的表皮和真皮層并部分地用于臨床試驗，但已經出現了問題。當前，在人造真皮移植后利用的是用部分厚度的移植物或用培養的表皮細胞覆蓋創傷皮膚的方法。人造真皮通過利用海綿或凝膠型膠原或通過利用吸收性聚合物制備。
當前人造皮膚的技術如下1)培養的自體同源(autologous)角質細胞(keratinocyte)移植物自從1950年代以來就認識到了培養的表皮細胞可用于完整厚度的皮膚部位缺失的事實。在1975年，Rheinwald和Green報道了當向底部覆蓋有間充質細胞的培養基中添加生長刺激物質例如表皮生長因子(EGF)或霍亂毒素時，表皮細胞迅速增殖。根據他們的研究，當小量的表皮細胞培養3-4周后，細胞增殖5000倍，足以覆蓋成人的整個體表面積(1.7m2)。
為了將表皮細胞用于移植，應當誘導正常分化的過程。然而，如果表皮細胞治標性地培養于培養基中，它們異常分化。結果，它們不能用于移植。換言之，由于角質層未形成，移植后的表皮細胞干燥并脫落。另外，由于細胞中發生不完全的生物化學分化，表皮層在維持其框架和防御功能方面出現問題。Prmieras等(1983，J Invest Dermatol 8128s-33s.)宣稱當在其培養步驟中將表皮層置于空氣中時，形態分化正常發生。Maruguchi等(1994，PlastReconstr Surg 93537-44)報道了當在移植的人造真皮上培養表皮細胞時，生物化學分化正常發生。因此，他們宣稱如果表皮細胞在人造真皮上置于空氣中培養，則正常表皮的功能和結構得以恢復。
O′connor(1981，Lancet 1:75)首先將培養的表皮細胞用于燒傷患者，并將細胞移植到潰瘍、痣、大皰性表皮松解癥部位。O′connor報道它們的粘附率在15到50％的范圍內。然而，雖然它們在殘留真皮的部位粘附得很好，但它們不粘附于脂肪、慢性創面或傳染性創面。
即使在粘附后，培養的表皮細胞收縮至創面大小的30％，并且比部分厚度的移植物形成更多的過大疤痕。此外，移植部位容易剝離，或者在其上形成水泡。這些現象起因于不穩定的表皮層和后來形成的表皮-真皮結合部位。
2)無細胞人造真皮Yannas和Burke(1980，J Biomed Mater Res 1465-81)開發出無細胞人造真皮。該人造真皮通過將葡糖胺聚糖(glycosaminoglycan)混合在膠原中，將混合物快速凍干，然后在高溫下真空干燥而制備。由于創面部位沒有表皮層，應當利用兩步的外科手術操作。首先，用硅橡膠層覆蓋創面部位。然后，當人造真皮在移植后粘附于創面部位時，取走硅橡膠層并用部分厚度的移植物覆蓋創面部位。
該人造真皮具有帶孔的海綿型結構。移植后，血管、成纖維細胞和纖維組織生長進入這些孔中。結果形成新的表皮結構，并且人造真皮與正常組織結合。因此，孔徑大小在人造真皮的粘附中起著重要作用。孔徑大小取決于葡糖胺聚糖的種類或含量、交聯方法、冷凍速率以及膠原的濃度。合適的孔徑大小在50到150μm的范圍內。該人造真皮移植后據報道具有在從50到70％范圍內的相對低的粘附率。低粘附率因在移植部位產生血腫、38％的高感染率以及體內酶的早期降解所致。然而，該人造真皮不可用的主要原因在于移植后在新的真皮結構形成之前，該人造真皮的結構就被內在的膠原酶早早地降解了。雖然利用了與戊二醛交聯后的人造真皮以解決這個問題，但存在另一個戊二醛的強毒性的問題。細胞在移植后迅速增殖從而新真皮得以快速形成的另一種方法是利用具有良好的親細胞性的硫酸肝素替代葡糖胺聚糖中傳統的軟骨素-6-膦酸鹽。可以利用無毒性的抗壞血酸銅離子替代戊二醛，但是難以誘導預期的交聯。
3)細胞人造皮膚細胞人造真皮是具有雙層結構的人造皮膚，其中無細胞人造真皮覆以培養的表皮細胞以解決無細胞人造真皮兩步外科手術的問題。由于人造真皮具有海綿型結構，其中細胞可穿透進入它的孔中，人造真皮表面用膠原凝膠或片層覆蓋，然后表皮細胞在其上鋪展。在這種情況下比僅移植無細胞人造真皮的情況較少發生創面收縮。據報道，從培養后11天起形成類似于正常層狀體的結構。
