將含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法

專利名稱：將含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法
技術領域：
本發明涉及用于將生物材料滅菌，以降低其中一種或多種活性生物污染物或病原體的含量的方法，所述活性生物污染物或病原體是例如病毒、細菌(包括細胞間和細胞內細菌，例如支原體屬、尿原體屬、nanobacteria、衣原體屬、立克次氏體)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或單獨或聯合引起TSEs的類似物和/或單細胞或多細胞寄生物。本發明特別涉及用輻射法將含有一種或多種非水性溶劑的生物材料滅菌的方法。
背景技術：
很多為人、獸醫、診斷和/或實驗使用而制備的生物材料可能含有有害的和具有潛在危險的生物污染物或病原體，例如病毒、細菌(包括細胞間和細胞內細菌，例如支原體屬、尿原體屬、nanobacteria、衣原體屬、立克次氏體)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或單獨或聯合引起TSEs的類似物和/或單細胞或多細胞寄生物。所以，在產品使用前將任何生物污染物或病原體進行滅活是極為重要的。當將物質直接給藥于患者，例如在輸血、血液因子替代治療、器官移植和通過靜脈內、肌內或其它形式的注射或輸注來進行的人的治療中，這是尤其關鍵的。對于含有各種血漿和/或血漿衍生物的在培養基中制備的或者經由細胞或重組細胞培養制備的生物材料或可能遭受支原體菌屬、朊病毒、細菌、病毒和其它生物污染物或病原體污染的其它生物材料來說，這也是很關鍵的。
大多數生產生物材料的操作涉及將生物材料進行關于一種或多種特定生物污染物或病原體的篩選或測試，而不是將污染物或病原體從材料中除去或將之滅活。僅不使用對生物污染物或病原體測試呈陽性的材料。篩選操作的實例包括對來自獻血者的人血中的特定病毒進行測試。然而，這樣的操作并不總是可靠的，并且不能探測到某些病毒的存在，特別是以非常低的數目存在的病毒。鑒于假陰性結果所帶來的后果，這降低了測試的價值或確定性。在某些情況下，例如在獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)情況下，假陰性結果能夠對生命構成威脅。此外，在某些情況下，即使不需要數月，也需要數周才能確定物質是否被污染。此外，迄今為止，沒有用于鑒定生物材料內的朊病毒的、適于篩選出潛在供體或感染材料的可靠測試或測定。這使得對于將生物材料內的朊病毒消滅，同時仍然保持材料所要求的活性的有效方法的需要提高了。因此，在制備生物材料的過程中和/或之后，需要使用一定的技術將污染物或病原體殺死或滅活。
這些技術的重要方面是明顯不考慮生物材料來源。所有活細胞和多細胞生物體都有可能感染病毒和其它病原體。因此，單細胞天然或重組生物體或組織的產品具有病原體污染的危險性。除了生產性細胞或細胞培養物存在可能被感染的危險性以外，這些和其它生物材料的加工也產生了環境污染的機會。這種感染危險性對于多細胞天然和重組生物體例如轉基因動物更明顯。值得注意的是，即使是得自不同于人的物種例如轉基因植物的產品也有這種危險性，這是由于如上所述的加工污染和在生長設施中的環境污染所致，其中生長設施可能被環境中的病原體或與所需植物一起存在于設施中的感染的生物體污染。例如，預計戶外生長的轉基因玉米作物在生長季節可能會接觸嚙齒動物例如小鼠。小鼠可攜帶嚴重的人病原體例如經常致命的漢坦病毒。因為這些動物在生長的作物中是不能檢測到的，由這些動物散播的病毒可能在收割時進入轉基因材料內。實際上，這樣的嚙齒動物非常難以防治，并且可能在播種、生長、收割或貯藏時接近農作物。同樣，由飛行或棲息的鳥類帶來的污染可能傳播作為鸚鵡熱病因物的嚴重的病原體。因此，無論其來源，任何生物材料都有可能攜帶嚴重的病原體，在將這樣的材料施用給接受者之前必須將它們除去或滅活。
在進行測定滅活病毒的技術能力的實驗過程中，很少使用有關的確切病毒。這是由于對進行試驗的工作人員的安全考慮以及與防范設備和廢物處理有關的困難和費用。在其場所，使用相同科和綱的模型病毒。一般說來，最難滅活的病毒是那些具有由蛋白質形成的外殼的病毒，而它們當中最難滅活的又是那些具有最小尺寸的病毒，這是大家公認的。這在γ輻射和大多數其它形式的輻射中已經得到證明，之所以如此是因為這些病毒的極小尺寸與很小的基因組有關。輻射到分子上的直接效果的大小與分子大小成正比，就是說，目標分子越大，效果就越好。作為必然的結果，在γ輻射中已經被證實，病毒的基因組越小，滅活病毒所需要的輻射劑量就越高。
在關系到得自人和動物的生物材料的病毒當中，最小的因而也就是最難滅活的病毒屬于細小病毒(Parvoviruses)和稍大的包被蛋白質的肝炎病毒。在人中，細小病毒B19和甲型肝炎病毒是所擔心的病毒。在得自豬的材料中，相應的最小病毒是豬細小病毒。因為這種病毒對人無害，所以經常被選擇作為人B19細小病毒的模型病毒。這種模型細小病毒的滅活例證被看作這樣的充分證據，即所使用的方法也會殺死人B19病毒和甲型肝炎病毒，并且通過引申，該方法也會殺死較大和較不難滅活的病毒如HIV、CMV、乙型和丙型肝炎病毒以及其它病毒。
最近的努力集中在將產品中的污染物除去或將之滅活的方法上。這樣的方法包括加熱處理、過濾和向產品中加入化學滅活劑或增敏劑。
目前的美國食品和藥品監督管理局的標準要求是，生物材料的加熱處理應當在約60℃加熱最少10個小時，而這會對敏感的生物材料造成損害。事實上，加熱滅活能夠破壞某些生物材料的生物學活性的50％或更多。
過濾涉及對產品進行過濾以便用物理方式除去污染物。遺憾的是，這種方法也會將具有高分子量的產品除去。而且，在某些情況下，小的病毒可能不能通過濾器除去。
化學增敏操作涉及加入與病毒的DNA/RNA結合并通過UV或者其它射線激活的有毒物質。輻射產生反應中間體和/或自由基，其與病毒的DNA/RNA結合，將DNA/RNA骨架中的化學鍵打破，和/或將其交聯或復合，使得病毒不再能夠復制。該操作需要將未結合的增敏劑從產品中洗出來，因為增敏劑既使沒有誘變和致癌作用，也是有毒性的，所以不能施用給患者。
用γ射線輻射產品是將產品滅菌的另一種方法。當給予高的總劑量時，γ射線能夠有效地消滅病毒和細菌(Keathly等人，“輻射后還有生物嗎？第2部分”BioPharm July-August，1993，和Leitman，“在預防輸血后移植物對宿主疾病的過程中使用血細胞輻射”，TransfusionScience 10219-239(1989))。然而，本領域發表的文獻告戒，γ輻射會損害對輻射敏感的產品，例如血液、血液產品、蛋白質和含蛋白質的產品。特別是，已經證明，高輻射劑量對紅細胞、血小板和粒細胞(Leitman)是有害的。美國專利4,620,908揭示，為了保持蛋白質產品的活力，輻射之前必須將蛋白質產品冷凍。該專利認為，“如果使用γ輻射而同時蛋白質材料處于例如室溫，該材料也將會遭到徹底的破壞，就是說，材料的活性會變得如此低以至于事實上是無效的”。遺憾的是，很多敏感的生物材料，例如單克隆抗體(Mab)，如果為了輻射目的而經受冷凍然后在給藥患者之前融化，就會喪失活力和活性。
鑒于上述困難，仍然需要能夠有效地降低活性生物污染物或病原體的水平而同時對材料不造成不利影響的將生物材料滅菌的方法。
當適于作為另外或供選擇的細節、特征和/或技術背景的教導時，上述參考文獻引入本文以供參考。
發明概述本發明的目的是解決至少上述問題和/或缺點，和提供至少下文所述的優點。
因此，本發明的目的是提供通過降低活性生物污染物或病原體的水平而同時對材料無不利影響來將生物材料滅菌的方法。本發明的其它目的、特征和優點將在隨后的優選實施方案的詳細描述中加以闡明，并且通過該描述將會部分地顯而易見或通過本發明的實施來獲悉。本發明的這些目的和優點可通過說明書和權利要求書中特別指出的組合物和方法來實現和達到。
根據這些和其它的目的，本發明的第一個實施方案涉及用于將對輻射敏感并且含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法，所述方法包括用射線以能將材料有效滅菌和保護材料免受輻射損害的輻射率將所述生物材料輻射能將材料有效滅菌的時間。
本發明的另一個實施方案涉及用于將對輻射敏感并且含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)將至少一種穩定劑以有效保護所述生物材料免受輻射損害的量加到生物材料中；和(ii)用射線以有效輻射率將所述生物材料輻射能將材料有效滅菌的時間。
本發明的另一個實施方案涉及用于將對輻射敏感并且含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)將生物材料的殘余溶劑含量降低到有效保護所述生物材料免受輻射損害的水平；和(ii)用射線以有效輻射率將生物材料輻射能將所述生物材料有效滅菌的時間。
本發明的另一個實施方案涉及用于將對輻射敏感并且含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)將生物材料的溫度降低到有效保護生物材料免受輻射損害的水平；和(ii)用射線以有效輻射率將生物材料輻射能將生物材料有效滅菌的時間。
本發明的另一個實施方案涉及用于將對輻射敏感并且含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)給生物材料施加選自下列的穩定化處理(a)降低生物材料的殘余溶劑含量，(b)將至少一種穩定劑加到生物材料中；和(c)降低生物材料的溫度；和(ii)用射線以有效輻射率將生物材料輻射能將生物材料有效滅菌的時間，其中所述穩定化處理和輻射率一起有效地保護生物材料免受輻射損害。
本發明的另一個實施方案涉及用于將對輻射敏感并且含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)給生物材料施加至少兩種選自下列的穩定化處理(a)降低生物材料的殘余溶劑含量，(b)將至少一種穩定劑加到生物材料中；和(c)降低生物材料的溫度；和(ii)用射線以有效輻射率將生物材料輻射能將生物材料有效滅菌的時間，其中所述穩定化處理可以以任何次序進行，并且一起有效地保護生物材料免受輻射損害。
本發明還提供了包含生物材料和非水性溶劑的組合物，其中所述非水性溶劑的量能有效保護制劑在用輻射滅菌后仍可實現其預期應用。
本發明還提供了包含至少一種生物材料、至少一種非水性溶劑和至少一種穩定劑的組合物，其中所述非水性溶劑和穩定劑以有效保護材料在用輻射滅菌后仍可實現其預期應用的量一起存在。
本發明的其它優點、目的和特征將在隨后的描述中部分地提出，并且在進行下列測定后，對于本領域技術人員來說將變得顯而易見，或者可通過本發明的實施來獲悉。本發明的目的和優點可通過在權利要求書中特別指出的方案來實現和達到。
附圖簡述通過下列附圖來詳細地描述本發明，在附圖中，同樣的參考數字是指同樣的部分，其中附

圖1是表明γ輻射對干燥尿激酶的影響的圖，其中所述尿激酶是懸浮在聚丙二醇(PPG)400或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。
附圖2是表明在不同形式的聚丙二醇存在下輻射后，固定的抗胰島素單克隆抗體的活性的圖。
附圖3是表明γ輻射對胰蛋白酶的影響的圖，其中所述胰蛋白酶在不同水平的殘余溶劑(水)含量下懸浮在聚丙二醇中。
附圖4(a)-4(d)表明了在聚丙二醇400(PPG400)和任選清除劑存在下接受γ輻射的豬心臟瓣膜所受的影響。
附圖5(a)-5(e)表明了在50％DMSO和任選穩定劑存在下，并且在聚丙二醇400(PPG400)存在下，γ輻射對豬心臟瓣膜尖的影響。
附圖6(a)-6(e)表明了γ輻射對冷凍的豬AV心臟瓣膜的影響，其中所述瓣膜浸泡在不同溶劑中，并且在-20℃以1.584kGy/小時的輻射率被輻射至30kGy的總劑量。
附圖7(a)-7(h)表明了γ輻射對冷凍的豬AV心臟瓣膜的影響，其中所述瓣膜浸泡在不同溶劑中，并且在-70℃以約6kGy/小時的輻射率被輻射至45kGy的總劑量。
優選實施方案的詳細描述A.定義除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有本領域技術人員所通常理解的相同含義。
除非另有說明，本文所用的單數形式“a”、“an”和“the”包括復數含義。
本文所用術語“滅菌”意指將在依據本發明處理的生物材料中發現的至少一種活性生物污染物或病原體的水平降低。
本文所用術語“生物材料”意指任何由活的生物體衍生或獲得的物質。生物材料的實例包括但不限于下列細胞；組織；血液或血液組分；蛋白，包括重組蛋白和轉基因蛋白，以及蛋白質性質的材料；酶，包括消化酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；免疫球蛋白，包括單和多免疫球蛋白；植物；食品等。優選的生物材料實例包括但不限于下列韌帶；腱；神經；骨，包括去除礦物質的骨基質、移植物、關節、股骨、股骨頭等；牙齒；皮膚移植物；完整或加工過的骨髓，包括骨髓細胞懸浮液；心臟瓣膜；軟骨；角膜；動脈和靜脈；器官，包括移植器官，例如心臟、肝、肺、腎、腸、胰腺、肢和指；脂質；碳水化合物；膠原，包括天然的、無纖維的(afibrillar)、atelomeric、可溶的和不可熔的、重組和轉基因的膠原，二者具有天然序列和改性序列；殼多糖及其衍生物，包括NO-羧基脫乙酰殼多糖(NOCC)；干細胞、朗罕氏細胞島以及其它移植細胞，包括基因改變的細胞；紅細胞；白細胞，包括單核細胞；和血小板。
本文所用術語“非水性溶劑”意指生物材料可溶解或懸浮在其中的除水以外的任何液體，包括無機溶劑和更優選有機溶劑。合適的非水性溶劑的實例包括但不限于下列烷烴和環烷烴，例如戊烷、2-甲基丁烷(異戊烷)、庚烷、己烷、環戊烷和環己烷；醇，例如甲醇、乙醇、2-甲氧基乙醇、異丙醇、正丁醇、叔丁醇、丁二醇、丙二醇和辛醇；酯，例如乙酸乙酯、乙酸2-甲氧基乙酯、乙酸丁酯和苯甲酸芐酯；芳族化合物，例如苯、甲苯、吡啶、二甲苯；醚，例如乙醚、2-乙氧基乙醚、乙二醇二甲醚和甲基叔丁基醚；醛，例如甲醛和戊二醛；酮，例如丙酮和3-戊酮(二乙基酮)；二醇，包括單體二醇，例如乙二醇和丙二醇，和聚合二醇，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，例如PPG 400、PPG 1200和PPG 2000；酸和酸酐，例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、磷酸和乙酸酐；油，例如棉籽油、花生油、培養基、聚乙二醇、罌粟籽油、紅花油、芝麻油、豆油和植物油；胺和酰胺，例如哌啶、N，N-二甲基乙酰胺和N，N-二甲基甲酰胺；二甲亞砜(DMSO)；腈，例如苯甲腈和乙腈；肼；洗滌劑，例如聚氧乙烯脫水山梨醇一月桂酸酯(Tween 20)和一油酸酯(Tween 80)、Triton和十二烷基硫酸鈉；二硫化碳；鹵代溶劑，例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯苯、1，2-二氯乙烷、四氯乙烯和1-氯丁烷；呋喃，例如四氫呋喃；噁烷類，例如1，4-二氧雜環己烷；和甘油/丙三醇。其它優選的非水性溶劑包括甲酰胺；solutol；甘露醇；普羅布考和肉豆蔻酸異丙酯。合適的非水性溶劑的特別優選的實例包括還起穩定劑功能的非水性溶劑，例如乙醇和丙酮。
