類脂化糖胺聚糖顆粒及其在診斷和治療用藥物和基因傳遞中的應用的制作方法

專利名稱：類脂化糖胺聚糖顆粒及其在診斷和治療用藥物和基因傳遞中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基于類脂化(lipidated)糖胺聚糖顆粒的藥物傳遞系統，所述顆粒中包封有隨后傳遞以供治療和診斷的藥物。
背景技術：
糖胺聚糖類或粘多糖類以及膠原是所有結締組織的主要構成成分。糖胺聚糖類(Gags)是多糖鏈與少量蛋白質的大復合物。這些化合物能與大量水結合，由此而產生能形成身體結締組織的凝膠狀基質。糖胺聚糖類是由重復的二糖單元(氨基糖-酸性糖重復單元)構成的長鏈。氨基糖典型地為葡糖胺或半乳糖胺。氨基糖也可硫酸化。酸性糖可以是D-葡糖醛酸或L-艾杜糖醛酸。在體內，糖胺聚糖類(除了透明質酸外)與蛋白質共價結合，形成蛋白聚糖單體。酸性糖與氨基糖的加成使多糖鏈展長。
最常見的糖胺聚糖是透明質酸、硫酸角質素、硫酸軟骨素、硫酸肝素和硫酸皮膚素(dermatin sulfate)。經化學修飾，可使糖胺聚糖較其最初提取形式含有更多的硫基團。另外，可部分或全合成糖胺聚糖，也可以是植物或動物來源。
透明質酸是糖胺聚糖家族中的天然成分，它尤其以高濃度存在于關節的軟骨和滑液中，以及玻璃體、血管壁中和臍帶和其他結締組織中。透明質酸可以是游離形式(例如在滑液中)；也可以是結合(attached)形式(例如作為胞外基質的組成)。這種多糖由與交替(alternating)β-1，3-葡萄糖苷(glucuronidic)和β-1，4-氨基葡糖苷(glucosaminidic)鍵結合的交替乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸殘基所組成。在水中，透明質酸溶解而形成高粘性流體。由天然來源分離的透明質酸的分子量一般在5×104-107道爾頓之間。透明質酸對胞外基質和各種腫瘤(包括乳房、腦、肺、皮膚和其他器官和組織腫瘤)具有高度的親和力。
藥物傳遞系統通過將藥物施用到體內而持久保持恒定的血藥濃度，或者或經全身或局部施用而在特定的靶器官持久保持最適的藥物濃度。
經化學修飾的透明質酸可用于控釋給藥。Balazs等在US4582865中披露了“透明質酸的交聯凝膠能降低低分子量物質的釋放，所述低分子量物質分散于凝膠中但未與凝膠大分子骨架共價結合”。
多種形式的藥物制劑可用作藥物傳遞系統，這包括利用聚合物薄膜或脂質體作為藥物載體。
藥物載體大體分二類微粒體系，例如細胞、微球、病毒包膜和脂質體；和非微粒體系(通常為可溶性系統)，由大分子例如蛋白質或合成聚合物構成。
通常，顯微-和亞顯微-微粒載體具有幾個明顯的優點。它們可用作持續釋藥或控釋型藥物貯庫(貯庫)，因此可改善藥物效力并能降低給藥頻率。通過為被包封藥物和生物環境提供保護，這些載體降低了藥物失活和降解的風險。從顆粒中釋放出的游離藥物的藥物動力學不同于直接施用的游離藥物，這些載體可用于降低毒性以及不想要的副作用。
盡管藥物包封生物聚合物有一定的優點，仍存在著一些相關的問題。例如，呈微米顆粒或納米顆粒結構的生物聚合物的靶向能力有限、在循環中的保留和穩定性有限、長期施用有潛在毒性以及不能外滲等。為了賦于微粒體系(例如脂質體、微球等)以靶向作用，曾采用許多措施使其與不同的識別物質(包括抗體、糖蛋白和凝集素)結合。盡管這些識別物與微粒體系的結合取得了一定的成功，但是這些經修飾的微粒體系的表現并不盡人意(尤其是在體內)。
當采用這種識別物質時，也會產生其他問題。例如，由于抗體可能是患者特異性的，這樣就增加了藥物療法的費用。另外，識別底物與載體之間的結合并非均是共價的。共價結合是必須的，因為非共價的結合可能使識別物質在施用部位與微粒體系解離(這是由于微粒體系與識別對應體(counterpart)對識別物質靶點的競爭所致)。當出現解離時，所施用的經修飾微粒體系會重新變成常規微粒體系，這樣就達不到施用改良微粒體系的目的。
發明概述本發明的一個目的是克服現有技術的缺陷。
本發明另一目的是制備包封了藥物的含糖胺聚糖顆粒。
本發明另一目的是傳遞包封在含糖胺聚糖基顆粒中的藥物。
本發明另一目的是提供采用類脂化糖胺聚糖顆粒為給藥載體的傳遞藥物的方法。
在一個優選的實施方案中，所述傳遞是口服施用顆粒劑型。在另一個優選的實施方案中，所述傳遞是經鼻內施用顆粒劑型，特別是用于治療需要通過血腦屏障(BBB)的腦部和相關器官(例如，腦膜和脊髓)。在這些方案中，也可經眼內給藥。在另一優選的實施方案中，所述傳遞是經靜脈內(iv)施用顆粒劑型，這對于施用長效靜脈內制劑特別有益。
本發明的另一目的是提供采用類脂化糖胺聚糖顆粒為基因傳遞材料進行基因傳遞的方法。
本發明提供新穎的多產品基因和藥物傳遞技術及其制備和應用方法。傳遞系統包括類脂化糖胺聚糖(亦稱gagomer)，它是由具有伯氨基的類脂與含羧酸的糖胺聚糖交聯而制得的生物粘附性生物聚合物。以可控方式制得的微米-或納米粒，其中大多數顆粒的直徑約為2-5微米(微粒)和約50-200納米(納米粒)。小的或大的藥物、生物活性物質或活性成分，例如抗生素、化療藥物、蛋白質和核酸，均可以較高包封率包封于這些顆粒中(即使較大大分子的包封率也一般大于50％)。例如，對于質粒DNA，納米粒可提供約66％的包封率，而微粒可提供約75％的包封率。