將培養的成纖維細胞植入人造皮膚的真皮中，以便新的真皮可以在移植后快速形成。該方法表現出70％的粘附率(Hansbrough，1989 JAMA 2622125-30)，并且在移植后9天形成固定的原纖維和基底膜。盡管該方法可用于完整厚度皮膚的缺陷部位，它具有的問題是真皮部位交聯中所用的戊二醛的毒性。
4)培養的合成皮膚的移植培養的合成皮膚是由Bell開發的人造皮膚，以活皮膚等同體或雜種皮膚聞名。表皮通過在膠原凝膠型真皮部位培養表皮細胞而制備，膠原凝膠型真皮部位通過在膠原溶液中種植并壓縮成纖維細胞制備。真皮部位的成纖維細胞通過使膠原凝膠成熟增加人造皮膚的機械張力，使之易于操作，使得人造皮膚具有膠原酶降解的抗性，并刺激表皮細胞的增殖。此外，該成纖維細胞產生新的基質，并使得與血管和創面愈合相關的細胞在移植后快速生長。因此，成纖維細胞在人造皮膚的粘附中具有重要作用。不過，Bell的方法具有如下的一些問題由Bell的方法制備的真皮部位的胞間基質為不規則排列。隨著時間的推移，移植部位的細胞數目下降，因而外科手術期間的操作困難。移植后，真皮部位容易降解，而且它們具有表皮細胞的低粘附率。
5)由同種異體皮膚制備的人造真皮當同種異體真皮被移植到完整厚度皮膚的缺陷部位且無排斥地粘附于皮膚時，該同種異體真皮補償了真皮層的厚度，由此在移植完整厚度的皮膚時取得出色的結果。同種異體皮膚的免疫應答通過細胞發生，而真皮的胞間基質不導致排斥。因此，同種異體真皮在除去所有細胞并凍干以維持胞間基質結構時可用作移植物。由上述方法加工的同種異體真皮作為產品AlloDerm已經上市。然而，該產品昂貴，并且有賴于生產系統，該生成系統通過根據醫生處方某患者需迅速供給在無菌室中大量培養的活細胞組織的醫囑進行。因此，國外開發的產品由于向患者提供它們需要長的周期而具有細胞壞死現象的問題。
6)由生物可降解聚合物制備的人造真皮在Langer和Vacanti介紹了利用吸收性聚合物產生預期組織的組織工程技術之后，該技術被應用于人造皮膚。由生物可降解聚合物制備的人造真皮是通過將成纖維細胞種植到以聚合物而非膠原形成的骨架中制備的，以解決膠原制成的人造真皮的問題。移植后在膠原制成的人造皮膚上發生炎癥，并且該人造皮膚在新的真皮結構形成之前就溶解了。American Advanced TissueScience利用polyglactin制備的人造真皮以Dermagraft的名稱上市，并作為美國專利No.5,460,939被授予專利權。由于Dermagraft覆有硅橡膠層，Dermagraft在活體中移植2周后完成血管化。因此，如果取走硅橡膠層并用部分厚度的皮膚覆蓋取走部位，它的粘附率為51％。雖然polyglactin在活體中通過水解作用在60天內降解，但當制備人造真皮時它在培養期間在培養基中就開始降解。因此，由于polyglactin在移植后快速溶解和消除，它不能很好地起人造皮膚的功用。本發明的目的在于提供一種真皮替代品，其包括培養于三維骨架中的活基質組織以及過渡覆層。
所述的基質組織包括毛囊間充質細胞、由該間充質細胞分泌的胞外基質蛋白和生長因子。
所述毛囊間充質細胞是真皮乳頭細胞和結締組織鞘細胞。
真皮乳頭100長久以來被認為是毛發生長起始和維持所必需的。不過，環繞毛囊靠下節段并含血管叢的結締組織鞘102的功能是未知的(見

圖1)。
盡管所有的毛囊間充質細胞可用作本文的毛囊間充質細胞，但頭皮或胡須毛囊的間充質細胞是優選的。本發明實施例中使用的是胡須毛囊間充質細胞。
參照參考實施例1，在毛囊間充質細胞中而非成纖維細胞中檢測到明顯存在于肌成纖維細胞(myofibroblasts)中的α-平滑肌蛋白SM22和α-平滑肌肌動蛋白。因此，本文的毛囊間充質細胞較之于成纖維細胞具有與肌成纖維細胞更相近的特征。
真皮替代品最重要的事情是基質蛋白例如膠原、纖連蛋白、核心蛋白聚糖(decorin)和骨粘連蛋白(osteonectin)，以及生長因子例如結締組織生長因子、色素表皮衍生因子、血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子、轉化生長因子和葡糖胺聚糖。參照參考實施例2，毛囊間充質細胞中的基質蛋白和生長因子的產量比用作現有技術的基質細胞的成纖維細胞更高。不過，毛囊間充質細胞中降解基質蛋白的膠原酶活性小于成纖維細胞。因而，通過利用毛囊間充質細胞，本發明能夠提供具有出色的再生皮膚細胞能力的真皮替代品。