本文所用術語“生物污染物或病原體”意指這樣的生物污染物或病原體，其在直接或間接與生物材料接觸時，可以對生物材料或其接受者產生有害的作用。這樣的其它生物污染物或病原體包括本領域技術人員已知的通常存在于或感染生物材料的各種各樣的病毒、細菌(包括細胞間和細胞內細菌，例如支原體屬、尿原體屬、nanobacteria、衣原體屬、立克次氏體)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或單獨或聯合引起TSEs的類似物和/或單細胞或多細胞寄生物。其它生物污染物或病原體的實例包括但不限于下列病毒，例如人免疫缺陷病毒和其它逆轉錄病毒、皰疹病毒、線狀病毒、circoviruses、副粘液病毒、巨細胞病毒、肝炎病毒(包括甲型、乙型和丙型肝炎病毒及其它們的變種)、痘病毒、披膜病毒、Ebstein-Barr病毒和細小病毒；細菌，例如埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、鏈球菌屬(Streptococcus)以及葡糖球菌屬(Staphalococcus)；nanobacteria；寄生蟲，例如錐蟲屬和瘧疾寄生蟲，包括瘧原蟲屬類；酵母；霉菌；真菌；支原體和尿原體屬、衣原體屬；立克氏體，例如Coxiella burnetti；和朊病毒以及已知在哺乳動物中單獨或聯合引起傳播性海綿狀腦病(TSEs)，例如瘙癢病、傳播性貂腦病、慢性消耗病(通常見之于騾、鹿和麋鹿)、貓海綿狀腦病、牛海綿狀腦病(瘋牛病)、Creutzfeld-Jakob病(包括變異的CJD)、致命性家族失眠癥、Gerstmann-Straeussler-Scheinker綜合癥、kuru和Alpers綜合癥的類似物。本文所用術語“活性生物污染物或病原體”意指這樣的生物污染物或病原體，其能夠單獨或與另一種因子，例如另一種生物污染物或病原體或天然蛋白(野生型或突變型)或抗體聯合在生物材料和/或其接受者中產生有害的作用。
本文所用術語“血液組分”意指可以從全血中分離出來的一種或多種組分，包括但不限于下列細胞血液組分，例如紅細胞、白細胞和血小板；血液蛋白，例如血液凝固因子、酶、白蛋白、纖溶酶原、纖維蛋白原和免疫球蛋白；以及液態血液組分，例如血漿、血漿蛋白組分(PPF)、冷凝蛋白、血漿組分和含血漿的組合物。
本文所用術語“細胞血液組分”意指全血的一種或多種組分，包括細胞，例如紅細胞、白細胞、干細胞和血小板。
本文所用術語“血液蛋白”意指通常在全血中發現的一種或多種蛋白。在哺乳動物，包括人中發現的血液蛋白的實例包括但不限于下列凝血蛋白，包括維生素K依賴型，例如因子VII和因子IX，和非維生素K依賴型，例如因子VIII和von Willebrands因子；白蛋白；脂蛋白，包括高密度脂蛋白和低密度脂蛋白；補體蛋白；球蛋白，例如免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和IgE；等。優選的一組血液蛋白包括因子I(纖維蛋白原)、因子II(前凝血酶)、因子III(組織因子)、因子V(前促凝血球蛋白)、因子VI(促凝血球蛋白)、因子VII(前轉變素，血清凝血酶原轉化)、因子VIII(抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(Stuart-Prower因子)、因子XI(血漿促凝血酶原激酶前體)、因子XII(哈格曼因子)、因子XIII(protransglutamidase)、von Willebrands因子(vWF)、因子Ia、因子IIa、因子IIIa、因子Va、因子VIa、因子VIIa、因子VIIIa、因子Ixa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa和因子XIIIa。另一組優選的血液蛋白包括在紅細胞內部發現的蛋白，例如血紅蛋白和各種各樣的生長因子，以及這些蛋白的衍生物。還有一組優選的血液蛋白類包括在市售的血漿蛋白組分產品例如Plasma-Plex(Centeon/AventisBehring)、Protenate(Baxter Laboratories)、Plasmanate(BayerBiological)和Plasmatein(Alpha Therapeutic)中發現的蛋白。
本文所用術語“液態血液組分”意指全血的一種或多種液態非細胞組分，例如血漿(在凝固前發現的人或動物全血的液態非細胞部分)和血清(在凝固后發現的人或動物全血的液態非細胞部分)。
本文所用術語“生物相容性溶液”意指這樣的溶液，生物材料可以暴露于其中，例如通過懸浮或溶解于其中來暴露于其中，并保持活性，即保持其本質的生物或生理特性。
本文所用術語“生物相容性緩沖液”意指具有適于維持其中的材料完整性的pH和滲透特性(例如張力、重量摩爾滲透壓濃度和/或有效滲透壓)的生物相容性溶液。適宜的生物相容性緩沖液具有4-8.5的pH值，并且是等滲的或僅僅適度低滲或高滲的。對于本領域技術人員來說，生物相容性緩沖液是已知和容易獲得的。
本文所用術語“穩定劑”意指將接受輻射的生物材料的損害降低至不足以妨礙材料的安全和有效使用的水平。穩定劑的實例包括但不限于下列抗氧化劑；自由基清除劑，包括自旋捕獲劑，例如叔丁基亞硝基丁烷(tNB)、α-苯基叔丁基硝酮(PBN)、5，5-二甲基吡咯烷-N-氧化物(DMPO)、叔丁基亞硝基苯(BNB)、α-(4-吡啶基-1-氧化物)-N-叔丁基硝酮(4-POBN)和3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸(DBNBS)；聯合穩定劑，即能有效猝滅I型和II型光動力反應的穩定劑；和能夠穩定結合于其上的分子的配體，例如肝素。穩定劑的優選實例包括但不限于下列乙醇；丙酮；脂肪酸，包括6，8-二巰基-辛酸(硫辛酸)及其衍生物和類似物(α，β，二氫，二去甲(bisno)和四去甲(tetranor)硫辛酸)，硫辛酸、6，8-二巰基-辛酸、二氫硫辛酸酯(dihydrolopoate)(DL-6，8-二巰基辛酸甲酯)、硫辛酰胺、二去甲甲酯和四去甲二氫硫辛酸、呋喃脂肪酸、油酸和亞油酸以及棕櫚酸及其鹽和衍生物；黃酮類、phenylpropaniods、和flavenols，例如櫟精、蕓香苷及其衍生物、芹黃素、氨基黃酮、兒茶素、橙皮苷和柚皮苷；胡蘿卜素，包括β-胡蘿卜素；Co-Q10；葉黃素；多元醇，例如甘油、甘露醇；糖，例如木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖、果糖和海藻糖；氨基酸及其衍生物，例如組氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷氨酸、色氨酸、辛酸鈉、N-乙酰色氨酸和蛋氨酸；疊氮化物，例如疊氮化鈉；酶，例如超氧化物岐化酶(SOD)和過氧化氫酶；尿酸及其衍生物，例如1，3-二甲基尿酸和二甲基硫脲；別嘌醇；硫醇，例如谷胱甘肽和還原的谷胱甘肽和半胱氨酸；微量元素，例如硒；維生素，例如維生素A、維生素C(包括其衍生物和鹽，例如抗壞血酸納和棕櫚酰抗壞血酸)和維生素E(及其衍生物和鹽，例如生育酚乙酸酯和α-tocotrienol)；色滿醇-α-C6；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸(Trolox)和衍生物；體外蛋白，例如明膠和白蛋白；三-3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(MCI-186)；西替沃酮；puercetin；柯因；二甲亞砜(DMSO)；哌嗪二乙磺酸(PIPES)；咪唑；甲氧沙林(MOPS)；1，2-二噻烷-4，5-二醇；還原物質，例如丁基化羥基茴香醚(BHA)和丁基化羥基甲苯(BHT)；膽固醇；普羅布考；吲哚衍生物；硫汞撒；拉扎堿和甲磺酸替拉扎特；proanthenols；proanthocyanidins；硫酸銨；Pegorgotein(PEG-SOD)；N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)；4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-醇(Tempol)；抗壞血酸鹽、尿酸鹽和Trolox C的混合物(Asc/尿酸鹽/Trolox C)；蛋白質和肽，例如甘氨酰基甘氨酸和肌肽，其中每一氨基酸可以呈D或L形式；地奧司明；pupurogalin；五倍子酸及其衍生物，包括但不限于五倍子酸丙酯、甲醛次硫酸鈉和水飛薊素。另外優選的穩定劑包括丙二醇；丁二醇；甲酰胺；solutol；DMEM；五倍子酸丙酯；檸檬酸鹽；丙烷二醇；肉豆蔻酸異丙酯；香豆酸；PVP及其混合物。特別優選的實例包括能有效猝滅I型和II型光動力反應的單一穩定劑或穩定劑的聯合，以及能夠被作為氣體施用和/或易于通過蒸發、低壓和類似的方法除去的揮發性穩定劑。這樣的單一穩定劑或穩定劑的聯合在本文中稱為“聯合穩定劑”。
本文所用術語“殘余溶劑含量”意指生物材料中的可自由利用的液體的量或比例。可自由利用的液體意思是存在于被滅菌的生物材料中的、沒有結合到或與生物材料一種或多種非液體組分絡合的液體，例如水或有機溶劑(例如乙醇、異丙醇、丙酮、聚乙二醇等)。可自由利用的液體包括細胞內的水。本文中作為水提及的殘余溶劑含量是指通過FDA批準、改進的Karl Fischer方法(Meyer和Boyd，AnalyticalChem.，31215-219，1959；May，等人，J.Biol.Standcndization，10249-259，1982；Centers for Biologics Evaluation and Research，FDA，Docket No.89D-0140，83-93；1990)或近紅外線光譜法測定的水平。其它溶劑的殘余水平的定量測定可以用本領域眾所周知的方法來進行，這取決于所使用的溶劑。殘余溶劑與溶質的比例也可以看作是溶質在溶劑內濃度的反映。當如此表示時，溶質的濃度越高，則殘余溶劑的量就越低。
本文所用術語“增敏劑”意指這樣的物質，其可以選擇性地針對病毒、細菌、朊病毒和/或寄生性污染物，使它們對于輻射滅活更加敏感，因此與沒有增敏劑相比，就使得有可能使用較低的輻射速度或較低的輻射劑量和/或較短的輻射時間。適宜的增敏劑的實例包括但不限于下列補骨脂素及其衍生物和類似物(包括3-乙氧羰基補骨脂素)；inactines及其衍生物和類似物；含有鹵素取代基和增加水溶性的基團例如季銨離子或磷離子的當歸根素、凱林和香豆素；結合核酸的化合物；溴化血卟啉；酞菁染料；紅紫素；卟啉；二血卟啉酯的鹵化或由金屬原子取代的衍生物、血卟啉衍生物；苯并卟啉衍生物、氫化二苯并卟啉二馬來酰胺、氫化二苯并卟啉、二氰基二砜、四乙氧羰基氫化二苯并卟啉和四乙氧羰基氫化二苯并卟啉二丙酰胺；阿霉素和柔紅霉素，其可以用鹵素或金屬原子進行修飾；力確興；BD肽、S2肽；S-303(ALE化合物)；染料，例如金絲桃素、亞甲藍、曙紅、熒光素(及其衍生物)、黃素、份菁染料540；光敏化合物，例如佛手內酯；和SE肽。另外，也可以使用結合到朊病毒并因此增加它們的輻射敏感性的原子。這樣的原子的實例是銅離子，其結合到朊病毒蛋白上，并且由于蛋白中Z數目高于其它原子，在輻射特別是γ輻射期間，增加了朊病毒蛋白吸收能量的概率。
本文所用術語“蛋白質性質的材料”意指，由活生物體產生或獲得的包含至少一種蛋白質或肽的任何材料。蛋白質性質的材料可以是呈其自然狀態，或加工/純化和/或衍生化后的天然材料，或者是人工制得的材料，其由化學合成或重組/轉基因技術制得，并任選經過加工/純化和/或衍生化。蛋白質性質的材料的實例包括但不限于下列從細胞培養物制得的蛋白質和肽；奶和其它奶制品；腹水；激素；生長因子；從動物組織提取或分離的材料，包括藥物，例如肝素和胰島素，或植物物質；血漿，包括新鮮的、冷凍的和凍干的血漿，以及血漿蛋白組分；纖維蛋白原及其衍生物、血纖蛋白、血纖蛋白I、血纖蛋白II、可溶性血纖蛋白和血纖蛋白單體、和/或血纖蛋白密封產品；全血；蛋白質C；蛋白質S；α-1抗-胰蛋白酶(α-1蛋白酶抑制劑)；丁基-膽堿酯酶；抗凝血劑，例如香豆素(華法林)；鏈激酶；組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA)；紅細胞生成素(EPO)；尿激酶；neupogen；抗-凝血酶-3；α-葡糖苷酶；(胎)牛血清/馬血清；肉；免疫球蛋白，包括抗血清、單克隆抗體、多克隆抗體和通過基因工程或制得的抗體；白蛋白；α-球蛋白；β-球蛋白；γ-球蛋白；凝血蛋白；補體蛋白；和干擾素。
本文所用術語“輻射”意指輻射足夠的能量，以將被輻射的生物材料中的至少一些組分滅菌。輻射的類型包括但不限于下列(i)粒子輻射(亞原子粒子如中子、電子和/或質子流)；(ii)電磁輻射(發生于各種電磁場，例如無線電波，可見(單色和多色)和不可見光，紅外線、紫外線，X-射線，以及γ射線及其混合物)；和(iii)聲音和壓力波。這樣的射線經常被稱做離子(在被輻射的材料中能夠產生離子)射線，例如γ射線，和非離子射線，例如可見光。這樣的射線源可以是多種多樣的，通常，對具體的輻射源的選擇并沒有嚴格要求，只要在適當的時間以適當的速度發出足夠的輻射來實現滅菌即可。在實踐中，γ射線通常由鈷和銫的同位素產生，而UV和X射線則分別由輻射UV和X-射線的機器產生，電子通常用于在經由機器產生被稱做“E-射束”輻射的方法中滅菌材料。單色和多色的可見光都由機器產生，并且在實踐中與由相同或不同機器產生的不可見光，例如紅外線和UV聯合使用。
本文所用術語“保護”意指將接受輻射的生物材料的任何損害減至不足以妨礙在輻射后安全和有效使用材料的水平。也就是說，與沒有存在該物質或方法相比，如果存在的該物質或進行該方法使得材料受到較小的輻射損害，則該物質或方法“保護”生物材料免受輻射損害。因此，在“保護”材料的物質存在或保護材料的方法被實施的情況下，在輻射后可以安全和有效地使用生物材料，但是在同等情況下，如果沒有該物質或未實施該方法，輻射后生物材料就不能安全和有效地使用。