在本發明中，“藥物”是指能治療性地作用于身體或用于體內診斷的任何物質。示例性治療藥物包括治療癌癥的化療藥物、治療感染的抗生素和治療真菌感染的抗真菌劑。示例性診斷藥物包括放射性同位素例如99Tc、127I和67Gd，以及用于體內部位顯影的熒光分子。
本發明生物聚合物的制備和藥物包封是簡單且低成本的方法。這些新穎的載體可用作持續釋放藥物貯庫，其中抗生素和化療藥物的外流(efflux)半衰期為19-35小時。這些特性以及生物粘附性特性，提供了新穎的載藥能力，可用作供全身(包括口服、局部)和部位(包括鼻內)給藥的位點附著、位點存留、持續釋放的藥物貯庫。
另外，本發明類脂化糖胺聚糖是無毒的。當將被包封的化學治療藥物在細胞培養物模型中進行實驗時，系統在腫瘤治療方面表現出高活性，甚至能克服已知的耐藥問題。因此，類脂化糖胺聚糖可用作具有廣泛治療活性的顯微和亞微藥物傳遞系統，例如癌癥、感染性疾病、創傷愈合、酶療法、基因療法等。
令人驚奇的是，空白顆粒(僅含類脂化糖胺聚糖而不含藥物或其他治療劑型)也呈現出重要的腫瘤-抑制作用。因此，這種顆粒作為主要或輔助化療藥物，可用于癌癥療法特別是用于轉移癌。
附圖簡述附

圖1A和1B為同批顆粒的視野掃描電子顯微鏡圖片(兩種不同放大率)。附圖1A為5000×倍。附圖1B為3000×倍。
附圖2A-2C表示個體細胞與與3種不同劑型溫育的共聚焦顯微照片。附圖2A表示與游離溴乙啡錠(ethidium bromide，EtBr)溫育的細胞C6(鼠神經膠質瘤)系。附圖2B表示與混懸于游離EtBr溶液的“空白”(即僅包封緩沖劑)類脂化糖胺聚糖溫育的C6細胞。附圖2C表示與包封EtBr的gagomer溫育的C6細胞。
附圖3A表示用包封EtBr的類脂化糖胺聚糖處理的PANC-1細胞系(人胰腺癌)細胞。
附圖3B表示細胞用游離EtBr處理的PANC-1細胞系細胞。
附圖4A為似于附圖3B系統的共聚焦顯微照片，但放大率更大。
附圖4B為似于附圖3A系統的共聚焦顯微照片，但放大率更大。
附圖5表示游離透明質酸和基于透明質酸的gagomer的濁度研究結果(游離透明質酸和基于透明質酸的gagomer的濃度在600nm處的吸收度變化對大分子的濃度作圖)。
附圖6A和6B表示微米類脂化糖胺聚糖和納米類脂化糖胺聚糖的顯微鏡照片。附圖6A表示包封模型蛋白質(BSA-FITC)的微米類脂化糖胺聚糖的熒光顯微鏡照片，放大因子為2000。附圖6B表示包封質粒DNA的納米類脂化糖胺聚糖的光學顯微鏡照片，放大因子為2000。
附圖7為單向流出狀況下阿霉素從微米類脂化糖胺聚糖(圓形)和納米類脂化糖胺聚糖(正方形)中外流的曲線。獨立變量為時間。因變量(f)是時間＝t時釋放的藥物相對于t＝0時系統總藥物的百分率。符號表示實驗數據，和實線表示按多室(multipool)外流機制所作的理論期望值。
附圖8為C6細胞經不含藥物微米類脂化糖胺聚糖(即僅包封緩沖劑，即附圖2B定義的“空白”)、給定劑量的游離化學治療藥物、包封相等劑量的相同藥物的微米類脂化糖胺聚糖處理48小時后的存活示意圖。實驗藥物為絲裂霉素C(MMC)、阿霉素(DOX)和長春堿(VIN)，結果分成3個數據組(每種藥物為一組)。每條是3個獨立實驗的均值，每一實驗包括20個獨立的測量數據。誤差棒表示各自的標準偏差。
附圖9表示Zeta電勢(有效的表面電荷)對納米粒和微粒濃度作圖。Zeta電勢反映了混懸液中膠體大小顆粒之間的總相互作用力。
附圖10表示不含藥物傳遞系統(DDS)納米粒的毒性實驗結果(DDS劑量為1mg/ml和溫育時間為24小時)。每條是32-64個獨立測量的均值，和誤差棒表示標準偏差。
附圖11A和11B表示與游離藥物和不含藥物傳遞系統(DDS)相比，包封于DDS(納米顆粒)中MMC(附圖11A)和DOX(附圖11B)對C26的細胞毒性作用，其中細胞與處理介質接觸4小時。***表示p＜0.001，每一物種和劑量下載體與不含藥物劑型的比較。
附圖12表示血液中MMC濃度對劑型類型和注射時間作圖。每一符號為5只動物的均值，和誤差棒表示標準差均值(SEM)。曲線是非理論性的，旨在表明數據趨勢。
附圖13表示腫瘤體積隨時間的增加。點值為實驗數據，每個代表5只動物的均值；誤差棒為SEM，曲線為非理論性的，僅表明數據趨勢。箭頭及其上面的數字表示處理天數。符號邊的數字為腫瘤出現的天數。
附圖14表示第1輪中的動物存活。每種劑型給每一動物注射3次。鹽水和游離MMC組的數據來自10動物/組；DDS和MM/DDS的數據來自5只動物/組。
附圖15表示第2輪中的動物存活。每種劑型給每一動物注射4次。DDS的數據來自3只動物和MMC/DDS的數據來自5只動物。
附圖16為標記物MMC的腦部蓄積條形圖(鼻內(IN)施用游離MMC和包封于DDS納米粒中的MMC，數據來自第1輪，實驗動物為鼠)。