本發明包括與過渡覆層相連的作為骨架的三維活基質組織。
所述過渡覆層由硅橡膠例如聚氨酯和硅橡膠層構成。
三維骨架允許細胞粘附在它上面并生長不止一層。可利用非生物可降解材料例如尼龍(聚酰胺)、滌綸織物(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙稀、聚丙烯酸酯、聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酯(PC)和硝化纖維形成該骨架。對于體內應用，優選利用生物可降解骨架例如聚半乳糖酸(polyglactic acid)、聚葡萄糖醛酸、膠原、血纖蛋白、明膠、棉花、纖維素、殼聚糖或葡聚糖。
在本發明的實施例中，真皮替代品通過在由膠原-殼聚糖-葡糖胺聚糖形成的三維骨架中培養分離自胡須的間充質細胞來制備。圖1顯示了毛囊的結構。
圖2a是顯示毛囊間充質細胞在培養狀態下的模式的照片。
圖2b是顯示成纖維細胞在培養狀態下的模式的照片。
圖3是說明毛囊間充質細胞和成纖維細胞在培養10天時生長速率的曲線圖。
圖4a是顯示利用抗α-平滑肌肌動蛋白抗體對培養狀態的毛囊間充質細胞免疫染色結果的照片。
圖4a是顯示利用抗α-平滑肌肌動蛋白抗體對培養狀態的成纖維細胞免疫染色結果的照片。
圖5是顯示在三維骨架上培養胡須間充質細胞結果的照片。
圖6是顯示對培養在三維骨架上的胡須間充質細胞染色結果的照片。參考實施例1毛囊間充質細胞和成纖維細胞之間分類學差異的實驗1)毛囊間充質細胞和成纖維細胞的培養從男性脫發癥患者中通過生檢(biopsy)獲取胡須組織以分離胡須毛囊。將分離的毛囊靠上的2/3的部分除去，并將余下的靠下的1/3部分在5％的二氧化碳中培養。成纖維細胞在包皮環切術中獲自皮膚。利用含青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100ug/ml)、谷酰胺(0.584mg/ml)和20％胎牛血清的Dulbecco′s改良Eagle′s培養基(DMEM；Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)作為液體培養基。該液體培養基每3天更換一次。培養后4周，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA溶液分離每一個細胞，然后亞培養。利用第三次亞培養的細胞來測量10天的細胞生長速率。
2)免疫組織化學將第3代細胞培養物在甲醇中固定5分鐘，并在室溫下與α-平滑肌肌動蛋白的單克隆抗體溫育1小時。在PBS(磷酸鹽緩沖鹽溶液)中充分洗滌后，將細胞暴露于生物素標記的抗鼠抗體(Dako，Glostrup，丹麥)1小時，再次洗滌，并與辣根過氧化物酶交聯的鏈抗生素蛋白(steptavidin)溫育等長的時間。用1％雙氧水和5％二氨基聯苯胺顯色。免疫染色后，某些切片在脫水和固定前用蘇木精輕微反染色。
上述實驗的結果如下。
如圖2a和2b所示，胡須間充質細胞呈現出扁平形態，具有眾多的細胞突，而非毛囊皮膚成纖維細胞具有更加規則、紡錘狀的形態。間充質細胞形成塊或聚集物。該聚集物與規則的混雜模式的皮膚成纖維細胞形成對照。
如圖3所示，胡須間充質細胞比皮膚成纖維細胞生長得更慢。
參照圖4a和4b，當成纖維細胞和胡須間充質細胞用抗α-平滑肌肌動蛋白抗體免疫染色時，成纖維細胞很少著色，但毛囊間充質細胞清晰著色。該結果表明胡須間充質細胞與肌成纖維細胞的親緣關系比成纖維細胞更近。