如本文所用的，“可接受水平”的損害可根據所用的本發明特定方法的一些特征，例如所用特定生物材料和/或非水性溶劑的性質和特征，和/或接受輻射的生物材料的預期應用來改變，并且可由本領域技術人員憑經驗來確定。因此，“不可接受水平”的損害是妨礙被滅菌的生物材料安全有效地使用的損害水平。在給定的生物材料中，特定的損害水平可用本領域技術人員已知的任何方法和技術來確定。
B.特別優選的實施方案本發明的第一個優選實施方案涉及用于將對輻射敏感并且含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法，所述方法包括用射線以能將材料有效滅菌和保護材料免受輻射損害的輻射率將所述生物材料輻射能將材料有效滅菌的時間。
本發明的另一個優選實施方案涉及用于將對輻射敏感并且含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)將至少一種穩定劑以有效保護所述生物材料免受輻射損害的量加到生物材料中；和(ii)用射線以有效輻射率將所述生物材料輻射能將材料有效滅菌的時間。
本發明的另一個優選實施方案涉及用于將對輻射敏感并且含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)將生物材料的殘余溶劑含量降低到有效保護所述生物材料免受輻射損害的水平；和(ii)用射線以有效輻射率將生物材料輻射能將所述生物材料有效滅菌的時間。
本發明的另一個優選實施方案涉及用于將對輻射敏感并且含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)將生物材料的溫度降低到有效保護生物材料免受輻射損害的水平；和(ii)用射線以有效輻射率將生物材料輻射能將生物材料有效滅菌的時間。
本發明的另一個優選實施方案涉及用于將對輻射敏感并且含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)給生物材料施加選自下列的穩定化處理(a)降低生物材料的殘余溶劑含量，(b)將至少一種穩定劑加到生物材料中；和(c)降低生物材料的溫度；和(ii)用射線以有效輻射率將生物材料輻射能將生物材料有效滅菌的時間，其中所述穩定化處理和輻射率一起有效地保護生物材料免受輻射損害。
本發明的另一個優選實施方案涉及用于將對輻射敏感并且含有非水性溶劑的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)給生物材料施加至少兩種選自下列的穩定化處理(a)降低生物材料的殘余溶劑含量，(b)將至少一種穩定劑加到生物材料中；和(c)降低生物材料的溫度；和(ii)用射線以有效輻射率將生物材料輻射能將生物材料有效滅菌的時間，其中所述穩定化處理可以以任何次序進行，并且一起有效地保護生物材料免受輻射損害。
本發明的另一個優選實施方案涉及包含生物材料和非水性溶劑的組合物，其中所述非水性溶劑的量能有效保護制劑在用輻射滅菌后仍保持其適當且有效的預期應用。
本發明的另一個優選實施方案涉及包含至少一種生物材料、至少一種非水性溶劑和至少一種穩定劑的組合物，其中所述非水性溶劑和穩定劑以有效保護材料在用輻射滅菌后仍可實現其預期應用的量一起存在。
非水性溶劑優選為在輻射下不易于形成自由基的非水性溶劑，更優選為在輻射下不易于形成自由基，并且具有很少或沒有溶解氧或其它在輻射下易于形成自由基的氣體的非水性溶劑。揮發性非水性溶劑是特別優選的，甚至更特別優選的是其為穩定劑的非水性溶劑，例如乙醇和丙酮。
依據本發明的某些實施方案里，生物材料可含有水與非水性溶劑例如乙醇和/或丙酮的混合物。在這樣的實施方案中，非水性溶劑優選為在輻射下不易于形成自由基的非水性溶劑，最優選為在輻射下不易于形成自由基，并且具有很少或沒有溶解氧或其它在輻射下易于形成自由基的氣體的非水性溶劑。揮發性非水性溶劑是特別優選的，甚至更特別優選的是其為穩定劑的非水性溶劑，例如乙醇和丙酮。
按照本發明的一些方法，在用射線將含有非水性溶劑的生物材料輻射之前加入穩定劑。優選將穩定劑以有效保護生物材料免受輻射損害的量加到含有非水性溶劑的生物材料中。或者，將穩定劑以與非水性溶劑一起有效保護生物材料免受輻射損害的量加到含有非水性溶劑的生物材料中。適宜的穩定劑的量，可以根據所使用的本發明特定方法的某些特征而變化，例如根據所使用的特定的穩定劑和/或接受輻射的含有非水性溶劑的特定生物材料的性質和特征和/或其預期應用而變化，并且可以由本領域技術人員憑經驗確定。
按照本發明的一些方法，在用射線將生物材料輻射之前將含有非水性溶劑的生物材料的殘余溶劑含量降低。優選將殘余溶劑的含量降至能有效保護生物材料免受輻射損害的水平。殘余溶劑含量的適宜水平可以根據所使用的本發明特定方法的某些特征而變化，例如根據接受輻射的含有非水性溶劑的特定生物材料的性質和特征和/或其預期應用而變化，并且可以由本領域技術人員憑經驗確定。對于有些生物材料，可能要求將殘余溶劑含量保持在一個特定范圍內，而不是一個具體的值。
根據本發明的一些實施方案，當含有非水性溶劑的生物材料還含有水時，可通過把含有非水性溶劑的生物材料溶解或懸浮于能夠溶解水的非水性溶劑中來降低生物材料的殘余溶劑(水)的含量。當生物材料是液相時，通過加入液體非水性溶劑將殘余溶劑(水)稀釋，也可以實現相同結果。優選地，這樣的另一種非水性溶劑在輻射下不易于形成自由基，并且具有很少或沒有溶解氧或在輻射下易于形成自由基的其它氣體。
當含有非水性溶劑的生物材料是液相時，殘余溶劑含量的降低可以通過多種方法來實現，例如通過增加溶質濃度來實現。以這種方法，溶解于溶劑內的含有非水性溶劑的生物材料的蛋白質濃度可以增加至一般至少約0.5％，典型地至少約1％，通常至少約5％，優選至少約10％，更優選至少約15％，甚至更優選至少約20％，還甚至更優選至少約25％，而最優選至少約50％。
在本發明的某些實施方案中，可以發現，含有非水性溶劑的特定生物材料的殘余溶劑含量是在一個范圍內，而不是一個具體值。對于含有非水性溶劑的特定生物材料的優選殘余溶劑含量，這樣的范圍可以由本領域技術人員憑經驗確定。
雖然不想受縛于任何可操作性理論，但是據信，殘余溶劑含量的降低，降低了含有非水性溶劑的生物材料的自由度，降低了用于自由基產生的目標數目，并限制了這些自由基的溶解度。因此，通過將含有非水性溶劑的生物材料的溫度降至低于它的低共熔點或低于它的冰點，或通過玻璃化同樣降低生物材料的自由度，也可以達到類似的結果。與其它可以接受的結果相比，這些結果可以容許使用更高的輻射率和/或劑量。因此，本文所述方法可以在任何不導致含有非水性溶劑的生物材料受到不可接受的損害，即會妨礙安全和有效使用生物材料的溫度下實施。優選地，本文所述方法在室溫或低于室溫，例如低于被輻射的含有非水性溶劑的生物材料的低共熔點或冰點的溫度下進行。
可以用本領域技術人員已知的，用于從含有非水性溶劑的生物材料中減少溶劑，同時不給生物材料造成不可接受水平的損害的任何方法和技術將含有非水性溶劑的生物材料的殘余溶劑含量降低。這樣的方法包括但不限于加入溶質、蒸發、濃縮、離心濃縮、玻璃化和噴霧干燥。
用于降低含有非水性溶劑的生物材料的殘余溶劑含量的特別優選的方法是凍干。
用于降低含有非水性溶劑的生物材料的殘余溶劑含量的另一特別優選的方法是加入溶質。
用于降低含有非水性溶劑的生物材料的殘余溶劑含量的另一特別優選的方法是噴霧干燥。
用于降低含有非水性溶劑的生物材料的殘余溶劑含量的另一特別優選的方法是是玻璃化法，其可以用本領域技術人員已知的方法和技術來進行，包括加入溶質和/或附加溶質例如蔗糖，以提高含有非水性溶劑的生物材料的低共熔點，然后逐漸給含有非水性溶劑的生物材料施加降低的壓力，以除去殘余的溶劑。所得玻璃狀材料將具有降低的殘余溶劑含量。
按照本發明的某些方法，可以用任何本領域技術人員已知且可采用的方法，將欲滅菌的含有非水性溶劑的生物材料固定于固體表面上。例如，可以將欲滅菌的含有非水性溶劑的生物材料作為生物或非生物基質的包被或表面提供。
在本發明方法中使用的輻射可以是任何將被處理的含有非水性溶劑的生物材料有效滅菌的輻射。該輻射可以是粒子輻射，包括E-射束輻射。優選地，該輻射是電磁輻射，包括X-射線、紅外線、可見光、UV光和各種波長電磁射線的混合物。特別優選的射線形式是γ射線。
按照本發明方法，用射線以有效滅菌生物材料，同時不對該材料造成不可接受水平的損害的輻射率將含有非水性溶劑的生物材料輻射。合適的輻射率可以根據所使用的本發明方法的某些特征而變化，例如根據被輻射的可含有非水性溶劑的特定生物材料的性質和特征，有關射線的特定形式和/或被滅活的特定的生物污染物或病原體而變化。合適的輻射率可以由本領域技術人員憑經驗確定。優選地，輻射率在滅菌過程中是恒定的。當該輻射率不切實際或不符合要求時，可以使用變動的或不連續的輻射。
按照本發明方法，可以將輻射率進行優化以產生產品收率和完成操作所需時間的最有利組合。在本文所述方法中，使用低(≤3kGy/小時)和高(＞3kGy/小時)輻射率都可以達到這樣的結果。對輻射率進行優選以優化含有非水性溶劑的生物材料的收率，而同時仍然使含有非水性溶劑的生物材料得以滅菌。雖然降低輻射率可減小對含有非水性溶劑的生物材料的損害，但其也會導致為達到特定要求的總劑量而需要較長的輻射時間。因此，在某些情況下可以優選較高劑量的輻射率，以例如將后勤問題和成本減到最小，并且當按照本文所述方法使用時，可保護含有非水性溶劑的生物材料免受輻射損害。
按照本發明特別優選的實施方案，輻射率不高于約3.0kGy/小時，更優選為約0.1kGy/小時-3.0kGy/小時，甚至更優選為約0.25kGy/小時-2.0kGy/小時，還甚至更優選為約0.5kGy/小時-1.5kGy/小時，最優選為約0.5kGy/小時-1.0kGy/小時。
按照本發明另一個特別優選的實施方案，輻射率為至少約3.0kGy/小時，更優選為至少約6kGy/小時，甚至更優選為至少約16kGy/小時，甚至更優選為至少約30kGy/小時，而最優選為至少約45kGy/小時或更高。
按照本發明方法，欲滅菌的含有非水性溶劑的生物材料是用射線對其輻射能有效將生物材料滅菌的時間。與輻射率相聯合，適宜的輻射時間產生施用于含有非水性溶劑的生物材料的適當輻射劑量。適宜的輻射時間可以根據有關的特定輻射形式和輻射率和/或接受輻射的含有非水性溶劑的特定生物材料的性質和特征而變化。適宜的輻射時間可以由本領域技術人員憑經驗確定。
按照本發明的方法，用射線將欲滅菌的含有非水性溶劑的生物材料輻射至能有效地將生物材料滅菌，而同時不給該材料造成不可接受水平的損害的總劑量。適宜的輻射總劑量可以根據所使用的本發明方法的某些特征而變化，例如根據被滅菌的含有非水性溶劑的特定生物材料的性質和特征，有關的特定輻射形式和/或被滅活的特定生物污染物或病原體而變化。適宜的輻射總劑量可以由本領域技術人員憑經驗確定。優選地，輻射總劑量為至少25kGy，更優選為至少45kGy，甚至更優選為至少75kGy，而還更優選為至少100kGy或更高，例如150kGy或200kGy或更高。
被輻射的含有非水性溶劑的生物材料的特定幾何形狀，例如厚度和離輻射源的距離可以由本領域技術人員憑經驗確定。優選的實施方案是在整個制劑中提供均勻輻射速度的幾何形狀。特別優選的實施方案是這樣的幾何形狀，其在整個制劑中帶來短的輻射路徑長度，由此將在制劑的前面與后面之間的輻射劑量差異減至最小。在某些優選的幾何形狀中，特別是其中制劑沿著與輻射源垂直的其軸具有恒定半徑的幾何形狀，可通過利用將制劑沿著所述軸旋轉的手段來將這樣的差異進一步減小。
類似地，按照本發明的某些方法，用于在輻射期間包含制劑的有效包裝是合并了在輻射影響下的穩定性，并且將包裝與輻射之間的相互作用降至最小的包裝。優選的包裝在輻射之前、期間和之后保持了抗外部環境的封閉，不與其中所包含的制劑反應，它們不產生可與其中所包含的制劑相互作用的化學物質。特別優選的實例包括但不限于這樣的容器，它們包含在輻射時穩定的玻璃，通過用橡膠制成的塞子來塞住，所述橡膠在輻射期間比較穩定，并從中釋放出極小量的化合物，通過用鋁或具有較低Z數目的其它適當材料制成的金屬卷曲封條密封。合適的材料可通過測定其物理性能，輻射后反應性可瀝濾化合物的量和類型，以及通過由本領域技術人員憑經驗測定已知對于生物材料的防范很重要的其它特征來確定。
按照本發明的某些方法，在輻射之前，可以任選將有效量的至少一種增敏化合物加到含有非水性溶劑的生物材料中，以例如提高輻射對生物材料中的生物污染物和病原體的作用效果，同時用本文所述方法將輻射將對生物材料的有害作用降至最小。適宜的增敏劑是本領域技術人員已知的，包括補骨脂素及其衍生物和inactines及其衍生物。
按照本發明的方法，含有非水性溶劑的生物材料的輻射可以在對被輻射的生物材料無害的任何溫度下進行。按照一個優選的實施方案，將含有非水性溶劑的生物材料在室溫下進行輻射。依據另一個優選的實施方案，將含有非水性溶劑的生物材料在低溫下，即低于室溫的溫度下，例如在0℃、-20℃、-40℃、-60℃、-78℃或-196℃溫度下進行輻射。按照本發明的該實施方案，優選在生物材料的冰點或低共熔點溫度下或低于所述冰點或低共熔點的溫度下對含有非水性溶劑的生物材料進行輻射。按照另一個優選的實施方案，在高溫下，即高于室溫的溫度下，例如在37℃、60℃、72℃或80℃下對含有非水性溶劑的生物材料進行輻射。雖然不希望受縛于任何理論，但是據信，使用高溫可以增強輻射對生物污染物或病原體的作用效果，并因此可以使用較低的輻射總劑量。
最優選地，含有非水性溶劑的生物材料的輻射在保護制劑免受輻射損害的溫度下進行。適宜的溫度可以由本領域技術人員憑經驗確定。
在本發明的某些實施方案中，進行輻射的溫度可在一個范圍內，而不是在一個具體值上。對于含有非水性溶劑的特定生物材料的輻射來說，這樣的優選溫度范圍可由本領域技術人員憑經驗確定。
按照本發明的方法，含有非水性溶劑的生物材料的輻射可以在不對被滅菌的含有非水性溶劑的生物材料造成損害的任何壓力下進行。按照一個優選的實施方案，將含有非水性溶劑的生物材料在高壓下進行輻射。更優選地，將含有非水性溶劑的生物材料在由于施用聲波或使用揮發物而造成的高壓下進行輻射。雖然不希望受縛于任何理論，但是據信，使用高壓可增強輻射對生物污染物或病原體的作用效果和/或增強由一種或多種穩定劑提供的保護作用，并因此可以使用較低總劑量的輻射。適宜的壓力可由本領域技術人員憑經驗確定。
一般地，按照本發明方法，進行滅菌的含有非水性溶劑的生物材料的pH值為約7。然而，在本發明的某些實施方案中，含有非水性溶劑的生物材料可以具有小于7，優選小于或等于6，更優選小于或等于5，甚至更優選小于或等于4，最優選小于或等于3的pH值。在另外的本發明實施方案中，含有非水性溶劑的生物材料可以具有大于7，優選大于或等于8，更優選大于或等于9，甚至更優選大于或等于10，最優選大于或等于11的pH值。按照本發明的某些實施方案，進行滅菌的制劑的pH值在生物材料的一個組分的等電點或接近等電點。適宜的pH水平可由本領域技術人員憑經驗確定。