附圖17為標記物MMC的腦部蓄積條形圖(鼻內(IN)施用游離MMC和包封于DDS納米粒中的MMC，數據來自第2輪，實驗動物為小鼠)。
附圖18表示在C57BL/6小鼠(靜脈注射B16F10細胞)肺中發現的轉移灶數量，對照組是沒有注射腫瘤細胞的健康動物。每條是5只動物/組的均值，和誤差棒為標準偏差。
附圖19表示荷瘤鼠的肺部增重(由肺重量的原始數據計算，見實驗部分公式)。每條為5只動物/組的均值，和誤差棒為標準偏差。
附圖20表示附圖18和19數據(均值)的重繪圖。點值表示實驗數據，和實線為非理論性的，旨在表明數據趨勢。
附圖21表示被攝取到MCF7細胞中的類脂化糖胺聚糖包封的BSA-FITC(光學和熒光顯微鏡)。上面兩格表示蛋白質的攝取和非特異性結合。下面兩格表示進入胞液和細胞核的蛋白質。
發明詳述本發明涉及顯微和亞微傳遞系統的制備和應用，以及可用于組織工程學和組織支架的材料。本發明藥物傳遞系統是微粒載體形式(也被稱作gagomer)的新穎粘附性生物聚合物，所述載體由含有至少一種伯胺的類脂與糖胺聚糖制得，即類脂化糖胺聚糖。
如表1所示，與其他微粒載體相比，本發明顆粒是特別低成本的。
本申請中所用的術語透明質酸或HA，是指透明質酸以及任何透明質酸鹽類，包括例如透明質酸鈉、透明質酸鉀、透明質酸鎂和透明質酸鈣。類似地，術語糖胺聚糖包括任何糖胺聚糖/鹽類以及游離酸。
本發明類脂化糖胺聚糖是微米顆粒(MDDS)和納米微粒藥物傳遞系統(NDDS)，是可用于包封藥物的粘附性生物聚合物。與以游離形式施用的相同藥物相比，這些負載了藥物的載體改善了臨床效果。所述類脂化糖胺聚糖是由生物相容和生物可降解的天然材料制得的。
表1.本發明優點低成本生產方面

本發明類脂化糖胺聚糖還具有許多優于其他微粒載體的優點，包括體內過程方面，這可參見表2。
表2.本發明在體內過程方面的優點

本發明類脂化糖胺聚糖還提供優于其他微粒載體的生物和治療活性，其中的一些優點如表3所示。
表3.本發明在生物/治療活性方面的優點

可以合成兩種基本類型的類脂化糖胺聚糖低類脂-糖胺聚糖比例(1∶1，w/w)記為LLG，和高類脂-糖胺聚糖比例(5∶1-20∶1，w/w)記為HLG。通過變化制備中的特定步驟，可按需形成微米或納米粒。
本發明類脂化糖胺聚糖(類脂化糖胺聚糖)，可在治療有此需要動物病理學病癥的藥物療法中用作傳遞系統。在此所用的術語“動物”是指包括人和其他哺乳動物例如牛、犬、貓、鼠、小鼠，以及鳥類，爬行類動物和魚類。
在本發明中，適于經類脂化糖胺聚糖治療的病理學病癥包括但不限于癌癥，真菌或細菌感染(包括創傷例如燒傷的繼發感染)，寄生蟲或病毒引起的感染，朊病毒(prion)感染等。
本發明類脂化糖胺聚糖也可用于疫苗制劑和基因療法。含免疫原多肽為活性成分的疫苗制劑是本領域技術人員熟知的。同樣地，制備用于基因插入的載體也是本領域技術人員熟知的。
可在制劑的不同階段，對本發明方法制得的類脂化糖胺聚糖進行凍干或脫水。例如，可在以除去溶劑后和加入藥物之前，凍干類脂膜。也可在水合類脂化糖胺聚糖之前凍干類脂-藥物膜。可以在減壓下進行類脂或類脂化糖胺聚糖的脫水，以除去所有懸浮的溶劑。
另外或選擇性地，也可將水合的類脂化糖胺聚糖制劑置于在液氮中的周圍介質中進行脫水，并在脫水步驟之前進行冷凍。可在一種或更多保護劑(例如糖類)存在下，進行脫水(預先冷凍)。這種技術能提高制劑長期貯存性和穩定性。
再水化后，可加熱制劑。也可采用其他適宜方法對類脂化糖胺聚糖制劑進行脫水。類脂化糖胺聚糖也可不經預先冷凍而脫水。一旦類脂化糖胺聚糖脫水后，可在用前長期貯藏。適當的貯存溫度取決于類脂化糖胺聚糖的類脂劑型和包封材料的溫敏性。
當欲施用脫水的類脂化糖胺聚糖時，簡單地向類脂化糖胺聚糖中加入水溶液(例如蒸餾水或適當的緩沖液)，即可使其再水合。可在室溫或類脂化糖胺聚糖組合物及其內容物適宜的其他溫度下進行再水化。
優選地，按照以下方法，經具有至少一種伯氨基的類脂與含羧酸的糖胺聚糖共價結合制備本發明的gagomer，即類脂化糖胺聚糖(a)提供反應容器，其中類脂薄層鋪展于容器底部和壁上。將類脂溶于有機溶劑中，并于旋轉蒸發儀中低壓蒸發類脂至干燥即可。
(b)在酸性pH下與交聯劑預溫育，使糖胺聚糖活化。
(c)將活化的糖胺聚糖加至反應容器中。
(d)類脂和活化糖胺聚糖的反應混合物緩沖至堿性(pH 8.6)。
(e)在連續攪拌下，將緩沖后的反應混合物溫育一定時間(例如37℃過夜)，使類脂化糖胺聚糖形成。由于類脂化糖胺聚糖預期在體內使用，因此其應在約37℃時穩定。當溫度高于類脂化反應溫度時，類脂會隨溫度的升高而發生物理變化，通常約62℃。因此，優選在約30-40℃的溫度進行類脂化反應。
(f)將類脂化糖胺聚糖緩沖至中性pH，并加入其他離子和水溶性添加劑，以提高離子強度，使其相當于生物流體中離子或鹽類(例如NaCl、KCl、Ca2+和Mg2+)的生理水平。
(g)經連續離心(4℃，40分鐘，1.3×105g)分級顆粒3次操作后的小球(pellet)是富含微粒的級分，富含微粒的上層再離心3次操作即獲得富含納米粒的級分。
(h)凍干所得的類脂化糖胺聚糖。
