血管生成素－2的特異結(jié)合劑的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：888404閱讀：414來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：血管生成素－2的特異結(jié)合劑的制作方法
            
技術(shù)領(lǐng)域：
            本發(fā)明涉及識別血管生成素-2(Ang-2)并且與之結(jié)合的特異結(jié)合劑。更具體地說，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合Ang-2的所述特異結(jié)合劑及其片段的制備，診斷用途，和治療用途。
            
背景技術(shù)：
            血管發(fā)生，從存在的血管生成新的血管，對于很多生理和病理過程都是比需的。一般來說，血管發(fā)生由血管生成因子原和抗血管生成因子嚴(yán)格調(diào)節(jié)，但是在象癌癥，眼新血管病，關(guān)節(jié)炎，和牛皮癬這樣的疾病的情況下，該過程可能錯誤進(jìn)行。Folkman，J.，Nat.Med.，127-31(1995)。
            
有很多種疾病已知與不受調(diào)節(jié)的或者不期望的血管發(fā)生相關(guān)。這樣的疾病包括但不限于，眼新血管形成，例如視網(wǎng)膜病(包括糖尿病視網(wǎng)膜病)，與年齡有關(guān)的斑變性，牛皮癬，成血管瘤(hemangioblastoma)，血管瘤，動脈硬化，炎性疾病，例如類風(fēng)濕性或風(fēng)濕性炎癥，尤其是關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，或者其他慢性炎癥，例如慢性哮喘，動脈粥樣硬化或者移植后動脈粥樣硬化，子宮內(nèi)膜異位，和瘤，例如所謂的實體瘤和液體(或血液)腫瘤(例如白血病和淋巴瘤)。與不期望的血管發(fā)生相關(guān)的其他疾病對于那些本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
            
雖然很多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在血管發(fā)生的調(diào)節(jié)中涉及，但是表征得最充分并且最具內(nèi)皮細(xì)胞選擇性系統(tǒng)之一涉及Tie-2受體酪氨酸激酶(稱作″Tie-2″或″Tie-2R″(也稱作″ORK″)；鼠Tie-2也稱作″tek″)及其配體，血管生成素(Gale，N.W.和Yancopoulos，G.D.，Genes Dev.131055-1066)。有四種已知的血管生成素；血管生成素-1(″Ang-1″)至血管生成素-4(″Ang-4″)。這些血管生成素也稱作″Tie-2配體″.(Davis，S.，等，Cell，871161-1169；Grosios，K.，等，Cytogenet Cell Genet，84118-120；Holash，J.，等，Investigative Ophthalmology & Visual Science，421617-1625；Koblizek，T.I.，等，Current Biology，8529-532；Lin，P.，等，Proc Natl Acad Sci USA，958829-8834；Maisonpierre，P.C.，等，Science，27755-60；Papapetropoulos，A.，等，Lab Invest，79213-223；Sato，T.N.，等，Nature，37570-74；Shyu，K.G.，等，Circulation，982081-2087；Suri，C.，等，Cell，871171-1180；Suri，C.，等，Science，282468-471；Valenzuela，D.M.，等，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA，961904-1909；Witzenbichler，B.，等，J Biol Chem，27318514-18521)。Ang-1與Tie-2結(jié)合刺激培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中的受體磷酸化作用，發(fā)現(xiàn)Ang-2刺激和拮抗Tie-2受體磷酸化作用(Davis，S.，等，，上文；Maisonpierre，P.C.，等，，上文；Kim，I.，J.H.Kim，等，Oncogene 19(39)4549-4552(2000)；Teichert-Kuliszewska，K.，P.C.Maisonpierre，等，Cardiovascular Research 49(3)659-70(2001))。
            
小鼠Tie-2和Ang-1敲除物的表型是類似的并且提示Ang-1-刺激的Tie-2磷酸化作用通過保持內(nèi)皮細(xì)胞-支持細(xì)胞附著而介導(dǎo)子宮中發(fā)育血管的改變和穩(wěn)定(Dumont，D.J.，等，Genes & Development，81897-1909；Sato，T.N.，等，Nature，37670-74；Suri，C.，等，，上文)。認(rèn)為Ang-1在血管穩(wěn)定中的作用在成年人中是保守的，而且廣泛而基本性表達(dá)(Hanahan，D.，Science，27748-50；Zagzag，D.，等，ExperimentalNeurology，159391-400)。相反，Ang-2表達(dá)主要限于血管改造部位，認(rèn)為在那里阻斷Ang-1功能，從而誘導(dǎo)有益于血管發(fā)生的血管可塑性狀態(tài)(Hanahan，D.，，上文；Holash，J.，等，Science，2841994-1998；Maisonpierre，P.C.，等，，上文)。
            
很多公開的研究支持證明病態(tài)血管-選擇性Ang-2表達(dá)與血管發(fā)生有關(guān)。這些病理學(xué)情況包括，例如，牛皮癬，斑變性，和癌癥(Bunone，G.，等，American Journal of Pathology，1551967-1976；Etoh，T.，等，Cancer Research，612145-2153；Hangai，M.，等，Investigative Ophthalmology & Visual Science，421617-1625；Holash，J.，等，上文；Kuroda，K.，等，Journalof Investigative Dermatology，116713-720；Otani，A.，等，Investigative Ophthalmology & Visual Science，401912-1920；Stratmann，A.，等，American Journal ofPathology，1531459-1466；Tanaka，S.，等，J Clin Invest，10334-345；Yoshida，Y.，等，International Journalof Oncology，151221-1225；Yuan，K.，等，Journal ofPeriodontal Research，35165-171；Zagzag，D.，等，上文)。這些研究大多數(shù)聚焦在癌癥上，其中很多癌癥類型表現(xiàn)出顯示血管Ang-2表達(dá)。與在病理性血管發(fā)生中的表達(dá)相反，正常組織中Ang-2表達(dá)十分有限(Maisonpierre，P.C.，等，，上文；Mezquita，J.，等，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，260492-498)。在正常成年人體內(nèi)血管發(fā)生的三個主要部位是卵巢，胎盤，和子宮；這些是其中檢測到Ang-2mRNA的正常(即，非癌)組織中主要組織。
            
一些功能研究提示Ang-2可能在腫瘤血管發(fā)生中涉及。Ahmad等(Cancer Res.，611255-1259)描述Ang-2超量表達(dá)并且支持性證明這與小鼠異種移植模型中腫瘤生長增加有關(guān)。也參見Etoh等，上文，和Tanaka等，上文，其中給出支持Ang-2超量表達(dá)與腫瘤血管過多相關(guān)的數(shù)據(jù)。但是，相反，Yu等.(Am.J.Path.，158563-570)報道數(shù)據(jù)支持證明Lewis肺癌和TA3乳房癌細(xì)胞中Ang-2超量表達(dá)延長用相應(yīng)的轉(zhuǎn)染子注射的小鼠的存活。
            
在過去的幾年中，很多出版物提出Ang-1，Ang-2和/或Tie-2可能是抗癌治療的靶物。例如，美國專利Nos.6,166,185，5,650,490，和5,814,464各自公開了抗-Tie-2配體抗體和受體的概念。Lin等(Proc.Natl.Acad.Sci USA，958829-8834)對小鼠注射腺病毒表達(dá)可溶Tie-2；聲稱可溶Tie-2減小小鼠產(chǎn)生的腫瘤的數(shù)目和大小。在最近的研究中，Lin等(J.Clin.Invest.，1002072-2078)對大鼠注射可溶形式的Tie-2；聲稱這種化合物減小大鼠的腫瘤大小。Siemeister等(Cancer Res.，593185-3189)制備出表達(dá)Tie-2胞外結(jié)構(gòu)域的人黑素瘤細(xì)胞系，對裸鼠注射這些細(xì)胞系，得出結(jié)論聲稱可溶Tie-2導(dǎo)致腫瘤生長和腫瘤血管發(fā)生的″顯著抑制″。從這個信息看，并且已知Ang-1和Ang-2都結(jié)合Tie-2，從這些研究不能清楚地看出i Ang-1，Ang-2，或Tie-2會是抗癌治療的有吸引力的靶物。
            
提高這些分子的半壽期的一些肽與穩(wěn)定的血漿蛋白例如Ig恒定區(qū)的融合體描述于，例如，PCT公開WO 00/24782，2000年5月4日公開。
            
先前描述過提高分子半壽期的一種蛋白質(zhì)或者其片段與一種穩(wěn)定的血漿蛋白質(zhì)例如Ig恒定區(qū)的融合體(例如，實施例，美國專利No.5,480,981；Zheng等，J.Immunol.，1545590-5600，(1995)；Fisher等，N.Engl.J.Med.，3341697-1702，(1996)；Van Zee，K.等，J.Immunol.，1562221-2230，(1996)；美國專利No.5,808,029，1998年9月15日公開；Capon等，Nature，337525-531，(1989)；Harvill等，Immunotech.，195-105，(1995)；WO97/23614，1997年7月3日公開；PCT/US 97/23183，filed Dec.11，1997年12月11日申請；Linsley，J.Exp.Med.，174561-569，(1991)；WO 95/21258，1995年8月10日公開)。
            
有效的抗-Ang-2療法可能使大量的癌癥患者受益，因為大多數(shù)實體腫瘤需要新血管化生長直徑超過1-2毫米。這樣的療法對其他與血管發(fā)生相關(guān)的疾病例如視網(wǎng)膜病，關(guān)節(jié)炎和牛皮癬有廣泛的應(yīng)用。
            
對于特異性識別并結(jié)合Ang-2的新的藥物有著未開發(fā)的需求。這樣的藥物將有用于對與Ang-2活性相關(guān)的病態(tài)的診斷篩選和治療干預(yù)。
            
因此，本發(fā)明的一個目的是提供調(diào)節(jié)Ang-2活性的Ang-2的特異結(jié)合劑。
            
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，其中所述重鏈包含選自下組的重鏈可變區(qū)526 HC(SEQ ID NO.1)；528 HC(SEQ ID NO.3)；531 HC(SEQ ID NO.5)；533 HC(SEQ ID NO.7)；535 HC(SEQ IDNO.9)；536 HC(SEQ ID NO.11)；537 HC(SEQ ID NO.13)；540HC(SEQ ID NO.15)；543 HC(SEQ ID NO.17)；544 HC(SEQ ID NO.19)；545 HC(SEQ ID NO.21)；546 HC(SEQ ID NO.23)；551 HC(SEQ IDNO.25)；553 HC(SEQ ID NO.27)；555 HC(SEQ ID NO.29)；558HC(SEQ ID NO.31)；559 HC(SEQ ID NO.33)；565 HC(SEQ ID NO.35)；F1-C6 HC(SEQ ID NO.37)；FB1-A7 HC(SEQ ID NO.39)；FD-B2HC(SEQ ID NO.41)；FE-B7 HC(SEQ ID NO.43)；FJ-G11 HC(SEQID NO.45)；FK-E3 HC(SEQ ID NO.47)；G1D4 HC(SEQ ID NO.49)；GC1E8 HC(SEQ ID NO.51)；H1C12 HC(SEQ ID NO.53)；IA1-1E7HC(SEQ ID NO.55)；IF-1C10 HC(SEQ ID NO.57)；IK-2E2 HC(SEQID NO.59)；IP-2C11 HC(SEQ ID NO.61)；及其抗原結(jié)合片段；所述輕鏈包含選自下組的輕鏈可變區(qū)526κ(SEQ ID NO.2)；536κ(SEQID NO.12)；543κ(SEQ ID NO.18)；544κ(SEQ ID NO.20)；551κ(SEQ ID NO.26)；553κ(SEQ ID NO.28)；555κ(SEQ ID NO.30)；558κ(SEQ ID NO.32)；565κ(SEQ ID NO.36)；FE-B7κ(SEQ ID NO.44)；FJ-G11κ(SEQ ID NO.46)；FK-E3κ(SEQ ID NO.48)；IA1-1E7κ(SEQ ID NO.56)；IP-2C11κ(SEQ ID NO.62)；528λ(SEQ ID NO.4)；531λ(SEQ ID NO.6)；533λ(SEQ ID NO.8)；535λ(SEQ ID NO.10)；537λ(SEQ ID NO.14)；540λ(SEQ IDNO.16)；545λ(SEQ ID NO.22)；546λ(SEQ ID NO.24)；559λ(SEQ ID NO.34)；F1-C6λ(SEQ ID NO.38)；FB1-A7λ(SEQ ID NO.40)；FD-B2λ(SEQ ID NO.42)；G1D4λ(SEQ ID NO.50)；GC1E8λ(SEQ ID NO.52)；H1C12λ(SEQ ID NO.54)；IF-1C10λ(SEQ ID NO.58)；IK-2E2λ(SEQ ID NO.60)；及其抗原結(jié)合片段。
            
本發(fā)明還提供了包含至少一種選自下組的肽的特異結(jié)合劑SEQ IDNO.1；SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.9；SEQ ID NO.11；SEQ ID NO.13；SEQ ID NO.15；SEQ ID NO.17；SEQ ID NO.19；SEQ ID NO.21；SEQ ID NO.23；SEQ ID NO.25；SEQ ID NO.27；SEQ ID NO.29；SEQ ID NO.31；SEQ ID NO.33；SEQ ID NO.35；SEQ ID NO.37；SEQ ID NO.39；SEQ ID NO.41；SEQ ID NO.43；SEQ ID NO.45；SEQ ID NO.47；SEQ ID NO.49；SEQ ID NO.51；SEQ ID NO.53；SEQ ID NO.55；SEQ ID NO.57；SEQ ID NO.59；SEQ ID NO.61；SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.20；SEQ ID NO.2 6；SEQ ID NO.28；SEQ ID NO.30；SEQ ID NO.32；SEQ ID NO.36；SEQ ID NO.44；SEQ ID NO.46；SEQ ID NO.48；SEQ ID NO.56；SEQ ID NO.62；SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.10；SEQID NO.14；SEQ ID NO.16；SEQ ID NO.22；SEQ ID NO.24；SEQID NO.34；SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.40；SEQ ID NO.42；SEQID NO.50；SEQ ID NO.52；SEQ ID NO.54；SEQ ID NO.58；和SEQ ID NO.60及其片段。
            
應(yīng)該理解，特異結(jié)合劑可以是，例如抗體，如多克隆、單克隆、嵌合的、人源化或完全的人抗體。所述抗體也可以是單鏈抗體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤。
            
可以理解，本發(fā)明涉及如此處所描述的偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物可以是，例如，本發(fā)明的特異結(jié)合劑(如抗體)。
            
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的特異結(jié)合劑(如抗體)的核酸分子，以及包含所述核酸分子的載體，以及包含所述載體的宿主細(xì)胞。
            
此外，本發(fā)明提供了一種制備特異結(jié)合劑的方法，包括，(a)用至少一種編碼權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(b)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸分子；和(c)分離所述特異結(jié)合劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備抗體的方法，包括(a)用至少一種編碼本發(fā)明抗體的核酸分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(b)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸分子；和(c)分離所述特異結(jié)合劑。
            
本發(fā)明還涉及抑制哺乳動物中不期望的血管發(fā)生的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的特異結(jié)合劑。本發(fā)明還提供治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的特異結(jié)合劑。
            
本發(fā)明還涉及抑制哺乳動物中不期望的血管發(fā)生的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的抗體。本發(fā)明還提供治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的抗體。
            
應(yīng)該理解，本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本發(fā)明的特異結(jié)合劑和藥學(xué)可接受制劑的藥物組合物。該藥物組合物可以包含本發(fā)明的抗體和藥學(xué)可接受制劑。
            
本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)或抑制血管生成素-2活性的方法，包括施用一種或多種本發(fā)明的特異結(jié)合劑。本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)或抑制血管生成素-2活性的方法，包括施用一種或多種本發(fā)明的抗體。
            
本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)哺乳動物血管滲透性或血漿滲漏中至少一項的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的特異結(jié)合劑。本發(fā)明還涉及治療哺乳動物中以下病癥中的至少一種的方法眼新血管病，肥胖，成血管瘤，血管瘤，動脈硬化，炎性疾病，炎性紊亂，動脈粥樣硬化，子宮內(nèi)膜異位，腫瘤性疾病，骨相關(guān)疾病，或者牛皮癬，包括施用治療有效量的本發(fā)明的特異結(jié)合劑。
            
此外，本發(fā)明涉及治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的特異結(jié)合劑和化療藥物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，特異結(jié)合劑和化療藥物不需要同時施用。
            
本發(fā)明還涉及治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的本發(fā)明的抗體和化療藥物。特異結(jié)合劑和化療藥物不需要同時施用。
            
本發(fā)明還提供一種包含以下任意一種互補決定區(qū)1(CDR 1)的特異結(jié)合劑526 HC(SEQ ID NO.1)；528 HC(SEQ ID NO.3)；531 HC(SEQ ID NO.5)；533 HC(SEQ ID NO.7)；535 HC(SEQ ID NO.9)；536 HC(SEQ ID NO.11)；537 HC(SEQ ID NO.13)；540 HC(SEQID NO.15)；543 HC(SEQ ID NO.17)；544 HC(SEQ ID NO.19)；545 HC(SEQ ID NO.21)；546 HC(SEQ ID NO.23)；551 HC(SEQID NO.25)；553 HC(SEQ ID NO.27)；555 HC(SEQ ID NO.29)；558 HC(SEQ ID NO.31)；559 HC(SEQ ID NO.33)；565 HC(SEQID NO.35)；F1-C6 HC(SEQ ID NO.37)；FB1-A7 HC(SEQ ID NO.39)；FD-B2 HC(SEQ ID NO.41)；FE-B7 HC(SEQ ID NO.43)；FJ-G11 HC(SEQ ID NO.45)；FK-E3 HC(SEQ ID NO.47)；G1D4 HC(SEQ ID NO.49)；GC1E8 HC(SEQ ID NO.51)；H1C12 HC(SEQ ID NO.53)；IA1-1E7HC(SEQ ID NO.55)；IF-1C10 HC(SEQ ID NO.57)；IK-2E2 HC(SEQID NO.59)；IP-2C11 HC(SEQ ID NO.61)；526κ(SEQ ID NO.2)；536κ(SEQ ID NO.12)；543κ(SEQ ID NO.18)；544κ(SEQ IDNO.20)；551κ(SEQ ID NO.26)；553κ(SEQ ID NO.28)；555κ(SEQ ID NO.30)；558κ(SEQ ID NO.32)；565κ(SEQ ID NO.36)；FE-B7κ(SEQ ID NO.44)；FJ-G11κ(SEQ ID NO.46)；FK-E3κ(SEQ ID NO.48)；IA1-1E7κ(SEQ ID NO.56)；IP-2C11κ(SEQID NO.62)；528λ(SEQ ID NO.4)；531λ(SEQ ID NO.6)；533λ(SEQ ID NO.8)；535λ(SEQ ID NO.10)；537λ(SEQ ID NO.14)；540λ(SEQ ID NO.16)；545λ(SEQ ID NO.22)；546λ(SEQ IDNO.24)；559λ(SEQ ID NO.34)；F1-C6λ(SEQ ID NO.38)；FB1-A7λ(SEQ ID NO.40)；FD-B2λ(SEQ ID NO.42)；G1D4λ(SEQ ID NO.50)；GC1E8λ(SEQ ID NO.52)；H1C12λ(SEQ ID NO.54)；IF-1C10λ(SEQ ID NO.58)；和IK-2E2λ(SEQ ID NO.60)。
            
本發(fā)明還涉及一種包含以下任意一種互補決定區(qū)2(CDR2)的特異結(jié)合劑526 HC(SEQ ID NO.1)；528 HC(SEQ ID NO.3)；531 HC(SEQ ID NO.5)；533 HC(SEQ ID NO.7)；535 HC(SEQ ID NO.9)；536 HC(SEQ ID NO.11)；537 HC(SEQ ID NO.13)；540 HC(SEQID NO.15)；543 HC(SEQ ID NO.17)；544 HC(SEQ ID NO.19)；545 HC(SEQ ID NO.21)；546 HC(SEQ ID NO.23)；551 HC(SEQID NO.25)；553 HC(SEQ ID NO.27)；555 HC(SEQ ID NO.29)；558 HC(SEQ ID NO.31)；559 HC(SEQ ID NO.33)；565 HC(SEQID NO.35)；F1-C6 HC(SEQ ID NO.37)；FB1-A7 HC(SEQ ID NO.39)；FD-B2 HC(SEQ ID NO.41)；FE-B7 HC(SEQ ID NO.43)；FJ-G11 HC(SEQ ID NO.45)；FK-E3 HC(SEQ ID NO.47)；G1D4 HC(SEQ ID NO.49)；GC1E8 HC(SEQ ID NO.51)；H1C12 HC(SEQ ID NO.53)；IA1-1E7HC(SEQ ID NO.55)；IF-1C10 HC(SEQ ID NO.57)；IK-2E2 HC(SEQID NO.59)；IP-2C11 HC(SEQ ID NO.61)；526κ(SEQ ID NO.2)；536κ(SEQ ID NO.12)；543κ(SEQ ID NO.18)；544κ(SEQ IDNO.20)；551κ(SEQ ID NO.26)；553κ(SEQ ID NO.28)；555κ(SEQ ID NO.30)；558κ(SEQ ID NO.32)；565κ(SEQ ID NO.36)；FE-B7κ(SEQ ID NO.44)；FJ-G11κ(SEQ ID NO.46)；FK-E3κ(SEQ ID NO.48)；IA1-1E7κ(SEQ ID NO.56)；IP-2C11κ(SEQID NO.62)；528λ(SEQ ID NO.4)；531λ(SEQ ID NO.6)；533λ(SEQ ID NO.8)；535λ(SEQ ID NO.10)；537λ(SEQ ID NO.14)；540λ(SEQ ID NO.16)；545λ(SEQ ID NO.22)；546λ(SEQ IDNO.24)；559λ(SEQ ID NO.34)；F1-C6λ(SEQ ID NO.38)；FB1-A7λ(SEQ ID NO.40)；FD-B2λ(SEQ ID NO.42)；G1D4λ(SEQ ID NO.50)；GC1E8λ(SEQ ID NO.52)；H1C12λ(SEQ ID NO.54)；IF-1C10λ(SEQ ID NO.58)；和IK-2E2λ(SEQ ID NO.60)。
            
本發(fā)明還涉及一種包含以下任意一種互補決定區(qū)3(CDR3)的特異結(jié)合劑526 HC(SEQ ID NO.1)；528 HC(SEQ ID NO.3)；531 HC(SEQ ID NO.5)；533 HC(SEQ ID NO.7)；535 HC(SEQ ID NO.9)；536 HC(SEQ ID NO.11)；537 HC(SEQ ID NO.13)；540 HC(SEQID NO.15)；543 HC(SEQ ID NO.17)；544 HC(SEQ ID NO.19)；545 HC(SEQ ID NO.21)；546 HC(SEQ ID NO.23)；551 HC(SEQID NO.25)；553 HC(SEQ ID NO.27)；555 HC(SEQ ID NO.29)；558 HC(SEQ ID NO.31)；559 HC(SEQ ID NO.33)；565 HC(SEQID NO.35)；F1-C6 HC(SEQ ID NO.37)；FB1-A7 HC(SEQ ID NO.39)；FD-B2 HC(SEQ ID NO.41)；FE-B7 HC(SEQ ID NO.43)；FJ-G11 HC(SEQ ID NO.45)；FK-E3 HC(SEQ ID NO.47)；G1D4 HC(SEQ ID NO.49)；GC1E8 HC(SEQ ID NO.51)；H1C12 HC(SEQ ID NO.53)；IA1-1E7 HC(SEQ ID NO.55)；IF-1C10 HC(SEQ ID NO.57)；IK-2E2 HC(SEQ ID NO.59)；IP-2C11 HC(SEQ ID NO.61)；526κ(SEQ ID NO.2)；536κ(SEQ ID NO.12)；543κ(SEQ ID NO.18)；544κ(SEQ IDNO.20)；551κ(SEQ ID NO.26)；553κ(SEQ ID NO.28)；555κ(SEQ ID NO.30)；558κ(SEQ ID NO.32)；565κ(SEQ ID NO.36)；FE-B7κ(SEQ ID NO.44)；FJ-G11κ(SEQ ID NO.46)；FK-E3κ(SEQ ID NO.48)；IA1-1E7κ(SEQ ID NO.56)；IP-2C11κ(SEQID NO.62)；528λ(SEQ ID NO.4)；531λ(SEQ ID NO.6)；533λ(SEQ ID NO.8)；535λ(SEQ ID NO.10)；537λ(SEQ ID NO.14)；540λ(SEQ ID NO.16)；545λ(SEQ ID NO.22)；546λ(SEQ IDNO.24)；559λ(SEQ ID NO.34)；F1-C6λ(SEQ ID NO.38)；FB1-A7λ(SEQ ID NO.40)；FD-B2λ(SEQ ID NO.42)；G1D4λ(SEQ ID NO.50)；GC1E8λ(SEQ ID NO.52)；H1C12λ(SEQ ID NO.54)；IF-1C10λ(SEQ ID NO.58)；和IK-2E2λ(SEQ ID NO.60)。
            
本發(fā)明還提供一種編碼本發(fā)明的特異結(jié)合劑的核酸分子。
            
此外，本發(fā)明涉及一種檢測生物樣品中血管生成素-2水平的方法，包括(a)使本發(fā)明的特異結(jié)合劑與樣品接觸，和(b)確定特異結(jié)合劑與樣品的結(jié)合程度。本發(fā)明還涉及一種檢測生物樣品中血管生成素-2水平的方法，包括(a)使本發(fā)明的抗體與樣品接觸，和(b)確定抗體與樣品的結(jié)合程度。
            