同樣地，按照本發明方法，含有非水性溶劑的生物材料的輻射可以在不對被處理的生物材料造成損害的任何氣氛下進行。按照一個優選的實施方案，將含有非水性溶劑的生物材料置于低氧或惰性氣氛下。當使用惰性氣氛時，該氣氛優選由稀有氣體，例如氦或氬，更優選高分子量稀有氣體，最優選氬組成。按照另一個優選的實施方案，在輻射時將含有非水性溶劑的生物材料置于真空下。按照本發明特別優選的實施方案，在輻射之前將含有非水性溶劑的生物材料(凍干的、液體的或冷凍的)貯藏在真空或惰性氣氛(優選稀有氣體，例如氦或氬，更優選高分子量稀有氣體，最優選氬)下。按照本發明另一優選的實施方案，在輻射前，將含有非水性溶劑的液體生物材料置于低壓下，以減少溶于液體中的氣體特別是氧氣的量，同時采用或不采用減少溶劑的先前步驟例如凍干。這樣的除氣法可以使用本領域技術人員已知的任何方法進行。
在另一個優選的實施方案中，當含有非水性溶劑的生物材料包含有溶解于其中或與之結合的氧或其它氣體時，可以用本領域技術人員已知的任何方法和技術，例如通過有控制地降低裝有被處理制劑的容器(剛性或柔性)內的壓力，或者通過將制劑置于大致相等體積的容器中，來將制劑內的或與制劑結合的這些氣體的量降低。
在本發明的某些實施方案中，當欲處理的含有非水性溶劑的生物材料是組織時，按照本領域技術人員已知的任何方法和技術，將至少一種穩定劑引入其中，包括把組織在含有穩定劑的溶液中浸泡，優選在壓力、高溫和/或在滲透促進劑例如二甲亞砜存在下進行浸泡。將至少一種穩定劑引入組織內的其它方法包括但不限于施加含有穩定劑的氣體，優選在壓力和/或高溫度下施加；將穩定劑或含有穩定劑的溶液直接注射到組織中；把組織置于低壓下，然后引入含有穩定劑的氣體或溶液；以及兩種或多種這些方法的組合。按照這樣的方法，可以將一種或多種穩定劑引入到組織內。
應當理解，本文所描述的一個或多個特征的組合的使用，會進一步將由輻射所造成的對含有非水性溶劑的生物材料的有害作用減至最小，而同時保持輻射操作對生物污染物或病原體的充分作用效果。例如，除了使用穩定劑以外，在輻射之前，還可以把含有非水性溶劑的特定生物材料凍干，置于降低的溫度下和貯存于真空中，以便進一步使有害作用減至最小。
特定生物污染物或病原體對射線的敏感性一般是通過確定滅活或殺死樣本中約37％的目標物所需的劑量來計算的，其稱為D37值。生物材料的所需組分也可以被看作具有與消除約37％其所需生物和生理特征所需的輻射劑量相等的D37值。
按照本發明的某些優選方法，含有非水性溶劑的生物材料的滅菌，是在導致生物污染物或病原體的D37值下降，而同時不降低生物材料的D37值的條件下進行的。按照本發明的其它優選方法，含有非水性溶劑的生物材料的滅菌是在導致生物材料的D37值增加的條件下進行的。按照本發明的最優選方法，含有非水性溶劑的生物材料的滅菌是在導致生物污染物或病原體的D37值降低，而同時生物材料的D37值增加的條件下進行的。
實施例下面的實施例是對本發明的舉例說明而不是限制。其它適當的修正和改進是本領域技術人員所通常遇見的變化，并完全在本發明的實質和范圍內。除非另有說明，否則全部輻射皆使用60Co源來實現。
實施例1在該實驗中，測定γ輻射對懸浮在聚丙二醇(PPG)400或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的干燥尿激酶的影響。
方法制備如下表中所示的含有尿激酶和PPG400(管2和5)、PBS(管3和6)或單獨的干燥尿激酶(管1和4)的6個1.5ml微型聚丙烯離心管。將管4-6在4℃以45kGy(1.9kGy/小時)進行γ輻射。管1-3是對照(4℃)。
輻射后，將樣本在室溫以14k RPM離心5分鐘。將PPG400溶劑從管2和5中除去，向這兩個管中加入120μl PBS。向管1和4中分別加入128μl和135μl PBS(尿激酶濃度為40,000IU/ml)。然后用PBS將所有樣本進行50倍稀釋，測定在280nm的吸收度。然后將50μl各個稀釋的樣本加到96-孔微量滴定板中，然后加入50μl 3mM在2×測定緩沖液中的底物。將平板在搖動下于37℃培養，從加入底物后5分鐘開始，每隔20分鐘讀取一次在405和620nm的吸收度。將在630nm的吸收度(背景吸收)從在405nm的值中減去以獲得校正的吸收值。尿激酶的終濃度為1000IU/ml。
材料尿激酶-Sigma cat.#U-5004，lot 29H1054；2.5mg＝4000IU尿激酶。
PPG400-Fluka cat.#81350。
底物-尿激酶底物1，比色測定-Calbiochem.cat.#672157，lotB23901，5mg小瓶，終濃度1.5mM。
2×測定緩沖液-100mM Tris(pH 8.8)，100mM NaCl，0.2％PEG8000。
結果懸浮在PPG400中，然后接受45kGy的總劑量的γ輻射的尿激酶保持與γ輻射的干燥粉末尿激酶相同的百分活性(80％)。與其相反，懸浮在PBS中接受相同γ輻射的尿激酶僅保持6％的活性。該實驗的結果在附圖1中給出。
實施例2在該實驗中，測定在不同形式的聚丙二醇(分子量為400、1200和2000)存在下輻射后，固定的抗胰島素單克隆抗體的活性(通過與抗原結合的能力表示)。
方法在兩個96-孔微量滴定板(falcon板-ProBind聚苯乙烯cat.#353915)中，將孔用全體積的PBS(pH 7.4)洗滌4次。一旦如上所述制得這兩個平板，即在包被緩沖液中將它們用100μl/孔的新制備的2μg/ml抗胰島素包被，然后在4℃放置過夜。然后將平板用PBS(pH 7.4)簡單地洗滌3次，向特定的孔中加入100μl PPG400、PPG1200或PPG2000，每一溶液被制成1升，即用PBS進行2-倍系列稀釋。用蓋墊(Greiner蓋墊cat.#381070(USA Scientific))將這兩個平板緊密覆蓋，在4℃以0kGy/小時或45kGy(1.92kGy/小時)輻射。
輻射后，向所有孔中加入約380μl全體積的封閉緩沖液，將平板在37℃培養2小時。將平板用TBST洗滌4次，向每個孔中加入100μl50ng/ml生物素標記的胰島素在結合緩沖液中的溶液。將平板用平板密封器(Dynatech乙酸酯平板密封器)覆蓋，在搖動下(設置為3的LabLine Titer Plate Shaker)于37℃培養1.5小時。將平板用TBST洗滌4次，向每個孔中加入100μl 0.5μg/ml磷酸酶標記的鏈霉抗生物素蛋白在結合緩沖液中的溶液。將平板用平板密封器覆蓋，在搖動下于37℃培養1小時。將平板用TBST洗滌4次，向每個孔中加入100μl 1mg/ml磷酸酶底物在DEA緩沖液中的溶液，將平板在搖動下于37℃培養。按照需要以5分鐘的間隔讀取在405和620nm的吸收度。將在630nm的吸收度(背景吸收)從在405nm的值中減去以獲得校正的吸收值。
材料封閉緩沖液-2％BSA/PBS(pH 7.4)。
TBST-含有0.05％Tween 20的Tris緩沖鹽水(pH 7.4)。
生物素標記的胰島素-得自牛胰腺-Sigma I-2258lot 11OH8065，5mg胰島素，1.2mol FITC/摩爾胰島素，以1.0mg/ml在5ml無菌水中重新配制，在4℃貯藏。
結合緩沖液-0.25％BSA/PBS(pH 7.4)。
磷酸酶標記的鏈霉抗生物素蛋白-KPL cat.#15-30-00；0.5mg/ml在50％甘油/H2O中的溶液(1∶1000稀釋的貯備液)。
DEA緩沖液-每1L-97ml二乙醇胺(SigmaD-8885)，0.1gMgCl2.6H2O，0.02％疊氮化鈉，在4℃貯藏。
磷酸酶底物-磷酸對硝基苯酯-Sigma 104-105，5mg/片。磷酸酶底物新配制成1mg/ml在磷酸酶底物緩沖液，即DEA緩沖液中的溶液。該溶液是光敏感的，因此必須將其在黑暗中貯藏直至準備配送。
單克隆IgG1抗人胰島素-Biodesign Int.cat.#E86102M，lot8J2877。
包衣緩沖液-碳酸鹽/碳酸氫鹽(pH 9.4)。
聚丙二醇P400-Fluka cat.#81350。
聚丙二醇P1200-Fluka cat.#81370。
聚丙二醇P2000-Fluka cat.#81380。
結果含有PPG的被輻射的樣本表現出的結合活性是未輻射對照樣本的約50-63％。與其不同，含有PBS的輻射樣本沒有表現出結合活性。結果在附圖2中給出。
實施例3在該實驗中，用不同的輻射總劑量輻射含有50％甘油并摻加豬細小病毒(PPV)的液體凝血酶。
方法1.向Wheaton 3ml管(一式兩份)中加入100μl 100％甘油、摻加50μl PPV的20μl凝血酶(100U/ml凝血酶)和任選作為穩定劑的20μl(200mM)抗壞血酸鈉(用H2O將總體積調節至1ml)，在4℃以1.8kGy/小時輻射至10、30或45kGy的總劑量。
2.將96-孔細胞培養板標記和加入細胞，使得每次稀釋4個孔(在接種前一天加入細胞)。向每個孔中加入濃度為4×104/ml的200μl細胞懸浮液。使用相同細胞培養基來在病毒接種后進行細胞生長和保持。
3.當細胞達到70-90％鋪滿時，進行病毒接種。在該實驗中，首先將800μl PK-13生長培養基加到200μl樣本中。
4.用PK-13生長培養基制備樣本的稀釋液(1∶5)，然后使用低蛋白結合盤式濾器將濾器滅菌。
5.將50μl預稀釋的樣本加到96孔板的柱1中。在柱1中，通過上下吸移4-5次將培養基與樣本混和在一起。用新鮮的柱尖將所需量(50μl)轉移到下一個柱上，重復該混和操作。將所有液體從柱尖中排出來，使用同一組柱尖，將樣本轉移到下一個柱上。在每個柱中重復該操作直至到達柱12。當把柱12中的樣本混和時，將液體從柱尖中排出來，抽出樣本量，將額外的液體置于廢瓶內。獲得了12次樣本稀釋。
6.將平板放回37℃的培養器中。
7.在第4-5和7天，用顯微鏡觀察，并記錄接種的培養基中的細胞病變作用。依據Karber的方法，從CPE讀數計算TCID50。
8.通過加入50μl PPV感染貯備液來制備陽性對照，通過加入50μl PK-13生長培養基，然后進行系列1∶5稀釋來制備陰性對照。
材料Wheaton管-玻璃血清瓶，Wheaton#223684，lot#1154132-02。
凝血酶-來源于牛，5000US單位(5000U/ml貯備液)。
抗壞血酸鈉-Aldrich Chem.Co.cat.#26，855-0(Milw，WI53201)。
豬細小病毒(PPV)-ATCC#VR-742；PPV感染貯備液是用PEG8000制備的，其中將1/5體積的PEG8000(20％在2.5M NaCl中的溶液)加到PPV中，在冷凍溫度培養24小時，然后在Beckman SW-28轉筒中以15,000rpm將PPV離心45分鐘，重懸在1/10體積的PEG緩沖液中。通過TCID50確定豬細小病毒的PPV效價，其效價為約9.0log/ml(032301貯備液)。PPV在液體凝血酶中的摻入比例為1∶4(50μlPPV貯備液與150μl蛋白溶液混和)。
PEG緩沖液-0.1M NaCl，0.01M Tris(pH 7.4)，1mM EDTA。
在該實驗中使用的硅氧烷化塞子得自American Stemli(Princeton，N.J.)，6720GC橡膠，lot#G009/7202。
Cells-PK-13(ATCC#CRL-6489)，#14代。將細胞保持在PK-13生長培養基(補充10％FBS和1×青霉素/鏈霉素/L-谷酰胺的Dulbecco改進的Eagle培養基)。
結果樣本 每0.05ml的TCID50效價Log的減少0kGy/+200mM抗壞血酸鈉 6.290kGy/無穩定劑 6.37510kGy/+200mM抗壞血酸鈉4.971.3210kGy/無穩定劑2.973.40530kGy/+200mM抗壞血酸鈉3.053.2430kGy/無穩定劑2.354.02545kGy/+200mM抗壞血酸鈉3.053.2445kGy/無穩定劑3.053.325有和沒有抗壞血酸鈉存在下，采用10kGy的總劑量，使PPV水平分別有了1.32log和3.405log的減少。類似地，有和沒有抗壞血酸鈉存在下，采用30kGy的總劑量，使PPV水平分別有了3.24log和4.025log的減少。有和沒有抗壞血酸存在下，采用45kGy的總劑量，使PPV水平分別有了3.24log和3.325log的減少。該實驗證實了，在非水性溶劑存在下，使用和不使用有效的穩定劑，能有效滅活非常小的未包膜病毒。
實施例4在該實驗中，在不同水平的殘余溶劑(水)含量下，將懸浮在聚丙二醇400中的胰蛋白酶進行γ輻射。
方法以約20,000U/ml的濃度將胰蛋白酶懸浮在聚丙二醇400中，并分成多個樣本。向每份樣本中加入固定量的水(0％、1％、2.4％、4.8％、7％、9％、10％、20％、33％)；還制備不含PPG 400的100％水樣本。
在4℃以1.9kGy/小時的速度將樣本輻射至總劑量為45kGy。輻射后，將每份樣本離心以讓未溶解的胰蛋白酶沉淀。取出PPG/水溶性級份，將離心沉淀團重懸在單獨的水中以進行活性測試。
分析條件將5U/孔胰蛋白酶(50U/ml)+BAPNA底物(0.5mg/ml)系列稀釋(3倍稀釋)到96-孔板中。在兩個96-孔板中進行測定，在第5和20分鐘讀取在405和620nm的吸收度。將在630nm的吸收度(背景吸收)從在405nm的值中減去以獲得校正的吸收值。將在第5分鐘與第15分鐘反應時間之間該值隨著時間的變化繪制曲線，使用雙曲線矩形方程在Sigma Plot中確定Vmax和Km。
結果含有聚丙二醇(PPG 400)與水(最高達33％水)的混合物的被輻射的樣本保持了未被輻射的胰蛋白酶對照的約80％活性，并且活性等于在同樣條件下輻射的干燥(凍干)胰蛋白酶對照的活性。在輻射至45kGy的100％水樣本中沒有檢測到活性。該實驗的結果以圖的方式在附圖3中表示。
實施例5在該實驗中，在聚丙二醇400(PPG400)存在下，并任選在清除劑存在下，將豬心臟瓣膜輻射至總劑量為30kGy(1.584kGy/小時，在-20℃)。
材料組織-豬肺瓣膜(PV)，在使用前割下心臟瓣膜并貯藏。