為了將藥物或其他活性成分包封于類脂化糖胺聚糖中，將所需材料溶于無離子的純水中。然后，在含有待包封材料的水溶液中，對上述得到的凍干干粉狀類脂化糖胺聚糖進行重建。
通過在分光光度計中光散射，對相同濃度的可溶性透明質酸和由透明質酸、磷脂酰乙醇胺制備的類脂化糖胺聚糖進行濁度研究，以確定是否合成了微粒物質。該研究的代表性結果如附圖5所示。同預期一致，整個濃度范圍內的待試游離透明質酸均是是可溶性的，并且其溶液沒有散射光。相反，含類脂化糖胺聚糖的試樣是混濁的，并且光散射隨著類脂化糖胺聚糖濃度的提高而增加，表明生物聚合物為不溶性材料。
包封了大分子的類脂化糖胺聚糖試樣在光學和熒光顯微鏡均可見。如附圖6所示，表示微粒(由HLG和包封的模型蛋白質BSA-FITC制得，直徑2-5微米)在熒光顯微鏡下可見的典型視野(上格)。這些微粒的制備如上。在顯微鏡照片下觀察之前，應除去制劑中未被包封蛋白質(4℃，30分鐘和1.2×105g超速離心)。將含顆粒(包封有蛋白質)的小球再混懸于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。
如附圖6所示，表示納米粒(50-200nm直徑，由HLG和包封的質粒DNA制得)在光學顯微鏡下可見的典型視野(下格)。FITC-BSA納米粒的制備如上。
糖胺聚糖制得的顆粒具有廣泛的應用，例如相同的顆粒可單獨使用，或者與包封其中的任何類型材料一起使用。優選地，糖胺聚糖顆粒制備中不包封任何材料，然后凍干形成粉末。然后，將粉狀糖胺聚糖顆粒與待包封的粉末材料混合。備選地，粉狀糖胺聚糖顆粒可與包含待包封材料的水溶液重建。一旦混合物被重建，顆粒將包封混合在溶液中的待包封材料。這樣，采用這種技術可包封小分子(例如抗生素和化學治療藥物)和大分子(例如蛋白質)。顆粒可用于包封DNA，并且大的顆粒甚至可以包封全細胞和細胞系。因此，這種顆粒也可用作組織工程學支架。
由至少一種長型糖胺聚糖(即gag未裂成較小尺寸)反應制備本發明顆粒。所有糖胺聚糖(除透明質酸以外)，均是蛋白質部分天然地與多糖部分共價結合的形式。水解蛋白質-糖鍵的方法是本領域技術人員已知的，例如化學和酶促法。另外，也可采用一些市售產品(已經除去其蛋白質部分)。
糖胺聚糖聚合物與含有至少一種伯氨基的類脂反應，使糖胺聚糖的羧酸殘基與類脂中的伯胺交聯。一旦發生反應，熱力學穩定性會引起類脂間的相互作用，形成外層為糖胺聚糖和內層類脂的球狀產物。這些顆粒可隨后用于包封其他材料，包括藥物、DNA、細胞、蛋白質等。
在本發明的一個實施方案中，除去了糖胺聚糖中的蛋白質部分，僅僅是糖主鏈與類脂反應。
本領域已知，將透明質酸結合到脂質體外層，使脂質體具有靶向或使其更具生物粘附性。在本發明中，是將類脂分子(而非脂質體)與透明質酸共價結合。
在本發明的另一實施方案中，其他分子可先與糖胺聚糖結合，然后糖胺聚糖再與類脂反應。其中其他分子處于這些顆粒的外層。這些其他分子可以是例如抗體、葉酸鹽、卟啉或凝集素，并可用于靶向。
盡管本發明為了避免與免疫原性和毒性相關的問題而優選使用天然糖胺聚糖，但是也可以采用合成糖胺聚糖以及天然、合成或半合成分子，包括但不限于軟骨素、透明質酸、葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、硫酸角質素、硫酸角質蛋白、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素，和其片段、鹽類、及混合物。在此所用的術語“糖胺聚糖”進一步包括經化學改變(并非部分水解)但仍保持功能的糖胺聚糖。這些修飾包括但不限于酯化、硫酸化、多硫酸鹽化和甲基化。
糖胺聚糖的天然來源包括植物和動物來源，包括但不限于山毛櫸樹和動物軟骨形式，包括鯊魚軟骨、牛氣管、鯨隔膜、豬鼻，和軟體動物例如Perna canaliculus和海參。
業已發現，與游離藥物相比，包封于本發明糖胺聚糖顆粒中的藥物更有效(尤其是對那些業已耐藥的癌細胞)。很明顯，類脂化糖胺聚糖通過與癌細胞附著而成為藥物貯庫，該貯庫能更快地進入細胞(快于其排泄速度)。盡管大多數癌細胞已形成耐藥機制，但是這些包封的藥物對細胞仍具有毒性作用。
本發明類脂化糖胺聚糖幾乎可以包封任何未經修飾的分子。與之形成對照的是，為了與DNA絡合，脂質體必須首先荷正電，然而許多其他材料卻不是荷正電的。本發明的一個優點在于所述類脂化糖胺聚糖實質上能包封任何類型的分子。
至于所用糖胺聚糖的大小，可采用其由生物來源提純時的尺寸，并且不易于被化學和/或生物降解。例如，對于透明質酸，其相應大小約1×105-1×107道爾頓。
本發明采用類脂化糖胺聚糖的藥物組合物可經任何常規途徑施用，包括非腸道，例如皮下、靜脈內、局部、肌內、腹膜內、經皮、直腸、陰道、鼻內、眼內。選擇性或同時地，可以口服途徑施用。
可采用濃注或隨著時間梯度灌注進行非腸道給藥。非腸道給藥通常是注射施用，最典型地是經皮下、肌內或靜脈內。