本發(fā)明還涉及抑制哺乳動物不期望的血管發(fā)生的方法，包括施用治療有效量的這里描述的多肽或組合物。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)哺乳動物血管發(fā)生的方法，包括施用治療有效量的這里描述的多肽或組合物。本發(fā)明還涉及抑制哺乳動物中以不期望的血管發(fā)生為特征的腫瘤生長的方法，包括施用治療有效量的這里描述的多肽或組合物。另外，本發(fā)明涉及治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的這里描述的多肽或組合物，和化療藥物。在優(yōu)選的實施方案中，所述化療藥物是5-FU，CPT-11，和脫乙酰基紫杉醇(Taxotere)中的至少一種。但是要明白也能使用其他合適的化療藥物和其他癌癥療法。
            
可以明白本發(fā)明的特異結(jié)合劑能被用來治療與失去控制的或不期望的血管發(fā)生相關(guān)的多種疾病。這樣的疾病包括但不限于，眼新血管化，例如視網(wǎng)膜病(包括糖尿病視網(wǎng)膜病和與年齡相關(guān)的黃斑變性)，牛皮癬，成血管瘤，血管瘤，動脈硬化，炎性疾病，例如類風(fēng)濕性或風(fēng)濕性炎癥，特別是關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，或者其他慢性炎性紊亂，例如慢性哮喘，動脈或移植后動脈粥樣硬化，子宮內(nèi)膜異位，和腫瘤性疾病，例如所謂實體瘤和液體瘤(例如白血病)。通過施用特異結(jié)合劑能治療的另外的疾病對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這樣的另外的疾病包括但不限于肥胖，血管滲透，血漿滲漏，骨相關(guān)疾病，包括骨質(zhì)疏松。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療這些與失去控制或不期望的血管發(fā)生相關(guān)的疾病的方法。
            
本發(fā)明的其他實施方案通過這里提供的公開內(nèi)容容易變成顯而易見的。
            
附圖簡述
            

            
圖1描述了用本發(fā)明的抗Ang-2抗體(克隆533，537或544)，對照抗體，或者磷酸緩沖鹽水(PBS)治療的攜帶腫瘤的小鼠腫瘤體積(y-軸)對時間(x-軸)的曲線圖。實施例中描述了詳細(xì)情況。
            
圖2A，2B，和2C描述分別在全長人Ang-2(hAng-2)，hAng-2的N-末端，和hAng-2的C-末端，對于根據(jù)本發(fā)明的抗體TN8-Con4-C，L1-7-N，和12-9-3-C，以及對于對照抗體，Tie2-Fc，C2B8，或5B12的表位定位數(shù)據(jù)(O.D.370)。實施例中描述了詳細(xì)情況。
            
發(fā)明詳述這里使用這部分的標(biāo)題只是為了組織的目的，而不是為了在任何方面限制描述的主題。
            
對于重組DNA分子，蛋白質(zhì)，和抗體制備，以及對于組織培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)化可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)一般根據(jù)廠商說明進(jìn)行或者根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)通常公開的使用常規(guī)方法進(jìn)行，例如Sambrook等(分子克隆實驗室手冊“Molecular CloningA Laboratory Manual”冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.)中給出的那些，或者根據(jù)這里描述的。除非提供具體的定義，這里描述的相關(guān)術(shù)語，試驗方法和分析化學(xué)，合成有機(jī)化學(xué)，藥學(xué)和藥劑化學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域公知的和常規(guī)使用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以用于化學(xué)合成，化學(xué)分析，藥物制備，制劑，和送遞，和對患者的治療。
            
定義除非另外具體說明，貫穿說明書使用的術(shù)語如下定義。
            
術(shù)語″Ang-2″指美國專利No.6,166,185的圖6中給出的多肽(″Tie-2配體-2″)或者其片段以及相關(guān)的多肽，包括等位變體，剪接變體，衍生物，取代，缺失，和/或插入變體，融合肽和多肽，和種間同系物或者其片段。Ang-2多肽可以包括或可以不包括另外的末端殘基，例如，前導(dǎo)序列，引導(dǎo)序列，氨基末端甲硫氨酸，和賴氨酸殘基，和/或標(biāo)記或融合蛋白序列，取決于制備它的方法。
            
術(shù)語″生物活性″當(dāng)與Ang-2或Ang-2特異結(jié)合劑相關(guān)聯(lián)使用時指具有Ang-2或Ang-2特異結(jié)合劑的至少一種活性特征的肽或多肽。Ang-2的特異結(jié)合劑就Ang-2的至少一種生物活性來說可以具有激動劑，拮抗劑，或中和或阻斷活性。
            
術(shù)語″特異結(jié)合劑″指一種分子，優(yōu)選蛋白質(zhì)分子，其以高于其它血管生成素的親和力結(jié)合Ang-2(及這里定義的其變體和衍生物)。一種特異結(jié)合劑可以是一種蛋白質(zhì)，肽，核酸，碳水化合物，脂質(zhì)，或者優(yōu)先與Ang-2結(jié)合的小分子量化合物。在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的特異結(jié)合劑是以已知技術(shù)通過的抗體，如多克隆抗體，單克隆抗體(mAb)，嵌合抗體，CDR嫁接的抗體，多特異性抗體，雙特異性抗體，催化抗體，人源化抗體，人抗體，抗獨特型(抗Id)抗體和可以以可溶或結(jié)合形式標(biāo)記的抗體，及其片段、變體或衍生物，它們單獨存在或與其它氨基酸序列組合。所述技術(shù)包括但并不限于酶促裂解，化學(xué)裂解，肽合成或重組技術(shù)。本發(fā)明的抗-Ang-2特異結(jié)合劑能結(jié)合Ang-2的部分，調(diào)節(jié)，例如，抑制或促進(jìn)，Ang-2的生物活性和/或其他Ang-2-相關(guān)活性。
            
術(shù)語“多克隆抗體”是指識別并且結(jié)合相同抗原上的不同表位的抗體的異質(zhì)混合物?？梢詮拇种蒲逯苿┲蝎@得多克隆抗體，或者可以使用例如抗原親和層析或蛋白A/蛋白G親和層析進(jìn)行純化。
            
術(shù)語“單克隆抗體”是指由相同的核酸分子編碼的抗體集合，所述抗體任選由單個雜交瘤或其它細(xì)胞系產(chǎn)生，或由轉(zhuǎn)基因哺乳動物產(chǎn)生，這樣一般每種單克隆抗體將識別抗原上的相同表位。術(shù)語“單克隆”不限于用于制備抗體的特定方法，該術(shù)語也不限于在特定物種，如小鼠、大鼠等中產(chǎn)生的抗體。
            
術(shù)語“嵌合抗體”是指一種抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而所述鏈的其余部分與來源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源。也包括所述抗體的片段，它們顯示出需要的生物活性(即，特異性結(jié)合Ang-2的能力)。見美國專利4,816,567和Morrison et al.，Proc Natl Acad Sci(USA)，816851-6855。
            
術(shù)語“CDR嫁接的抗體”是指一種抗體，其中來自特定物種或同種型的一種抗體的CDR被重組插入相同或不同物種或同種型的另一種抗體的構(gòu)架中。
            
術(shù)語“多特異性抗體”是指一種具有識別一種或多種抗原上的一個以上表位的可變區(qū)的抗體。該類型抗體的亞類是識別相同或不同抗原上的兩種不同表位的“雙特異性抗體”。
            
“催化”抗體是指這樣的抗體，其中一種或多種細(xì)胞毒性的，或更普遍地說，一種或更具有生物活性的部分連接于與導(dǎo)向結(jié)合劑。
            
術(shù)語“人源化抗體”是指一種特定類型的CDR嫁接的抗體，其中抗體構(gòu)架區(qū)來源于人，但是每個CDR被來源于另一物種的CDR，如鼠CDR取代。術(shù)語“CDR”在下文定義。
            
術(shù)語“完全的人”抗體是指其中CDR和構(gòu)架區(qū)均來源于一種或多種人DNA分子的抗體。
            
術(shù)語“抗獨特型”抗體是指任何特異性結(jié)合于識別抗原的另一種抗體的任何抗體?？梢杂么颂幟枋龅挠糜诋a(chǎn)生Ang-2特異性抗體的方法產(chǎn)生抗獨特型抗體，只是這些抗體產(chǎn)生自例如用Ang-2特異性抗體或其Ang-2結(jié)合片段免疫動物，而不是Ang-2多肽自身或其片段。
            
這里使用的術(shù)語″變體″包括其中天然存在的(至少一種公知的)結(jié)合劑的氨基酸序列中的氨基酸殘基被插入，缺失和/或取代的那些肽或多肽。本發(fā)明的變體包括如下所述的融合蛋白。
            
″衍生物″包括以不同于插入，缺失或取代的變體的一些方式化學(xué)修飾的那些結(jié)合劑。
            
″特異性結(jié)合Ang-2″指本發(fā)明的特異結(jié)合劑(例如抗體，或者其片段)識別并結(jié)合成熟的，全長或部分長度的人Ang-2多肽或者其直向同源物的能力，這樣其親和性(根據(jù)例如這里描述的親和性ELISA或BIAcore測定確定)或者其中和能力(根據(jù)這里描述的例如，中和作用ELISA測定或類似測定來確定)至少是相同的任何其他血管生成素或其他肽或多肽的親合力或中和能力的大小的10倍，但是任意地是50倍，100，250或500倍，或者甚至至少1000倍，其中抗體的肽部分第一次與人Fc部分融合用于在這樣的測定中評價。
            
術(shù)語“抗原結(jié)合域”或“抗原結(jié)合區(qū)”是指含有與抗原相互作用并且在結(jié)合劑上賦予其對抗原的特異性和親和力的特異結(jié)合劑氨基酸殘基(或其它部分)的特異結(jié)合劑(如抗體分子)的部分。在抗體中，抗原結(jié)合域通常稱作“互補決定區(qū)或CDR”。
            
術(shù)語″表位″指在一個或多個結(jié)合劑的抗原結(jié)合區(qū)能被特異結(jié)合劑例如抗體識別和結(jié)合的任何分子的部分。表位通常由化學(xué)活性表面分子基團(tuán)例如氨基酸或糖基側(cè)鏈組成，并且具有特異三維結(jié)構(gòu)特征以及特異電荷特征。這里使用的表位可以是連續(xù)或不連續(xù)的。
            
術(shù)語″抑制和/或中和表位″是一種表位，當(dāng)被特異結(jié)合劑例如抗體結(jié)合時，它導(dǎo)致體內(nèi)，體外，或者原位包含這樣的表位的分子，細(xì)胞，或生物體的生物活性的喪失(或者至少降低)。在本發(fā)明的上下文中，中和表位位于Ang-2的生物活性區(qū)或者與Ang-2的生物活性區(qū)有關(guān)?；蛘?，術(shù)語″活性表位″是一種表位，當(dāng)被本發(fā)明的特異結(jié)合劑例如抗體結(jié)合時，導(dǎo)致Ang-2的生物活性構(gòu)象激活，或者至少維持。
            
術(shù)語″抗體片段″指肽或多肽，其包括完全完整抗體的部分。完全的抗體包含兩個功能獨立的部分或片段稱作“Fab”的抗原結(jié)合片段和稱作“Fc”的羧基末端可結(jié)晶片段。Fab片段包括來自重鏈和輕鏈的第一恒定區(qū)(CH1和CL1)以及結(jié)合特異性抗體的來自重鏈和輕鏈的可變區(qū)。重鏈和輕鏈的每一個都包括三個互補決定區(qū)(CDRs)和分開各個CDRs的構(gòu)架氨基酸殘基。Fc區(qū)包括第二和第三重鏈恒定區(qū)(CH2和CH3)并且參與效應(yīng)物功能如補體激活和吞噬細(xì)胞攻擊。在一些抗體中，F(xiàn)c和Fab區(qū)由抗體“鉸鏈區(qū)”分開，并且，根據(jù)全長抗體如何被蛋白酶促裂解，鉸鏈區(qū)可以與Fab或Fc片段締合。例如，用木瓜蛋白酶裂解抗體，導(dǎo)致鉸鏈區(qū)與得到的Fc片段締合，而用胃蛋白酶裂解，提供了其中的鉸鏈區(qū)與兩個Fab片段同時締合的片段。由于兩個Fab片段實際上是在胃蛋白酶裂解之后共價連接的，得到的片段被稱作F(ab′)2片段。
            
Fc結(jié)構(gòu)域可以具有相對長的血清半壽期，而Fab的壽命短。[Caponet al.，Nature，337525-31(1989)]。當(dāng)作為融合蛋白的一部分表達(dá)時，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域可以賦予更長的半壽期或者帶來諸如Fc受體結(jié)合、蛋白A結(jié)合、補體固定和可能甚至胎盤轉(zhuǎn)移至與其融合的蛋白中的功能。Fc區(qū)可以是天然存在的Fc區(qū)，或者可以經(jīng)改變而改進(jìn)某些質(zhì)量，如治療質(zhì)量或循環(huán)時間。
            
術(shù)語“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”是指抗體輕鏈和/或重鏈的一部分，一般包括重鏈中的大約氨基末端的120-130個氨基酸和輕鏈中的大約100-110個氨基末端氨基酸?？勺儏^(qū)一般在氨基酸序列中，甚至在相同物種的抗體中廣泛不同?？贵w的可變區(qū)一般決定其特定抗原的每種特定抗體的結(jié)合和特異性。序列的可變性集中在那些稱作互補決定區(qū)(CDRs)的區(qū)域中，而可變區(qū)中保守性更高的區(qū)域稱作構(gòu)架區(qū)(FR)。輕鏈和重鏈的CDRs在其中含有很大程度負(fù)責(zé)抗體與抗原的直接相互作用的氨基酸，而FRs中的氨基酸可以顯著影響抗原結(jié)合/識別，如下文所討論。
            
當(dāng)涉及抗體時，根據(jù)恒定區(qū)的氨基酸序列，術(shù)語“輕鏈”集中指兩種不同的類型，即κ或λ。
            
當(dāng)涉及抗體時，根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，術(shù)語“重鏈”是指五種不同的類型，即α，δ，ε，γ和μ。重鏈和輕鏈的組合產(chǎn)生了五種公知的抗體類型，分別為IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，包括四種公知的IgG亞類，命名為IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。
            
當(dāng)與象核酸分子，多肽，宿主細(xì)胞等這樣的生物材料相關(guān)使用時，術(shù)語″天然存在的″指在自然界發(fā)現(xiàn)的沒有被人改變的那些。
            
術(shù)語″分離的″當(dāng)與Ang-2相關(guān)或與Ang-2的特異結(jié)合劑相關(guān)的使用時，指沒有至少一種其天然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的污染多肽或化合物的化合物，優(yōu)選基本上沒有會干擾其治療或診斷用途的污染哺乳動物多肽。
            
當(dāng)術(shù)語″成熟″與Ang-2抗體或者其片段相關(guān)使用時，或者與Ang-2的其他蛋白質(zhì)特異結(jié)合劑相關(guān)使用時，指沒有前導(dǎo)序列或信號序列的肽或多肽。在例如在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的結(jié)合劑時，″成熟″肽或多肽還可以包括另外的氨基酸殘基(但是仍然沒有前導(dǎo)序列)，例如氨基末端甲硫氨酸，或者一個或多個甲硫氨酸和賴氨酸殘基?？梢允褂糜眠@種方法制備的肽或多肽，這些另外的氨基酸殘基已經(jīng)被去除或者沒有被去除。
            
術(shù)語″有效量″和″治療有效量″與Ang-2的特異結(jié)合劑相關(guān)使用時，指對于支持Ang-2的一種或幾種生物活性水平可觀察變化是有用的或必需的量。所述變化可以是Ang-2活性水平的提高或降低。優(yōu)選地，所述變化是Ang-2活性水平的降低。
            
特異結(jié)合劑和抗體此處使用的術(shù)語“特異結(jié)合劑”是指此處描述的具有識別和結(jié)合Ang-2的特異性的分子。適當(dāng)?shù)奶禺惤Y(jié)合劑包括，但不限于，抗體及其衍生物，多肽和小分子。可以使用本領(lǐng)域公知的方法制備適當(dāng)?shù)奶禺惤Y(jié)合劑。本發(fā)明的一種示例性的Ang-2多肽特異結(jié)合劑能夠結(jié)合Ang-2的某一部分，并且優(yōu)選調(diào)節(jié)Ang-2多肽的活性或功能。
            
特異性結(jié)合Ang-2多肽的抗體和抗體片段等特異結(jié)合劑在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？贵w可以是多克隆抗體，包括單特異性多克隆抗體，單克隆抗體，重組抗體，嵌合抗體，人源化抗體，如CDR嫁接的抗體，人抗體，單鏈抗體，催化抗體，多特異性和/或雙特異性抗體，及其片段，變體和/或衍生物。
            
一般通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射添加或不添加佐劑的Ang-2多肽或其片段在動物(如兔、倉鼠、山羊、綿羊、馬、豬、大鼠、沙鼠、豚鼠、小鼠或任何其它適當(dāng)?shù)牟溉閯游?，以及其它非哺乳動物物種)中產(chǎn)生針對Ang-2多肽的單克隆抗體。所述佐劑包括，但不限于弗氏完全和不完全佐劑，礦物凝膠如氫氧化鋁，和表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔血藍(lán)蛋白和二硝基苯酚。BCG(bacilliCalmette-Guerin)和Corynebacterium parvum是可能有用的人類佐劑。將抗原多肽與在要免疫的物種中具有免疫原性的載體蛋白，如匙孔血藍(lán)蛋白，血清，白蛋白，牛血紅蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑偶聯(lián)可能是有用的。同樣，聚集劑如明礬也可用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。免疫后，對動物取血，測定抗Ang-2多抗體滴度，這可以使用“實施例”部分描述的測定法來確定。多克隆抗體可以在檢測到它們的血清中利用，或者可以從血清中純化，使用例如抗原親和層析或蛋白A或G親和性層析。
            
可以使用例如，但不限于傳統(tǒng)的“雜交瘤”方法或更新的“噬菌體展示”技術(shù)產(chǎn)生針對Ang-2多肽的單克隆抗體。例如，可以按照Kohleret al.，Nature 256495；the human B-cell hybridomatechnique[Kosbor et al.，Immunol Today 472(1983)；Coteet al.，Proc Natl Acad Sci(USA)802026-2030(1983)；Brodeuret al.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)]and theEBV-hybridoma technique[Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R Liss Inc，NewYork N.Y.，pp 77-96，(1985)]中描述的雜交瘤方法制備單克隆抗體。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生與Ang-2多肽反應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
            
當(dāng)使用雜交瘤技術(shù)時，可以使用骨髓瘤細(xì)胞系。所述適用于生產(chǎn)雜交瘤的融合程序的細(xì)胞系優(yōu)選不產(chǎn)生抗體，具有高融合效率，并且由于缺乏酶而使得它們不能在僅僅支持所需的融合細(xì)胞(雜交瘤)生長的某些選擇性培養(yǎng)基中生長。例如，用于小鼠融合的細(xì)胞系為Sp-20，P3-X63/Ag8，P3-X63-Ag8.653，NSI/I.Ag 4 1，Sp210-Ag14，F(xiàn)O，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XXO Bul，用于大鼠融合的細(xì)胞系為R210.RCY3，Y3-Ag 1.2.3，IR983F和4B210。其它適用于細(xì)胞融合的細(xì)胞系為U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMy2和UC729-6。考慮雜交瘤和其它產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞系為本發(fā)明的新組合物。
            
也可使用噬菌體展示技術(shù)從任何物種產(chǎn)生單克隆抗體。優(yōu)選地，該技術(shù)用于產(chǎn)生完全的人抗體，其中編碼單Fab或Fv抗體片段的多核苷酸在噬菌體顆粒的表面上表達(dá)。[Hoogenboom et al.，J Mol Biol227381(1991)；Marks et al.，J Mol Biol 222581(1991)；也見美國專利No.5,885,793]]?？梢允褂眠@里描述的結(jié)合測定“篩選”每個噬菌體，以鑒定那些具有Ang-2親和性的抗體片段。因此，這些方法通過在絲狀噬菌體的表面展示抗體片段所有組成成分而模擬免疫選擇，并且隨后通過它們與Ang-2的結(jié)合選擇噬菌體。一種這樣的方法描述于以Adams等的名義提交的PCT申請PCT/US98/17364，該申請描述了使用這樣的方法分離MPL-和msk-受體的高親和性和功能性激動抗體片段。在該方法中，按照以前的描述[Mullinax et al.，Proc Natl Acad Sci(USA)878095-8099(1990)]，可以通過從外周血淋巴細(xì)胞克隆天然重排的人V基因而產(chǎn)生完全的人抗體所有組成成分的基因。
            
一旦鑒定了編碼本發(fā)明的全長單克隆抗體的每條鏈或Fab或Fv片段的多核苷酸序列，可以采用公知的重組技術(shù)和本領(lǐng)域的常規(guī)實踐，使用真核或原核宿主細(xì)胞表達(dá)單克隆抗體多核苷酸?；蛘?，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，其中編碼所需特異結(jié)合劑的多核苷酸被導(dǎo)入受體動物，例如，小鼠，兔，山羊或牛，采用的方式允許編碼單克隆抗體或其它特異結(jié)合劑的多核苷酸分子表達(dá)。一方面，可以將編碼單克隆抗體或其它特異結(jié)合劑的多核苷酸連接至哺乳動物特異性調(diào)節(jié)序列，并且嵌合多核苷酸可以被導(dǎo)入靶動物的生殖系。得到的轉(zhuǎn)基因動物然后在其乳中產(chǎn)生需要的抗體[Pollock et al.，J Immunol Meth 231147-157(1999)；Little et al.，Immunol Today 8364-370(2000)]。此外，通過用編碼單克隆抗體或其它特異結(jié)合劑的多核苷酸轉(zhuǎn)染適當(dāng)植物，使用植物表達(dá)并且產(chǎn)生Ang-2特異結(jié)合劑如單克隆抗體。
            
在本發(fā)明的另一種實施方案中，來源于人之外的物種的單克隆或多克隆抗體或其片段可以是“人源化的”或“嵌合的”。對非人抗體進(jìn)行人源化的方法是本領(lǐng)域公知的(見美國專利5,859,205，5,585,089，和5,693,762)。例如，人源化是利用本領(lǐng)域描述的方法[Jones et al.，Nature 321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 2391534-1536(1988)]，通過用人抗體的相應(yīng)區(qū)域取代如嚙齒動物的互補決定區(qū)(CDRs)的至少一部分而進(jìn)行的。如此處所討論和本領(lǐng)域所公知，本發(fā)明還提供了這些人抗體的變體和衍生物。
            
本發(fā)明還包括結(jié)合Ang-2多肽的完全的人抗體，及其片段、變體和/或衍生物。可以使用此處描述的噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生所述抗體?；蛘撸梢允褂迷诓划a(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的情況下能夠產(chǎn)生人抗體的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)產(chǎn)生所述抗體。這可以通過用Ang-2抗原或其片段免疫動物而完成，其中Ang-2片段具有Ang-2獨特的氨基酸序列。所述免疫原可以任選與載體偶聯(lián)。見，例如，Jakobovits et al.，Proc Natl Acad Sci(USA)，902551-2555(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno，733(1993)。在一種方法中，所述轉(zhuǎn)基因動物是通過使編碼其中的重鏈和輕鏈免疫球蛋白的內(nèi)源性基因座失去功能，并且將編碼人重鏈和輕鏈蛋白的基因座插入其基因組而制備。然后將具有少于這些完整的修飾的部分修飾的動物進(jìn)行雜交以獲得具有所有所需的免疫系統(tǒng)修飾的動物。當(dāng)施用免疫原時，這些轉(zhuǎn)基因動物能夠產(chǎn)生具有人可變區(qū)的抗體，包括人(而不是，例如鼠)的氨基酸序列，它們對于所需的抗原是免疫特異性的。見PCT申請PCT/US96/05928和PCT/US93/06926。其它方法描述于美國專利5,545,807，PCT申請PCT/US91/245，PCT/GB89/01207，以及EP546073B1和EP546073A1。也可以如此處所述，通過在宿主或者通過在此處所描述的雜交瘤細(xì)胞中表達(dá)重組DNA而產(chǎn)生人抗體。
            
轉(zhuǎn)基因是通過很多不同的途徑完成的。見，例如，Bruggeman et al.，Immunol Today 17391-7(1996)。在一種方法中，構(gòu)建一種微基因座，這樣，人工使得種系構(gòu)型中的基因片段彼此接近。由于大小限制(即一般小于30kb)，得到的微基因座將含有有限數(shù)量的不同基因片段，但仍然能夠產(chǎn)生抗體的大的所有組成成分。僅僅含有人DNA序列，包括啟動子和增強(qiáng)子的微基因座在轉(zhuǎn)基因小鼠中是完全有功能的。
            
當(dāng)在轉(zhuǎn)基因動物中需要更大數(shù)目的基因片段時，使用酵母人工染色體(YACs)。YACs可以從數(shù)十萬堿基到1Mb，并且通過直接微量注射到卵中或者通過將YAC轉(zhuǎn)移到胚胎干(ES)細(xì)胞系中而導(dǎo)入小鼠(或其它適當(dāng)?shù)膭游?基因組。一般地，通過純化DNA的脂轉(zhuǎn)染或酵母原生質(zhì)球融合而將YACs轉(zhuǎn)移到ES細(xì)胞中，其中純化的DNA攜帶于微團(tuán)中，并且以類似于雜交瘤融合程序的方式進(jìn)行融合。在DNA轉(zhuǎn)移之后選擇所需的ES細(xì)胞是通過在YAC上引入本領(lǐng)域公知的任何選擇標(biāo)記而完成的。
            