組織制備試劑聚丙二醇400.Fluka，cat#81350lot#386716/1TroloxC.Aldrich，cat#23，881-3lot#02507TS香豆酸.Sigma，cat#C-9008lot#49H3600五倍子酸正丙酯.Sigma，cat#P-3130lot#117H0526α-硫辛酸.CalBiochem，cat#437692lot#B34484Dulbecco’s PBS.Gibco BRL cat#14190-144lot#10950272.0ml螺口管.VWR Scientific Products，cat#20170-221lot#0359組織水解試劑Nerl H2O.NERL Diagnostics cat#9800-5lot#03055151丙酮.EM Science cat#AX0125-5，lot#370597116N恒沸HCl.Pierce cat#24309，lot#BA42184Int-Pyd(乙酰化吡啶啉醇(Pyridinoline))HPLC內標.MetraBiosystems Inc.cat#8006，lot#9H142 expiration 2/2002 Store@≤-20℃鹽酸.VWR Scientific cat#VW3110-3，lot#n/a七氟丁酸(HFBA)Sigma cat#H-7133，lot#20K3482 FW 214.0，在2-8℃貯藏SP-Sephadex C-25樹脂.Pharmacia cat#17-0230-01，lot#247249(按照制造商的說明用NaCl充滿)水解瓶-10mm×100mm真空水解管.Pierce cat#29560，lot#BB627281加熱組件-Pierce，Reacti-therm.Model#18870，S/N1125000320176Savant-Savant Speed Vac System1.Speed Vac Model SC110，#SC110-120型，#SC110-SD171002-1H系列a.Refrigerated Vapor Trap Model RVT100，#RVT100-120V型，#RVT100-58010538-1B系列b.真空泵，VP 100 Two Stage Pump Model VP100，#93024系列柱-Phenomenex，Luna 5μ C18(2)100，4.6×250mm.Part#00G-4252-E0，S/N#68740-25，B/N#5291-29HPLC系統Shimadzu系統控制器SCL-10AShimadzu自動樣本注射器SIL-10A(50μl回路)Shimadzu分光熒光檢測器RF-10AShimadzu泵LC-10AD軟件-Class-VP版本4.1低結合管-MiniSorp 100×15Nunc-Immunotubc.Batch#042950，cat#468608方法A.制備穩定劑溶液Trolox CMW＝250；因此，對于1M，需要250mg/ml，對于0.5M，需要125mg/ml實際重量＝250.9mg250÷125mg/ml＝2.0ml不溶；因此加入2ml of PPG。水浴超聲處理和計時后，Trolox C在125mM溶解。
香豆酸MW＝164；因此，對于1M，需要164mg/ml實際重量＝164.8mg164.8mg÷164mg/ml＝1.0ml水浴超聲處理約15分鐘-不是100％溶解。加入1ml PPG，再次水浴超聲處理。
五倍子酸正丙酯
MW＝212.2；因此，對于1M，需要212mg/ml，對于0.5M，需要106mg/ml實際重量＝211.9mg211.9mg÷106mg/ml＝2.0ml水浴超聲處理20-30分鐘后溶解。
1M α-硫辛酸MW＝206；因此，206mg/ml實際重量＝412mg412mg÷206mg/ml＝2.0ml水浴超聲處理10分鐘后，溶解性非常好清除劑的最終貯備液125mM Trolox C-4ml1M硫辛酸-2ml0.5M香豆酸-2ml0.5M五倍子酸正丙酯-2mlB.在γ輻射之前處理瓣膜1.將PV心臟瓣膜在濕冰上融化。
2.將瓣膜尖從每個瓣膜上切下來，合并到含有冷的Dulbecco’sPBS的50ml錐形管內。
3.將瓣膜尖在PBS中于4℃洗滌約1.5小時；在洗滌期間更換PBS總共6次。
4.將2個瓣膜尖分別置于2ml螺口管中。
5.將1.2ml下列物質加到2個管中(對于0和30kGy)PPG125mM Trolox C在PPG中的溶液SCb穩定劑混合物包含1.5ml 125mM Trolox C、300μl 1M硫辛酸、600μl 0.5M香豆酸和600μl 0.5M五倍子酸正丙酯(終濃度分別為62.5mM、100mM、100mM和100mM)。
6.在搖動下將管在4℃培養。
7.將穩定劑溶液和瓣膜尖轉移到用于γ輻射的2ml玻璃瓶內。
8.將所有玻璃瓶在干冰上冷凍。
9.將對照樣本在室內于-20℃培養。
C.組織的γ輻射在-20℃將樣本以1.584kGy/小時的輻射率輻射至總劑量為30kGy。
D.用于水解/提取的組織加工1.因為PPG是粘性的，所以加入PBS以使得組織易于轉移。
2.將每對瓣膜尖(每個條件下2個)置于填充有冷PBS的50mlFalcon管中，在冰上培養-定期將管反轉。
3.1小時后，將PBS從含有在PPG/0和30中的瓣膜尖的管中傾析出來，用新鮮的冷PBS再充滿。對于含有Trolox C或穩定劑混合物的PPG樣本，準備填充有冷PBS的新的50ml Falcon管，并將瓣膜尖轉移。
4.進行另外3次洗滌。
5.將一個瓣膜尖轉移到用于提取的填充有冷PBS的2mlEppendorf管中。準備用于水解的其它瓣膜尖。
E.組織水解組織水解1.在Eppendorf管中將每個瓣膜尖用丙酮洗滌6次(約1.5ml/洗滌)。
2.給每個瓣膜尖施以SpeedVac(不加熱)15分鐘或直至變干。
3.稱重樣本，轉移到水解瓶中，以20mg組織/ml HCl的體積加入6N HCl樣本ID 干重(mg)μl 6N HCl1.PPG/0 6.493252.PPG/307.263633.PPG T/0 5.802904.PPG T/30 8.20410
5.PPG SCb/06.41 3216.PPG SCb/30 8.60 4304.將樣本在110℃水解約23小時。
5.將水解產物轉移到Eppendorf管中，以12,000rpm離心5分鐘。
6.將上清液轉移到干凈的Eppendorf中。
7.將50μl水解產物在8ml Nerl H2O中稀釋(將HCl稀釋至約38mM)。
8.在200μl 2×int-pyd中摻加。通過反轉混和(對于1600μl2×int-pyd160μl 20×int-pyd+1440μl Nerl H2O)。
9.將樣本負載到已在水中平衡的SP-Sephadex C25柱(約1×1cm填充層體積)上。(用NaCl預先填充該柱)10.將流出液再次負載到柱上。
11.用20ml 150mM HCl洗滌。
12.用5ml 2N HCl將交聯物洗脫到低結合管內。
13.在Savant中將整個樣本干燥。
F.分析水解產物準備下列樣本 μl μl H2O μl HFBA1.PPG/0kGy18 180 22.PPG/30kGy 59 139 23.PPG T/0kGy 67 171 24.PPG T/30kGy 64 134 25.PPG SCb/0kGy10 188 26.PPG SCb/30kGy 32 16 2結果HPLC結果如附圖4A-4C所示。在PPG 400存在下，無論心臟瓣膜是否已經被輻射過，結果幾乎相同。加入一種穩定劑(trolox C)或穩定劑混合物產生了更有效的結果。附圖4D所示的凝膠分析證實了這些條件所提供的保護有效性。
實施例6在該實驗中，確定在50％DMSO和任選穩定劑存在下，并且在聚丙二醇400(PPG400)存在下，γ輻射對豬心臟瓣膜尖的影響。
制備用于輻射的組織1.將5個PV瓶和3個心房瓣膜(AV)在冰上融化。
2.除去融化培養基，將瓣膜在填充有PBS的燒杯中洗滌。
3.將每個瓣膜轉移到含有PBS的50ml錐形瓶中。通過反轉洗滌，并取出。
4.反復洗滌3次。
5.將3個瓣膜尖(瓣膜)切下來。
6.貯藏在2ml頂端螺口Eppendorf瓶(Eppendorfs)內的PBS中，并在冰上保持。
制備穩定劑制備所有穩定劑，使得DMSO的終濃度為50％。
1M抗壞血酸鹽在50％DMSO中的溶液Aldrich cat#26，855-0lot#10801HU將200mg溶解在300μl H2O中。加入500μl DMSO。用水將體積調節至1ml，最終的pH約為8.01M香豆酸Sigma cat#C-9008lot#49H3600.MW 164.2將34.7mg溶解在106μl DMSO中pH＝≈3.0加入138μl H2O。將樣本粉碎。
一旦用1N NaOH將pH調節至7.5，即將香豆酸加到溶液中。
1M五倍子酸正丙酯Sigma cat#P-3130lot#117H0526.MW 212.2將58.2mg溶解在138μl DMSO中。
加入138μl H2O。最終的pH為6.5或稍微更低一些。
穩定劑混合物
1.0ml 500mM抗壞血酸鹽500μl 1M香豆酸300μl 1M五倍子酸正丙酯1.2ml50％DMSO3.0ml方法將1.6ml溶液(穩定劑混合物或PPG400)加到每份樣本中，然后將樣本在4℃培養2.5天。然后將瓣膜與1ml培養它們的溶液轉移到2ml輻射瓶中。在3.6℃用γ射線以1.723kGy/小時的速度將每份樣本輻射至總劑量為25kGy。
組織水解1.在2ml Eppendorf瓶中用丙酮將每個瓣膜尖洗滌6次。
2.最后一次丙酮洗滌后，將樣本在Savant中(不加熱)干燥約10-15分鐘或直至變干。
3.稱重樣本，將其轉移到水解瓶中，然后加入20mg組織/ml HCl的6N HCl樣本ID 干重(mg) μl 6NHCl1.PBS/0kGy 11.4 5702.PBS/25kGy6.0 3003.DMSO/OkGy6.42 3214.DMSO/25kGy 8.14 4075.DMSO/SC-a/0kGy 8.7 4356.DMSO/SC-a/25kGy 8.15 4087.PPG/OkGy 13.09 6558.PPG/25kGy10.88 5445.將樣本在110℃水解約23小時。
6.將水解產物轉移到Eppendorf管中，以12,000rpm離心5分鐘。
7.將上清液轉移到干凈的Eppendorf中。
8.將50μl水解產物在8ml Nerl H2O中稀釋(將HCl稀釋至約37mM)。
9.在200μl 2×int-pyd中摻加。通過反轉混和(對于2000μl2×int-pyd200μl 20×int-pyd+1.8ml Nerl H2O)。
10.將樣本負載到已在水中平衡的SP-Sephadex C25柱(約1×1cm填充層體積)上。(用NaCl預先填充該柱)11.將流出液再次負載到柱上。
12.用20ml 150mM HCl洗滌。
13.用5ml 2N HCl將交聯物洗脫到低結合管內。50ml 2 NHCl用Nerl H2O將8.6ml濃HCl調節至體積為50ml。
14.在Savant中干燥整個樣本。
蛋白聚糖的胍鹽酸鹽提取和DEAE-瓊脂糖純化4M胍鹽酸鹽提取1.將所有3個瓣膜尖從γ輻射瓶中取出來，轉移到單獨的50ml錐形管中。
2.用50ml dPBS將瓣膜尖洗滌5次(在4℃洗滌約5小時)，在Kimwipe上加濕后測定一個瓣膜尖的濕重。
3.將每組中的一個瓣膜尖轉移到5ml微型離心管中，加入適當體積的含有2μg/ml蛋白酶抑制劑(抑酶肽、亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制劑A)的4M胍鹽酸鹽/150mM乙酸鈉緩沖液，pH 5.8，使體積與組織比例為15(參見Methods in Enzymology Vol.144 p.321-關于15-20的最佳收率使用比例)。
4.用剪刀將瓣膜尖切成小片。
5.在4℃振搖約48小時。
6.在Hermle Z-252M上以16,500RPM于4℃離心10分鐘。
7.收集胍可溶性級份，在10K MWCO Slide-A-Lyzer中用5LPBS透析過夜(具有一個5L的3個slide-a-lyzer和在另5L中的5個slide-a-lyzer)以除去胍。
8.更換PBS，在攪拌下于4℃再透析9小時。
9.收集透析液，在4℃貯藏。
10.在Hermle Z-252M上以16,500RPM于4℃離心5分鐘。
11.取出PBS可溶性級份來用于DEAE-瓊脂糖色譜。
DEAE-瓊脂糖色譜1.將500μl PBS可溶性胍提取液的NaCl濃度增加至300mMNaCl(假定的PBS可溶性級份已經具有約～150mM的NaCl，因此向每500μl樣本中加入15μl 5M NaCl貯備液)。
2.將～1ml填充的DEAE-瓊脂糖(預先用1M NaCl/PB pH 7.2洗滌過)平衡到300mM NaCl/PB pH 7.2(注意為了制備300mMNaCl/PB pH7.2-將3ml 5M NaCl貯備液加到100ml PBS中)。
3.將200μl 1μl樹脂漿液加到515μL GuHCl提取液中(都具有300mM NaCl)。
4.在室溫振搖1小時。
5.輕微離心以讓樹脂沉降。
6.取出“未結合”的樣本，在-20℃貯藏。
7.將樹脂用～1.5ml 300mM NaCl/PBS pH7.2洗滌5次。
8.最后一次洗滌之后，用100μl Hamilton注射器取出所有額外的緩沖液。
9.在室溫用三份100μl體積的1M NaCl/PB pH 7.2洗脫。在-20℃貯藏。
SDS-PAGE用于分析PBS可溶性胍鹽酸鹽提取物和進行DEAE-瓊脂糖色譜的5-20％梯度凝膠。
1.Gel#lGuHCl提取物/PBS可溶性級份-依次用甲苯胺藍和考馬斯藍染色。
2.Gel#2DEAE-瓊脂糖洗脫級份#1-依次用甲苯胺藍和考馬斯藍染色。
通過HPLC定量測定膠原交聯1.制備100-200μl在1％七氟丁酸(HFBA)中的1×溶液。
2.在用流動相平衡的C18 HPLC柱上注射50μl。
3.將分光熒光計設定為在295nm激發，在395nm發射。
4.計算每1μl 1×Int-Pyd溶液內吡咯醇啉(Int-Pyd)的整合熒光。
結果HPLC結果如附圖5A-D所示。主峰代表內吡咯醇啉(Int-Pyd)峰。在含水環境(PBS)中的輻射使得較小峰顯著減少(附圖5A)。通過加入非水性溶劑(PPG 400)來減少水含量產生了幾乎重疊的曲線(附圖5B)。在保持主峰方面，DMSO的有效性較小(附圖5C)，而DMSO加穩定劑混合物(附圖5D)具有較大的有效性，雖然某些次要峰具有些許增加。如下表所示，計算關于每個樣本的pyd峰下的面積。這些結果證實了上述結論，并且表明，在含有PPG和DMSO以及清除劑混合物的樣本中，在成熟膠原里發現的氨基酸交聯(pyd)被有效地保持。凝膠分析在附圖5E中顯示，并且反映了由HPLC分析得到的主要結論，其中在PBS中看見的譜帶顯著減少，在非水性溶劑存在下，保持了主要譜帶。
實施例7在該實驗中，在-20℃以1.584kGy/小時的速度將浸泡在不同溶劑中的冷凍的豬AV心臟瓣膜γ輻射至總劑量為30kGy。
材料
1.獲得了豬心臟瓣膜，在低溫保護溶液(含有胎牛血清、青霉素-鏈霉素、M199培養基和約20％DMSO)中于-80℃貯藏。
2.Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水Gibco BRL cat#14190-144lot10950273.2ml帶螺口蓋的瓶VWR cat#20170-221lot#03594.2ml玻璃瓶Wheaton cat#223583lot#370000-015.13mm堵塞器Stelmi 6720GC lot#G006/55116.DMSOJT Baker cat#9224-01 lot#H406307.抗壞血酸鈉Aldrich cat#26，855-0 lot10801HU；制成2M在Nerl水中的貯備液。