局部劑型由類脂化糖胺聚糖、透皮促進劑，和其他生物活性藥物或藥劑所構成，可以多種方式施用。例如，可用適宜給藥裝置將溶液滴至適當的皮膚或患病皮膚或粘膜區域，并用手擦涂或任其在空氣中干燥。可將適宜膠凝劑加至溶液中，將制劑施于適當區域并擦涂。為了施用到傷口或燒傷上，可將類脂化糖胺聚糖摻入例如油、乳劑等劑型中。這種制劑可以以洗劑、膏劑、糊劑、軟膏等形式直接施于患部表面。
備選地，也可將局部溶液劑型填入噴霧器裝置中，并經噴霧器施用。這種類型的藥物傳遞裝置尤其適于向大的患皮膚病的皮膚區域、高度敏感性皮膚或鼻腔或口給藥。任選地，以軟膏或經皮貼劑形式施用類脂化糖胺聚糖。
口服途徑施用包括經頰和舌下途徑施用。
也可經適于粘膜吸收的其他途徑施用本發明類脂化糖胺聚糖。例如，優選經陰道(特別是治療陰道疾病時)、直腸和鼻內途徑施用。另外，類脂化糖胺聚糖尤其適于經粘膜組織或上皮施用。當鼻內施用時，可典型地以氣霧劑或滴劑形式施用類脂化糖胺聚糖。這在治療肺部疾病方面特別有益。適宜劑型可參見Remington’Pharmaceutical Sciences，第16和18版，MackPublishing公司，Easton，Pa.(1980和1990)，和Introduction to PharmaceuticalDosage Forms，第4版，Lea&Febiger公司，Philadelphia(1985)，其公開內容在此引入作為參考。
根據施用方式的不同，所用組合物可呈固體、半固體或液體劑型形式，例如片劑、栓劑、丸劑、膠囊劑、散劑、液體、混懸液等。優選采用適宜以精確劑量單獨施用的單位劑型。藥物組合物包括類脂化糖胺聚糖和可藥用賦形劑，和任選地包括其他藥劑、藥物、載體、輔劑等。藥用載體優選是對所述活性化合物呈化學惰性的物質，并且在施用中沒有有害的副作用或毒性。可以部分地根據特定活性成分以及施用組合物的具體方法，來確定所需載體。因此，廣泛的劑型均適宜本發明藥物組合物。
具體地說，適宜賦形劑包括填充劑例如糖類(例如乳糖或蔗糖、甘露醇或山梨醇、纖維素制劑和/或磷酸鈣(例如磷酸三鈣或磷酸氫鈣)，以及粘合劑例如淀粉糊(例如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、土豆淀粉)、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、和/或聚乙烯吡咯烷酮。
供非腸道施用的注射用劑型可為液體溶液或混懸液、適于注射前用液體配制成溶液或混懸液的固體制劑、或乳劑。適宜賦形劑例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等。另外，如有需要，藥物組合物中也可含有少量非毒性的輔劑，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑等，例如醋酸鈉、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
水性注射用混懸液也可含有能增加混懸液粘度的物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。任選地，混懸液中也可含有穩定劑。
非腸道劑型可以是單位劑量或多劑量的密封容器形式，例如安瓿和小玻璃瓶，并可在冷凍干燥(凍干)狀況下貯存，用前僅需加入無菌液體載體(例如水)而配成注射劑。可采用前述的各種無菌散劑、顆粒劑和片劑，配制臨時調配型注射溶液和混懸液。
可向口服施用的藥用非毒性組合物中摻入任何常規賦形劑，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、交聯纖維素鈉、葡萄糖、明膠、蔗糖、碳酸鎂等。這種組合物包括溶液劑、混懸液、片劑、分散片、丸劑、膠囊劑、散劑、緩釋劑型等。適宜口服施用制劑包括液體溶液(例如有效量化合物溶于稀釋劑例如水、鹽水或橙汁中)；囊劑、錠劑和含片，其中含有預定量的固體或顆粒狀活性成分；散劑；適當液體中的混懸液；和適宜乳劑。液體劑型包括稀釋劑(例如，水和醇，例如乙醇、苯甲醇、和聚乙烯醇)，也可以加入藥用表面活性劑、助懸劑或乳化劑。
當組合物為丸劑或片劑時，可含有活性成分、稀釋劑(例如乳糖、蔗糖、磷酸二鈣等)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂等)和粘合劑(例如淀粉、樹膠、阿拉伯膠、明膠、聚乙烯吡咯烷、纖維素及其衍生物等)。
片劑可包括一種或更多乳糖、蔗糖甘露醇、玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸、微晶纖維素、阿拉伯膠、明膠、瓜爾膠、膠體二氧化硅、交聯纖維素鈉、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酸、其他防腐劑、矯味劑、藥用崩解劑、濕潤劑、防腐劑、矯味劑和藥物相容性載體。
膠囊劑可以是常規的硬或軟殼的明膠類型，其中含有例如表面活性劑、潤滑劑和惰性填充劑(例如乳糖、蔗糖、磷酸鈣和玉米淀粉)。
錠劑包括負載于載體(一般為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠)中的活性成分，以及錠劑包括負載于惰性基質(例如明膠或甘油或蔗糖和阿拉伯膠)中的活性成分。