作為另一種選擇，使用在細(xì)菌大腸桿菌宿主中擴(kuò)增的噬菌體P1載體。盡管這些載體比YAC攜帶更少的插入的DNA，這些克隆容易以足夠高的產(chǎn)率生長，以便允許直接微量注射到小鼠卵中。已經(jīng)證明使用不同P1載體的混合物可以導(dǎo)致高水平的同源重組。
            
一旦已經(jīng)使用本領(lǐng)域公知的任何檢測循環(huán)抗體的血清水平的技術(shù)(如ELISA)鑒定了適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因小鼠(或其它適當(dāng)?shù)膭游?，將轉(zhuǎn)基因動物與其中的內(nèi)源Ig基因座被破壞的小鼠雜交。該結(jié)果提供了其中基本上所有的B細(xì)胞都表達(dá)人抗體的后代。
            
作為另一種選擇，用人Ig基因座置換完整的動物Ig基因座，其中得到的動物僅僅表達(dá)人抗體。在另一種方法中，用人基因座中的特定和相應(yīng)區(qū)域置換動物基因座的部分。在某些情況下，從該程序得到的動物可以表達(dá)與完全的人抗體不同的嵌合抗體，這取決于小鼠Ig基因座中置換的性質(zhì)。
            
也可以通過體外將人脾細(xì)胞(B或T細(xì)胞)暴露于抗原，然后在免疫受損的小鼠如SCID或nod/SCID中重建暴露的細(xì)胞而產(chǎn)生人抗體。見Brams et al.，J Immunol，1602051-2058；Carballidoet al.，Nat Med，6103-106。在一種方法中，將人胎組織移植到SCID小鼠(SCID-hu)中，導(dǎo)致長期造血和人T細(xì)胞發(fā)育[McCuneet al.，Science 2411532-1639(1988)；Ifversen et al.，SemImmunol 8243-248(1996)]。這些嵌合小鼠中的任何體液免疫應(yīng)答完全依賴于這些動物中T細(xì)胞的共發(fā)育[Martensson et al.，Immunol831271-179(1994)]。在一種可選擇的方法中，將人外周血淋巴細(xì)胞腹膜內(nèi)(或其它方式)移植到SCID小鼠中[Mosier et al.，Nature 335256-259(1988)]。當(dāng)用激發(fā)劑，如葡萄球菌外毒素A(SEA)[Martensson et al.，Immunol 84224-230(1995)]，或抗人CD40單克隆抗體[Murphy et al.，Blood 861946-1953(1995)]處理移植細(xì)胞時，檢測到了更高水平的B細(xì)胞產(chǎn)生。
            
或者，通過組裝每個人VH片段和隨機(jī)核苷酸的D片段以及人J片段從未重排的V基因片段產(chǎn)生完全合成的人重鏈所有組成成分[Hoogenboom et al.，J Mol Biol 227381-388(1992)]。同樣，通過組合每個人V片段和J片段構(gòu)建輕鏈所有組成成分[Griffiths etal.，EMBO J 133245-3260(1994)]。將編碼完整抗體(即重鏈和輕鏈)的核苷酸作為單鏈Fv片段連接，并且將該多核苷酸與編碼絲狀噬菌體小外被蛋白的核苷酸連接。當(dāng)在噬菌體表面表達(dá)該融合蛋白時，通過使用固定抗原進(jìn)行選擇而鑒定編碼特異性抗體的多核苷酸。
            
在另一種方法中，通過使一條鏈與噬菌體蛋白融合，并且將另一條鏈分泌到細(xì)菌周質(zhì)中而將抗體片段組裝為兩個Fab片段[Hoogenboomet al.，Nucl Acids Res 194133-4137；Barbas et al.，ProcNatl Acad Sci(USA)887978-7982(1991)]。
            
一般通過重組方法產(chǎn)生嵌合的、人源化的、CDR嫁接的和完全的人抗體或其片段。可以用此處描述的材料和方法將編碼每種抗體的重鏈和輕鏈或其片段的多核苷酸分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞并且進(jìn)行表達(dá)。在一種優(yōu)選實施方案中，所述抗體在哺乳動物宿主細(xì)胞，如CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。所述產(chǎn)生的詳細(xì)內(nèi)容描述于下文。
            
特異結(jié)合劑的融合配偶體在本發(fā)明的另一實施方案中，包含Ang-2抗體可變區(qū)，如具有此處描述的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)或具有此處描述的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的多核苷酸可以在N末端或C末端與人IgG的Fc區(qū)的一個或多個結(jié)構(gòu)域融合。當(dāng)與一種治療蛋白，如Ang-2特異性抗體的Fab一起構(gòu)建時，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域可以提供更長的半壽期，或者摻入Fc受體結(jié)合、蛋白A結(jié)合、補體固定以及可能甚至是胎盤轉(zhuǎn)移等功能[Capon et al.，Nature，337525-531(1989)]。
            
在一個例子中，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，可以在抗Ang-2 Fab或Fv片段等特異結(jié)合劑多肽(例如從噬菌體展示文庫獲得)的N末端或C末端融合抗體鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。可以使用蛋白A或蛋白G親和柱純化得到的融合蛋白。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)融合于Fc區(qū)的肽和蛋白與未融合的對應(yīng)物相比表現(xiàn)出顯著更長的體內(nèi)半壽期。同樣，與Fc區(qū)的融合允許融合多肽的二聚化/多聚化。Fc區(qū)可以是天然存在的Fc區(qū)，或者可以經(jīng)改變而改進(jìn)某些質(zhì)量，如治療質(zhì)量、循環(huán)時間、減少聚集問題等。本領(lǐng)域公知的其它例子包括以下這些，其中可以來自于人或其它物種或可以是合成的Fc區(qū)與CD30L的N末端融合以治療霍奇金病、退行性淋巴瘤和T細(xì)胞白血病(美國專利5,480,981)，F(xiàn)c區(qū)與TNF受體融合以治療膿毒性休克[Fisher et al.，N Engl J Med，3341697-1702(1996)]，F(xiàn)c區(qū)與Cd4受體融合以治療AIDS[Capon et al.，Nature，337525-31(1989)]。
            
催化抗體是另一種類型的融合分子，并且包括一種或多種細(xì)胞毒性部分或更普遍的是一種或多種生物活性部分連接的抗體，所述抗體與特異結(jié)合劑連接。見，例如[Rader et al.，Chem Eur J 122091-2095(2000)]。該類型的細(xì)胞毒性劑改進(jìn)抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，并且包括直接或間接刺激細(xì)胞死亡的細(xì)胞因子、放射性同位素、化療藥物(包括藥物前體)、細(xì)菌毒素(如假單孢菌外毒素、白喉毒素等)、植物毒素(如蓖麻毒蛋白、gelonin等)、化學(xué)偶聯(lián)物(如maytansinoid毒素，calechaemicin等)、放射性偶聯(lián)物、酶偶聯(lián)物(RNA酶偶聯(lián)物、抗體定位的酶/藥物前體治療[ADEPT])等部分。一方面，細(xì)胞毒性劑可以通過將該試劑結(jié)合于抗體上的一種可選擇的抗原識別位點而“連接”于雙特異性或多特異性抗體的一種成分。作為一種選擇，可以在將編碼毒素的多核苷酸連接于編碼結(jié)合劑的多核苷酸之后將蛋白毒素表達(dá)為與特異結(jié)合劑的融合蛋白。在另一種選擇中，可以共價修飾特異結(jié)合劑以包括需要的細(xì)胞毒素。
            
所述融合蛋白的例子是免疫原性多肽、具有長循環(huán)半壽期的蛋白，如免疫球蛋白恒定區(qū)、標(biāo)記蛋白、促進(jìn)所需特異性結(jié)合劑多肽純化的蛋白或多肽，以及促進(jìn)多聚蛋白(如用于二聚體形成/穩(wěn)定性的亮氨酸拉鏈基序)形成的多肽序列。
            
這種類型的插入性變體通常具有天然分子的所有或大部分，在N或C末端連接于第二種多肽的所有或一部分。例如，融合蛋白一般使用來自其它物種的前導(dǎo)序列，以便允許蛋白在異源宿主中的重組表達(dá)。另一種有用的融合蛋白包括添加免疫學(xué)活性結(jié)構(gòu)域，如抗體表位，以便促進(jìn)融合蛋白的純化。在融合蛋白的結(jié)合處或其附近引入裂解位點將促進(jìn)在純化后去除外源性多肽。一種有用的融合包括連接功能性結(jié)構(gòu)域如酶的活性位點、糖基化位點、細(xì)胞導(dǎo)向信號或跨膜區(qū)。
            
這種類型的插入變體一般具有在N-或C-末端與第二多肽的全部或部分連接的天然分子的全部或大部分。例如，融合蛋白一般使用來自其他物種的前導(dǎo)序列以允許在異源宿主中重組表達(dá)蛋白質(zhì)。另一種有用的融合蛋白包括免疫活性結(jié)構(gòu)域例如抗體表位的加入，以有利于融合蛋白的純化。融合連接處或附近裂解位點所包含的會有利于在純化之后去除外來多肽。其他有用的融合物包括功能結(jié)構(gòu)域的連接，例如來自酶的活性位點，糖基化結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞定向信號或跨膜區(qū)。
            
有很多可以在本發(fā)明中使用的商售融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)。特別有用的系統(tǒng)包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)系統(tǒng)(Pharmacia)，麥芽糖結(jié)合蛋白系統(tǒng)(NEB，Beverley，Mass.)，F(xiàn)LAG系統(tǒng)(IBI，New Haven，Conn.)，和6xHis系統(tǒng)(Qiagen，Chatsworth，Calif.)。這些系統(tǒng)能產(chǎn)生只帶有少數(shù)附加氨基酸的重組肽和/或抗體，這少數(shù)附加氨基酸不可能顯著重組多肽抗原能力。例如，F(xiàn)LAG系統(tǒng)和6xHis系統(tǒng)只加入短序列，已知這兩種系統(tǒng)免疫原性不好并且不會不利地影響多肽折疊成它的天然構(gòu)象。另一種有用的N-末端融合體是蛋白質(zhì)或肽的N-末端區(qū)Met-Lys二肽的融合體。這樣的融合體可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)表達(dá)或活性的有利的提高。
            
一種特別有用的融合構(gòu)建體可以是其中特異結(jié)合劑肽與半抗原融合以增強(qiáng)特異結(jié)合劑融合構(gòu)建體的免疫原性的那種，所述特異結(jié)合劑融合構(gòu)建體可以用于例如產(chǎn)生本發(fā)明的抗獨特型抗體。所述融合構(gòu)建體增加免疫原性是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如，特異結(jié)合劑與輔助抗原如hsp70，或例如來自白喉毒素鏈的肽序列，或細(xì)胞因子如IL-2的融合體可以用于激發(fā)免疫應(yīng)答。在另一種實施方案中，可以制備增強(qiáng)抗原結(jié)合劑組合物導(dǎo)向于特定位點或細(xì)胞。
            
也考慮其它融合構(gòu)建體，它包括具有所需特性，如延長血清半壽期的IgG恒定區(qū)或用于導(dǎo)向的抗體或其片段的異源多肽。其他融合體系產(chǎn)生多肽雜合體，其中期望從期望的肽或抗體切除融合配偶體。在一個實施方案中，融合配偶體通過含有蛋白酶的特異識別序列的肽序列與重組抗體連接。合適的序列的例子是煙草Etch病毒蛋白酶(LifeTechnologies，Gaithersburg，Md.)或因子Xa(New EnglandBiolabs，Beverley，Mass.)識別的那些。
            
本發(fā)明還提供了融合多肽，其包括與截短的組織因子(tTF)組合的Ang-2抗體的可變區(qū)的全部或部分，如具有此處描述的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)或具有此處描述的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，TTF是由作為腫瘤血管凝固劑發(fā)揮作用的人血凝固-誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的截短形式構(gòu)成的血管靶向劑，如美國專利Nos.5,877,289；6,004,555；6,132,729；6,132,730；6,156,321；和歐洲專利No.EP 0988056所述。TTF與抗-Ang-2抗體或肽，或者其片段的融合有利于抗-Ang-2向靶細(xì)胞的送遞。
            
特異結(jié)合劑的變體本發(fā)明的特異性結(jié)合劑的變體包括插入，缺失，和/或取代變體。在本發(fā)明的一個方面，提供了插入變體，其中一個或多個氨基酸殘基補充了特異結(jié)合劑氨基酸序列。插入可以位于氨基酸蛋白的一端或兩端，或者可以位于特異結(jié)合劑氨基酸序列的內(nèi)部區(qū)域。在一個末端或者兩個末端有附加殘基的插入變體能包括，例如，包括氨基酸標(biāo)記或標(biāo)記的融合蛋白和蛋白質(zhì)。插入變體特異結(jié)合劑多肽，其中將一個或多個氨基酸殘基添加到特異結(jié)合劑氨基酸序列，或其片段。
            
本發(fā)明的變體產(chǎn)物還包括成熟的特異結(jié)合劑產(chǎn)物。所述特異結(jié)合劑產(chǎn)物去除了前導(dǎo)序列或信號序列，得到的蛋白質(zhì)與野生型Ang-2多肽相比有附加的氨基末端殘基。附加的氨基末端殘基可以來源于另一種蛋白，或可以包括一個或多個不能鑒定為來自于特定蛋白的殘基。包括氨基酸位置-1有附加的甲硫氨酰殘基的特異性結(jié)合劑(Met-1-特異結(jié)合劑)，這些是在位置-2和-1有附加的甲硫氨酸和賴氨酸殘基(Met-2Lys-1-特異結(jié)合劑)的特異性結(jié)合劑產(chǎn)物。有附加的Met，Met-Lys，Lys殘基(或一個或多個堿性殘基，一般地)的變體特別用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中提高重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)。
            
本發(fā)明還包括使用特異表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的具有附加的額氨基酸殘基的特異性結(jié)合劑。例如，使用表達(dá)作為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合產(chǎn)物的一部分的期望的多肽的商售載體提供從期望的多肽裂解GST成分之后在氨基酸位置-1具有附加的甘氨酸殘基的期望的多肽。也包括在其他載體系統(tǒng)表達(dá)得到的變體，包括其中一般在序列的羧基和/或氨基末端向氨基酸序列中插入聚組氨酸標(biāo)記的那些。
            
插入變體還包括上文所述的融合蛋白，其中特異結(jié)合劑多肽的氨基和/或羧基末端與另一個多肽，其片段或者一般沒有識別是任何特異蛋白質(zhì)序列的一部分的氨基酸融合。
            
另一方面，本發(fā)明提供缺失變體，其中特異結(jié)合劑多肽中一個或多個氨基酸殘基被去除。從特異結(jié)合劑多肽的一個或兩個末端進(jìn)行缺失，或者在抗體氨基酸序列中去除一個或多個殘基。缺失變體必須包括特異結(jié)合劑多肽的所有的片段。
            
抗體片段包括結(jié)合于抗原多肽上的表位的抗體部分。所述片段的例子包括Fab和F(ab′)2片段，它們例如是通過全長抗體的酶促或化學(xué)裂解產(chǎn)生的。其它結(jié)合片段包括通過重組DNA技術(shù)，如含有編碼抗體可變區(qū)的核酸序列的重組質(zhì)粒的表達(dá)等產(chǎn)生的那些。本發(fā)明還包括Ang-2結(jié)合劑的多肽片段，其中所述片段維持了特異性結(jié)合Ang-2多肽的能力。此處也包括含有本發(fā)明的肽或多肽的至少5，10，15，20，25，30，35，40，45或50個連續(xù)氨基酸的片段。優(yōu)選的多肽片段顯示出本發(fā)明的抗原結(jié)合劑獨特或特異的免疫學(xué)特性?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知和常規(guī)實踐的任何方法制備具有所需免疫學(xué)特性的本發(fā)明的片段。
            
另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的特異結(jié)合劑的取代變體。一般認(rèn)為取代變體與原來的多肽“相似”，或者與原來的多肽具有一定的“同一性百分比”，并且包括其中多肽的一個或多個氨基酸殘基被去除并且由其它殘基置換的多肽。一方面，取代作用性質(zhì)是保守的，但是本發(fā)明包括也是不保守的取代作用。
            
通過公知的方法能容易地計算相關(guān)的多肽的同一性和相似性。這樣的方法包括但不限于下面文獻(xiàn)描述的那些ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，編著，Oxford University Press，New York(1988)；BiocomputingInformatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，編著，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，編著，Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，編著，M.Stockton Press，New York(1991)；和Carillo等，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)。
            
設(shè)計測定兩個多肽的相關(guān)性或同一性百分比的優(yōu)選方法，得到測試序列之間的最大匹配。公眾能夠得到的計算機(jī)程序中描述了測定同一性的方法。測定兩個序列之間的同一性的優(yōu)選的計算機(jī)程序方法包括但不限于，GCG程序包，包括GAP(Devereux等，Nucl.Acid.Res.，12387(1984)；Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，WI，BLASTP，BLASTN，和FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.，215403-410(1990))。公眾從the NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)和其他來源(BLASTManual，Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda，Md.20894；Altschul等，上文(1990))能獲得BLASTX程序。也可以使用公知的SmithWaterman算法來測定同一性。
            
用于將兩個氨基酸序列比對的一些比對方案可以導(dǎo)致兩個序列只有一個短的區(qū)匹配，這個小的比對區(qū)可以具有非常高的序列同一性，即使兩個全長序列之間沒有顯著相關(guān)性。因此，在一些實施方案中，選擇的比對方法(GAP程序)可以導(dǎo)致跨距至少是比較的靶多肽全長的10％對齊，即，比較至少400個氨基酸序列時至少40個連續(xù)的氨基酸，比較至少300至大約400個氨基酸序列時至少30個連續(xù)的氨基酸，比較至少300至大約400個氨基酸序列時至少30個連續(xù)的氨基酸，比較200至大約300個氨基酸序列時至少20個連續(xù)的氨基酸，比較大約100至200個氨基酸序列時至少10個連續(xù)的氨基酸。
            
例如，利用計算機(jī)算法GAP(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.)，將要測定序列同一性百分比的兩個多肽對它們各個氨基酸進(jìn)行最佳匹配比對(″匹配跨度″，根據(jù)算法確定)。在一些實施方案中，空位罰分(一般計算為3X平均對角線；″平均對角線″是使用的比較矩陣的對角線的平均值；″對角線″是特定比較矩陣分配給每一個完全氨基酸匹配的分?jǐn)?shù)或數(shù)目)和空位延長罰分(它通常是空位罰分的1/10倍)，并且與算法聯(lián)合使用象PAM250或BLOSUM 62這樣的比較矩陣。在一些實施方案中，算法還使用標(biāo)準(zhǔn)比較矩陣(關(guān)于PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等，Atlas ofProtein Sequence and Structure，5(3)(1978)；關(guān)于BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，8910915-10919(1992))。
            
在一些實施方案中，多肽序列比較參數(shù)包括如下算法Needleman等，J.Mol.Biol.，48443-453(1970)；比較矩陣上文Henikoff等(1992)的BLOSUM 62；空位罰分12空位延長罰分4相似性閾值0使用上述參數(shù)的GAP程序是有用的。在一些實施方案中，使用GAP算法，上述參數(shù)對于多肽比較是默認(rèn)參數(shù)(對于末端空位沒有罰分)。
            
在一些實施方案中，對于多核苷酸分子序列(與氨基酸序列相對應(yīng))的參數(shù)包括如下算法Needleman等，上文(1970)；比較矩陣匹配＝+10，錯配＝0空位罰分50空位延長罰分3使用上述參數(shù)的GAP程序也是有用的。上述參數(shù)對于多核苷酸分子比較是默認(rèn)參數(shù)。
            
其他例舉的算法，空位罰分，空位延長罰分，比較矩陣，相似性閾值等也可以使用Program Manual，Wisconsin Package，第9版，1997年9月中提出的那些。進(jìn)行的具體選擇對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的并且取決于要進(jìn)行的具體比較，例如DNA-與-DNA，蛋白質(zhì)-與-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-與-DNA；另外，比較是否在給定序列對之間(其中一般優(yōu)選GAP或BestFit)或者在一個序列和一個序列的大數(shù)據(jù)庫之間(其中FASTA或BLASTA是優(yōu)選的)。
            
如這里使用的，按常規(guī)使用20種常見氨基酸和它們的縮寫。參見Immunology-A Synthesis(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，這里為了所有的目的引作參考。
            
氨基酸可以具有L或D立體化學(xué)(除了Gly之外，其即不是L也不是D)，并且本發(fā)明的多肽和成分可以包括立體化學(xué)的混合物。但是，L立體化性是優(yōu)選的。本發(fā)明還提供了反向分子，其中氨基酸的氨基末端至羧基末端序列是反向的。例如，具有正常序列X1-X2-X3的分子的反向應(yīng)該是X3-X2-X1。本發(fā)明還提供了逆-反向分子，其中，如上所述，氨基酸的氨基末端至羧基末端序列是反向的，并且一般的″L″對映異構(gòu)體的殘基被改變?yōu)椤錎″立體異構(gòu)型。
            
二十種常見氨基酸的立體異構(gòu)體(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸，例如[α]-，[α]-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，和其他非常見氨基酸也是本發(fā)明的多肽的合適的成分。非常見氨基酸的例子包括但不限于氨基脂肪酸，β-丙氨酸，β-氨基丙酸，氨基丁酸，哌啶酸，氨基癸酸，氨基庚酸，氨基異丁酸，氨基庚二酸，二氨基丁酸，鎖鏈素，二氨基庚二酸，二氨基丙酸，N-乙基甘氨酸，N-乙基天冬酰胺，羥基賴氨酸，異-羥基賴氨酸，羥基脯氨酸，異鎖鏈素，異-異亮氨酸，N-甲基甘氨酸，肌氨酸，N-甲基異亮氨酸，N-甲基纈氨酸，新纈氨酸，正亮氨酸，鳥氨酸，4-羥基脯氨酸，[γ]-羧基谷氨酸，[ε]-N，N，N-三甲基賴氨酸，[ε]-N-乙?；嚢彼幔琌-磷酸絲氨酸，N-乙?；z氨酸，N-甲?；琢虬彼?，3-甲基組氨酸，5-羥基賴氨酸，[σ]-N-甲基精氨酸，和其他相似氨基酸和氨基酸(例如，4-羥基脯氨酸)。
            
類似地，除非具體說明，單鏈多核苷酸序列的左手端是5′端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向指為5′方向。初始RNA轉(zhuǎn)錄本的5′至3′加入方向稱作轉(zhuǎn)錄方向；和RNA具有相同序列并且是RNA轉(zhuǎn)錄本的5′至5′端的DNA鏈上的序列區(qū)稱作″上游序列″；和RNA具有相同序列并且是RNA轉(zhuǎn)錄本的3′至3′端的DNA鏈上的序列區(qū)稱作″下游序列″。
            
保守性氨基酸取代可以包括非天然存在的氨基酸殘基，它們一般是通過化學(xué)肽合成，而不是通過在生物系統(tǒng)中合成而摻入的。這些包括肽模擬物和氨基酸部分的反向或插入形式。
            
天然存在的殘基可以根據(jù)它們共同的側(cè)鏈性質(zhì)分為幾類1)疏水性Met，Ala，Val，Leu，Ile；2)中性疏水性Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；3)酸性Asp，Glu；4)堿性His，Lys，Arg；5)影響鏈取向的殘基Gly，Pro；和6)芳香Trp，Tyr，Phe。
            
例如，非保守性取代可以包括將這些類中的一個變化為另一類中的一個。所述取代的殘基可以引入人抗體中與非人抗體同源的區(qū)域，或者引入分子的非同源區(qū)。
            
根據(jù)一些實施方案，進(jìn)行這樣的變化時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)(hydropathic index)。以氨基酸的疏水性和電荷特征為基礎(chǔ)對各種氨基酸指派親水指數(shù)。它們是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
            
本領(lǐng)域知曉氨基酸親水指數(shù)在對蛋白質(zhì)帶來相互影響的生物學(xué)功能中的重要性。Kyte等，J.Mol.Biol.，157105-131(1982)。已知某些氨基酸可以被具有相似親水指數(shù)或分?jǐn)?shù)的另外的氨基酸取代而仍然保留相似的生物活性。在根據(jù)親水指數(shù)進(jìn)行變化中，在一些實施方案中，包括親水指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸取代。在一些實施方案中，包括親水指數(shù)在±1之內(nèi)的那些，在一些實施方案中，包括親水指數(shù)在±0.5之內(nèi)的那些。
            
本領(lǐng)域還知曉，以親水性為基礎(chǔ)能有效地進(jìn)行類似氨基酸的取代，特別是在由此產(chǎn)生的生物功能抗體或肽是為了在免疫實施方案中應(yīng)用的情況下，本發(fā)明情況就是如此。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)最大局部平均親水性，這由其相鄰氨基酸的親水性支配，與它的免疫原性和抗原性相關(guān)，即，與蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)。
            