8.胎牛血清9.青霉素-鏈霉素10.M199培養基11.DMSO方法低溫保存操作制備溶液冷凍培養基胎牛血清(FCS)(10％)＝50ml青霉素-鏈霉素＝2.5mlM199＝QS 500ml2M DMSODMSO＝15.62g冷凍培養基＝QS 100ml3M DMSODMSO＝23.44g冷凍培養基＝QS 100ml
1.將切割的心臟瓣膜(具有少量連接的導管/肌肉)放置在冷凍玻璃管(用色筆標記)內。
2.加入2ml冷凍培養基。
3.在21℃加入1ml 2M DMSO溶液。
4.在第5分鐘加入1ml 2M DMSO溶液。
5.在第30分鐘加入4ml 3M DMSO溶液。
6.在第45分鐘于4℃將冷凍管置于冰上。
7.在第50分鐘于-7.2℃接種浴。
8.在第55分鐘于-7.2℃成核。
9.在第70分鐘以1℃/分鐘冷卻至-40℃。從浴中取出，置于液氮罐中，在低溫貯藏容器中貯藏。
將心臟瓣膜輻射的操作1.將AV心臟瓣膜尖在濕的冰上融化。
2.將瓣膜尖合并到50ml管中。
3.在搖動下于4℃用～50ml dPBS洗滌瓣膜尖。在5小時期間更換5次PBS。
4.將瓣膜尖轉移到2ml帶螺口蓋的管中(2個瓣膜尖/管)。
5.將1.0ml下列物質加到兩個管當中的每個管內dPBS，50％DMSO和含有200mM抗壞血酸鈉的50％DMSO(如下所述將2M抗壞血酸鈉貯備液稀釋400μl(2M)+1.6ml水+2ml 100％DMSO)。
6.在振搖下將管在4℃培養～46小時。
7.將溶液和瓣膜尖轉移到2ml玻璃瓶中，堵塞并蓋上蓋子。
8.將所有瓶在干冰上冷凍。
10.然后在-20℃以1.584kGy/小時的速度將冷凍的樣本輻射至總劑量為30kGy。
結果HPLC分析結果如附圖6A-D所示。在含水環境(PBS)中的輻射使得較小峰顯著減少(附圖6A)。通過加入非水性溶劑(20％DMSO)來減少水含量使得這些峰更可靠(附圖6B)。在保持主峰和次要峰方面，將DMSO濃度增加至50％稍微更有效(附圖6C)，而DMSO加穩定劑混合物(附圖6D)非常有效(另外的新峰是由于穩定劑自身所致)。凝膠分析在附圖6E中顯示，并且反映了由HPLC分析得到的主要結論，其中在PBS中看見的譜帶顯著減少，在非水性溶劑存在下，以及有和沒有穩定劑存在下，保持了主要譜帶。
實施例8在該實驗中，在-70℃以約6kGy/小時的速度將浸泡在不同溶劑中的冷凍的豬AV心臟瓣膜γ輻射至總劑量為45kGy。
材料1.獲得豬心臟瓣膜尖，并且在低溫保護溶液(與實施例7中所述相同的溶液)于-80℃貯藏。
2.Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水Gibco BRL cat#14190-144lot10950273.2ml帶螺口蓋的瓶VWR cat#20170-221 lot#03594.2ml玻璃瓶Wheaton cat#223583 lot#370000-015.13mm堵塞器Stelmi 6720GC lot#G006/55116.DMSOJT Baker cat#9224-01 lot#H406307.抗壞血酸鈉Aldrich cat#26，855-0 lot10801HU；制成2M在Nerl水中的貯備液。
8.聚丙二醇400(PPG400)Fluka cat#81350 lot#386716/1方法低溫保存方法與實施例7相同。
1.將AV心臟瓣膜尖在濕的冰上融化。切下瓣膜尖，將合并的瓣膜尖用冷PBS洗滌6次。
2.將每一瓣膜尖干燥，將瓣膜尖轉移到2ml帶螺口蓋的管(2個瓣膜尖/管)。
3.將1.2ml下列物質加到兩個管當中的每個管內dPBS，含有200mM抗壞血酸鈉的dPBS，PPG400，用于再水合的PPG400，50％DMSO和含有200mM抗壞血酸鈉的50％DMSO(如下所述將2M抗壞血酸鈉貯備液稀釋400μl(2M)+1.6ml水+2ml 100％DMSO)。
4.在振搖下將管在4℃培養～46小時。
5.用新鮮的溶液替換所有溶液(具有下列例外對于一個PPG400組，除去PPG400，將瓣膜尖用PBS+200mM抗壞血酸鹽洗滌，然后將所述抗壞血酸鹽除去，并用新鮮的PBS+200mM抗壞血酸鹽替換)。
6.在振搖下將管在4℃培養～46小時。
7.將在步驟5)中制備的PPG400脫水/PBS+抗壞血酸鹽再水合瓣膜尖的溶液更換。
8.在振搖下將管在4℃培養～6小時。
9.將溶液和瓣膜尖轉移到2ml玻璃瓶中，堵塞并蓋上蓋子。
10.將所有瓶在干冰上冷凍。
11.然后在-70℃以6kGy/小時的速度將冷凍的樣本輻射至總劑量為45kGy。
結果HPLC結果如附圖7A-F所示。在含水環境(PBS)中的輻射使得次要峰改變，并且主峰右移。加入各種非水性溶劑，減少殘余水含量和加入穩定劑產生了與相應對照更匹配的特征。凝膠分析在附圖7G-7H中顯示，并且顯示了PBS中的譜帶顯著失去，而其它組表現出顯著保留了這些失去的譜帶。
當將實施例8中的結果與實施例5、6和7中的結果比較時，顯然，對于γ輻射，降低溫度通常導致對膠原交聯的改變和破壞量下降。該溫度依賴性的一個例證是含有50％DMSO和抗壞血酸鹽的樣本，其中隨著溫度從-20℃降至-80℃，另外的峰顯著減少。
實施例9在該實驗中，評價有或沒有穩定劑混合物(100mM海藻糖、150mM甘露醇、3.1M DMSO、2.2M丁二醇和3.1M甲酰胺)存在下，輻射至25kGy或50kGy總劑量的γ輻射對人股骨的機械完整性的影響。
材料甲酰胺(EM Science #4650，lot3631B33)；密度＝1.13g/mL2，3-丁二醇(Aldrich #B8，490-4，lot K023119BO)；密度＝0.995g/mL海藻糖(Sigma T-9531，lot 61K7026)；0.5M在水中的貯備液甘露醇(Sigma M-8429，lot 106H00842)；0.5M在水中的貯備液二甲亞砜(JT Baker #9224-01)Wheaton 5mL血清瓶(Wheaton #223685，lot 1165122-01)堵塞器(Stelmi，C14046720GC 6TP，lot G005/3768)人股骨，得自Comprehensive Tissue Centre via RadTag具有強力金鋼石刀片(Marmed，#75H)的Diamond Band SawModel #80(Marmed Inc.，Cleveland，OH)3％過氧化氫，購自local drug store中子生成輻照器操作1.用剃刀片將保留的軟組織和骨膜從骨頭上刮下來。
2.將股骨切成～2cm片段。
3.在攪拌下在溫熱的去離子水中將片段洗滌2小時。
4.在攪拌下將片段用3％過氧化氫處理0.5小時。
5.用幾份更換的水洗滌片段。
6.在攪拌下于4℃將片段在水中洗滌過夜。
7.將股骨片段切成5mm×5mm×1cm的小塊。
8.將股骨小塊在水中保持直至放置在清除劑溶液。
9.將股骨小塊隨機取出，并置于一個下列組中a.無穩定劑混合物/未輻射b.無穩定劑混合物/輻射至25kGyc.無穩定劑混合物/輻射至50kGyd.有穩定劑混合物/未輻射e.有穩定劑混合物/輻射至25kGyf.有穩定劑混合物/輻射至50kGy
在-72℃以約2.5kGy/小時的速度將樣本輻射至總劑量為25kGy或50kGy。
10.將含有穩定劑混合物的組置于5mL穩定劑混合物中，將未處理的組置于5mL 3.1M DMSO中。
11.將樣本在4℃攪拌24小時。
12.將樣本置于用于輻射的小瓶中，在干冰乙醇浴中迅速冷凍。
13.將樣本在-80℃保持直至進行輻射。
14.輻射后，將樣本在-80℃貯藏直至進行機械測試。
將樣本在三點彎曲試驗中測試。
結果用穩定劑混合物預處理的骨導致彎曲應力顯著恢復。與所有其它測試的處理相比，僅在低溫下輻射表現出彎曲應力恢復的顯著改善。下面所示結果是基于與對照相比的平均彎曲應力計算的a.無穩定劑混合物/輻射至25kGy9％下降c.無穩定劑混合物/輻射至50kGy26％下降e.有穩定劑混合物/輻射至25kGy5％下降f.有穩定劑混合物/輻射至50kGy14％下降實施例10目的測定進行或未進行如下處理的骨的機械完整性用聚丙二醇處理，然后用穩定劑混合物(200μM TroloxC、100mM香豆酸、100mM硫辛酸、100mM五倍子酸丙酯)處理，然后冷凍干燥，最后輻射至25kGy或50kGy。
材料香豆酸(Sigma C-4400，lot 51K3660)，0.5M在乙醇中的貯備液五倍子酸丙酯(Sigma P-3130，lot 60K0877)，0.5M在乙醇中的貯備液α-硫辛酸(Calbiochem 437692，lot B34484)，0.5M在乙醇中的貯備液TroloxC(Aldrich 23，881-3，lot 02507TS)2mM在DPBS中的貯備液DPBS(Sigma D-8662，lot 70K2343)聚丙二醇P400(Fluka #81350，lot 386716)Wheaton 5mL血清瓶(Wheaton#223685，lot 1165122-01)堵塞器(Stelmi，C14046720GC 6TP，lot G005/3768)通過Maestro軟件進行分析的VirTis Genesis 25EL冷凍干燥器人股骨，得自Comprehensive Tissue Centre via RadTag具有強力金鋼石刀片(Marmed，#75H)的Diamond Band SawModel #80(Marmed Inc.，Cleveland，OH)3％過氧化氫，購自local drug store中子生成輻照器操作1.用剃刀片將保留的軟組織和骨膜從骨頭上刮下來。
2.將股骨切成約2cm片段。
3.在攪拌下在溫熱的去離子水中將片段洗滌2小時。
4.在攪拌下將片段用3％過氧化氫處理0.5小時。
5.用幾份更換的水洗滌片段。
6.在攪拌下于4℃將片段在水中洗滌過夜。
7.將股骨片段切成5mm×5mm×1cm的小塊。
8.將股骨小塊在水中保持直至放置在穩定劑混合溶液中。
9.將股骨小塊隨機取出，并置于下列6個組中之一(-CK是指樣本未用穩定劑混合物處理，+CK是指樣本用穩定劑混合物處理，并且輻射劑量如后面所示)a.-CK/0kGyb.-CK/25kGyc.-CK/50kGyd.+CK/0kGye.+CK/25kGyf.+CK/50kGy
10.將所有樣本在PPG中于4℃培養過夜。
11.取出樣本，用Kimwipe輕拍以除去過量PPG。
12.將4mL穩定劑混合物加到指定為+CK的樣本中，而未處理的-CK保持不處理。
13.將+CK樣本在4℃攪拌過夜，而將-CK樣本在4℃放置相同時間。
14.將樣本置于輻射小瓶中，進行冷凍干燥。
15.冷凍干燥后，將樣本在4℃保持直至進行輻射。
16.輻射后，將樣本在4℃貯藏直至進行機械測試。
將樣本在三點彎曲試驗中測試。
結果三點彎曲試驗結果證實了與未預處理的樣本相比，加入穩定劑混合物在輻射后提供了更好的彎曲應力恢復。下面所示結果是基于與對照相比的平均彎曲應力計算的+CK/25＝10％彎曲應力下降+CK/50＝30％彎曲應力下降-CK/25＝42％彎曲應力下降-CK/50＝22％彎曲應力下降實施例11在該實驗中，評價在抗壞血酸鹽(200mM)或穩定劑混合物(2.2M丁二醇、3.1M DMSO、3.1M甲酰胺、150mM甘露醇和100mM海藻糖)存在下，γ輻射對人骨樣本的影響。處理或未處理的樣本未輻射或輻射至總劑量為50kGy。測定胍和胃蛋白酶提取物。
方法1.將人骨片用200mM抗壞血酸鹽或穩定劑混合物(2.2M丁二醇、3.1M DMSO、3.1M甲酰胺、150mM甘露醇和100mM海藻糖)于4℃處理過夜。
2.將骨片浸泡在液氮在，用錘粉碎。
3.將粉碎的樣本置于eppendorf管中(10-40mg/管)
4.進行胍和胃蛋白酶提取。通過SDS-PAGE分析結果。
結果根據SDS-PAGE分析，與用抗壞血酸鹽處理的樣本相比，穩定劑混合物處理的樣本表現出改善的結果。
實施例12目的測定不同的穩定劑混合物對輻射至50kGy的人骨的保護作用。
材料1.5mm×5mm×30mm骨密質桿(得自Comprehensive TissueCentre via RadTag Technologies的人股骨)。
2.穩定劑混合物a.CK2-f150mM甘露醇(Sigma M-8429，lot 106H00842)100mM海藻糖(Sigma T＝9531，lot 61K7026)2.2M丁二醇(Aldrich #B8，490-4，lot K023119BO)3.1M DMSO(JT Baker #9224-01)b.CK1-fd100mM香豆酸(Sigma C-4400，lot 51K3660)，0.5M在乙醇中的貯備液100mM硫辛酸(Calbiochem#437692，lot B34484)，0.5M在乙醇中的貯備液100mM五倍子酸丙酯(Sigma P-3130，lot 60K0877)，0.5M在乙醇中的貯備液200μM TroloxC(Aldrich 23，881-3，lot 02507TS)2mM在PBS中的貯備液3.聚丙二醇P400(Fluka #81350，lot 386716)4.30mL血清瓶(Wheaton)5.堵塞器(Stelmi#C1404 6720GC 6TP，lot G005/3768)操作
1.在搖動下將10個骨密質桿在50mL聚丙二醇(PPG)P400中于37℃浸泡2小時。
2.將骨密質桿從PPG中取出，用Kimwipe輕輕吸干以除去過量PPG，然后在攪拌下于4℃在50mL CK1-fd中浸泡過夜(～16小時)。
3.將12個骨桿置于50mL CK2-f中，在攪拌下于4℃浸泡過夜(～16小時)。將另外10個骨桿置于去離子水中，如關于其它骨桿所述浸泡過夜。
4.在第二天的早晨，將骨桿取出，置于30mL用于輻射的小瓶中。
5.將小瓶在-80℃保持直至進行輻射。
6.將樣本在干冰上以約4.7kGy/小時的速度輻射至總劑量為約50kGy。
7.使用三點彎曲試驗評價骨的機械強度。
結果彎曲試驗分析表明，與未用穩定劑混合物處理的輻射的樣本(相應對照的73％)相比，用CK2-f和CK1-fd處理的輻射的樣本表現出改善的結果(分別是相應對照的86％和85％)。
實施例13目的測定不同的穩定劑混合物對輻射至50kGy的骨的保護作用。
材料1.3mm×3mm×25mm骨密質桿(得自Comprehensive TissueCentre via RadTag Technologies的人股骨)。