在確定類脂化糖胺聚糖顆粒的施用劑量，應根據特定活性成分的藥理學特性確定施用劑量和頻率。一般至少采用3種劑量水平。通常，在毒性研究中，最高劑量應達到毒性水平但是對組中的大多數動物是亞致死量的。如有可能，最低劑量應產生可生物學證明的效力。應對選定的每種化合物平行進行這些研究。
另外，活性成分的ED50(50％待試群體有效的劑量)水平應是上述劑量水平的一種，和其他兩種選定劑量水平為毒性水平。最低劑量是指未出現可生物學證明效力的劑量。應采用根據所得結果計算出的適當的新劑量，重復毒理學試驗。
首選物種為種系明確的年輕、健康小鼠或大鼠，并通常最先對優選施用途徑進行研究。試驗中的對照組給予安慰劑或不經處理。通常，應對另一種非嚙鼠動物(例如兔子或犬)，重復進行上面概述的常規毒性試驗。也可采用交替的施用途徑重復實驗。
應在出現急性毒性跡象和確定的死亡方式下，進行單劑量毒性實驗。根據上述毒性實驗結果計算出施用劑量。也可無需對所有最初選定的化合物進行連續研究。
可采用重量或體積/kg體重的單位形式，表示單劑量毒性數據(例如LD50，即50％實驗動物死亡的劑量)，并且通常應來自不同施用方式的至少兩種物種的實驗。至于嚙鼠動物的LD50值，應測定其他物種(即犬和兔子)的最高耐受劑量和/或最低致死劑量。
當如上確定了適宜和大概的安全劑量水平后，也應對藥物的長期毒性、對生殖的作用和潛在的致突變性進行研究，以確保計算出的大致劑量范圍是安全的。
然后，對藥動學參數(例如活性成分和代謝物的吸收、分布、生物轉化和排泄)進行藥理學動物研究。然后，根據所得結果，設計對人的藥理學研究。
應采用健康受試者、期望的臨床施用途徑(可在患者身上重復的)，就化合物對人的藥效學和藥動學進行研究。當采用不同的劑量、或者幾種類型的絡合物或絡合物與游離化合物聯用時，應研究劑量反應關系，以闡明量效關系(劑量一血漿濃度一效力)、治療范圍和最適劑量間隔。也應對時效關系(尤其是其他重要器官系統)進行研究，例如研究效力的時程和研究不同器官，以闡明藥物之所需或不需要的藥理作用。
接著，本發明化合物準備進行臨床試驗，與已知療法進行比較。期間應更為細致地研究治療效力和副作用的量效關系。
應根據經驗確定本發明化合物對任一選定患者的施用量，并應根據患者狀況而變化。首先施用相對少量的活性成分，如果未觀察到不良反應則平穩地提高劑量，不應超過常規動物毒性實驗測定的最大安全毒性劑量。
本發明組合物包括所有組合物，其中活性成分的有效量足以達到其預期目的。本領域技術人員可根據個體差異，確定每種化合物有效量的最佳范圍。施用劑量取決于個體接受者的年齡、健康和體重狀況，以及共存治療的性質和所需效力。典型的劑量包括0.01-100mg/kg體重。優選劑量包括0.1-100mg/kg體重。最優選劑量包括1-50mg/kg體重。
類脂化糖胺聚糖可配制成包封有藥物或基因療法的治療組合物，或者也可以是空白，用于治療癌癥特別是轉移癌。
實施例1微米-類脂化糖胺聚糖的結構研究通過掃描電子顯微鏡(SEM)獲得的結構數據見附圖1A和1B。附圖1的兩部分是兩種不同的放大率的同一批產品的視野(參見每一附圖底部的裝置標注的信息)。以下結果證明了3種特征(1)這些數據證明了這些聚合物的微粒性質；(2)這些數據也證實了粒徑范圍(參見附圖1A中的1μM條)；和(3)一些細節提供了顆粒的形狀。
可觀察到顆粒的粒徑是不均勻的(如附圖1A，附圖1B更明顯)。這是可以預料的，因為顯微鏡觀察是在分級成納米-和微粒之前進行的。可根據微粒選擇SEM中顯微鏡的放大率范圍。
實施例2化學鍵合由于類脂的氨基基團與透明質酸的羧酸殘基交聯，使游離透明質酸貢獻給類脂化糖胺聚糖的游離羧酸的數量下降。與類脂的結合越多，游離羧酸基團數量的降低就越多。另外，由游離羧酸的降低程度，可以測量出類脂相對于透明質酸的化學計量。可采用羧酸分析法測定預期的下降程度。也可以估算出，微粒中約有33％的葡糖醛酸殘基被類脂分子俘獲，而在納米粒僅有約20％的葡糖醛酸殘基被類脂分子俘獲。
實施例3EtBr類脂化糖胺聚糖劑型的物理化學和特性測定了藥物或其他生物活性物質在類脂化糖胺聚糖中的包封率，以及小分子量藥物外流的藥動學。采用ELISA板式讀數器，在適當波長處測定每一選定被包封實體的吸光度。
微粒和納米粒的典型包封率結果分別如表4和5所示。
表4.微米類脂化糖胺聚糖藥物包封率和藥物外流半衰期

表5.納米-類脂化糖胺聚糖藥物包封率和藥物外流半衰期

類脂化糖胺聚糖包封的EtBr的濃度為25μM。包封率為49.8(±3.1)(％)。
EtBr從類脂化糖胺聚糖中外流的半衰期為27.7小時。
實施例4體外毒性研究在細胞培養物中，對微米和納米尺寸的不含藥物類脂化糖胺聚糖(低類脂和高類脂的類脂化糖胺聚糖)進行毒實驗。試驗中采用兩種細胞系(鼠神經膠質瘤細胞系C6和鼠成纖維細胞系NIH3T3)。在所有情況下，在100倍于0.02-2mg/ml聚合物的濃度范圍內，未發現類脂化糖胺聚糖有毒性。