對這些氨基酸殘基指定下面的親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬氨酸(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)在根據(jù)相似親水性值進(jìn)行改變中，在一些實施方案中，包括其親水性值在±2之內(nèi)的氨基酸取代。在一些實施方案中，包括親水性值在±1之內(nèi)的那些，在一些實施方案中，包括親水性值在±0.5之內(nèi)的那些。人們以親水性為基礎(chǔ)還可以鑒定主要氨基酸序列中的表位。這些區(qū)也稱作″表位核心區(qū)″。
            
下面表1中給出例示的氨基酸取代作用。
            
表1氨基酸取代作用 
            
應(yīng)用公知的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定這里給出的多肽的合適的變體。在一些實施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過定位據(jù)信對于活性不是重要的區(qū)而可以鑒定可以改變而不破壞活性的分子的合適的區(qū)。在一些實施方案中，人們能鑒定在相似肽或多肽中保守的分子的殘基和部分。在一些實施方案中，即使對生物活性或者對結(jié)構(gòu)是重要的區(qū)也可以進(jìn)行保守性氨基酸取代而不破壞生物學(xué)活性或者不會不利地影響多肽結(jié)構(gòu)。
            
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員能進(jìn)行對相似多肽鑒定對于活性或結(jié)構(gòu)重要的殘基的結(jié)構(gòu)-功能研究?？紤]這樣的比較，人們能預(yù)測蛋白質(zhì)中相應(yīng)于相似蛋白質(zhì)中對于活性或結(jié)構(gòu)重要的氨基酸殘基的氨基酸殘基的重要性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇對于這樣預(yù)測的重要的氨基酸殘基的化學(xué)類似氨基酸取代作用。
            
本領(lǐng)域技術(shù)人員還能分析與相似多肽中的結(jié)構(gòu)相關(guān)的三維結(jié)構(gòu)和氨基酸序列。考慮這樣的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對抗體預(yù)測有關(guān)其三維結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基比對。在一些實施方案中，既然這樣的殘基可能在與其他分子的重要的相互作用中涉及，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇不對預(yù)測在蛋白質(zhì)表面上的氨基酸殘基產(chǎn)生根本變化。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得在各個期望的氨基酸殘基處包含單一氨基酸取代的試驗變體。然后利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的活性測定能對變體進(jìn)行篩選。這樣的變體可以被用來收集有關(guān)合適的變體的信息。例如，如果有人發(fā)現(xiàn)對特定氨基酸殘基的改變導(dǎo)致活性破壞，不期望的降低，或者不適活性，可以避免有這樣改變的變體。換句話說，根據(jù)從這樣的常規(guī)實驗收集的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地確定應(yīng)該單獨地或與其他突變組合地避免進(jìn)一步的取代作用的氨基酸。
            
很多科學(xué)出版物致力于二級結(jié)構(gòu)的判斷。參見，Moult J.，Curr.Op.Biotech.，7(4)422-427(1996)，Chou等，Biochemistry，13(2)222-245(1974)；Chou等，Biochemistry，113(2)211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，4745-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem.，47251-276和Chou等，Biophys.J.，26367-384(1979)。此外，目前可獲得輔助判斷二級結(jié)構(gòu)的計算機(jī)程序。一種二級結(jié)構(gòu)判斷方法是以同源性模型為基礎(chǔ)的。例如，具有大于30％序列同一性的，或者大于40％相似性的兩個多肽或蛋白質(zhì)常常具有相似的結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué)。近來蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的增長(PDB)為二級結(jié)構(gòu)提供了提高的可預(yù)測性，包括多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中可能的折疊數(shù)目。參見Holm等，Nucl.Acid.Res.，27(1)244-247(1999)。有人提出(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)369-376(1997))一種給定多肽或蛋白質(zhì)有有限數(shù)目的折疊，而且一旦明了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)數(shù)目，結(jié)構(gòu)預(yù)測將變得大大地更加精確。
            
確定二級結(jié)構(gòu)的另外的方法包括″threading″(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)377-87(1997)；Sippl等，Structure，4(1)15-19(1996))，″曲線分析″(Bowie等，Science，253164-170(1991)；Gribskov等，Meth.Enzym.，183146-159(1990)；Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13)4355-4358(1987))，和″改良鍵合″(參見Holm，上文(1999)，和Brenner，上文(1997))。
            
在一些實施方案中，抗體變體包括糖基化變體，其中與原多肽的氨基酸序列相比，改變了糖基化位點的數(shù)目和/或類型。在某些實施方案中，蛋白變體包含比天然蛋白更多或更少的N-連接的糖基化位點。一種N-連接的糖基化位點特征在于序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定為X的氨基酸殘基可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸殘基。對構(gòu)成該序列的氨基酸殘基的取代或加入提供加入N-連接的糖鏈的可能的新的位點?；蛘撸梢匀コ撔蛄械娜〈饔脮コ延械腘-連接的糖鏈。還提供了N-連接的糖鏈的重排，其中一個或多個N-連接的糖基化位點(一般是天然存在的那些)被去除并且產(chǎn)生一個或多個新的N-連接的位點。其它優(yōu)選的抗體變體包括半胱氨酸變體，其中與原氨基酸序列相比，缺失了一個或多個半胱氨酸殘基，或者用另一種氨基酸(如絲氨酸)取代。當(dāng)例如在分離不溶的包含體之后將抗體重新折疊為生物活性構(gòu)象時，半胱氨酸變體可以是有用的。半胱氨酸變體一般比天然蛋白的半胱氨酸數(shù)目少，并且一般為偶數(shù)，以減少未配對半胱氨酸導(dǎo)致的相互作用。
            
根據(jù)某些實施方案，氨基酸取代(1)減少對蛋白水解的易感性，(2)減少對氧化的易感性，(3)改變對形成蛋白復(fù)合物的結(jié)合親和力，(4)改變結(jié)合親和力，和/或(5)賦予或修飾所述多肽上的其它功能特性。根據(jù)某些實施方案，可以在天然存在的序列中(在某些實施方案中，在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外的多肽部分)進(jìn)行單個或多個氨基酸取代(在某些實施方案中，保守氨基酸取代)。在某些實施方案中，保守氨基酸取代一般不會顯著改變母體序列的結(jié)構(gòu)特征)如取代氨基酸不應(yīng)該破壞母體序列中的螺旋，或破壞作為母體序列特征的其它類型的二級結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域公知的多肽二級和三級結(jié)構(gòu)的例子描述于Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；andThornton et at.Nature 354105(1991)。
            
作為多肽或肽取代變體的本發(fā)明的特異結(jié)合劑分子中最多可以有大約10-12％的原始氨基酸序列被取代。對于抗體變體，重鏈可以有50，49，48，47，46，45，44，43，42，41，40，39，38，37，36，35，34，33，32，31，30，29，28，27，26，25，24，23，22，21，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，或1個氨基酸被取代，而輕鏈可以有25，24，23，22，21，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，或1個氨基酸被取代。
            
特異結(jié)合劑的衍生物本發(fā)明還提供特異結(jié)合劑多肽的衍生物。衍生物包括具有不同于氨基酸殘基的插入，缺失或取代的修飾的特異結(jié)合劑多肽。優(yōu)選地，修飾作用性質(zhì)是共價的，并且包括例如，與聚合物，脂質(zhì)，其他有機(jī)和無機(jī)部分的化學(xué)鍵合?？梢灾苽涮岣咛禺惤Y(jié)合劑多肽的循環(huán)半壽期的本發(fā)明的衍生物，或者可以設(shè)計提高多肽對期望的細(xì)胞，組織，或器官的定向能力的本發(fā)明的衍生物。
            
本發(fā)明進(jìn)一步包括衍生的結(jié)合劑，被共價修飾而包括一個或多個水溶性聚合物連接，例如聚乙二醇，聚氧乙二醇，或聚丙二醇，描述于美國專利Nos.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；和4,179,337。本領(lǐng)域公知的其他有用的聚合物包括一甲氧基-聚乙二醇，葡聚糖，纖維素或者其他以碳水化合物為基礎(chǔ)的聚合物，聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇，丙二醇均聚物，a聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物，聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇，以及這些聚合物的混合物。特別優(yōu)選的是用聚乙二醇(PEG)亞基共價修飾的特異結(jié)合劑產(chǎn)物。水溶性聚合物可以在特定位置例如在特異結(jié)合劑產(chǎn)物的氨基末端鍵合，或者與多肽的一個或多個側(cè)鏈隨機(jī)連接。2000年10月17日公布的Gonzales等人的美國專利No.6,133,426描述了用于提高對特異性結(jié)合劑，和對于人源化抗體的治療能力的PEG的使用。
            
抗體誘變的靶位點可以使用某些策略操作Ang-2-特異性抗體的固有性質(zhì)，如抗體對其靶的親和力。這些策略包括使用編碼抗體的多核苷酸分子的位點特異性或隨機(jī)誘變而產(chǎn)生抗體變體，然后進(jìn)行設(shè)計用于回收表現(xiàn)出所需改變，如增加或降低的親和力的抗體變體的篩選步驟。
            
誘變策略最常見的靶氨基酸殘基是CDRs的氨基酸殘基。如上文所述，這些區(qū)域含有實際上與Ang-2相互作用的殘基和其它影響這些殘基的空間排列的氨基酸。然而，也已經(jīng)證明CDR區(qū)外的可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)中的氨基酸對抗體的抗原結(jié)合特性有顯著貢獻(xiàn)，并且可以作為操作所述特性的靶。見Hudson，Curr Opin Biotech，9395-402(1999)及其中的參考文獻(xiàn)。
            
可以通過將隨機(jī)或定點誘變限制于CDRs中相當(dāng)于容易在親和力成熟過程中“超變“的區(qū)域的位點而產(chǎn)生更小和更有效篩選的抗體變體文庫。見Chowdhury和Pastan，Nature Biotech，17568-572及其中的參考文獻(xiàn)。已知以此方式確定超變位點的DNA元件的類型包括直接和反向重復(fù)，某些共有序列，二級結(jié)構(gòu)和回文序列。共有DNA序列包括四堿基序列嘌呤-G-嘧啶-A/T(即A或G-G-C或T-A或T)和絲氨酸密碼子AGY(其中Y可以是C或T)。
            
因此，本發(fā)明的一種實施方案包括其目標(biāo)為增加抗體對其靶的親和力的誘變策略。這些策略包括誘變整個可變重鏈和輕鏈，僅僅誘變CDR區(qū)，誘變CDRs中的共有序列超變位點，誘變構(gòu)架區(qū)，或這些方法的任意組合(在此上下文中的“誘變”可以是隨機(jī)或定點的)。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，如X線結(jié)晶學(xué)分辨所討論的抗體和抗體-配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)而完成對CDR區(qū)的確定描繪和包含抗體結(jié)合位點的殘基的鑒定。基于所述抗體晶體結(jié)構(gòu)的分析和表征的各種方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且盡管不能確定，也可以用于估計CDR區(qū)。所述常用方法的例子包括Kabat，Chothia，AbM和接觸限定。
            
Kabat限定是基于序列變異性，并且是最常用的預(yù)測CDR區(qū)的限定。[Johnson and Wu，Nucleic Acids Res，28214-8(2000)]。Chothia限定是基于結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的定位[Chothia et al.，J Mol Biol，196901-17(1986)；Chothia et al.，Nature，342877-83(1989)]。AbM限定是Kabat和Chothia之間的折中。AbM是由OxfordMolecular Group生產(chǎn)的用于抗體結(jié)構(gòu)模擬的完整程序組[Martin etal.，Proc Natl Acad Sci(USA)869268-9272(1989)；Rees，etal.，ABMTM，a computer program for modeling variable regionsof antibodies，Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd.]。AbM程序組采用已知數(shù)據(jù)庫和從頭開始的方法的組合模擬來自一級測序的抗體三級結(jié)構(gòu)。最近引入了稱作接觸限定的其它限定[MacCallum et al.，J Mol Biol，5732-45(1996)]。該限定是基于可獲得的復(fù)雜晶體結(jié)構(gòu)的分析。
            
根據(jù)習(xí)慣，一般將重鏈中的CDR區(qū)稱作H1，H2和H3并且按順序編號，以便從氨基末端向羧基末端計數(shù)。輕鏈中的CDR區(qū)一般稱作L1，L2和L3并且按順序編號，以便從氨基末端向羧基末端計數(shù)。
            
根據(jù)Chothia和AbM限定，CDR-H1的長度為大約10-12個殘基，并且一般起始于Cys之后4個殘基，或者根據(jù)Kabat限定一般在5個殘基之后。H1之后一般是Trp，一般是Trp-Val，但也可以是Trp-Ile，或Trp-Ala。根據(jù)AbM限定，H1的長度為大約10-12個殘基，而Chothia限定排除了最后4個殘基。
            
根據(jù)Kabat和AbM限定，CDR-H2一般起始于H1的末端后15個殘基。在H2之前的殘基一般是Leu-Glu-Trp-Ile-Gly，但也可以有多個變異。H2之后一般是氨基酸序列Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。根據(jù)Kabat限定，H2的長度為大約16-19個殘基，而AbM定義預(yù)測長度一般為9-12個殘基。
            
CDR-H3一般起始于H2末端后的33個殘基，并且之前一般是氨基酸序列(典型為Cys-Ala-Arg)。H3后一般是氨基酸序列-Gly。H3的長度是3-25個殘基。
            
CDR-L1一般起始于大約殘基24，并且一般隨后是Cys。CDR-L1之后的殘基一般是Trp，并且一般以序列Trp-Tyr-Gln，Trp-Leu-Gln，Trp-Phe-Gln，或Trp-Tyr-Leu起始。CDR-L1的長度為大約10-17個殘基。本發(fā)明的抗體的推定的CDR-L1精確符合該模式，Cys之后是15個氨基酸，然后是Trp-Tyr-Gln。
            
CDR-L2起始于L1末端后的大約16個殘基。一般其后是殘基Ile-Tyr，Val-Tyr，Ile-Lys或Ile-Phe。CDR-L2的長度為大約7個殘基。
            
CDR-L3一般起始于L2末端后33個殘基，其后一般是Cys。L3之后一般是氨基酸序列Phe-Gly-XXX-Gly。L3的長度為大約7-11個殘基。
            
本領(lǐng)域已經(jīng)描述過各種用于修飾抗體的方法。例如，美國專利5,530,101(屬于Queen等，1996年6月25日)描述了制備人源化抗體的方法，其中人源化免疫球蛋白重鏈可變區(qū)構(gòu)架區(qū)的序列與供體免疫球蛋白重鏈可變區(qū)構(gòu)架區(qū)的序列具有65％-95％的同一性。除CDRs外，每個人源化免疫球蛋白鏈一般將含有來自于供體免疫球蛋白構(gòu)架區(qū)的氨基酸，所述構(gòu)架區(qū)例如能夠與CDRs相互作用以影響結(jié)合親和力，所述氨基酸例如是通過分子模擬預(yù)測的緊鄰供體免疫球蛋白中的CDR或者約3埃內(nèi)的一個或多個氨基酸?？梢酝ㄟ^使用各種位置標(biāo)準(zhǔn)中的任意一個或全部而設(shè)計每一條重鏈和輕鏈。當(dāng)組合至完整抗體中時，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白對人基本沒有免疫原性，并且保留與抗原，如含有表位的蛋白或其它化合物的供體免疫球蛋白基本相同的親和力。也參見1997年12月2日授權(quán)的Queen等的美國專利5,693,761中的相關(guān)方法(″Polynucleotides encoding improved humanizedimmunoglobulins″)，1997年12月2日授權(quán)的Queen等的美國專利5,693,762(″Humanized Immunoglobulins″)，以及1996年12月17日授權(quán)的Queen等的美國專利5,585,089(″HumanizedImmunoglobulins″)。
            
1996年10月15日授權(quán)的美國專利5,565,332(″Production ofchimeric antibodies-a combinatorial approach″)的一個實施例中描述了制備與母體抗體具有相似的結(jié)合特異性但具有增加的人類特征的抗體和抗體片段的生產(chǎn)方法。人源化抗體是通過鏈混排獲得的，例如，使用噬菌體展示技術(shù)，并且將包含感興趣抗原的特異性非人抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)的多肽與人互補(輕或重)鏈可變區(qū)的所有組成成分進(jìn)行組合。鑒定了感興趣抗原的特異性雜合配對物，并且將來自所選的配對物的人類鏈與人類互補可變區(qū)(輕或重)的所有組成成分進(jìn)行組合。從得到的抗體多肽二聚物文庫選自雜合體并且用于第二個人源化混排步驟?；蛘撸绻撾s合體已經(jīng)具有使其具有治療價值的足夠人類特征，則省略該第二步。也描述了進(jìn)行修飾以增加人類特征的方法。也見Winter，F(xiàn)EBS Letts 43092-92(1998)。
            
作為另一個例子，2000年4月25日授權(quán)的Carter等的美國專利6,054,297描述了通過用相應(yīng)的人CDR氨基酸序列取代CDR氨基酸序列和/或用相應(yīng)的人FR氨基酸序列取代FR氨基酸序列而制備人源化抗體的方法。
            
作為另一個例子，1998年6月16日授權(quán)的Studnicka等的美國專利5,766,886(″Modified antibody variable domains″)描述了用于鑒定抗體可變區(qū)的氨基酸殘基的方法，所述可變區(qū)可以進(jìn)行修飾而不減少抗原結(jié)合域的天然親和力，同時減少其對異源物質(zhì)的免疫原性，其中還描述了用于施用于異源物種的修飾的抗體可變區(qū)的制備方法。
            
如所討論的內(nèi)容，通過本領(lǐng)域公知的任何方法對抗體進(jìn)行的修飾，一般設(shè)計為增加受體中對抗原的結(jié)合親和力和/或減少抗體的免疫原性。在一種方法中，可以修飾人源化抗體以去除糖基化位點，從而增加抗體對其相關(guān)抗原的親和力[Co et al.，Mol Immunol 301361-1367(1993)]。“重塑形”、“超嵌合化”和“veneering/resurfacing”等技術(shù)產(chǎn)生了具有更強(qiáng)治療潛能的人源化抗體[Vaswami et al.，Annals of Allergy，Asthma，& Immunol81105(1998)；Roguska et al.，Prot Engineer 9895-904(1996)]。也參見2000年月6日授權(quán)的Hardman等的美國專利6,072,035，其中描述了對抗體進(jìn)行重新塑形的方法。盡管這些技術(shù)通過減少外源殘基的數(shù)目而減少了抗體的免疫原性，它們不能防止重復(fù)施用抗體之后的抗獨特型和抗異型反應(yīng)。用于替代這些方法減少免疫原性的方法描述于Gilliland et al.，J Immunol 62(6)3663-71(1999)。
            
在許多情況下，對抗體進(jìn)行人源化導(dǎo)致失去了抗原結(jié)合能力。因此優(yōu)選“逆向突變”人源化抗體以包含原始(最常見是嚙齒類)抗體中的一個或多個氨基酸殘基，以便試圖恢復(fù)抗體的結(jié)合親和力。例如參見Saldanha et al.，Mol Immunol 36709-19(1999)。
            
非肽特異結(jié)合劑類似物/蛋白質(zhì)模擬物此外，也包括提供穩(wěn)定結(jié)構(gòu)或減小生物降解性的肽的非肽特異結(jié)合劑類似物。在選擇的抑制肽的基礎(chǔ)上通過非肽部分置換一個或多個殘基能制備肽模擬物類似物。優(yōu)選地，非肽部分允許肽保留它的天然構(gòu)象，或者穩(wěn)定一種優(yōu)選的，例如，生物活性構(gòu)象，它保留識別和結(jié)合Ang-2的能力。一方面，得到的類似物/模擬物顯示對Ang-2的提高的結(jié)合親和力。Nachman等，Regul.Pept.57359-370(1995)中描述了從肽制備非肽模擬物類似物的方法的一個例子。如果期望，例如通過本發(fā)明肽的糖基化作用，酰胺化作用，羧酸化作用，或磷酸化作用，或者通過產(chǎn)生酸加成鹽，酰胺，酯，特別是C-末端酯，和N-?；苌?，能修飾本發(fā)明的特異結(jié)合劑肽。通過與其他部分形成共價或非共價復(fù)合物，也可以對特異結(jié)合劑肽加以修飾，產(chǎn)生肽衍生物。通過在N-或C-末端使化學(xué)部分與包括特異結(jié)合劑肽的氨基酸的側(cè)鏈上的官能團(tuán)連接能制備共價結(jié)合的復(fù)合物。
            
特別地，預(yù)見所述特異結(jié)合劑肽能與報道基團(tuán)結(jié)合，包括但不限于放射性標(biāo)記，熒光標(biāo)記，酶(例如，催化測熱反應(yīng)或熒光反應(yīng))，底物，固體基體，載體(例如，生物素或抗生物素蛋白)。因此，本發(fā)明提供一種包括抗體分子的分子，其中所述分子優(yōu)選進(jìn)一步包括選自放射性標(biāo)記，熒光標(biāo)記，酶，底物，固體基體，載體的報道基團(tuán)。這樣的標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如，特別包括生物素標(biāo)記。這樣的標(biāo)記的應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且描述于，例如，美國專利Nos.3,817,837；3,850,752；3,996,345；和4,277,437。有用的其他標(biāo)記包括但不限于放射性標(biāo)記，熒光標(biāo)記和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。涉及使用這樣的標(biāo)記物的美國專利包括，例如美國專利Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；和3,996,345。本發(fā)明的任何肽可以包括任何這些標(biāo)記的一個，兩個，或多個。
            
制備特異結(jié)合劑的方法根據(jù)常規(guī)技術(shù)可以在溶液中或者在固相載體上合成作為蛋白的本發(fā)明的特異結(jié)合劑。固相肽合成目前的限制是85-100氨基酸長度。但是，化學(xué)合成技術(shù)通?？梢杂糜诨瘜W(xué)連接一系列小肽以產(chǎn)生全長多肽。各種各樣的自動合成儀是商業(yè)上可獲得的并且可以根據(jù)公知的方法使用。參見，例如，Stewart和Young(上文)；Tam等，J.Am.Chem.Soc.，1056442，(1983)；Merrifield，Science 232341-347(1986)；Barany和Merrifield，The Peptides，Gross and Meienhofer，編著，Academic Press，New York，1-284；Barany等，Int.J.Pep.ProteinRes.，30705-739(1987)；和美國專利No.5,424,398，各篇文獻(xiàn)在此引作參考。
            
固相肽合成方法使用共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，含有0.1-1.0mM胺/克聚合物。這些肽合成方法使用丁基氧羰基(t-BOC)或9-芴基甲氧羰基(FMOC)保護(hù)α-氨基。兩種方法都涉及分步合成，從肽的C-末端開始每一步加上一個氨基酸(參見，Coligan等，Curr.Prot.Immunol.，Wiley Interscience，1991，第9單元)。完成化學(xué)合成時，可以將合成肽去保護(hù)，去除t-BOC或FMOC氨基保護(hù)基團(tuán)并且降低的溫度下用酸處理從聚合物上裂解下來(例如，液體HF-10％茴香醚在0℃下處理大約0.25至大約1小時)。蒸發(fā)溶劑之后，用1％乙酸溶液從聚合物萃取出肽，然后凍干，得到粗產(chǎn)物。一般通過象在Sephadex G-15上使用5％乙酸作為溶劑進(jìn)行凝膠過濾這樣的技術(shù)進(jìn)行純化。將過柱的合適的級分凍干得到同質(zhì)肽或肽衍生物，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行表征，象氨基酸分析，薄層色譜法，高效液相色譜法，紫外吸收光譜法，摩爾旋光，溶解性，并且通過固相埃德曼降解定量測定。
            
抗-Ang2-抗體、及其衍生物、變體和片段，以及其它基于蛋白的Ang-2結(jié)合劑的化學(xué)合成允許將非天然存在的氨基酸摻入試劑。
            
重組DNA技術(shù)是制備本發(fā)明的全長抗體和其他蛋白質(zhì)特異性結(jié)合劑或者其片段的常規(guī)方法?？梢詫⒕幋a抗體或片段的cDNA分子插入表達(dá)載體，其接著可以被插入宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體或片段?？梢岳斫饩幋a所述抗體的cDNAs可以被修飾，以改變“原始”cDNA(從mRNA翻譯)，以便提供密碼子簡并或允許在各種宿主細(xì)胞中的密碼子偏好使用。
            
一般情況下，應(yīng)用這里實施例中描述的方法能獲得編碼肽的DNA分子。當(dāng)需要獲得與原始抗體分子相關(guān)的Fab分子或CDRs時，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)篩選適當(dāng)?shù)奈膸?噬菌體展示文庫；淋巴細(xì)胞文庫等)，以鑒定和克隆相關(guān)Fabs/CDRs。用于所述篩選的探針可以是編碼原始抗體Fab部分的全長或截短的Fab探針，針對原始抗體Fab部分的一個或多個CDRs的探針，或其它合適的探針。當(dāng)采用DNA片段作為探針時，典型的雜交條件是Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols Press)中提出的那些。雜交之后，根據(jù)象探針大小，克隆的探針的期望的同源性，篩選的文庫的類型，和篩選的克隆的數(shù)目這樣的因素，在合適的嚴(yán)謹(jǐn)度下洗滌探針印跡。高嚴(yán)謹(jǐn)度篩選的例子是在50-65℃之間的溫度下，0.1XSSC，和0.1％SDS。
            
可以使用各種各樣的表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)包含和表達(dá)編碼本發(fā)明的特異結(jié)合劑多肽的多核苷酸分子。這些系統(tǒng)包括但不限于微生物，例如重組噬菌體，質(zhì)粒或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)轉(zhuǎn)染的或者細(xì)菌表達(dá)載體(例如，Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞體系；或者動物細(xì)胞體系。
            