2.穩定劑混合物a.CK2-f150mM甘露醇(Sigma M-8429，lot 106H00842)100mM海藻糖(Sigma T＝9531，lot 61K7026)2.2M丁二醇(Aldrich #B8，490-4，lot K023119BO)3.1M DMSO(JT Baker #9224-01)b.10-DM
10％DMSO，USP(Spectrum#D1258，lot RP0915)150mM甘露醇，USP(Spectrum#MA165，lot RM0418)3.聚丙二醇P400(Fluka #81350，lot 386716)4.30mL血清瓶(Wheaton)5.堵塞器(Stelmi#C1404 6720GC 6TP，lot G005/3768)操作1.每個處理使用12個骨密質桿-6個用于輻射的樣本，6個用于未輻射的樣本。
2.將骨質放在5mL錐形瓶中，用一種下列液體處理a.3mL水；b.3mL CK2-f；或c.3ml 10-DM。
3.將樣本在4℃超聲處理約20分鐘。
4.超聲處理后，在攪拌下將骨在室溫浸泡約2小時40分鐘。
5.浸泡后，將骨從液體中取出，置于用于輻射的小瓶中，在約-80℃貯藏。
6.將樣本在干冰上以約2.6kGy/小時的速度輻射至總劑量為約55kGy-60kGy。
7.使用三點彎曲試驗評價骨的機械強度。
結果彎曲試驗分析表明，用CK2-f處理的輻射的樣本表現出的強度是相應對照強度的82％，用10-DM處理的輻射的樣本表現出的強度是相應對照強度的73％。
實施例14目的測定穩定劑混合物對輻射至50kGy的豬ACL樣本的保護作用。
材料1.豬ACLRadTag Technologies，Inc.
2.穩定劑混合物
3.1M DMSO；2.2M 2，3-丁二醇150mM甘露醇；和100mM海藻糖。
操作1.將豬ACL(10個)在-80℃貯藏，在37℃的水浴中融化約30分鐘；2.將每個ACL置于單獨的50mL錐形管中；3.在搖動下將樣本用50mL PBS洗滌4次，每次洗滌約5分鐘；4.在搖動下將樣本用水(各50mL)洗滌1次(5分鐘)；5.將每個韌帶切成約4-5個小片(直徑約3mm)；6.將樣本置于2mL小瓶(1個/瓶)中；7.向每個小瓶中加入1mL穩定劑混合物或水；8.將橡膠堵塞器和蓋子蓋住小瓶；9.將樣本在4℃搖動過夜；10.將樣本輻射至總劑量為約50kGy；11.通過SDS-PAGE分析樣本。
結果根據SDS-PAGE，與未處理的對照相比，用穩定劑混合物處理的樣本表現出改善的性質。
實施例15目的測定不同的穩定劑混合物對輻射至50kGy的牛脛骨的保護作用。
材料牛脛骨，得自屠宰場(Mt.Airy Meat Locker)，研磨至3mm×3mm×42mm的片段丁二醇(Aldrich B8，490-4，lot K023119B0)丙二醇(Sigma，P-4347，lot 111K1658)DMSO，USP(Spectrum，D1258，lot RE0754)甘露醇，USP(Spectrum，MA165，lot RE1020)
海藻糖(Sigma T-9531，lot 062K7302)五倍子酸(Sigma，G-7384，lot 111K0103)抗壞血酸鈉，USP(Spectrum S1349，lot RM0398)Branson 2710水浴超聲器30mL血清瓶(Kimble Glass 62121D-30)20mm堵塞器(Stelmi C1404 6720GC 6TP，lot G005/3758)穩定劑混合物F1(BDGT)2.2M丁二醇3.1M DMSO100mM五倍子酸50mM海藻糖F2(ABMT)200mM抗壞血酸鹽2.2M丁二醇150mM甘露醇50mM海藻糖F3(ABDM)200mM抗壞血酸鹽1.66M丁二醇0.33M DMSO125mM甘露醇F4(BGMT)2.2M丁二醇50mM五倍子酸150mM甘露醇50mM海藻糖F5(BDG)2.2M丁二醇
3.1M DMSO100mM五倍子酸F6(AMPT)200mM抗壞血酸鹽150mM甘露醇2.2M丙二醇50mM海藻糖操作1.將研磨的骨密質片置于大的燒杯中并混和。
2.隨機選擇10個骨片，置于50mL錐形瓶中。
3.將上述穩定劑混合物加至錐形瓶的40mL標志。
4.將錐形瓶放置在浮床上，然后置于水浴超聲器中。
將水浴中的水預先冷卻至4℃在4個小時期間內，每隔約15分鐘用冰冷卻的水替換水浴中的水。
5.超聲處理后，將錐形瓶置于固定架上，在4℃輕微攪拌24小時。
6.將骨片從錐形瓶中取出，除去過量穩定劑混合物，將樣本置于25mL用于輻射的血清瓶中。
7.將血清瓶堵塞，蓋上蓋子，在-80℃貯藏直至進行輻射。
8.將樣本在干冰上輻射至總劑量為約50kGy。
9.通過三點彎曲試驗測定骨的機械強度。
結果三點彎曲試驗分析給出了關于輻射的樣本的機械強度的下列結果(相對于未輻射的對照的平均值)BDGT75％ABMT66％ABDM60％BGMT68％BDG59％AMPT61％
無穩定劑56％實施例16目的測定不同的穩定劑混合物對在干冰溫度下輻射至50kGy的豬ACL膠原的保護作用。
材料豬ACL(在2002年6月25日收獲的)，得自RadTag Technologies鹽水
丙二醇(Sigma P-4347，lot 111K1658)二甲亞砜，USP(Spectrum，D1258，lot RE0754)甘露醇，USP(Spectrum，MA165，lot RE1020)海藻糖(Sigma T-9531，lot 062K7302)DMEM(Quality Biological 112-103-101，lot 710850)普羅布考(Sigma P-9672，lot 128H0695)Trolox(Aldrich 23，881-3，lot 02507TS)1M五倍子酸丙酯(Sigma，P-3130，lot 60K0877)貯備液，在200耐性乙醇(Aldrich E702-3，lot 012I3740)中制得的3mL血清瓶(Wheaton#223648)Stelmi堵塞器(#C1503 6720GC 6DT)操作1.將七個豬ACL融化，在PBS中洗滌5次。
2.將整個ACL在一種下列溶液中于40℃浸泡4小時，然后在4℃浸泡過夜(約15小時)a.鹽水；b.2.2M丙二醇、3.1M DMSO、150mM甘露醇和100mM海藻糖，用鹽水調節至所需體積；c.2.2M丙二醇、3.1M DMSO、150mM甘露醇、100mM海藻糖、1％solutol，用鹽水調節至所需體積；d.DMEM；e.DMEM、2.2 M丙二醇、150mM甘露醇；
f.DMEM、50μM普羅布考、2％DMSO；或g.DMEM、50mM trolox、100mM五倍子酸丙酯；3.將ACL從溶液中取出來。觀察到腱性質的改變，并且在下面記錄(在該部分中的字母與在上面2中用相同字母表示的溶液相對應)4.將ACL切成兩半，將末端修剪以與3mL小瓶相適合(一半用于0kGy對照，另一半用于50kGy)。將樣本在-80℃貯藏直至用于輻射包裝。
5.將樣本在干冰上輻射至總劑量為約50kGy。
結果與其它穩定劑混合物相比，用穩定劑混合物d、e和f處理的輻射的樣本表現出改善的結果。
實施例17目的測定不同的穩定劑混合物對輻射至50kGy的牛脛骨的保護作用。
材料牛脛骨，得自屠宰場(Mt.Airy Meat Locker)，洗滌并研磨至3mm×3mm×42mm的片段丁二醇(Aldrich B8，490-4，lot K023119B0)丙二醇(Sigma，P-4347，lot 111K1658)DMSO，USP(Spectrum，D1258，lot RE0754)甘露醇，USP(Spectrum，MA165，lot RE1020)海藻糖(Sigma T-9531，lot 062K7302)五倍子酸(Sigma，G-7384，lot 111K0103)抗壞血酸鈉，USP(Spectrum S1349，lot RM0398)Branson 2710水浴超聲器30mL血清瓶(Kimble Glass 62121D-30)20mm堵塞器(Stelmi C1404 672GC 6TP，lot G005/3758)在水中的檸檬酸鈉二水合物(Mallinkrodt #0754，lot 0754T51H28)穩定劑混合物
a.F1(BDGT)2.2M丁二醇3.1M DMSO100mM五倍子酸50mM海藻糖b.F4(BGMT)2.2M丁二醇50mM五倍子酸150mM甘露醇50mM海藻糖c.F4-prop(GMPT)50mM五倍子酸150mM甘露醇2.2M丙二醇50mM海藻糖d.F4+pH(BGMTc)2.2M丁二醇50mM五倍子酸150mM甘露醇50mM海藻糖200mM檸檬酸鈉e.CK2(BDMT)2.2M丁二醇3.1M DMSO150mM甘露醇100mM海藻糖操作1.將研磨的骨密質片置于大的燒杯中并混和。
2.隨機選擇6個骨片，置于50mL錐形瓶中以用一種上述穩定劑混合物處理。
3.將上述穩定劑混合物加至錐形瓶的40mL標志處。
4.將錐形瓶放置在浮床上，然后置于水浴超聲器中。
將水浴中的水預先冷卻至4℃在4個小時期間內，每隔約15分鐘用冰冷卻的水替換水浴中的水。
5.超聲處理后，將錐形瓶置于固定架上，在4℃輕微攪拌24小時。
6.將骨片從錐形瓶中取出，除去過量穩定劑混合物，將6個骨片置于25mL用于輻射的血清瓶中。
7.將血清瓶堵塞，蓋上蓋子，在-80℃貯藏直至進行輻射。
8.將樣本在干冰上輻射至總劑量為約50kGy。
9.通過三點彎曲試驗測定骨的機械強度。
結果三點彎曲試驗分析給出了關于輻射的樣本的機械強度的下列結果(相對于未輻射的對照的平均值)無穩定劑62％CK278％F177％F467％F4+pH71％F4-prop62％實施例18目的測定不同的穩定劑混合物對輻射至50kGy的牛脛骨的保護作用。
材料牛脛骨，得自屠宰場(Mt.Airy Meat Locker)，洗滌并研磨至3mm×3mm×42mm的片段DMSO(Spectrum，D1258，lot RE0754)海藻糖(Sigma T-9531，lot 062K7302)；0.5M在水中的貯備液五倍子酸(Sigma，G-7384，lot 111K0103)
丁二醇(Aldrich B8，490-4，lot K023119B0)丙二醇(Sigma，P-4347，lot 111K1658)檸檬酸鈉二水合物(Mallinkrodt 0754，lot 0754T51H28)；2M在水中的貯備液具有Maestro軟件的VirTis Genesis 25EL冷凍干燥器o 08.16.02-08.19.02 freeze dry 1-Teri Bone cycle穩定劑混合物a.BDGT2.2M丁二醇3.1M DMSO100mM五倍子酸50mM海藻糖b.BDGT+C2.2M丁二醇3.1M DMSO100mM五倍子酸50mM海藻糖200mM檸檬酸鹽c.PDGT2.2M丙二醇3.1M DMSO100mM五倍子酸50mM海藻糖d.PDGT+C2.2M丙二醇3.1M DMSO100mM五倍子酸50mM海藻糖200mM檸檬酸鹽在加入組織之前將五倍子酸輕微加熱。
操作1.隨機選擇6個骨片，置于50mL錐形瓶中。稱重骨片，然后將穩定劑混合物或水加至40mL標志，記錄重量。如下所述在每個條件下使用2個樣本(1組是用于冷凍，另一組是用于冷凍干燥)
2.將含有骨的50mL錐形瓶放置在超聲器中，在4個小時的超聲總時間內，每隔約15分鐘用冰冷卻的水替換水浴中的水。
3.超聲處理后，將樣本在Styrofoam盒子中于4℃放置24小時。然后將樣本置于30mL用于輻射的血清瓶中，并在-80℃冷凍，或者置于玻璃板上，并放到冷凍干燥器中。
4.冷凍干燥后，將骨置于30mL血清瓶中，蓋上蓋子，在-80℃貯藏。
5.將樣本輻射至總劑量為約50kGy。
6.通過三點彎曲試驗分析樣本。
結果對于輻射至50kGy的冷凍干燥的樣本，與未用穩定劑混合物處理的樣本相比，用BDGT和BGDT+C處理的樣本的機械強度平均增加了約1.6倍。加入檸檬酸鹽沒有影響機械強度。
雖然已充分描述了本發明，但是本領域技術人員應當理解，可在不背離本發明范圍或其任何實施方案的情況下，用寬且等同的條件、制劑以及其它參數范圍來實施本發明方法。
在本文中引用的所有專利和出版物都全文引入本文以供參考。任何出版物的引用是由于其在本申請提交日期之前公開，而不應當解釋為承認這樣的出版物是現有技術，或者本發明沒有權力依靠在先的發明讓這樣的出版比實際日期早。
上述實施方案和優點僅是舉例說明，而不是對本發明的限制。本發明的教導易于應用其它類型的裝置。本發明的描述是說明性的，不限制權利要求的范圍。許多替代方案、改變和變型對于本領域技術人員來說是顯而易見的。
權利要求
1.用于將含有非水性溶劑并且對輻射敏感的生物材料滅菌的方法，所述方法包括用射線以能將所述生物材料有效滅菌和保護所述生物材料免受所述輻射損害的輻射率將所述生物材料輻射能將所述生物材料有效滅菌的時間。
2.用于將含有非水性溶劑并且對輻射敏感的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)將至少一種穩定劑以有效保護所述生物材料免受所述輻射損害的量加到所述生物材料中；和(ii)用合適的射線以有效輻射率將所述生物材料輻射能將所述生物材料有效滅菌的時間。
3.用于將含有非水性溶劑并且對輻射敏感的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)將所述生物材料的殘余溶劑含量降低到有效保護所述生物材料免受所述輻射損害的水平；和(ii)用合適的射線以有效輻射率將所述生物材料輻射能將所述生物材料有效滅菌的時間。
4.用于將含有非水性溶劑并且對輻射敏感的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)將所述生物材料的溫度降低到有效保護所述生物材料免受所述輻射損害的水平；和(ii)用合適的射線以有效輻射率將所述生物材料輻射能將所述生物材料有效滅菌的時間。
5.用于將含有非水性溶劑并且對輻射敏感的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)給所述生物材料施加至少一種選自下列的穩定化處理(a)降低所述生物材料的殘余溶劑含量，(b)降低所述生物材料的溫度；和(c)將至少一種穩定劑加到所述生物材料中；和(ii)用合適的射線以有效輻射率將所述生物材料輻射能將所述生物材料有效滅菌的時間，其中所述至少一種穩定化處理和輻射率一起有效地保護所述生物材料免受所述輻射損害。
6.用于將含有非水性溶劑并且對輻射敏感的生物材料滅菌的方法，所述方法包括(i)給所述生物材料施加至少兩種選自下列的穩定化處理(a)降低所述生物材料的殘余溶劑含量，(b)降低所述生物材料的溫度；和(c)將至少一種穩定劑加到所述生物材料中；和(ii)用合適的射線以有效輻射率將所述生物材料輻射能將所述生物材料有效滅菌的時間，其中所述至少兩種穩定化處理一起有效地保護所述生物材料免受所述輻射損害，并且其中所述至少兩種穩定化處理可以以任何次序進行。