實施例5示例性的對耐藥(MDR)神經膠質瘤細胞系的治療活性由于其部位以及對化學治療藥物的反應較差，腦腫瘤(尤其是神經膠質瘤)是難于治療的(Wolff等，1999，Nutt等，2000.The poor drug response is duein part to lack of access and in part to inherent multidrug resistance(MDR)of thesetumors(Larsen，2000；Gottesman等，1995)。
在腦腫瘤中，即使在藥物已進入腫瘤(例如局部施用或通過外科操作放置局部貯庫)的情況下，多藥耐藥也是一種障礙。在這種普遍的耐藥機制(以獲得或固有性模式)中，藥物沒有失去其固有的毒性活性，耐藥細胞也不能使藥物代謝成非毒性實體。而且，跨細胞膜被動擴散進入細胞的藥物自動流出，使胞內水平降至低于其致死閾。表現出固有MDR的神經膠質瘤C6系用作實驗模型體系，研究類脂化糖胺聚糖包封的化學治療藥物的治療效力是否優于游離藥物的治療效力。
方法學細胞接種于96孔平皿中，并一般在接種后24小時，于半融合時開始實驗。細胞接受選定劑量的藥物(包封于類脂化糖胺聚糖劑型中，用前洗去過量的非被包封藥物)。對照系統接受相同劑量的游離藥物，和似于待試系統劑量的不含藥物類脂化糖胺聚糖。采用MTT分析法(Nutt等，2000；Larsen等2000)，于處理后48小時測定細胞存活。
結果3種化學治療藥物的結果如附圖8所示(3種數據組)。游離類脂化糖胺聚糖的數據(每一3種數據組中的最左條)是附加的證實數據，表明類脂化糖胺聚糖沒有毒性。根據特定藥物的不同，每種藥物在其各自的劑量范圍內發揮作用，相對高劑量的游離藥物允許20-60％的細胞存活。如每一種數據組中的中間條所示，這種結果對多藥耐藥細胞的固有模式而言是典型的。當用相同劑量的類脂化糖胺聚糖包封的藥物代替游離藥物時，產生了顯著差異(如每一種數據組的右最條所示)。對每一3種藥物而言，新劑型可使細胞死亡增加3-4-倍(與相應的游離藥物相比)。兩種發現的緊密結合提高了本發明新穎給藥劑型在治療中的響應游離類脂化糖胺聚糖的無毒性，和各自具有獨特細胞毒性機制的3種不同藥物所致的細胞死亡增加。
為了克服多藥耐藥，必須發現能使化學治療藥物的胞內劑量高于致死閾的機制。傳統方法是采用逆轉劑(即化學致敏劑)降低流出。雖然已確認了一些這類物質(其中最主要的是維拉帕米)，然而目前可獲得化學致敏劑均不能臨床應用。另外，治療中需要細致的協作，因為兩種活性實體(化學治療藥物和化學致敏劑)必須一起到達靶點才能有效。然而，這在臨床實踐中并非易事。
提高胞內藥物劑量的另一方法是在強度和持續時間方面增加內流。很顯然，通過增加內流，顯著地增加了本發明包封藥物的類脂化糖胺聚糖的藥物響應。類脂化糖胺聚糖的生物粘附特性使其成為能與與細胞膜結合的藥物貯庫。這增加了藥物跨細胞膜的電化學梯度(與游離藥物相比)，并增加了藥物進入的時間間隔。這樣，治療就僅需要一種實體，即含藥的類脂化糖胺聚糖組合物。通過采用顯著降低的藥物劑量進行連續處理，這些新劑型也會使非耐藥腫瘤的治療受益。
實施例6微米類脂化糖胺聚糖與細胞的相互作用已知細胞不可透過核酸敏感性熒光標記物EtBr(溴乙啡錠)。與DNA和RNA結合，可顯著增強標記物的熒光發射，用于測定某種載體是否使細胞透過EtBr，具體地說是否抵達細胞核。
為了探察這些新穎聚合物與細胞的相互作用，制備了包封EtBr的類脂化糖胺聚糖，測定了這些類脂化糖胺聚糖的物理化學特性，然后類脂化糖胺聚糖與細胞溫育。結果采用共聚焦顯微鏡掃描。
測試了兩種細胞系，即C6--鼠惡性神經膠質瘤細胞系，和PANC-1--人胰腺癌細胞系。對于每一種細胞系，將單層細胞與3種不同劑型溫育(1)游離EtBr，(2)混懸于游離EtBr溶液中的“空白”(僅包封緩沖劑)類脂化糖胺聚糖，和(3)包封EtBr的類脂化糖胺聚糖。
EtBr在所有3種劑型中的濃度相同(25μM)。類脂化糖胺聚糖在劑型(2)和(3)中的濃度相同(0.25mg/ml)。在共聚焦顯微照相前，每一種劑型與細胞溫育60分鐘(室溫)。結果如附圖2(細胞系C6)、附圖3和4(細胞系PANC-1)所示。
C6細胞系結果如附圖2A所示。左上部分表示細胞與游離EtBr溫育的結果。可將細胞內部有微量熒光，與含該游離標記物的溶液相似。附圖2A的右上部分是細胞與含游離EtBr的溶液溫育，其中溶液中混懸有空白類脂化糖胺聚糖。在此也可見與游離EtBr相似的微量熒光，這表明顆粒本身并不能促進游離(非被包封的)EtBr進入細胞。
與這兩種對照品形成對照的是，當EtBr被包封顆粒內部時，它可進入細胞和細胞核中。這可從附圖2A底部的高熒光強度清晰地看出，從其在細胞核內部(與DNA相互作用)以及在胞液(與RNA相互作用)中的定位也可清晰地看出。這些發現不限于特定細胞系，由PANC-1系獲得的結果也類似。
在附圖3中，描述了劑型(2)和(3)的結果。游離EtBr與類脂化糖胺聚糖包封的EtBr之間的較大差異如附圖4所示。附圖4A表示單細胞與游離EtBr溫育。僅有微量的標記物進入細胞并抵達細胞核。同樣地，進入胞液的EtBr也是微量的。與此形成對照的是，如附圖4B所示，當與類脂化糖胺聚糖包封的EtBr溫育時，大量標記物進入細胞，并在細胞核(DNA-結合)和胞液(RNA-結合)中發現標記物。