重組特異結(jié)合劑蛋白質(zhì)生產(chǎn)中有用的哺乳動物細(xì)胞包括但不限于VERO細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，COS細(xì)胞(例如COS-7)，W138，BHK，HepG2，3T3，RIN，MDCK，A549，PC12，K562和293細(xì)胞，以及此處描述的雜交瘤細(xì)胞系。哺乳動物細(xì)胞系優(yōu)選用于制備特異結(jié)合劑如抗體和抗體片段，它們一般被糖基化，并且其活性需要正確的重折疊。優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞系包括CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。
            
下文描述一些用于重組表達(dá)特異結(jié)合劑蛋白的示例性方法。
            
術(shù)語″表達(dá)載體″指用于從DNA(RNA)序列表達(dá)多肽的質(zhì)粒，噬菌體，病毒或載體。一個表達(dá)載體可以包括轉(zhuǎn)錄單元，包括下面結(jié)構(gòu)的組裝(1)遺傳元件或者在基因表達(dá)中具有調(diào)節(jié)作用的元件，例如啟動子或增強(qiáng)子，(2)被轉(zhuǎn)錄到mRNA中并且翻譯成蛋白質(zhì)的編碼結(jié)合劑的結(jié)構(gòu)或序列，和(3)合適的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。要在酵母或真核表達(dá)系統(tǒng)中使用的結(jié)構(gòu)單元優(yōu)選包括使宿主細(xì)胞胞外分泌翻譯的蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列。或者，沒有前導(dǎo)序列或轉(zhuǎn)運序列表達(dá)重組蛋白質(zhì)的情況下，可以包括氨基末端甲硫氨酰殘基。這種殘基可以或可以不接著從表達(dá)的重組蛋白裂解，提供肽終產(chǎn)物。
            
例如，使用商售表達(dá)系統(tǒng)，例如Pichia表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen，SanDiego，Calif.)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明，可以在酵母中重組表達(dá)肽。這種系統(tǒng)還依賴指導(dǎo)分泌的前-原-α序列，但是甲醇誘導(dǎo)時醇氧化酶(AOX1)啟動子驅(qū)動插入片段的轉(zhuǎn)錄。
            
通過，例如，用來從細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞上清液純化肽的方法，從酵母生長培養(yǎng)基純化分泌的特異結(jié)合劑肽。
            
或者，可以將編碼特異結(jié)合劑肽的cDNA克隆到桿狀病毒表達(dá)載體pVL1393(PharMingen，San Diego，Calif.)中?？梢愿鶕?jù)生產(chǎn)商說明(PharMingen)使用這種載體在沒有sF9蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中感染Spodoptera frugiperda細(xì)胞，產(chǎn)生重組蛋白。使用肝素-瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia)純化并濃縮特異結(jié)合劑蛋白。
            
或者，在昆蟲系統(tǒng)中表達(dá)肽。用于蛋白質(zhì)表達(dá)的昆蟲系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在一個這樣的系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核型內(nèi)多角體病毒(AcNPV)能被用作在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中表達(dá)外源基因的載體?？梢詫⑻禺惤Y(jié)合劑肽編碼序列克隆到病毒的不重要的區(qū)，例如多角體蛋白基因，并且置于多角體蛋白啟動子的控制下。成功插入特異結(jié)合劑肽會使得多角體蛋白基因失活，并且產(chǎn)生沒有外被蛋白外殼的重組蛋白?？梢允褂弥亟M病毒感染草地夜蛾細(xì)胞或粉紋夜蛾幼蟲，表達(dá)肽。Smith等，J.Virol.46584(1983)；Engelhard等，Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)913224-7(1994)。
            
在另一個實施例中，通過PCR能擴(kuò)增編碼特異結(jié)合劑肽的DNA序列，并且克隆到合適的載體中，例如，pGEX-3X(Pharmacia)。設(shè)計pGEX載體產(chǎn)生包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的載體編碼的融合蛋白，和通過插入到載體克隆位點中的DNA片段編碼的特異結(jié)合劑蛋白。能制備包括例如一個合適的酶切位點的PCR引物。僅使用有利于表達(dá)的融合部分或者另外不期望與感興趣的肽連接，然后從融合蛋白的GST部分切割下來重組特異結(jié)合劑融合蛋白。pGEX-3X/特異結(jié)合劑肽構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-1 Blue細(xì)胞(Stratagene，La Jolla Calif.)中，并且分離各個轉(zhuǎn)化體并且培養(yǎng)。純化各個轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA，并且使用自動測序儀部分測序，證實以合適的方向編碼核酸插入片段的期望的特異性結(jié)合劑的存在。
            
使用此處描述的重組系統(tǒng)表達(dá)編碼抗-Ang-2抗體及其片段的多核苷酸可以導(dǎo)致產(chǎn)生抗體或其片段，所述抗體或其片段必須“重折疊”(正確產(chǎn)生各種二硫橋)而獲得生物活性。所述抗體的典型重折疊程序見此處的實施例和下面的章節(jié)。
            
可以如下純化特異結(jié)合劑，所述特異結(jié)合劑被制備成細(xì)菌中的不溶性包含體。離心破壞宿主細(xì)胞；在0.15M NaCl，10mM Tris，pH8，1mM EDTA中洗滌；并且在室溫下用0.1毫克/毫升溶菌酶(Sigma，St.Louis，Mo.)處理15分鐘。超聲處理澄清溶胞產(chǎn)物，并且通過以12,000Xg離心10分鐘沉積細(xì)胞碎屑。將含有特異結(jié)合劑的沉淀重新懸浮于50mMTris，pH8，和10mM EDTA，用50％甘油分層，并且以6,000Xg離心30分鐘。將沉淀重新懸浮于沒有Mg++和Ca++的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸緩沖鹽溶液(PBS)中。通過將重新懸浮的沉淀在變性SDS-PAGE(Sambrook等，上文)中分級分離而進(jìn)一步純化特異結(jié)合劑。凝膠在0.4M KCl中浸透，顯現(xiàn)蛋白質(zhì)，將其切下并且在沒有SDS的凝膠展開緩沖液中電洗脫。如果在細(xì)菌中產(chǎn)生的GST/融合蛋白是可溶蛋白，可以利用GST PurificationModule(Pharmacia)將其純化。
            
用于重組蛋白表達(dá)的哺乳動物宿主系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。對于加工表達(dá)蛋白或者產(chǎn)生某些翻譯后修飾的特定能力選擇宿主細(xì)胞菌株，所述修飾在提供蛋白質(zhì)活性中有用。這樣的多肽修飾作用包括但不限于乙?；饔?，羧化作用，糖基化作用，磷酸化作用，脂質(zhì)化作用和酰化作用。與象CHO這樣的宿主細(xì)胞不同，HeLa，MDCK，293，W138等具有這樣的翻譯后活性的特定細(xì)胞機(jī)構(gòu)和特征機(jī)理，并且可以選擇來確保引入的外來蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。
            
可以利用很多種篩選系統(tǒng)來回收已經(jīng)被轉(zhuǎn)化重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞。這樣的選擇系統(tǒng)包括但不限于HSV胸腺嘧啶核苷激酶，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因，分別在tk-，hgprt-或aprt-細(xì)胞中。還有，抗-代謝物抗性被用作下面篩選的基礎(chǔ)DHFR，它帶來甲氨喋呤抗性；gpt，它帶來霉酚酸抗性；neo，它帶來氨基苷G418抗性并帶來綠黃隆抗性；和hygro，它帶來潮霉素抗性?？梢允褂玫钠渌蛇x擇基因包括trpB，它使得細(xì)胞利用吲哚代替色氨酸，或hisD，它使得細(xì)胞利用histinol代替組氨酸。給出用于鑒定轉(zhuǎn)化體的可視指征的標(biāo)記包括花色素苷，β-葡萄糖醛酸酶及其底物，GUS，和熒光素酶及其底物，熒光素。
            
特異性結(jié)合劑的純化和重折疊在某些情況下，本發(fā)明的特異性結(jié)合劑為了有生物活性可能需要″重折疊″并且被氧化為合適的三級結(jié)構(gòu)并且產(chǎn)生二硫鍵。應(yīng)用本領(lǐng)域公知的很多種方法能實現(xiàn)重折疊。這樣的方法包括，例如，在離液劑的存在下將可溶性多肽試劑暴露給通常高于7的pH。離液劑的選擇類似于胞函體增溶作用使用的選擇，但是一般使用低濃度的離液劑。舉例的離液劑是胍。在大多數(shù)情況下，重折疊/氧化溶液還含有還原劑加特定比例的其氧化形式，產(chǎn)生特定的氧化還原潛能，使得可能存在形成半胱氨酸橋的二硫化合物。一些常用的氧化還原對包括半胱氨酸/胱胺，谷胱甘肽/二硫雙GSH，二氯化銅，二硫蘇糖醇DTT/二噻烷DTT，和2-巰基乙醇(bME)/二硫-bME。在很多情況下，可以使用輔助溶劑提高重折疊效率。通常使用的輔助溶劑包括甘油，各種分子量的聚乙二醇，和胍。
            
期望純化本發(fā)明的特異結(jié)合劑蛋白或其變體。蛋白質(zhì)純化技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。這些技術(shù)在一個水平上包括多肽和非多肽級分的分級分離。將所述特異結(jié)合劑多肽與其他蛋白質(zhì)分離之后，應(yīng)用實現(xiàn)部分或完全純化(或者純化至均勻)的色譜法和電泳技術(shù)能進(jìn)一步純化感興趣的多肽。特別適合制備本發(fā)明的特異結(jié)合劑的分析方法是離子交換色譜法，排阻層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳；等電聚焦。純化肽的特別有效的方法是快速蛋白質(zhì)液相色譜法或HPLC。
            
本發(fā)明的一些方面涉及純化，在特定實施方案中，涉及所編碼特異結(jié)合劑蛋白或肽的大量純化。這里使用的術(shù)語″純化的特異結(jié)合劑蛋白或肽″，是意指與其他成分可分離的成分，其中將特異結(jié)合劑蛋白或肽純化至相對其天然可獲得狀態(tài)的任何程度。因此純化的特異結(jié)合劑蛋白或肽也稱作從其天然存在的環(huán)境脫離的特異結(jié)合劑蛋白或肽。
            
一般，″純化的″指經(jīng)分級分離去除各種其他成分的特異結(jié)合劑組合物，所述組合物基本上保持其表達(dá)的生物活性。使用術(shù)語″基本上純化″時，該概念指特異結(jié)合劑組合物，其中特異結(jié)合劑蛋白或肽形成組合物的主要成分，例如組合物中蛋白質(zhì)構(gòu)成大約50％，大約60％，大約70％，大約80％，大約90％，大約95％或更多。
            
從現(xiàn)有公開物來說，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知很多用于定量特異結(jié)合劑的純化的方法。這些包括，例如，測定活性級分特異結(jié)合活性，或者通過SDS/PAGE分析測定級分中特異結(jié)合劑的量。評定特異結(jié)合劑級分的純度的優(yōu)選的方法是計算級分的特異性結(jié)合活性，將它與開始的提取物的結(jié)合活性比較，這樣計算出純化度，這里通過″-純化倍數(shù)″評價。用來表示結(jié)合活性的量的實際單位當(dāng)然取決于選擇進(jìn)行純化的特定分析技術(shù)和特異結(jié)合劑蛋白或肽是否顯示可檢測結(jié)合活性。
            
適合在結(jié)合劑蛋白純化中使用的各種技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。這些包括，例如，用硫酸銨沉淀，PEG，抗體(免疫沉淀)等或者通過熱變性，接著離心；色譜步驟例如親和色譜(例如，Protein-A-Sepharose)，離子交換，凝膠過濾，反相，羥基磷灰石和親和色譜；等電聚焦，凝膠電泳，以及這些和其他技術(shù)的組合。正如本領(lǐng)域公知的，相信進(jìn)行各種純化步驟的順序是可以改變的，或者可以省略一些步驟，仍然得到制備基本上純的特異性結(jié)合劑的合適的方法。
            
一般不要求本發(fā)明的特異結(jié)合劑總是以其最純化的狀態(tài)提供。事實上，想到在一些實施方案中比基本上純稍差的特異結(jié)合劑產(chǎn)物具有用途。通過組合中較少的純化步驟，或者通過使用不同形式的相同的一般純化方案，可以實現(xiàn)部分純化。例如，知道使用HPLC設(shè)備進(jìn)行的陽離子交換柱色譜一般會導(dǎo)致比利用低壓色譜系統(tǒng)的相同技術(shù)更大“倍數(shù)”的純化作用。顯示低度相對純化的方法在特異結(jié)合劑的總回收中，或者在特異結(jié)合劑的結(jié)合活性的保持中有益。
            
已知特異結(jié)合劑的遷移隨著SDS/PAGE的不同條件可以改變，有時改變顯著[Capaldi等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，76425(1977)]。因此明白在不同的電泳條件下，純化或部分純化的特異性結(jié)合劑表達(dá)產(chǎn)物的表觀分子量可以變化。
            
結(jié)合分析免疫結(jié)合分析一般使用與分析物靶抗原特異性結(jié)合并且經(jīng)常固定分析物靶抗原的捕獲劑。捕獲劑是與分析物特異性結(jié)合的部分。在本發(fā)明的一個實施方案中，捕獲劑是特異性結(jié)合Ang-2的特異結(jié)合劑或者其片段。這些免疫結(jié)合分析是本領(lǐng)域公知的[Asai，編著Methods in CellBiology，Vol.37，Antibodies in Cell Biology，Academic Press，Inc.，New York(1993)]。
            
免疫結(jié)合分析常常使用標(biāo)記試劑，它是捕獲劑或抗原形成的結(jié)合的復(fù)合物存在的信號。標(biāo)記試劑可以是包括結(jié)合的復(fù)合物的分子之一；即它可以是標(biāo)記的特異性結(jié)合劑或者標(biāo)記的抗特異性結(jié)合劑抗體?；蛘?，標(biāo)記試劑可以是第三分子，通常是另一種抗體，它結(jié)合結(jié)合的復(fù)合物。標(biāo)記試劑可以是，例如，帶有標(biāo)記的抗特異性結(jié)合劑抗體。二抗，對結(jié)合的復(fù)合物是特異性的，可以沒有標(biāo)記，但是能被第四分子結(jié)合，第四分子對于二抗是其中一員的抗體物質(zhì)是特異性的。例如，二抗可以被可檢測部分修飾，例如生物素，它之后被第四分子結(jié)合，所述第四分子例如酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白。能特異性結(jié)合免疫球蛋白的恒定區(qū)的其他蛋白質(zhì)，例如蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G也可以被用作標(biāo)記試劑。這些結(jié)合蛋白質(zhì)是鏈球菌細(xì)胞壁正常成分并且具有與各種物種的免疫球蛋白恒定區(qū)的強(qiáng)的非免疫原反應(yīng)性。Akerstrom，J.Immunol.，1352589-2542(1985)；Chaubert，Mod.Pathol.，10585-591(1997)。
            
在分析中，每一次混合試劑之后可能要求溫育和/或洗滌步驟。溫育步驟可以是大約5秒至幾小時，優(yōu)選大約5分鐘至大約24小時。但是，溫育時間取決于分析形式，分析物，溶液體積，濃度等。通常，在環(huán)境溫度下進(jìn)行分析，但是在一定溫度范圍內(nèi)可以進(jìn)行。
            
A.非競爭性結(jié)合鑒定法免疫結(jié)合鑒定法可以是非競爭性類型。這些分析有一定量的直接測量的捕獲分析物。例如，在優(yōu)選的″夾心″鑒定法中，捕獲試劑(抗體)可以直接結(jié)合固體底物，在那里被固定。這些固定化捕獲試劑然后捕獲(結(jié)合)分析樣品中存在的抗原。這樣被固定的蛋白質(zhì)然后結(jié)合標(biāo)記試劑，例如帶有標(biāo)記的二抗。在另一個優(yōu)選的″夾心″鑒定法中，二抗沒有標(biāo)記，但是可以被對二抗從中衍生的物質(zhì)的抗體特異性的標(biāo)記抗體結(jié)合。二抗還可以被可檢測部分例如生物素修飾，第三標(biāo)記分子例如鏈霉抗生物生蛋白能特異性結(jié)合生物素。參見Harlow和Lane，Antibodies，A LaboratoryManual，Ch 14，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(1988)，這里引作參考。
            
B.競爭性結(jié)合鑒定法免疫結(jié)合鑒定法可以是競爭性類型。通過測定樣品中存在的分析物置換的或者從捕獲試劑完全去除的加入的分析物的量，間接測定樣品中存在的分析物的量。在一個優(yōu)選的競爭性結(jié)合鑒定法中，向樣品加入通常被標(biāo)記的已知量的分析物，樣品然后接觸抗體(捕獲試劑)。與抗體結(jié)合的標(biāo)記分析物的量與樣品中存在的分析物的濃度成反比(參見，Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Ch 14，pp.579-583，上文)。
            
在另一個優(yōu)選的競爭性結(jié)合鑒定法中，捕獲試劑固定在固體底物上。通過測定蛋白質(zhì)/抗體復(fù)合體中存在的蛋白質(zhì)的量，或者通過測定保留的沒有復(fù)合的蛋白質(zhì)的量，可以測定與捕獲試劑結(jié)合的蛋白質(zhì)的量。通過提供標(biāo)記蛋白質(zhì)可以測定蛋白質(zhì)的量。Harlow和Lane(上文)。
            
在另一個優(yōu)選的競爭性結(jié)合鑒定法中，利用半抗原抑制作用。這里，已知的分析物固定在固體底物上。向樣品加入已知量的抗體，并且樣品接觸固定的分析物。與固定的分析物結(jié)合的抗體的量與樣品中存在的分析物的量成反比。通過測定抗體的固定級分或者溶液中保留的級分可以測定固定化抗體的量。測定可以是直接的，其中抗體被標(biāo)記，或者通過接著加入標(biāo)記部分而間接測定，所述標(biāo)記部分如上所述特異性結(jié)合抗體。
            
C.競爭性結(jié)合鑒定法的應(yīng)用競爭性結(jié)合鑒定法可以用于交叉反應(yīng)測定，允許技術(shù)人員測定本發(fā)明的特異結(jié)合劑識別的蛋白質(zhì)或酶復(fù)合體是不是期望的蛋白質(zhì)而不是交叉反應(yīng)分子，或者測定融合蛋白是不是對抗原是特異性的而不結(jié)合不相關(guān)的抗原。在這種類型的鑒定法中，抗原可以固定到固體載體上并且向測試中加入未知蛋白質(zhì)混合物，它會與特異結(jié)合劑與固定化蛋白質(zhì)的結(jié)合相競爭。該競爭分子還結(jié)合與所述抗原不相關(guān)的一種或幾種抗原。將蛋白質(zhì)與特異結(jié)合劑和固定化抗原結(jié)合相競爭的能力與和固體載體固定化的相同蛋白質(zhì)的結(jié)合相比較，測定蛋白質(zhì)混合物的交叉反應(yīng)。
            
D.其他結(jié)合鑒定法本發(fā)明還提供Western印跡法，測定或定量分析樣品中Ang-2的存在。所述技術(shù)一般包括以分子量為基礎(chǔ)通過凝膠電泳分離樣品蛋白質(zhì)并且將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適的固體載體，例如硝基纖維素過濾器，尼龍過濾器，或衍生化尼龍過濾器。樣品和特異性結(jié)合Ang-2的抗體或者其片段溫育并且檢測得到的復(fù)合體。這些抗體可以直接被標(biāo)記或者接著被檢測，使用特異性結(jié)合抗體的標(biāo)記抗體。
            
實施例中闡述了檢測破壞Ang-2與其受體結(jié)合的Ang-2特異結(jié)合劑的結(jié)合測定。
            
診斷分析本發(fā)明的肽或者其片段用于特征在于表達(dá)Ang-2或亞基的癥狀或疾病的診斷，或者用于對用Ang-2的誘導(dǎo)物，其片段，Ang-2活性的激動劑或抑制劑治療的患者監(jiān)測的檢定中。對于Ang-2的診斷鑒定包括使用特異結(jié)合劑和標(biāo)記檢測人體液或者細(xì)胞或組織提取物中的Ang-2的方法。本發(fā)明的特異結(jié)合劑可以在有或沒有修飾作用下使用。在優(yōu)選的診斷鑒定法中，通過連接，例如標(biāo)記或報道分子，將特異結(jié)合劑標(biāo)記。很多種標(biāo)記和報道分子是公知的，其中的一些已經(jīng)在這里描述。特別地，本發(fā)明用于人疾病的診斷。
            
本領(lǐng)域公知很多種使用對各種蛋白質(zhì)特異的多克隆和單克隆抗體測定Ang-2蛋白質(zhì)的方法。例子包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，放射免疫測定(RIA)和熒光激活細(xì)胞分類(FACS)。使用與Ang-2上兩個不干擾表位反應(yīng)的單克隆抗體的兩個位點單克隆為基礎(chǔ)的免疫測定是優(yōu)選的。這些測定方法描述于，例如，Maddox等，J.Exp.Med.，1581211(1983)。
            
為了提供診斷基礎(chǔ)，通常確定人Ang-2表達(dá)的正?；驑?biāo)準(zhǔn)值。在本領(lǐng)域公知的適合復(fù)合體形成的條件下，通過將來自正常受試者優(yōu)選人的體液或細(xì)胞提取物與抗Ang-2的抗體混合，來實現(xiàn)測定。使用對照和疾病樣品，通過比較特異結(jié)合劑與已知量的Ang-2蛋白質(zhì)的結(jié)合能定量測定標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合體形成的量。然后，將從正常樣品獲得的標(biāo)準(zhǔn)值與從可能受疾病影響的受試者的樣品獲得的值相比較。標(biāo)準(zhǔn)值和實驗值之間的偏差表明對于疾病狀態(tài)中的Ang-2的作用。
            
對于診斷應(yīng)用，在一些實施方案中，本發(fā)明的特異結(jié)合劑或肽一般用可檢測部分標(biāo)記。可檢測部分可以是任何能直接或間接產(chǎn)生可檢測信號的那些。例如，可檢測部分可以是放射性同位素，例如H，C，P，S，或I，熒光或化學(xué)發(fā)光化合物，例如熒光素異硫代氰酸酯，諾丹明，或熒光素；或者酶，例如堿性磷酸酶，[β]-半乳糖苷酶，或辣根過氧化物酶。Bayer等，Meth.Enz.，184138-163，(1990)。
            
疾病本發(fā)明提供用于治療人疾病和病理狀態(tài)的結(jié)合Ang-2的特異結(jié)合劑?？梢耘c其他治療藥物結(jié)合使用調(diào)節(jié)Ang-2結(jié)合活性或者其他細(xì)胞活性的試劑，以增強(qiáng)它們的治療效果或者降低可能的副作用。
            
一方面，本發(fā)明提供用于治療特征在于細(xì)胞中不期望的或異常水平的Ang-2活性的疾病和癥狀的藥物和方法。這些疾病包括癌癥，和其他超增殖癥狀，例如增生，牛皮癬，接觸性皮炎，免疫失調(diào)，和不孕癥。
            
本發(fā)明還提供了治療動物包括人的癌癥的方法，包括對動物施用有效量的特異性結(jié)合劑，所述特異結(jié)合劑抑制或降低Ang-2活性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及抑制癌細(xì)胞生長的方法，包括生物系統(tǒng)中細(xì)胞增殖，侵入，和轉(zhuǎn)移過程。所述方法包括使用本發(fā)明的化合物作為癌細(xì)胞生長抑制劑。優(yōu)選地，應(yīng)用所述方法對活體動物例如哺乳動物抑制或減小癌細(xì)胞生長，侵入，轉(zhuǎn)移，或腫瘤發(fā)生。本發(fā)明的方法還容易適合在測試系統(tǒng)中使用，例如，分析癌細(xì)胞生長及其性質(zhì)，以及鑒定影響癌細(xì)胞生長的化合物。
            
本發(fā)明的方法可治療的癌癥優(yōu)選在哺乳動物中發(fā)生。哺乳動物包括，例如，人和其他靈長目，以及寵物或陪伴動物例如狗和貓，試驗用動物例如大鼠，小鼠和兔，和農(nóng)場動物例如馬，豬，羊，和牛。
            
瘤或腫瘤包括其中細(xì)胞增殖失控且進(jìn)行性的組織細(xì)胞的生長。一些這樣的生長是良性的，但是其他稱作惡性并且可能導(dǎo)致生物死亡。惡性腫瘤或癌與良性生長的區(qū)別在于，除了表現(xiàn)出進(jìn)行性細(xì)胞增殖之外，它們可以侵犯周圍的組織并且轉(zhuǎn)移。此外，惡性腫瘤特征在于它們表現(xiàn)出較大分化損失(較大去分化)，以及相對另一種和它們周圍組織的它們的組織的較大損失。這種性質(zhì)也稱作″退行發(fā)育″。
            
本發(fā)明可治療的腫瘤還包括實體瘤，即，癌和肉瘤。癌包括滲透(侵入)周圍組織并且發(fā)生轉(zhuǎn)移的得自上皮細(xì)胞的那些惡性腫瘤。腺癌是得自腺組織的癌，或者它形成可識別腺組織。另一個寬的分類或癌包括肉瘤，它們是包埋在纖絲或同質(zhì)物質(zhì)象胚胎締結(jié)組織中的細(xì)胞。本發(fā)明還能治療骨髓或淋巴系統(tǒng)癌癥，包括白血病，淋巴瘤和一般不以腫瘤質(zhì)存在而是分布在血管或淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)中的其他癌癥。
            