參考實施例2由毛囊間充質細胞和成纖維細胞構建cDNA文庫，以及通過cDNA分析的基因表達頻率差異的實驗在DMEM中培養毛囊間充質細胞和皮膚成纖維細胞，并從70％融合的細胞中制備poly(A)+RNA。利用poly(A)+RNA(5μg)和Uni-Zap XR試劑盒(Stratagene)在ZAP II載體(Stratagene，USA)中構建cDNA文庫。通過ExAssist/SOLR系統(Stratagene)體內切除將該噬菌體文庫轉換為pBluescript噬菌粒cDNA文庫。在具有X-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB平板上涂布該pBluescript cDNA文庫，并挑選白色克隆進行測序。
利用所選克隆的過夜培養物(3ml在LB中)通過QIAwell-8質粒微抽提試劑盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)制備質粒DNA。利用測序酶DNA測序試劑盒從插入物的5′端對cDNA進行測序。序列與GenBank數據庫進行比較。
分析了來自每個cDNA文庫的1400個克隆，以比較基質蛋白、生長因子和基質蛋白降解酶的基因。結果示于表1中。分離自毛囊的間充質細胞以及分離自皮膚的成纖維細胞中生長因子、基質蛋白和基質蛋白降解酶的基因表達頻率
實施例利用毛囊間充質細胞制備真皮替代品1)培養來自胡須的間充質細胞從男性脫發癥患者中獲取胡須組織以分離胡須毛囊。將分離的毛囊靠上的2/3的部分除去，并將余下的靠下的1/3部分在5％的二氧化碳中于37℃培養。利用含青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100ug/ml)、谷酰胺(0.584mg/ml)和20％胎牛血清的Dulbecco′s改良Eagle′s培養基(DMEM；Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)作為培養液。每3天更換一次培養基。培養后4周，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA溶液分離每一個細胞，然后亞培養。
2)制備真皮替代品參照圖5，切割5×8cm的膠原-殼聚糖-葡糖胺聚糖片層。將5×105培養的毛囊間充質細胞置于片層上，并培養4-5周。
參照圖6，其顯示出毛囊間充質細胞附著在三維骨架上并且它們培養良好。如前面所討論的，毛囊間充質細胞比成纖維細胞產生更多的刺激細胞再生的生長因子和基質蛋白，而比成纖維細胞產生更少的降解基質蛋白的酶。因此，本文公開的利用間充質細胞制備的真皮替代品比常規技術具有更出色的細胞再生效果。
權利要求
1.一種真皮替代品，包括a)活基質組織，包括培養于三維骨架中的毛囊間充質細胞和由該毛囊間充質細胞分泌的結締組織蛋白；以及b)連接于該基質組織的過渡覆層。
2.根據權利要求1的真皮替代品，其中上述毛囊間充質細胞是真皮乳頭細胞和結締組織鞘細胞。
3.根據權利要求1或2的真皮替代品，其中所述毛囊是頭皮或胡須毛囊。
4.根據權利要求1的真皮替代品，其中所述三維骨架由選自由聚半乳糖酸、幾丁質、殼聚糖、棉花、聚葡萄糖醛酸、纖維素、明膠、膠原、血纖蛋白和葡聚糖所組成的組中的一種或多種生物可降解材料構成。
5.根據權利要求1的真皮替代品，其中所述骨架由選自由聚酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙稀、聚丙烯酸酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯和硝化纖維所組成的組中的一種或多種非生物可降解材料構成。
6.根據權利要求1的真皮替代品，其中所述過渡覆層由硅樹脂或聚氨酯制成。
全文摘要
本發明涉及自毛囊間充質細胞制備的真皮替代品。與成纖維細胞相比，分離自毛囊，尤其是來自人胡須毛囊的間充質細胞產生大量的生長因子和基質蛋白以刺激細胞再生，并產生少量的酶以分解基質蛋白。因此，由本發明制備的真皮替代品比傳統的人造皮膚具有更出色的細胞再生效果。
文檔編號A61L27/00GK1606614SQ02825518
公開日2005年4月13日 申請日期2002年12月17日 優先權日2001年12月18日
發明者金政澈, 金汶奎 申請人:金政澈