7.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述非水性溶劑是有機溶劑。
8.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述有效輻射率不超過約3.0kGy/小時。
9.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述有效輻射率不超過約2.0kGy/小時。
10.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述有效輻射率不超過約1.0kGy/小時。
11.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述有效輻射率不超過約0.3kGy/小時。
12.權利要求2、3、4、5或6的方法，其中所述有效輻射率超過約3.0kGy/小時。
13.權利要求2、3、4、5或6的方法，其中所述有效輻射率是至少約6.0kGy/小時。
14.權利要求2、3、4、5或6的方法，其中所述有效輻射率是至少約18.0kGy/小時。
15.權利要求2、3、4、5或6的方法，其中所述有效輻射率是至少約30.0kGy/小時。
16.權利要求2、3、4、5或6的方法，其中所述有效輻射率是至少約45kGy/小時。
17.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述含有非水性溶劑的生物材料保持在低氧氣氛中。
18.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述含有非水性溶劑的生物材料保持在含有至少一種稀有氣體或氮氣的氣氛中。
19.權利要求18的方法，其中所述稀有氣體是氬。
20.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述含有非水性溶劑的生物材料保持在真空中。
21.權利要求3、5或6的方法，其中用選自下列的方法將所述殘余溶劑含量降低凍干、干燥、濃縮、加入溶質、蒸發、化學萃取、噴霧干燥和玻璃化。
22.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約15％。
23.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約10％。
24.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約3％。
25.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約2％。
26.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約1％。
27.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約0.5％。
28.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量小于約0.08％。
29.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中在輻射所述生物材料的所述步驟之前，把至少一種穩定劑加到所述含有非水性溶劑的生物材料中。
30.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述含有非水性溶劑的生物材料含有至少一種選自下列的生物污染物或病原體病毒、細菌、酵母、霉菌、真菌、寄生蟲和朊病毒或單獨或聯合引起TSEs的類似物。
31.權利要求2、5或6的方法，其中所述至少一種穩定劑是抗氧化劑。
32.權利要求2、5或6的方法，其中所述至少一種穩定劑是自由基清除劑。
33.權利要求2、5或6的方法，其中所述至少一種穩定劑是聯合穩定劑。
34.權利要求2、5或6的方法，其中所述至少一種穩定劑是配體。
35.權利要求37的方法，其中所述配體是肝素。
36.權利要求2、5或6的方法，其中所述至少一種穩定劑減輕歸因于反應性氧物質的損害。
37.權利要求2、5或6的方法，其中所述至少一種穩定劑選自抗壞血酸或其鹽或酯；谷胱甘肽；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸；尿酸或其鹽或酯；蛋氨酸；組氨酸；N-乙酰半胱氨酸；α-硫辛酸；甲醛次硫酸鈉；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸正丙酯，香豆酸，和它們兩種或多種的混合物。
38.權利要求37的方法，其中所述兩種或多種穩定劑的混合物選自抗壞血酸、或其鹽或酯與尿酸、或其鹽或酯的混合物；抗壞血酸、或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸的混合物；抗壞血酸、或其鹽或酯、尿酸、或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸的混合物；尿酸、或其鹽或酯；α-硫辛酸；甲醛次硫酸鈉；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸正丙酯、香豆酸與6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸的混合物；和乙醇與丙酮的混合物。
39.權利要求2、5或6的方法，其中所述至少一種穩定劑是二肽類穩定劑。
40.權利要求39的方法，其中所述二肽類穩定劑選自甘氨酰基-甘氨酸(Gly-Gly)、肌肽和鵝肌肽。
41.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述輻射是粒子輻射或電磁輻射或它們的混合物。
42.權利要求41的方法，其中所述電磁輻射選自無線電波、微波、可見或不可見光、紫外線、X-射線輻射、γ輻射和它們的聯合。
43.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述輻射物是γ輻射。
44.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述輻射物是E-射束輻射。
45.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述輻射物是可見光。
46.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述輻射物是紫外線。
47.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述輻射物是X-射線輻射。
48.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述輻射物是多色可見光。
49.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述輻射物是紅外線。
50.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述輻射物是一種或多種波長的可見光與紫外線的聯合。
51.權利要求1、2、3、5或6的方法，其中所述輻射是在室溫進行的。
52.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述輻射是在低于室溫的溫度進行的。
53.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述輻射是在低于所述含有非水性溶劑的生物材料的冰點的溫度進行的。
54.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述輻射是在低于所述含有非水性溶劑的生物材料的低共熔點的溫度進行的。
55.權利要求1、2、3、5或6的方法，其中所述輻射是在高于室溫的溫度進行的。
56.組合物，其中包含至少一種含有非水性溶劑的生物材料和一定量的至少一種穩定劑，其中所述量的穩定劑能有效保護所述生物材料在用輻射滅菌后仍可實現其預期應用。
57.包含至少一種含有非水性溶劑的生物材料的組合物，其中所述生物材料的殘余溶劑含量處于能有效保護所述生物材料在用輻射滅菌后仍可實現其預期應用的水平上。
58.權利要求57的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約15％。
59.權利要求57的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約10％。
60.權利要求57的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約5％。
61.權利要求57的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約2％。
62.權利要求57的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約1％。
63.權利要求57的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約0.5％。
64.權利要求57的組合物，其中所述殘余溶劑含量低于約0.08％。
65.權利要求56或57的組合物，其中所述含有非水性溶劑的生物材料是玻璃狀或玻璃化的。
66.權利要求56或57的組合物，其中所述含有非水性溶劑的生物材料的蛋白總濃度為至少約0.5％。
67.權利要求56或57的組合物，其中所述含有非水性溶劑的生物材料的蛋白總濃度為至少約1％。
68.權利要求56或57的組合物，其中所述含有非水性溶劑的生物材料的蛋白總濃度為至少約5％。
69.權利要求56或57的組合物，其中所述含有非水性溶劑的生物材料的蛋白總濃度為至少約10％。
70.權利要求56或57的組合物，其中所述含有非水性溶劑的生物材料的蛋白總濃度為至少約15％。
71.權利要求56或57的組合物，其中所述含有非水性溶劑的生物材料的蛋白總濃度為至少約20％。
72.權利要求56或57的組合物，其中所述含有非水性溶劑的生物材料的蛋白總濃度為至少約25％。
73.權利要求56或57的組合物，其中所述含有非水性溶劑的生物材料的蛋白總濃度為至少約50％。
74.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述非水性溶劑選自甘油、DMSO、乙醇、丙酮和PPG。
75.權利要求74的方法，其中所述PPG是PPG 400、PPG 1200或PPG 2000。
76.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量為約0％。
77.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量為約1％。
78.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量為約2.4％。
79.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量為約4.8％。
80.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量為約7％。
81.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量為約9％。
82.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量為約10％。
83.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量為約20％。
84.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量為約33％。
85.權利要求3、5或6的方法，其中所述殘余溶劑含量低于約33％。
86.權利要求56的組合物，其中所述至少一種穩定劑選自抗壞血酸或其鹽或酯；谷胱甘肽；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸；尿酸或其鹽或酯；蛋氨酸；組氨酸；N-乙酰半胱氨酸；α-硫辛酸；甲醛次硫酸鈉；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸正丙酯，香豆酸，和它們兩種或多種的混合物。
87.權利要求86的組合物，其中所述兩種或多種穩定劑的混合物選自抗壞血酸、或其鹽或酯與尿酸、或其鹽或酯的混合物；抗壞血酸、或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸的混合物；抗壞血酸、或其鹽或酯、尿酸、或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸的混合物；尿酸、或其鹽或酯；α-硫辛酸；甲醛次硫酸鈉；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸正丙酯、香豆酸與6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸的混合物；和乙醇與丙酮的混合物。
88.預防或治療哺乳動物中感染或疾病的方法，包括給有此需要的哺乳動物施用有效量的依據權利要求1-6任一項的方法制得的生物材料。
89.權利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述生物材料選自尿激酶、免疫球蛋白、凝血酶、胰蛋白酶、白蛋白、純化的蛋白因子和組織。
90.權利要求89的方法，其中所述組織選自心臟瓣膜和脫礦質的骨基質。
全文摘要
本發明涉及用于將生物材料滅菌，以降低其中一種或多種活性生物污染物或病原體的含量的方法，所述活性生物污染物或病原體是例如病毒、細菌(包括細胞間和細胞內細菌，例如支原體屬、尿原體屬、nanobacteria、衣原體屬、立克次氏體)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或單獨或聯合引起TSEs的類似物和/或單細胞或多細胞寄生物。這些方法涉及用輻射法將含有一種或多種非水性溶劑的生物材料滅菌。
文檔編號A61L2/10GK1585651SQ02820861
公開日2005年2月23日 申請日期2002年9月24日 優先權日2001年9月24日
發明者S·麥加, M·J·麥克菲, W·N·德羅漢, D·M·曼, W·H·伯格斯 申請人:克里蘭特公司