能接受本發(fā)明治療的癌或腫瘤的類型包括，例如，ACTH-產(chǎn)生腫瘤，急性淋巴細(xì)胞白血病，急性非淋巴細(xì)胞白血病，腎上腺內(nèi)皮癌，膀胱癌，腦癌，乳腺癌，子宮頸癌，慢性淋巴細(xì)胞白血病，慢性髓細(xì)胞白血病，結(jié)腸癌，皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤，子宮內(nèi)膜癌，食管癌，Ewing′s肉瘤，膽囊癌，毛狀細(xì)胞白血病，頭頸癌，霍奇金淋巴瘤，Kaposi′s肉瘤，腎癌，肝癌，肺癌(小細(xì)胞和非小細(xì)胞)，惡性腹膜積液，惡性胸膜積液，黑素瘤，間皮瘤，多樣骨髓瘤，神經(jīng)胚細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，非霍奇金淋巴瘤，骨肉瘤，卵巢癌，卵巢(胚細(xì)胞)癌，胰腺癌，陰莖癌，前列腺癌，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，皮膚癌，軟組織肉瘤，鱗狀細(xì)胞癌，胃癌，睪丸癌，甲狀腺癌，滋養(yǎng)層腫瘤，子宮癌，陰道癌，陰戶癌，和Wilms′腫瘤。
            
關(guān)于一些類型的實驗確定的癌癥的治療，本發(fā)明在這里特別詳細(xì)地描述。在這些詳述的治療中，使用現(xiàn)有技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體外和體內(nèi)模型。這些方法能被用來鑒定預(yù)期在體內(nèi)治療方案中有效的藥物。但是，明白本發(fā)明的方法不局限于這些腫瘤類型的治療，而是延伸到源自任何器官系統(tǒng)的實體瘤。其侵入或轉(zhuǎn)移與Ang-2表達(dá)或活性有關(guān)的癌癥特別易于用本發(fā)明抑制或者甚至被誘導(dǎo)退化。
            
本發(fā)明還通過包括使用下面的本發(fā)明的化合物而實施，例如與另一種抗癌化療藥物例如任何常用化療藥物結(jié)合的特異結(jié)合劑。特異性結(jié)合劑與這樣的其他藥物結(jié)合能使化療方案有增強(qiáng)的作用。熟練醫(yī)師會想到很多種化療法能結(jié)合本發(fā)明的方法?？梢允褂萌魏位熕幬?，包括烷基化試劑，抗代謝物，激素和拮抗劑，放射性同位素，以及天然產(chǎn)物。例如，本發(fā)明的化合物能和抗生素一起給藥，所述抗生素例如阿霉素和其他蒽環(huán)霉素類似物，氮芥例如環(huán)磷酰胺，嘧啶類似物例如5-氟尿嘧啶，順鉑，羥基脲，紫杉醇及其天然和合成衍生物，等。在另一個實施例中，在混合腫瘤情況下，例如乳腺癌，其中腫瘤包括促性激素依賴性和非促性激素依賴性細(xì)胞，該化合物可以和抑那通或果絲瑞寧(LH-RH的合成肽類似物)聯(lián)合給藥。其他抗腫瘤方案包括使用四環(huán)素化合物和另一種治療用藥程式，例如，手術(shù)，放射等，這里也稱作″輔助抗腫瘤用藥程式″。因此，本發(fā)明的方法可以使用這樣的常規(guī)方案進(jìn)行，好處是減小副作用并且增強(qiáng)藥效。
            
本發(fā)明因此提供用于治療多種癌癥，包括實體瘤和白血病，的組合物和方法?？梢灾委煹陌┌Y類型包括但不限于乳腺癌，前列腺癌，和結(jié)腸癌；所有形式的肺支氣管原癌；骨髓癌；黑素瘤；肝臟腫瘤；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；乳頭狀瘤；胺前體攝取與脫羧細(xì)胞瘤；迷芽瘤；腮原瘤；惡性癌綜合癥；癌心臟?。话?例如，Walker癌，基細(xì)胞癌，basosquamous癌，Brown-Pearce癌，導(dǎo)管癌，Ehrlich腫瘤，Krebs 2癌，梅克爾細(xì)胞，粘蛋白，非小細(xì)胞肺癌，燕麥細(xì)胞，乳頭狀瘤，硬癌，細(xì)支氣管癌，支氣管原癌，鱗狀細(xì)胞癌，和移行細(xì)胞癌)；組織細(xì)胞性?。话籽。粣盒越M織細(xì)胞增多；Hodgkin′s病；免疫增殖小細(xì)胞肺癌；非霍金森淋巴瘤；漿細(xì)胞瘤；網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖；黑素瘤；成軟骨瘤；軟骨瘤；軟骨肉瘤；纖維瘤；纖維肉瘤；巨細(xì)胞腫瘤；組織細(xì)胞瘤；脂瘤；脂肉瘤；間皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；顱咽管瘤；無性細(xì)胞瘤；錯構(gòu)瘤；間葉瘤；中腎瘤；肌肉瘤；成釉細(xì)胞瘤；牙骨質(zhì)瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；tophoblastic腫瘤。此外，也可以治療下面類型的癌癥腺瘤；膽管瘤；膽脂瘤；cyclindroma；囊腺癌；囊腺瘤；粒層細(xì)胞瘤；兩性胚細(xì)胞瘤；肝細(xì)胞瘤；汗腺腺瘤；小島細(xì)胞腫瘤；間質(zhì)細(xì)胞腫瘤；乳頭狀瘤；塞爾托利氏細(xì)胞腫瘤；鞘細(xì)胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；原粒細(xì)胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；橫紋肌瘤；橫紋肌肉瘤；室管膜瘤；神經(jīng)節(jié)瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；成神經(jīng)管細(xì)胞瘤；腦膜瘤；神經(jīng)鞘瘤；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；神經(jīng)上皮瘤；神經(jīng)纖維瘤；神經(jīng)瘤；副神經(jīng)節(jié)瘤；副神經(jīng)節(jié)瘤nonchromaffin；血管角質(zhì)瘤；嗜曙紅細(xì)胞增多類淋巴管增生；血管瘤硬化；多發(fā)性血管瘤；血管球瘤；血管內(nèi)皮瘤；血管瘤；血管外皮細(xì)胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果體瘤；癌肉瘤；軟骨肉瘤；葉狀囊性肉瘤；纖維肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；淋巴瘤性白血病；脂肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；橫紋肌肉瘤；肉瘤；贅生物；nerofibromatosis；和子宮頸發(fā)育異常。
            
本發(fā)明的另一方面是使用本發(fā)明的材料和方法來防止和/或治療任何皮膚超增殖癥狀，包括牛皮癬和接觸性皮炎或者其他超增殖疾病。已經(jīng)證明牛皮癬和接觸性皮炎患者其身體病灶有升高的Ang-2活性[Ogoshi等，J.Inv.Dermatol.，110818-23(1998)]。優(yōu)選地，與治療表現(xiàn)這些臨床癥狀人的其他藥物聯(lián)合使用對Ang-2特異性的特異性結(jié)合劑。利用各種各樣的載體通過這里描述的給藥途徑和本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他途徑能送遞特異性結(jié)合劑。
            
本發(fā)明的另一方面包括治療各種其中涉及血管發(fā)生的視網(wǎng)膜病(包括糖尿病視網(wǎng)膜病和與年齡相關(guān)的黃斑變性)，以及女性生殖道失調(diào)/疾病，例如子宮內(nèi)膜異位，子宮纖維瘤，和與功能障礙血管增生相關(guān)的女性生殖周期期間其他這樣的癥狀(包括子宮內(nèi)膜微血管生長)。
            
本發(fā)明的另一方面涉及治療異常血管生長，包括腦動靜脈畸形(AVMs)胃腸粘膜損傷和修復(fù)，有消化系統(tǒng)潰瘍病使患者胃十二指腸粘膜潰瘍，包括中風(fēng)導(dǎo)致的局部缺血，各種肝病中肺維管失調(diào)和非肝門高血壓患者的肝門高血壓。
            
本發(fā)明的另一方面是使用本發(fā)明提供的組合物和方法預(yù)防癌癥。這樣的試劑包括抗Ang-2特異結(jié)合劑。
            
藥物組合物Ang-2特異結(jié)合劑的藥物組合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。含有抗體的藥物組合物詳細(xì)描述于，例如，2001年1月9日公布的Lam等人的美國專利No.6,171,586。這樣的組合物含有治療或預(yù)防有效量的特異性結(jié)合劑，例如與藥學(xué)可接受試劑混合的這里描述的抗體，或者其片段，變體，衍生物或融合體。在優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物含有與藥學(xué)可接受試劑混合的部分或完全調(diào)節(jié)Ang-2的至少一種生物活性的拮抗劑特異性結(jié)合劑。典型地，所述特異性結(jié)合劑足夠純化，用于對動物施用。
            
藥物組合物可以含有制劑材料，用于調(diào)整，保持或維持，例如，組合物的pH，克分子滲透壓濃度，粘度，澄清度，顏色，等張性，氣味，無菌，穩(wěn)定性，溶解或釋放速度，吸附或滲透。合適的制劑材料包括，但不限于，氨基酸(例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸)；抗菌劑；抗氧化劑(例如抗壞血酸，亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩沖液(例如硼酸鹽，碳酸氫鹽，Tris-HCl，檸檬酸鹽，磷酸鹽，其他有機(jī)酸)；膨脹劑(例如甘露糖醇或甘氨酸)，螯合劑[例如乙二胺四乙酸(EDTA)]；絡(luò)合劑(例如咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，β-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精)；填料；單糖；二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖，甘露糖，或糊精)；蛋白質(zhì)(例如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白)；著色劑；矯味劑和稀釋劑；乳化劑；親水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成鹽抗衡粒子(例如鈉)；防腐劑(例如氯化芐烷銨，苯甲酸，水楊酸，硫貢撒，苯乙醇，羥苯甲酯，羥苯丙酯，洗必太，山梨酸或過氧化氫)；溶劑(例如甘油，丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；表面活性劑或濕潤劑(例如普流羅尼，PEG，脫水山梨糖醇酯，聚山梨酯類例如聚山梨酯20，聚山梨酯80，三硝基甲苯，氨丁三醇，卵磷脂，膽固醇，四丁酚醛)；穩(wěn)定增強(qiáng)劑(蔗糖或山梨醇)；緊張性增強(qiáng)劑(例如堿金屬鹵化物(優(yōu)選氯化鈉或氯化鉀，甘露糖醇，山梨糖醇)；運送載體；稀釋劑；賦形劑和/或藥物佐劑(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18板，A.R.Gennaro，編著，Mack Publishing Company，1990)。
            
根據(jù)例如想用的給藥途徑，送遞方式，和期望的劑量，本領(lǐng)域技術(shù)人員會確定最佳藥物組合物。參見，例如，Remington′s PharmaceuticalSciences，上文。這樣的組合物可以影響特異性結(jié)合劑的物理狀態(tài)，穩(wěn)定性，和體內(nèi)釋放速度，和體內(nèi)清除速度。
            
藥物組合物中的主要賦形劑和載體性質(zhì)可以是含水的或非水的。例如，合適的賦形劑或載體可以是注射用水，生理鹽水或人工腦脊髓液，可能補充有腸胃外給藥組合物中常用的其他材料。中性緩沖鹽水或者與血清白蛋白混合的鹽水是另外的舉例的賦形劑。其他例示的藥物組合物含有大約pH7.0-8.5的Tris緩沖液，或者大約pH4.0-5.5的乙酸緩沖液，其可以進(jìn)一步包括山梨糖醇或者合適的替代物。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以通過將具有期望程度純度的選擇的組合物和任意的配藥制劑(Remington′s Pharmaceutical Sciences，上文)混合成凍干塊狀物或水溶液而制備結(jié)合劑組合物儲存。此外，利用合適的賦形劑例如蔗糖可以將結(jié)合劑產(chǎn)物配制成凍干劑。
            
可以選擇用于腸胃外給藥的藥物組合物?；蛘?，可以選擇組合物用于吸入法或腸給藥例如口服，耳給藥，眼給藥，直腸，或陰道給藥。這樣的藥學(xué)可接受組合物的制備在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)。
            
給藥部位可接受的濃縮物中存在制劑成分。例如，使用緩沖液保持組合物為生理pH或者稍低的pH，一般在大約5至大約8的pH范圍內(nèi)。
            
當(dāng)涉及腸胃外給藥時，本發(fā)明中使用的治療性組合物可以是無熱源的藥學(xué)可接受賦形劑中含有期望的特異性結(jié)合劑的腸胃外可接受水溶液。用于腸胃外注射的特別合適的賦形劑是無菌水，其中結(jié)合劑被配制成無菌的，等張的溶液，使當(dāng)?shù)胤栏６硪粋€制備涉及用一種提供產(chǎn)物緩蝕或持續(xù)性釋放然后通過貯存注射送遞的物質(zhì)，例如可注射微球體，生物可降解顆粒，聚合物化合物(聚乳酸，聚乙醇酸)，小球，或脂質(zhì)體，將期望的分子制成制劑。也可以使用透明質(zhì)酸，它在循環(huán)中有推廣延長時間的作用。引入期望的分子的其他合適的方法包括可植入藥物送遞裝置。
            
另一方面，可以在水溶液，優(yōu)選生理可容緩沖液例如Hanks′溶液，ringer′s溶液，或者生理緩沖鹽水中配制適合腸胃外給藥的藥物制劑。含水注射懸浮液可以含有提高懸浮液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉，山梨糖醇，或葡聚糖。另外，可以將活性化合物懸浮液制備成合適的油注射懸浮液。合適的親油性溶劑或賦形劑包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯，三甘油脂，或脂質(zhì)體。非脂質(zhì)聚陽離子氨基聚合物可以用于送藥。任選地，懸浮液還可以含有合適的穩(wěn)定劑或者提高化合物溶解度的試劑，制備出高濃縮溶液。
            
在另一個實施方案中，藥物組合物可以配制成吸入法用藥。例如，可以將結(jié)合劑配制成吸入用干粉末劑。也可以用用于氣霧劑送藥的拋射劑配制多肽或核酸分子吸入用溶液。在另一個實施方案中，可以噴灑溶液。PCT申請No.PCT/US94/001875中進(jìn)一步描述了肺給藥，它描述了肺給藥化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)。
            
還涉及可以口服施用一些制劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用或不使用象片劑和膠囊這樣的固體劑型是常規(guī)使用的那些載體，能配制以這種方式給藥的結(jié)合劑分子。例如，設(shè)計膠囊，當(dāng)生物利用率最大并且系統(tǒng)之前降解最小時，在胃腸道的一點釋放制劑的活性部分?？梢院懈郊釉噭┮杂欣诮Y(jié)合劑分子的吸收。也可以使用稀釋劑，矯味劑，低熔點蠟，植物油，潤滑劑，懸浮劑，片劑崩解劑，和粘合劑。
            
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的藥學(xué)可接受載體也能將用于口服給藥的藥物組合物配制成適合口服給藥的劑型。這樣的載體使藥物組合物被配制成患者攝食的片劑，丸劑，糖衣丸，膠囊，液體，凝膠，糖漿，漿液，懸浮液，等。
            
通過將活性化合物與固體賦形劑混合并且將得到的顆?；旌霞庸ぬ幚?任選地，在研磨之后)，獲得片劑或糖衣丸核心，能獲得口服使用的藥物制劑。如果期望，可以加入合適的輔助劑。合適的輔助劑包括碳水化合物或蛋白質(zhì)，例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇，和山梨糖醇；來自玉米，小麥，稻，馬鈴薯，或其他植物的淀粉；纖維素，例如甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，或羧甲基纖維素鈉；樹膠，包括阿拉伯膠和黃芪膠；和蛋白質(zhì)，例如明膠和膠原。如果期望，可以加入崩解劑或增溶劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮瓊脂，和海藻酸或者其鹽，例如藻酸鹽。
            
糖衣丸心核可以與合適的包衣聯(lián)合使用，所述合適的包衣是例如濃糖溶液，它還可以含有阿拉伯膠，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，carbopol gel，聚乙二醇，和/或二氧化鈦，漆溶液，和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。可以向片劑或糖丸劑包衣加入染料或顏料，用于產(chǎn)物識別或者表征活性化合物的量，即，劑量。
            
可以口服使用的藥物制劑還可以包括明膠制成的適合推動的膠囊，以及明膠和包衣例如甘油或山梨糖醇制成的軟密封膠囊。適合推動的膠囊可以含有與填料或粘合劑例如乳糖或淀粉，潤滑劑，例如滑石或硬脂酸鎂，和任選地，穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可以溶解于或懸浮于合適的液體中，例如脂肪油，液體，液體聚乙二醇，有或沒有穩(wěn)定劑。
            
另一種藥物組合物可以含有與適合制備片劑的無毒賦形劑的混合物中有效量的結(jié)合劑。通過將片劑溶解于無菌水，或者其他合適的賦形劑中，可以制備單位劑量形式的溶液。合適的賦形劑包括但相比于，惰性稀釋劑，例如碳酸鈣，碳酸鈉或碳酸氫鈉，乳糖，或磷酸鈣；或粘合試劑，例如淀粉，明膠，或阿拉伯膠；或潤滑劑例如硬脂酸鎂，硬脂酸，或滑石。
            
另外的藥物組合物對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的，包括持續(xù)性釋放或緩釋送藥制劑中含有結(jié)合劑分子的制劑。配制各種各樣的其他持續(xù)性或緩釋送藥方式的技術(shù)，例如脂質(zhì)體載體，生物可降解微?；蛘叽罂仔∏蚝唾A存注射液，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是公知的。參見，例如，PCT/US93/00829，它描述了用于送遞藥物組合物的大孔聚合物微粒的緩釋。持續(xù)性釋放制劑的另外的例子包括有形物品形式的半滲透聚合物基體，例如膜，或微膠囊。持續(xù)性釋放基體可以包括聚酯類，水凝膠，聚較酯(美國專利No.3,773,919，EP 58,481)，L-谷氨酸和γL-谷氨酸乙酯的共聚物[Sidman等，Biopolymers，22547-556(1983)]，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)[Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277，(1981)]和[Langer等，Chem.Tech.，1298-105(1982)]，乙酸亞乙基乙烯酯(Langer等，上文)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。持續(xù)性釋放組合物還包括脂質(zhì)體，通過本領(lǐng)域公知的幾種方法制備。參見，例如，Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，823688-3692(1985)；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949。
            
用于體內(nèi)施用的藥物組合物一般一定要滅菌。通過滅菌過濾膜滅菌過濾能實現(xiàn)這樣。將組合物凍干，在凍干和重新配制之前或之后可以實施利用這種方法的滅菌。用于腸胃外給藥的組合物可以以凍干形式或在溶液中儲存。另外，一般將腸胃外組合物置于具有滅菌入口的容器內(nèi)，例如，帶有皮下注射針頭可穿透的塞子的靜脈溶液袋或小瓶。
            
一旦配制了藥物組合物，可以在滅菌小瓶中貯溶液，懸浮液，凝膠，乳狀液，固體，或脫水或凍干粉末劑?？梢砸源眯问交蛘咴诮o藥之前需要重新配置的形式(例如凍干的)貯存這樣的制劑。
            
在具體的實施方案中，本發(fā)明涉及用于制備單劑量給藥單位的試劑盒。試劑盒可以各自含有盛有干燥的蛋白質(zhì)的第一容器和盛有含水制劑的第二容器兩者。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括包含單個或多個小室預(yù)裝注射器(例如液體注射器和凍干劑注射器)的試劑盒。
            
治療上使用的藥物組合物的有效量取決于，例如，治療背景和主體。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白用于治療的適當(dāng)?shù)膭┝克绞遣煌?，部分取決于送遞的分子，使用的結(jié)合劑分子的適應(yīng)征，給藥途徑，和患者的大小(體重，體表面或器官大小)和狀況(年齡和一般的健康情況)。因此，臨床醫(yī)師可以確定劑量并且改變給藥途徑，以獲得最佳治療效果。根據(jù)上面提到的因素，典型的劑量范圍是大約0.1mg/kg至最多大約100mg/kg或者更多。在其他實施方案中，劑量范圍可以是0.1mg/kg最多至100mg/kg；或者1mg/kg至最多大約100mg/kg；或者5mg/kg至最多大約100mg/kg。
            
對于任何化合物，開始時在細(xì)胞培養(yǎng)物或者動物模型例如小鼠，大鼠，兔，狗，豬，或猴中能估計治療有效劑量。還可以使用動物模型來確定合適的濃度范圍和給藥途徑。然后利用這樣的信息來確定對人給藥的有用的劑量和途徑。
            
考慮與需要治療的受試者相關(guān)的因素確定精確劑量。調(diào)節(jié)劑量和施用，提供足夠水平的活性化合物或者保持期望的作用?？梢钥紤]的因素包括病態(tài)的嚴(yán)重性，受者的一般健康，受者的年齡，體重和性別，該藥的時間和次數(shù)，藥物聯(lián)合，反應(yīng)靈敏性，對治療的反應(yīng)。根據(jù)特定制劑的半壽期和清除率，可以每3-4天，每周，或者每兩周施用長效藥物組合物。
            
給藥次數(shù)取決于使用的制劑中結(jié)合劑分子的藥物動力學(xué)參數(shù)。一般地，施用組合物，直到用量達(dá)到期望的作用。因此，可以用單劑量，或隨時間多次給藥(以相同或不同濃度/劑量)，或者連續(xù)輸液，可以施用組合物。合適劑量的進(jìn)一步精確給藥方案是常規(guī)制定的。通過使用適當(dāng)?shù)膭┝?反應(yīng)數(shù)據(jù)，可以確定合適的劑量。
            
藥物組合物的給藥途徑與已知方法相一致，例如口服，通過靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，大腦內(nèi)(薄壁組織內(nèi))，腦室內(nèi)，肌內(nèi)，眼內(nèi)，動脈內(nèi)，肝門內(nèi)，病灶內(nèi)途徑注射，骨髓內(nèi)，鞘內(nèi)，室內(nèi)，經(jīng)皮，皮下，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，腸內(nèi)，局部，舌下，尿道，陰道，或者直腸方式，通過持續(xù)性釋放系統(tǒng)或者通過埋入裝置。期望時，通過大丸劑注射，或者通過輸液或者通過埋入裝置連續(xù)施用組合物。
            
或者，另外，通過埋入其上已經(jīng)吸收或者包在其中有期望的分子的膜，海綿狀物質(zhì)，或者其他合適的材料，可以局部施用組合物。當(dāng)使用埋入裝置時，可以將裝置埋入任何合適的組織或器官，期望的分子的送遞可以通過擴(kuò)散，隨時間釋放的大丸劑，或者連續(xù)給藥。
            
在某些情況下，期望以來自體內(nèi)的方式使用藥物組合物。在這樣的情況下，使來自患者的細(xì)胞，組織，或器官接觸藥物組合物，其后接著將這些細(xì)胞，組織，和/或器官植回給患者。
            
在另外的情況下，本發(fā)明的結(jié)合劑例如特異結(jié)合劑能通過埋入利用這里描述的方法經(jīng)基因工程處理表達(dá)和分泌多肽的細(xì)胞送遞。這樣的細(xì)胞可以是動物或人細(xì)胞，并且可以是自身的，異種的，或異基因的。任選地，細(xì)胞可以是無限增殖的。為了減小免疫應(yīng)答機(jī)會，可以將細(xì)胞包在莢膜內(nèi)，以避免周圍組織滲透。密封材料是生物相容的半滲透聚合物外殼或膜，它允許蛋白質(zhì)產(chǎn)物釋放但是防止患者免疫系統(tǒng)或者周圍組織的其他有害因子對細(xì)胞的破壞。
            
聯(lián)合治療在Ang-2病理的治療中，本發(fā)明的特異性結(jié)合劑可以與其他治療法聯(lián)合應(yīng)用。這些其他療法包括，例如放射療法，化療藥物和其它生長因子。
            
化療治療可以使用抗腫瘤藥物，包括，例如，烷基化試劑，包括氮芥，例如雙氯乙基甲胺，環(huán)磷酰胺，異磷酰胺，左旋溶肉瘤素和苯丁酸氮芥；亞硝基脲類，例如卡氮芥(BCNU)，洛氮芥(CCNU)，和司莫司汀(甲基-CCNU)；氮丙啶/甲基三聚氰胺例如三亞乙基三聚氰胺(TEM)，三胺硫磷，硫替哌(噻替哌)，六甲基三聚氰胺(HMM，六甲蜜胺)；磺酸烷基酯，例如白消安；三嗪類，例如達(dá)卡巴嗪(DTIC)；抗代謝物，包括葉酸類似物，例如甲氨喋呤和曲美沙特，嘧啶類似物，例如5-氟尿嘧啶，氟去氧尿苷，吉西他濱，胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖孢苷)，5-氮雜胞苷，2，2′-二氟脫氧胞苷，嘌呤類似物，例如6-巰基嘌呤，6-硫代鳥嘌呤，硫唑嘌呤，2′-脫氧助間型霉素(噴司他丁)，赤型羥基壬基腺嘌呤(EHNA)，磷酸氟達(dá)拉濱，和2-氯脫氧腺苷(克拉屈濱，2-CdA)；天然產(chǎn)物，包括抗有絲分裂藥物，例如紫杉醇，長春花生物堿，包括長春堿(VLB)，長春新堿，和長春烯堿，脫乙?；仙即迹颇就。望}酸雌莫司汀；ppipodophylotoxins例如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素例如actimomycin D，柔毛霉素(柔紅霉素)，阿霉素，二羥蒽二酮，去甲柔毛霉素，博萊霉素，光輝霉素(普卡霉素)，絲裂霉素C，和放線菌素；酶例如L-天冬酰胺酶；生物學(xué)反應(yīng)修飾劑例如干擾素-α，IL-2，G-CSF和GM-CSF；各種藥物例如鉑復(fù)合物例如順鉑和卡鉑，蒽二酮類例如二羥蒽二酮，取代的脲例如羥基脲，甲基肼衍生物包括N-甲基肼(MIH)和甲芐肼，腎上腺皮質(zhì)抑制劑例如米托坦(o，p′-DDD)和安魯米特；激素和拮抗劑包括腎上腺皮質(zhì)激素甾族化合物拮抗劑例如強(qiáng)的松和等價物，地塞米松和安魯米特；孕激素例如長效黃體酮，甲羥孕酮乙酸鹽和甲地孕酮乙酸鹽；雌激素例如己烯雌酚和乙炔基雌二醇等價物；抗雌激素例如他莫西芬；雄激素包括丙酸睪丸和氟甲睪酮/等價物；抗雄激素例如氟他胺，促性腺素釋放激素類似物和抑那通；和非甾族抗雄激素例如氟他胺。
            
和生長因子的聯(lián)合治療包括細(xì)胞因子，淋巴因子，生長因子，或者其他造血因子，例如M-CSF，GM-CSF，TNF，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IFN，TNF0，TNF1，TNF2，G-CSF，Meg-CSF，GM-CSF，血小板生成素，干細(xì)胞因子，和紅細(xì)胞生成素。其他成分包括已知的血小板生成素，例如Ang-1，-2，-4，-Y，和/或人Ang-樣多肽，和/或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。生長因子包括血管生成素，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-3，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-8，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-10，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-11，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-12，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-13，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-14，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15，骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IA，骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB，腦起源神經(jīng)營養(yǎng)因子，睫狀營養(yǎng)佳良因子，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體，細(xì)胞因子-誘導(dǎo)的嗜中性白細(xì)胞趨化因子1，細(xì)胞因子-誘導(dǎo)的嗜中性白細(xì)胞趨化因子2，內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，內(nèi)皮素1，表皮生長因子，來自上皮的嗜中性白細(xì)胞誘引劑，成纖維細(xì)胞生長因子4，成纖維細(xì)胞生長因子5，成纖維細(xì)胞生長因子6，成纖維細(xì)胞生長因子7，成纖維細(xì)胞生長因子8，成纖維細(xì)胞生長因子8b，成纖維細(xì)胞生長因子8c，成纖維細(xì)胞生長因子9，成纖維細(xì)胞生長因子10，酸性成纖維細(xì)胞生長因子，堿性成纖維細(xì)胞生長因子，得自神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系的嗜中性細(xì)胞因子受體-1，得自神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系的嗜中性細(xì)胞因子受體-2，生長相關(guān)蛋白質(zhì)，生長相關(guān)蛋白質(zhì)-1，生長相關(guān)蛋白質(zhì)-2，生長相關(guān)蛋白質(zhì)-3，肝素結(jié)合表皮生長因子，肝細(xì)胞生長因子，肝細(xì)胞生長因子受體，胰島素-樣生長因子I，胰島素-樣生長因子受體，胰島素-樣生長因子II，胰島素-樣生長因子結(jié)合蛋白，角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子，白血病抑制因子，白血病抑制因子受體-1，神經(jīng)生長因子，神經(jīng)生長因子受體，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4，胎盤生長因子，胎盤生長因子2，得自血小板的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，得自血小板的生長因子，得自血小板的生長因子A鏈，得自血小板的生長因子AA，得自血小板的生長因子AB，得自血小板的生長因子B鏈，得自血小板的生長因子BB，得自血小板的生長因子受體-1，得自血小板的生長因子受體-2，pre-B細(xì)胞生長刺激因子，干細(xì)胞因子，干細(xì)胞因子受體，轉(zhuǎn)化生長因子-1，轉(zhuǎn)化生長因子-2，轉(zhuǎn)化生長因子-1.2，轉(zhuǎn)化生長因子-3，轉(zhuǎn)化生長因子-5，潛伏型轉(zhuǎn)化生長因子-1，轉(zhuǎn)化生長因子-1結(jié)合蛋白I，轉(zhuǎn)化生長因子-1結(jié)合蛋白II，轉(zhuǎn)化生長因子-1結(jié)合蛋白III，腫瘤壞死因子受體I型，腫瘤壞死因子受體II，尿激酶型纖溶酶原激活劑受體，血管內(nèi)皮生長因子，及其嵌合蛋白和生物學(xué)或免疫學(xué)活性片段。
            
免疫治療免疫治療一般依賴定向并破壞癌細(xì)胞的免疫效應(yīng)子細(xì)胞和分子的使用。免疫效應(yīng)子可以是，例如，識別靶細(xì)胞表面上的一些標(biāo)記的本發(fā)明的特異結(jié)合劑。單獨的抗體可以用作治療的效應(yīng)子或者它可以補充其他細(xì)胞來實際實施細(xì)胞殺傷。抗體也可以偶聯(lián)藥物或毒素(化療藥物，放射性核素，蓖麻毒A鏈，霍亂毒素，百日咳毒素，等)，因此可以只作為靶向試劑。
            
根據(jù)本發(fā)明，通過免疫療法可以將Ang-2的突變形式靶向于本發(fā)明的抗體或抗體偶聯(lián)物。特別考慮本發(fā)明的抗體組合物可以與結(jié)合Ang-2靶向治療的治療方法聯(lián)合應(yīng)用。
            
已經(jīng)證明被動免疫療法對于抗多種癌癥特別有效。參見，例如，WO98/39027。
            
下面的實施例只是為了詳細(xì)說明的目的，而不應(yīng)該認(rèn)為在任何方面限制本發(fā)明的范圍。
            
實施例1病理組織和正常組織中Ang-2表達(dá)利用原位雜交檢查正常和病理組織中Ang-2表達(dá)。通過逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR從人或鼠胎兒肺cDNA擴(kuò)增人(Genbank Accession NumberAF004327，核苷酸1274-1726)和鼠(Genbank Accession NumberAF004326，核苷酸1135-1588)Ang-2序列的片段，克隆到質(zhì)粒pGEM-T中，并且通過測序證實。使用33P-UTP和RNA聚合酶從線性化質(zhì)粒模板轉(zhuǎn)錄33P-標(biāo)記反義RNA探針。甲醛固定化的石蠟包埋的組織塊切成5微米，并且收集在帶電載玻片上。原位雜交之前，組織用0.2M HCL，接著用蛋白酶K消化，并且用三乙醇胺和乙酸酐進(jìn)行乙?；饔谩?5℃下切片與放射性標(biāo)記探針雜交過夜，然后進(jìn)行RNA酶消化，并且在大約0.1XSSC在55℃下高嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌，將載玻片浸入Kodak NTB2乳劑中，4℃下暴露2-3周，顯影，并且復(fù)染色。在黑暗區(qū)和標(biāo)準(zhǔn)照明下檢查切片，同時評價形態(tài)學(xué)和雜交信號。
            
結(jié)果表明正常產(chǎn)后人，Ang-2表達(dá)限于包含血管發(fā)生脈管系統(tǒng)的少數(shù)組織，例如卵巢，胎盤，和子宮。在正常成年人心臟，腦，腎，肝，肺，胰腺，脾，肌肉，扁桃體，胸腺，闌尾，淋巴結(jié)，膽囊，前列腺或睪丸和子宮中沒有可檢測的Ang-2表達(dá)。在五周大小的小鼠(而不是成年猴子或人)，腎顯示直小管中顯著的Ang-2表達(dá)。為了確定這種表達(dá)是不是胚胎發(fā)育遺留的，使用鼠Ang-2探針和上述條件對最大一年齡大小的小鼠源的腎反復(fù)進(jìn)行這項實驗。在新生兒發(fā)育期發(fā)現(xiàn)Ang-2表達(dá)降低，但是一年齡小鼠的腎中仍然明顯。
            
事實上對試驗的所有腫瘤類型檢查了Ang-2表達(dá)，包括，原發(fā)性人腫瘤，例如結(jié)腸癌(5例)，乳房癌(10例)，肺癌(8例)，惡性膠質(zhì)瘤(1例)，轉(zhuǎn)移性人腫瘤，例如乳房癌(2例)，肺癌(2例)，和卵巢癌(2例)，已經(jīng)轉(zhuǎn)移到腦，和嚙齒動物腫瘤模型例如C6(大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤)，HT29(人結(jié)腸癌)，Colo-205(人結(jié)腸癌)，HCT116(人結(jié)腸癌)，A431(人表皮樣瘤)，A673(人橫紋肌肉瘤)，HT1080(人纖維肉瘤)，PC-3(人前列腺癌)，B16F10(鼠黑素瘤)，MethA(鼠肉瘤)，和Lewis肺癌。另外，對反應(yīng)VEGF的生長到Matrigel栓中的新血管和早產(chǎn)視網(wǎng)膜病小鼠低氧癥模型檢查Ang-2表達(dá)。
            
實施例2重組mAng-2蛋白和兔多克隆抗-Ang-2抗血清的產(chǎn)生使用全長人Ang-2的PCR引物，通過PCR(Clontech AdvantagePCR Kit，Cat.#K1905-01)從鼠15日胚胎DNA文庫(Marathon-Ready-cDNA，Cat.#；7459-1，Clonetech，Inc.)獲得全長的，帶組氨酸標(biāo)記的Ang-2 cDNA。使用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche，Cat.#；1814443)將PCR產(chǎn)物連接至CMV啟動子表達(dá)載體中，將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HT1080人纖維肉瘤細(xì)胞(得自ATCC)中。通過G418選擇分離穩(wěn)定的克隆?？菇M氨酸標(biāo)記和蛋白印跡篩選表達(dá)mAng-2-his的克隆。
            
從這些細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(C.M.)純化重組的mAng-2多肽。通過兩步層析方法純化含mAng-2-His的C.M。簡言之，通過添加pH9.5的Tris緩沖液將條件培養(yǎng)基滴定到約20mM的終濃度。此外，加入去污劑CHAPS至大約5mM的終濃度。然后將C.M.直接加至陰離子交換柱Q-sepharose ff(Pharmacia)。然后用含有大約50mM NaCl的大約10mM Tris pH8.0洗滌柱。用含有大約350mM NaCl和大約5mMCHAPS的10mM Tris pH8.0以單個步驟洗脫重組的Ang-2-His。
            
將Q-sepharose柱的洗脫物調(diào)節(jié)至大約4mM咪唑，并且加至固定化的金屬親和柱(Ni-NTA superflow[Qiagen])。用含有大約5mMCHAPS和大約100mM咪唑的PBS洗脫結(jié)合的蛋白。然后將洗脫物濃縮至大約1.0mg/ml，然后用PBS透析，通過SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色測量mAng-2-His的純度大于90％。
            
用大約0.2mg mAng-2/注射免疫兔，以產(chǎn)生抗體。用1∶1的大約1mL Hunter′s TiterMax(Sigma)和mAng-2注射兔。四周后，每只兔接受重復(fù)注射或加強(qiáng)；此后兩周，接受下一次加強(qiáng)，在第7周，取出血清，評估對mAng-2的滴度。如果血清滴度高，連續(xù)6周每周取出50mL產(chǎn)物血液。然而，如果血清滴度低，對兔進(jìn)行一次額外的加強(qiáng)，從第9周開始連續(xù)6周每周取出50mL產(chǎn)物血液。連續(xù)六周取血后，讓兔休息6周。如果需要更多血清，最后一次取血后一個月對兔再進(jìn)行一次加強(qiáng)。
            
使用中和ELISA(描述于下文)，觀察來自兩只兔5254和5255的抗-mAng-2兔多克隆抗血清對mAng-2Tie2相互作用的中和。
            
實施例3評價Ang-2抗體的分子測定進(jìn)行分子測定(親和力ELISA，中和作用ELISA，和BIAcore)評價結(jié)合Ang-2和相關(guān)家族成員的直接抗體，以及抗體對Ang-2Tie-2相互作用的作用。下面詳細(xì)描述這些體外和基于細(xì)胞的測定。
            
A.親和力ELISA為了最初篩選侯選抗-Ang-2抗體，使用純化的人Ang-2(R&DSystems，Inc；目錄號623-AN；Ang-2以2個截短型的混合物被提供)或鼠Ang-2多肽(如上所述制備)。為了證實結(jié)合測試，從用全長人Ang-2 DNA轉(zhuǎn)染的人293T細(xì)胞的條件培養(yǎng)基獲得人Ang-2并且在含有大約50微克/毫升牛血清白蛋白(BSA)的無血清Dulbecco′s修飾的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。
            
使用微量滴定板，向每個孔加入大約100微升/孔Ang-2，并且將板溫育大約2小時，然后用含有大約0.1％Tween-20的磷酸緩沖鹽水(PBS)將板沖洗四次。然后對于每孔用250微升的大約5％BSA的PBS溶液封閉各孔，板在室溫下溫育大約2小時。溫育之后，棄除過量的封閉溶液，向孔中加入大約100微升的各種侯選抗-Ang-2抗體，稀釋系列開始濃度是大約40毫微摩爾，然后在含有大約1％BSA的PBS中系列稀釋4倍。培養(yǎng)板然后在室溫下溫育過夜。溫育之后，用含有大約0.1％Tween-20的PBS沖洗平板。將沖洗又重復(fù)四次，然后向每孔加入在含有1％BSA的PBS中以1∶5000預(yù)先稀釋的山羊抗-人IgG(Fc)-HRP(Pierce Chemical Co.，catalog #31416)大約100微升。培養(yǎng)板在室溫下溫育大約1小時。然后在含有大約0.1％Tween-20的PBS沖洗平板五次，然后每孔加入大約100微升的TMB(3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺液體底物體系；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.，目錄號T8665)底物，并且將培養(yǎng)板溫育大約5-15分鐘直到顯示藍(lán)色。然后在分光光度計上在大約370nm讀取吸光度。
            
B.中和作用ELISA根據(jù)對于親和力ELISA所描述的制備結(jié)合了人Ang-2多肽的微量滴定板。在含有大約1％BSA和大約1nM Tie-2(Tie-2-Fc分子提供，其中Tie-2部分只含有該分子的可溶性胞外部分；R&D Systems，目錄號313-TI)的PBS溶液中以4倍稀釋度從1000nM至0.2pM滴定侯選抗-Ang-2抗體。向各孔加入大約100微升的抗體/Tie-2溶液之后，培養(yǎng)板在室溫下溫育過夜，然后用含有大約0.1％Tween-20的PBS清洗五次。沖洗之后，每孔加入大約100微升的抗-Tie-2抗體(Pharmingen Inc.，catalog #557039)，最終濃度達(dá)到大約1微克/毫升，培養(yǎng)板在室溫下溫育大約1小時。接著，以含有大約1％BSA的PBS中以1∶10,000的稀釋度每孔加入大約100微升山羊抗-小鼠-IgG-HRP(Pierce Chemical CO.，catalog #31432)。培養(yǎng)板在室溫下溫育大約1小時，然后用含有大約0.1％Tween-20的PBS清洗五次。然后每孔加入大約100微升的TMB底物(如上所述)，使得顯色。然后在分光光度計上在大約370nm讀取吸光度。
            
C.親和力BIAcore使用PBS和0.005％P20表面活性劑(Biacore，Inc.)作為洗脫緩沖液在BIAcore2000(Biacore，Inc.，Piscataway，N.J.)上進(jìn)行各種侯選Ang-2抗體的親和力分析。使用Amine Coupling Kit(Biacore，Inc.)根據(jù)供應(yīng)商建議的方法通過伯胺基團(tuán)將重組蛋白質(zhì)G(Repligen，Needham，Mass.)固定到研究級CM5傳感器芯片(Biacore，Inc.)上。
            
通過首先將大約100Ru的各種侯選抗-Ang-2抗體捕獲到固定的蛋白質(zhì)G，然后以50微升/分鐘的流速向結(jié)合的抗體表面注射各種濃度的(0-100nM)的huAng-2或mAng-2三分鐘，進(jìn)行結(jié)合分析。應(yīng)用BIA求值3.1計算機(jī)程序(Biacore，Inc.)測定抗體結(jié)合動力學(xué)參數(shù)，包括ka(締合作用速度常數(shù))，kd(離解作用速度常數(shù))和KD(離解平衡常數(shù))。離解平衡常數(shù)越低，表明抗體對Ang-2的親和力越大。
            
實施例4通過噬菌體展示產(chǎn)生完全的人Ang-2抗體按照以下方案，通過對人Ang-2多肽(R and D Systems Inc.，catalog 623-AN)淘選Target Quest噬菌體展示Fab文庫(TargetQuest，Inc.)而產(chǎn)生完全的人抗體。
            
通過兩種方法將人Ang-2固定在聚苯乙烯磁珠表面(1)4℃下以50ug/ml直接包被Ang-2過夜；和(2)通過山羊抗Ang-2抗體4℃下以50ug/ml間接捕獲過夜。用PBS中的2％乳(MPBS)封閉珠表面。預(yù)選人Fab噬菌體文庫，以去除與未包被的磁珠或山羊抗-Ang-2抗體反應(yīng)的噬菌體克隆。然后在室溫下用噬菌體文庫溫育Ang-2包被的磁珠過夜。噬菌體結(jié)合步驟之后，用含有大約0.1％Tween 20的MPBS洗滌表面6次，然后用含有大約0.1％Tween 20的PBS洗滌6次，然后用PBS洗滌兩次。首先用大約100ug/ml人Tie2-Fc(R and D Systems，Minneapolis，MN)，然后用大約100mM三乙醇胺洗脫結(jié)合的噬菌體。將洗脫的噬菌體感染至大腸桿菌TG1細(xì)胞，擴(kuò)增，并且回收進(jìn)行下一輪篩選。通過進(jìn)行更嚴(yán)格的洗滌和減少輸入噬菌體的數(shù)目在連續(xù)的輪次中增加選擇壓力。進(jìn)行3輪選擇后，鑒定18個獨特的Ang-2結(jié)合Fab克隆，使用上文所述的ELISA親和力測定進(jìn)行檢測，幾乎所有的克隆都被識別為人Ang-2，小鼠Ang-2和大鼠Ang-2。這些噬菌體的大約10％也結(jié)合人Ang-1。按照下文所述將這些克隆轉(zhuǎn)化為IgG1抗體。
            
為了獲得其它獨特的噬菌體，使用相同文庫但略有不同的方案進(jìn)行第二輪篩選。在此方案中，在大約4℃下在Nunc maxisorp免疫管中將人Ang-2鋪于pH9.6的NaHCO3緩沖液中過夜。分別在1、2和3輪淘選中平鋪約1.5，0.74和0.3ug/ml的Ang-2。用PBS中的大約2％乳(MPBS)封閉免疫管表面，然后在大約4ml 2％MPBS中用來自上文提到的相同噬菌體展示文庫(Target Quest)的約2萬億個噬菌體顆粒(文庫中的大約50拷貝的每種獨特的噬菌體)溫育。噬菌體溫育步驟之后，用PBS加大約1％Tween 20洗滌表面20次，然后用PBS洗滌20次。用1uM hAng-2或1uM人Tie2(R and D Systems，如上文所述)洗脫結(jié)合的噬菌體。將洗脫的噬菌體感染至大腸桿菌TG1細(xì)胞(與噬菌體文庫一起提供)，擴(kuò)增，并且回收進(jìn)行下一輪篩選。通過PCR擴(kuò)增與hAng-2或Tie2結(jié)合的所有噬菌體，鑒定16個獨特的Ang-2結(jié)合Fab克隆，并且通過限制性消化分析這些克隆。對每個克隆的DNA進(jìn)行測序。
            
用互補引物擴(kuò)增每個噬菌體的每個重鏈可變區(qū)的編碼序列。設(shè)計引物以在可變區(qū)的5’末端摻入HindIII位點，XbaI位點，Kozak序列和信號序列(翻譯的肽為MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC；SEQ ID NO69)，而將BsmBI位點加在PCR產(chǎn)物的3’末端上。作為如何克隆重鏈的一個例子，用添加信號序列的最后7個氨基酸的引物2248-21(GTG GTT GAGAGG TGC CAG ATG TCA GGT CCA GCT GGT GCA G；SEQ ID NO70)和將BsmBI位點加在可變區(qū)末端的2502-31(ATT ACG TCT CAC AGT TCGTTT GAT CTC CAC；SEQ ID NO71)擴(kuò)增克隆544的模板噬菌體DNA(Seq ID No.19)。使用將9個氨基酸加至信號肽(AQLLGLLLL；SEQ IDNO73)的引物2148-98(CCG CTC AGC TCC TGG GGC TCC TGC TAT TGTGGT TGA GAG GTG CCA GAT；SEQ ID NO72)，然后使用2502-31，然后使用2489-36(CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAGGGT CCC CGC TCA GCT CCT GGG；SEQ ID NO74)和2502-31擴(kuò)增得到的產(chǎn)物。引物2489-36從5′至3′添加HindIII位點，XbaI位點，Kozak序列和信號序列的前6個氨基酸。用XbaI和BsmBI消化PCR產(chǎn)物，然后克隆到含有人IgG1恒定區(qū)的哺乳動物表達(dá)載體中。該載體含有SV40啟動子和DHFR選擇。
            
來自每個噬菌體的輕鏈?zhǔn)铅驶颚祟愋?。對于每種輕鏈，設(shè)計互補引物，以便從從5′至3′添加HindIII位點，XbaI位點，Kozak序列和信號序列(如上文所述)。將具有無錯誤編碼區(qū)的那些鏈克隆為全長產(chǎn)物。作為一個例子，用添加信號序列的最后7個氨基酸的引物2627-69(GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TGA CAT TGT GAT GAC TCAGTC TCC；SEQ ID NO75)和在終止密碼子之后添加SalI位點的引物2458-54(CTT GTC GAC TTA TTA ACA CTC TCC CCT GTT G；SEQ ID NO76)擴(kuò)增作為全長編碼區(qū)的噬菌體克隆536的輕鏈(Seq ID NO.11)。然后如前所述分別用與引物2458-54配對的額外的5’引物，2148-98和2489-36擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，完成信號序列和克隆位點的最終添加。將全長輕鏈作為XbaI-SalI片段克隆至上文所述的哺乳動物表達(dá)載體中。
            
與天然人恒定區(qū)序列相比，某些λ克隆在它們的恒定區(qū)中具有錯誤。為了糾正這些差異，用編碼理想λ恒定區(qū)和噬菌體來源的可變區(qū)的DNA進(jìn)行重疊PCR。這些克隆也克隆為如上文所述的XbaI-SalI片段。
            
當(dāng)κ可變區(qū)與它們的恒定區(qū)獨立進(jìn)行克隆時，將BsmBI位點添加至PCR產(chǎn)物的3’末端。用XbaI和BsmBI消化PCR產(chǎn)物后，將κ鏈可變區(qū)克隆至含有人κ恒定區(qū)的表達(dá)載體中。
            
采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen Corp.)，一般根據(jù)制造商建議的程序?qū)碜悦總€轉(zhuǎn)化的噬菌體的成對輕鏈和重鏈構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后14-16小時更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞傳代至組織培養(yǎng)皿中，用于按照制造商的推薦在大約48小時后進(jìn)行選擇。通過HT選擇大約3周而分離轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，此時用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞集落，并且合并至轉(zhuǎn)染細(xì)胞的“合并物”中。
            
48小時后收集小規(guī)模條件培養(yǎng)基，并且使用抗人Fc抗體、抗人κ抗體或抗人λ抗體，通過蛋白印跡分析抗體產(chǎn)生。然后使用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)無菌技術(shù)，在選擇壓力下傳代選擇的細(xì)胞群，直到獲得足夠的細(xì)胞，接種4個850cm2的滾瓶，每個滾瓶中接種2×107個存活細(xì)胞，并且使用DMSO制備冷凍的儲備細(xì)胞系。接種后，將細(xì)胞維持在裝有補加了谷氨酰胺和非必須氨基酸的含大約10％血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco/BRL，Inc)中。將細(xì)胞維持大約2-3天，直到達(dá)到約80％的細(xì)胞鋪滿度。此時將滾瓶中的培養(yǎng)基更換為補加了谷氨酰胺和非必須氨基酸的無血清培養(yǎng)基混合物(50％DMEM，50％F12，Gibco)。7天后收獲條件培養(yǎng)基，添加新鮮的無血清培養(yǎng)基，用于一次或兩次額外的收獲。
            
采用標(biāo)準(zhǔn)程序，通過蛋白G親和層析直接從條件培養(yǎng)基純化抗體。采用低pH(約pH3)緩沖液完成從蛋白G柱的洗脫，此后用1M Tris，pH8.5中和洗脫的抗體蛋白，然后用10kD分子量截斷離心濃縮器濃縮。然后將濃縮的抗體儲液緩沖交換到PBS中。
            
產(chǎn)生了31種抗體，每一種由兩條重鏈和兩條輕鏈(κ或λ)組成，命名見下表2。
            
表2 
            
表2(續(xù)) 
            
*按此處描述，測定與hAng-2，mAng-2，和hAng-1的結(jié)合。
            
以下四個表列出了從噬菌體轉(zhuǎn)化至全長IgG1抗體的31個抗-Ang-2抗體的重鏈和輕鏈(κ和λ)的序列和SEQ ID Nos。用VBASE數(shù)據(jù)庫，采用Kabat等在Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(NIH公開號91-3242；U.S.Dept.Health and HumanServices，5th ed.)中描述的技術(shù)預(yù)測單克隆抗體的互補決定區(qū)(CDRs)。將Fab區(qū)與數(shù)據(jù)庫中具有最接近的種系序列(見http//www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/restricted/ALIGNMENTS.html)的序列進(jìn)行比對，然后肉眼比較所述序列。每個可變區(qū)(重鏈或輕鏈)的CDRs如表7所示。
            
表3重鏈可變區(qū)   
            
表4κ鏈可變區(qū)  
            
表5λ鏈可變區(qū)  
            
表6人恒定區(qū)(CR) 
            
表7Ang-2抗體的重鏈(HC)和輕鏈(LC)的互補決定區(qū)(CDRs)   
            
采用親和和中和ELISA(如上文實施例3所述)以及BIAcore中和測定(如上文實施例3所述)檢驗17種抗體和陰性對照IgG1(稱作asRDB1)，以確定它們的親和力、中和和特異性能力。結(jié)果見下表(表8)，并且使用標(biāo)準(zhǔn)程序計算。
            
表8Ang-2抗體EC50s和IC50s 
            
采用上述BIAcore分析，評估兩種抗體，克隆536和克隆545。按上述對于BIAcore測定的描述確定抗體結(jié)合，較低的KDS表示較高的親和力，結(jié)果報道于下表9。
            
表9hAng-2和mAng-2的抗體親和力 
            
實施例5采用抗-Ang-2抗體的療效研究在小鼠中檢驗蛋白G純化的兔抗Ang-2多克隆抗體的藥代動力學(xué)。用多克隆抗-Ang-2兔抗體處理24只小鼠(1mg/小鼠)。在注射抗體后的以下時間點處死4只受治療的動物1小時，6小時，1天，3天，7天和14天。
            
結(jié)果表明，總的兔IgG在血清中具有大約19天的循環(huán)半衰期，而總IgG的抗-Ang-2 IgG成分具有大約8天的半衰期。
            
為評估療效，在異種移植后1，5，6，7，8，12，13，14，15，和18天后，腹膜內(nèi)給予攜帶A431腫瘤異種移植物的小鼠(10只動物/組)10劑(每劑約10mg IgG/小鼠)蛋白G純化的抗-mAng-2多克隆抗體。在第0，7，15和21天，測量體重，所述體重不受處理的影響。通過重復(fù)測量ANOVA，結(jié)果表明，與未免疫純化的多克隆抗血清(10mg IgG/小鼠/劑)和載體(PBS)對照相比，抗-Ang-2多克隆抗體抑制A431腫瘤異種移植物大約50％的生長，p＝0.008。
            
為檢驗完全的人單克隆抗-Ang-2抗體的體內(nèi)效力，用抗Ang-2抗體克隆533，537或544，或PBS或人IgG1-κ陰性對照腹膜內(nèi)處理攜帶A431腫瘤異種移植物的小鼠(10只動物/組)。第一劑給予大約420ug蛋白/小鼠，下三次給藥時每次給予大約140ug蛋白/小鼠，下四次給藥時每次給予大約55ug蛋白/小鼠，每只小鼠總共給予8劑。每周兩次記錄腫瘤體積和體重。研究末，處死動物，收集它們的血清用于通過ELISA測量抗體水平。從所有組收集腫瘤和正常組織。
            
如圖1所示，抗-Ang-2處理組和對照組的腫瘤生長有顯著差異。與對照組相比，所有三種抗-Ang-2處理都抑制腫瘤生長(在所有處理中，重復(fù)測量3種抗體的ANOVA，p＜.005vs.hIgG1對照)。相反，對照組中的腫瘤以更高的速度繼續(xù)生長)。
            
實施例6表位定位將全長(氨基酸1-495)，N-末端(氨基酸1-254)和C-末端(氨基酸255-495)人Ang-2(hAng-2)蛋白質(zhì)克隆到帶有C-末端6xHis標(biāo)記的CMV-驅(qū)動哺乳動物表達(dá)載體中。將三個得到的構(gòu)建體加載體對照物瞬時表達(dá)到293T細(xì)胞中。然后從感染的細(xì)胞收集條件培養(yǎng)基，并且通過6xHis ELISA和蛋白質(zhì)印跡估計培養(yǎng)基中Ang-2的表達(dá)水平。
            
根據(jù)下面的方案通過ELISA，通過它們結(jié)合人hAng-2的三種版本的能力，測定抗-Ang-2抗體和肽抗體的結(jié)合表位每孔用100微升條件培養(yǎng)基包被高結(jié)合96-孔測定板，并且在37℃下溫育1小時。吸出條件培養(yǎng)基，室溫下每孔用200微升5％BSA的PBS溶液封閉平板1小時。然后吸出封閉溶液。以1微克/毫升1％BSA的PBS溶液每孔加入100微升抗體，肽抗體，或Tie2-Fc，并且室溫下溫育1小時。用200微升0.1％Tween的PBS溶液將孔洗滌四次。每孔加入100微升HRP-偶聯(lián)的山羊抗-人IgG或山羊抗-小鼠IgG，并且室溫下溫育45分鐘。然后用200微升0.1％Tween的PBS溶液將孔洗滌四次。然后每孔加入100微升TMB底物。在370nm下讀取O.D.。
            
圖2a，圖2b，和圖2c給出結(jié)果。
            
序列表<110>AMGEN INC.
            
<120>血管生成素-2的特異結(jié)合劑<130>A-722A<140>未確定<141>2002-10-11<150>US 60/328,604<151>2001-10-11<160>76<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>123<212>PRT<213>人<400>1Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1   5   10  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20  25  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35  40  45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50  55  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65  70  75  80
            
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Pro Tyr Ala Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>2<211>112<212>PRT<213>人<400>2Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1   5   10  15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20  25  30Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35  40  45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro50  55  60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65  70  75  80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85  90  95Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>3<211>123<212>PRT<213>人<400>3Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1   5   10  15
            
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20  25  30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50  55  60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Gly Val Val Gly Asp Phe Asp Trp Leu Ser Phe Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>4<211>107<212>PRT<213>人<400>4Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln1   5   10  15Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Tyr Thr Tyr Thr20  25  30Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Phe35  40  45Gln Asp Phe Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser50  55  60Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met65  70  75  80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Thr Thr Ala Val85  90  95Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu100 105
            
<210>5<211>120<212>PRT<213>人<400>5Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1   5   10  15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20  25  30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50  55  60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr65  70  75  80Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Asp Arg Glu Asp Thr Ala Met Val Phe Asn Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>6<211>111<212>PRT<213>人<400>6Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln1   5   10  15Lys Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn20  25  30Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35  40  45
            
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50  55  60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln65  70  75  80Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu85  90  95Ser Ala Phe Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>7<211>122<212>PRT<213>人<400>7Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1   5   10  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20  25  30Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35  40  45Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50  55  60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65  70  75  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85  90  95Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Trp100 105 110Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>8<211>106<212>PRT<213>人
            
<400>8Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln1   5   10  15Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala20  25  30Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35  40  45Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser50  55  60Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu65  70  75  80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser His Val Val85  90  95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105<210>9<211>121<212>PRT<213>人<400>9Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1   5   10  15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20  25  30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35  40  45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50  55  60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65  70  75  80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85  90  95
            
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn290 295 300Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr305 310 315 320Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330<210>69<211>22<212>PRT<213>人<400>69Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1   5   10  15Leu Arg Gly Ala Arg Cys20<210>70<211>40<212>DNA<213>人<400>70gtggttgaga ggtgccagat gtcaggtcca gctggtgcag   40<210>71<211>30<212>DNA<213>人<400>71attacgtctc acagttcgtt tgatctccac  30<210>72<211>48<212>DNA<213>人
            
<400>72ccgctcagct cctggggctc ctgctattgt ggttgagagg tgccagat   48<210>73<211>9<212>PRT<213>人<400>73Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu1   5<210>74<211>54<212>DNA<213>人<400>74cagcagaagc ttctagacca ccatggacat gagggtcccc gctcagctcc tggg   54<210>75<211>45<212>DNA<213>人<400>75gtggttgaga ggtgcCagat gtgacattgt gatgactcag tctcc 45<210>76<211>31<212>DNA<213>人<400>76cttgtcgact tattaacact ctcccctgtt g3權(quán)利要求
            
1.一種特異結(jié)合劑及其片段，所述特異結(jié)合劑包括選自下組的至少一種肽SEQ ID NO.1；SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.5；SEQ IDNO.7；SEQ ID NO.9；SEQ ID NO.11；SEQ ID NO.13；SEQ ID NO.15；SEQ ID NO.17；SEQ ID NO.19；SEQ ID NO.21；SEQ ID NO.23；SEQ ID NO.25；SEQ ID NO.27；SEQ ID NO.29；SEQ ID NO.31；SEQ ID NO.33；SEQ ID NO.35；SEQ ID NO.37；SEQ ID NO.39；SEQ ID NO.41；SEQ ID NO.43；SEQ ID NO.45；SEQ ID NO.47；SEQID NO.49；SEQ ID NO.51；SEQ ID NO.53；SEQ ID NO.55；SEQID NO.57；SEQ ID NO.59；SEQ ID NO.61；SEQ ID NO.2；SEQ IDNO.12；SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.20；SEQ ID NO.26；SEQ IDNO.28；SEQ ID NO.30；SEQ ID NO.32；SEQ ID NO.36；SEQ ID NO.44；SEQ ID NO.46；SEQ ID NO.48；SEQ ID NO.56；SEQ ID NO.62；SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.16；SEQ ID NO.22；SEQ ID NO.24；SEQID NO.34；SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.40；SEQ ID NO.42；SEQ IDNO.50；SEQ ID NO.52；SEQ ID NO.54；SEQ ID NO.58；和SEQ ID NO.60。
            
2.權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑，其為抗體。
            
3.權(quán)利要求2的抗體，其為多克隆、單克隆、嵌合、人源化或完全的人抗體。
            
4.權(quán)利要求3的抗體，其為單鏈抗體。
            
5.產(chǎn)生權(quán)利要求3的單克隆抗體的雜交瘤。
            
6.包含權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑的偶聯(lián)物。
            
7.包含權(quán)利要求2、3或4的抗體的偶聯(lián)物。
            
8.編碼權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑的核酸分子。
            
9.編碼權(quán)利要求2、3或4的抗體的核酸分子。
            
10.包含權(quán)利要求8或9的核酸分子的載體。
            
11.含權(quán)利要求10的載體的宿主細(xì)胞。
            
12.制備特異結(jié)合劑的方法，包括(a)用至少一種編碼權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑的核酸分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(b)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸分子；和(c)分離所述特異結(jié)合劑。
            
13.制備抗體的方法，包括(a)用至少一種編碼權(quán)利要求2、3或4的抗體的核酸分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(b)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸分子；和(c)分離所述特異結(jié)合劑。
            
14.一種抑制哺乳動物不期望的血管發(fā)生的方法，包括施用治療有效量的權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑。
            
15.一種治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑。
            
16.一種抑制哺乳動物不期望的血管發(fā)生的方法，包括施用治療有效量的權(quán)利要求2、3或4的抗體。
            
17.一種治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的權(quán)利要求2、3或4的抗體。
            
18.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑和藥學(xué)可接受制劑。
            
19.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求2、3或4的抗體和藥學(xué)可接受制劑。
            
20.一種調(diào)節(jié)或抑制血管生成素-2活性的方法，包括施用權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑。
            
21.一種調(diào)節(jié)或抑制血管生成素-2活性的方法，包括施用權(quán)利要求2、3或4的抗體。
            
22.一種調(diào)節(jié)哺乳動物血管滲透性或血漿滲漏中至少一種的方法，包括施用治療有效量的權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑。
            
23.一種治療哺乳動物中以下病癥中的至少一種的方法眼新血管病，肥胖，成血管瘤，血管瘤，動脈硬化，炎性疾病，炎性紊亂，動脈粥樣硬化，子宮內(nèi)膜異位，腫瘤性疾病，骨相關(guān)疾病，或者牛皮癬，包括施用治療有效量的權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑。
            
24.一種調(diào)節(jié)哺乳動物血管滲透性或血漿滲漏中至少一種的方法，包括施用治療有效量的權(quán)利要求2、3或4的抗體。
            
25.一種治療哺乳動物中以下病癥中的至少一種的方法眼新血管病，肥胖，成血管瘤，血管瘤，動脈硬化，炎性疾病，炎性紊亂，動脈粥樣硬化，子宮內(nèi)膜異位，腫瘤性疾病，骨相關(guān)疾病，或者牛皮癬，包括施用治療有效量的權(quán)利要求2、3或4的抗體。
            
26.一種治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑和化療藥物。
            
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述特異結(jié)合劑和化療劑不是同時施用。
            
28.一種治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用治療有效量的權(quán)利要求2、3或4的抗體和化療藥物。
            
29.權(quán)利要求26的方法，其中所述特異結(jié)合劑和化療劑不是同時施用。
            
30.包含以下任一序列的CDR1的特異結(jié)合劑526 HC(SEQ ID NO.1)；528 HC(SEQ ID NO.3)；531 HC(SEQ ID NO.5)；533 HC(SEQID NO.7)；535 HC(SEQ ID NO.9)；536 HC(SEQ ID NO.11)；537HC(SEQ ID NO.13)；540 HC(SEQ ID NO.15)；543 HC(SEQ ID NO.17)；544 HC(SEQ ID NO.19)；545 HC(SEQ ID NO.21)；546 HC(SEQ ID NO.23)；551 HC(SEQ ID NO.25)；553 HC(SEQ BD NO.27)；555 HC(SEQ ID NO.29)；558 HC(SEQ ID NO.31)；559 HC(SEQ ID NO.33)；565 HC(SEQ ID NO.35)；F1-C6 HC(SEQ ID NO.37)；FB1-A7 HC(SEQ ID NO.39)；FD-B2 HC(SEQ ID NO.41)；FE-B7HC(SEQ ID NO.43)；FJ-G11 HC(SEQ ID NO.45)；FK-E3 HC(SEQID NO.47)；G1D4 HC(SEQ ID NO.49)；GC1E8 HC(SEQ ID NO.51)；H1C12 HC(SEQ ID NO.53)；IA1-1E7 HC(SEQ ID NO.55)；IF-1C10HC(SEQ ID NO.57)；IK-2E2 HC(SEQ ID NO.59)；IP-2C11 HC(SEQID NO.61)；526κ(SEQ ID NO.2)；536κ(SEQ ID NO.12)；543κ(SEQ ID NO.18)；544κ(SEQ ID NO.20)；551κ(SEQ ID NO.26)；553κ(SEQ ID NO.28)；555κ(SEQ ID NO.30)；558κ(SEQID NO.32)；565κ(SEQ ID NO.36)；FE-B7κ(SEQ ID NO.44)；FJ-G11κ(SEQ ID NO.46)；FK-E3κ(SEQ ID NO.48)；IA1-1E7κ(SEQID NO.56)；IP-2C11κ(SEQ ID NO.62)；528λ(SEQ ID NO.4)；531λ(SEQ ID NO.6)；533λ(SEQ ID NO.8)；535λ(SEQ ID NO.10)；537λ(SEQ ID NO.14)；540λ(SEQ ID NO.16)；545λ(SEQID NO.22)；546λ(SEQ ID NO.24)；559λ(SEQ ID NO.34)；F1-C6λ(SEQ ID NO.38)；FB1-A7λ(SEQ ID NO.40)；FD-B2λ(SEQ IDNO.42)；G1D4λ(SEQ ID NO.50)；GC1E8λ(SEQ ID NO.52)；H1C12λ(SEQ ID NO.54)；IF-1C10λ(SEQ ID NO.58)；和IK-2E2λ(SEQID NO.60)。
            
31.包含以下任一序列的CDR2的特異結(jié)合劑526 HC(SEQ ID NO.1)；528 HC(SEQ ID NO.3)；531 HC(SEQ ID NO.5)；533 HC(SEQID NO.7)；535 HC(SEQ ID NO.9)；536 HC(SEQ ID NO.11)；537HC(SEQ ID NO.13)；540 HC(SEQ ID NO.15)；543 HC(SEQ ID NO.17)；544 HC(SEQ ID NO.19)；545 HC(SEQ ID NO.21)；546 HC(SEQ ID NO.23)；551 HC(SEQ ID NO.25)；553 HC(SEQ ID NO.27)；555 HC(SEQ ID NO.29)；558 HC(SEQ ID NO.31)；559 HC(SEQ ID NO.33)；565 HC(SEQ ID NO.35)；F1-C6 HC(SEQ ID NO.37)；FB1-A7 HC(SEQ ID NO.39)；FD-B2 HC(SEQ ID NO.41)；FE-B7HC(SEQ ID NO.43)；FJ-G11 HC(SEQ ID NO.45)；FK-E3 HC(SEQID NO.47)；G1D4 HC(SEQ ID NO.49)；GC1E8 HC(SEQ IDNO.51)；H1C12 HC(SEQ ID NO.53)；IA1-1E7 HC(SEQ ID NO.55)；IF-1C10 HC(SEQ ID NO.57)；IK-2E2 HC(SEQ ID NO.59)；IP-2C11 HC(SEQ ID NO.61)；526κ(SEQ ID NO.2)；536κ(SEQ IDNO.12)；543κ(SEQ ID NO.18)；544κ(SEQ ID NO.20)；551κ(SEQ ID NO.26)；553κ(SEQ ID NO.28)；555κ(SEQ ID NO.30)；558κ(SEQ ID NO.32)；565κ(SEQ ID NO.36)；FE-B7κ(SEQ ID NO.44)；FJ-G11κ(SEQ ID NO.46)；FK-E3κ(SEQ ID NO.48)；IA1-1E7κ(SEQ ID NO.56)；IP-2C11κ(SEQ ID NO.62)；528λ(SEQ ID NO.4)；531λ(SEQ ID NO.6)；533λ(SEQ ID NO.8)；535λ(SEQ ID NO.10)；537λ(SEQ ID NO.14)；540λ(SEQ IDNO.16)；545λ(SEQ ID NO.22)；546λ(SEQ ID NO.24)；559λ(SEQ ID NO.34)；F1-C6λ(SEQ ID NO.38)；FB1-A7λ(SEQ ID NO.40)；FD-B2λ(SEQ ID NO.42)；G1D4λ(SEQ ID NO.50)；GC1E8λ(SEQ ID NO.52)；H1C12λ(SEQ ID NO.54)；IF-1C10λ(SEQ IDNO.58)；和IK-2E2λ(SEQ ID NO.60)。
            
32.包含以下任一序列的CDR3的特異結(jié)合劑526 HC(SEQ ID NO.1)；528 HC(SEQ ID NO.3)；531 HC(SEQ ID NO.5)；533 HC(SEQID NO.7)；535 HC(SEQ ID NO.9)；536 HC(SEQ ID NO.11)；537HC(SEQ ID NO.13)；540 HC(SEQ ID NO.15)；543 HC(SEQ ID NO.17)；544 HC(SEQ ID NO.19)；545 HC(SEQ ID NO.21)；546 HC(SEQ ID NO.23)；551 HC(SEQ ID NO.25)；553 HC(SEQ ID NO.27)；555 HC(SEQ ID NO.29)；558 HC(SEQ ID NO.31)；559 HC(SEQID NO.33)；565 HC(SEQ ID NO.35)；F1-C6 HC(SEQ ID NO.37)；FB1-A7 HC(SEQ ID NO.39)；FD-B2 HC(SEQ ID NO.41)；FE-B7 HC(SEQ ID NO.43)；FJ-G11 HC(SEQ ID NO.45)；FK-E3 HC(SEQ IDNO.47)；G1D4 HC(SEQ ID NO.49)；GC1E8 HC(SEQ ID NO.51)；H1C12HC(SEQ ID NO.53)；IA1-1E7 HC(SEQ ID NO.55)；IF-1C10 HC(SEQ ID NO.57)；IK-2E2 HC(SEQ ID NO.59)；IP-2C11 HC(SEQID NO.61)；526κ(SEQ ID NO.2)；536κ(SEQ ID NO.12)；543κ(SEQ ID NO.18)；544κ(SEQ ID NO.20)；551κ(SEQ ID NO.26)；553κ(SEQ ID NO.28)；555κ(SEQ ID NO.30)；558κ(SEQID NO.32)；565κ(SEQ ID NO.36)；FE-B7κ(SEQ ID NO.44)；FJ-G11κ(SEQ ID NO.46)；FK-E3κ(SEQ ID NO.48)；IA1-1E7κ(SEQ ID NO.56)；IP-2C11κ(SEQ ID NO.62)；528λ(SEQ ID NO.4)；531λ(SEQ ID NO.6)；533λ(SEQ ID NO.8)；535λ(SEQ IDNO.10)；537λ(SEQ ID NO.14)；540λ(SEQ ID NO.16)；545λ(SEQ ID NO.22)；546λ(SEQ ID NO.24)；559λ(SEQ ID NO.34)；F1-C6λ(SEQ ID NO.38)；FB1-A7λ(SEQ ID NO.40)；FD-B2λ(SEQ ID NO.42)；G1D4λ(SEQ ID NO.50)；GC1E8λ(SEQ ID NO.52)；H1C12λ(SEQ ID NO.54)；IF-1C10λ(SEQ ID NO.5 8)；和IK-2E2λ(SEQ ID NO.60)。
            
33.編碼權(quán)利要求30、31或32的任意一項的特異結(jié)合劑的核酸分子。
            
34.檢測生物樣品中血管生成素-2的水平的方法，包括(a)使權(quán)利要求1的特異結(jié)合劑與所述樣品接觸；和(b)確定特異結(jié)合劑與所述樣品的結(jié)合程度。
            
35.檢測生物樣品中血管生成素-2的水平的方法，包括(a)使權(quán)利要求20的抗體與所述樣品接觸；和(b)確定抗體與所述樣品的結(jié)合程度。
            
36.一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含選自下組的重鏈可變區(qū)526 HC(SEQ ID NO.1)；528 HC(SEQ ID NO.3)；531 HC(SEQID NO.5)；533 HC(SEQ ID NO.7)；535 HC(SEQ ID NO.9)；536HC(SEQ ID NO.11)；537 HC(SEQ ID NO.13)；540 HC(SEQ ID NO.15)；543 HC(SEQ ID NO.17)；544 HC(SEQ ID NO.19)；545 HC(SEQ ID NO.21)；546 HC(SEQ ID NO.23)；551 HC(SEQ ID NO.25)；553 HC(SEQ ID NO.27)；555 HC(SEQ ID NO.29)；558 HC(SEQ ID NO.31)；559 HC(SEQ ID NO.33)；565 HC(SEQ ID NO.35)；F1-C6 HC(SEQ ID NO.37)；FB 1-A7 HC(SEQ ID NO.39)FD-B2HC(SEQ ID NO.41)；FE-B7 HC(SEQ ID NO.43)；FJ-G11 HC(SEQID NO.45)；FK-E3 HC(SEQ ID NO.47)；G1D4 HC(SEQ ID NO.49)；GC1E8 HC(SEQ ID NO.51)；H1C12 HC(SEQ ID NO.53)；IA1-1E7HC(SEQ ID NO.55)；IF-1C10 HC(SEQ ID NO.57)；IK-2E2 HC(SEQID NO.59)；IP-2C11 HC(SEQ ID NO.61)；及其抗原結(jié)合片段；所述輕鏈包含選自下組的輕鏈可變區(qū)526κ(SEQ ID NO.2)；536κ(SEQ ID NO.12)；543κ(SEQ ID NO.18)；544κ(SEQ ID NO.20)；551κ(SEQ ID NO.26)；553κ(SEQ ID NO.28)；555κ(SEQID NO.30)；558κ(SEQ ID NO.32)；565κ(SEQ ID NO.36)；FE-B7κ(SEQ ID NO.44)；FJ-G11κ(SEQ ID NO.46)；FK-E3κ(SEQ IDNO.48)；IA1-1E7κ(SEQ ID NO.56)；IP-2C11κ(SEQ ID NO.62)；528λ(SEQ ID NO.4)；531λ(SEQ ID NO.6)；533λ(SEQ ID NO.8)；535λ(SEQ ID NO.10)；537λ(SEQ ID NO.14)；540λ(SEQID NO.16)；545λ(SEQ ID NO.22)；546λ(SEQ ID NO.24)；559λ(SEQ ID NO.34)；F1-C6λ(SEQ ID NO.38)；FB1-A7λ(SEQ ID NO.40)；FD-B2λ(SEQ ID NO.42)；G1D4λ(SEQ ID NO.50)；GC1E8λ(SEQ ID NO.52)；H1C12λ(SEQ ID NO.54)；IF-1C10λ(SEQ IDNO.58)；IK-2E2λ(SEQ ID NO.60)；及其抗原結(jié)合片段。
            
37.編碼權(quán)利要求36的抗體的核酸分子。
            
全文摘要
            
本發(fā)明公開了結(jié)合血管生成素－2的特異結(jié)合劑，如完全的人抗體。還公開了所述抗體的重鏈片段，輕鏈片段和CDRs，以及制備和使用所述抗體的方法。
            
文檔編號A61P27/02GK1602317SQ02824877 
            
公開日2005年3月30日 申請日期2002年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月11日
            
發(fā)明者J·D·奧利納 申請人:安姆根有限公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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