由于所有數據均來源于采用相同濃度的EtBr，很明顯所述差異是由聚合物的包封所引起的。載體促進其所負載核酸-敏感性標記物進入細胞并使游離胞內標記物與RNA相互作用以及進入細胞核并與DNA相互作用的主要機制有以下3種(1)吸附和擴散。負載標記物的顆粒于細胞膜附著，形成局部貯庫。標記物從顆粒中擴散出來，并且一些自由標記物跨細胞膜擴散進入細胞。
(2)融合。負載標記物的載體首先與細胞膜結合，然后與其融合，并在融合過程中將被包封材料釋放到胞液中。
(3)胞吞和釋放。負載標記物的載體經胞途徑進入細胞。胞吞進入的載體成功地將標記物釋放道胞液中。在所有3種機制中，一旦標記物在胞液呈自由態，胞內標記物部分會發現其進入細胞核的方式。
根據物化數據(表示被包封標記物的外流相當緩慢)，可以排除第一種機制。根據恒定的外流速率(以半衰期形式表示)，可以計算出在顯微照相之前的50分鐘溫育過程中，被包封標記物的外流最多為2％，相應地有0.5μM的EtBr變為自由的。即使所有這些EtBr跨細胞膜進入細胞，其結果與50倍高濃度的游離EtBr結果相比也是極微量的(25μM相對于0.5μM)(附圖2A)。與此形成對照的是，載體包封的標記物的結果表明，例如不能通過“吸附和擴散”機制進入的標記物表現出了相當高進入率。
不管被包封標記物對癌細胞的治療是否通過融合或胞吞機制進入細胞，很明顯載體可使不可透過的分子進入細胞和細胞核。這種能力暗示了類脂化糖胺聚糖在傳遞中的作用。
實施例7制劑研究顆粒特性顆粒粒徑采用ALV-NIBS粒徑儀，測量了低類脂-糖胺聚糖比例(LLG)和高類脂-糖胺聚糖比例(HLG)納米-和微粒的粒徑。結果見表6，提供了所有定量數據，與先前獲得的顯微鏡數據(EM，熒光)一致。兩種粒徑彼此不同，每種系統中相對低的散射表示各自方法的優良包封。數據也表明，通過控制類脂/HA比例，可使每種顆粒類型中的顆粒粒徑具有一定的靈活性。
表6.納米和微米Tau DDS系統的粒徑分布

Zeta電勢測定了微米和納米粒Zeta電勢隨顆粒濃度的變化。Zeta電勢或動電勢表示荷離子膠體顆粒周圍的離子跨擴散層的電勢，它對膠體穩定性有影響。典型的結果如附圖9所示，表明(a)如同根據顆粒化學組成和顆粒結構特征所推測的結果一致，Zeta電勢為負值；和(b)zeta電勢對濃度的依賴模式與荷負電顆粒視野中觀察到的模式一致。
包封率研究了兩種劑型；胰島素和α-干擾素各自包封于獨立的微粒制劑中。所得包封率如表7所示。很明顯，所有蛋白質的包封率較高，與其他大分子的結果(表4和5)一致。胰島素濃度為10mg/ml。在該范圍內，蛋白質為聚集成二聚體和六聚體，表明被包封實體大于6000da。該胰島素劑量水平下的包封率如此高，還未見其他微粒載體報道。
表7.治療性蛋白質在新DDS(微粒)中的包封率

實施例8體外研究細胞培養物中的毒性實驗如下進行DDS毒性實驗選定細胞系的細胞與遞增濃度的DDS(0.01-5mg/ml)溫育24或48小時。對照組細胞未與DDS接觸。對來源于人、大鼠和小鼠的8種不同細胞系進行了實驗。所有8種細胞系的共同特征在于均具有透明質酸受體。如附圖10所示，所有待試DDS濃度范圍(即0.01-5mg/ml)的結果似于1mg/ml劑量的DDS。附圖10的數據表明，所有劑量下的DDS與細胞系溫育后，DDS未表現出細胞毒性。
基因轉染如表4和5所示，DDS以令人意料的高親和力包封了質粒。對該劑型轉染所需質粒(導致表達編碼蛋白質)細胞的潛力，進行了體外實驗。
待試細胞系為PANC-1和C6(均含有透明質酸受體)。報道基因為綠色熒光蛋白質(GFP)編碼。DDS與兩種市售載體“基準”(Polyplex陽離子聚合物和lipofectamine-陽離子脂質體)進行了比較。市售載體的使用方案由制造商提供。
質粒包封于DDS(微粒)中，用前平衡24小時。所有3種載體中DNA濃度相同(1.5μg/孔)。細胞與選定載體-DNA制劑在DMEM中溫育5小時；對照組在DMEM中溫育5小時。5小時后，將加有血清的細胞生長介質加至所有孔中。
于起始點的12和24小時，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞。對觀測試樣的總細胞數量和熒光細胞數量進行計數。由這些數據計算出轉染率，定義為％熒光細胞/試樣總細胞。觀測試樣中的總細胞數量為200-400細胞。于實驗終點時(自起始點24小時)，測定細胞存活力。
所得結果見表8。基準的劑量為2mg/ml(制造商所提供方案中推薦)和DDS的劑量為0.2mg/ml(劑量降低10倍)。所有3種的DNA濃度相同。于12小時，用已建立的載體檢測基因制品GFP。盡管這一發現是所期望的，但仍令人鼓舞，因為試驗細胞系是那些具有特定治療價值的細胞系，而非轉染中所用的經典細胞系(例如COS 7)。采用DDS，蛋白質表達需要24小時。3種載體各自在所有細胞系中的轉染率表明，1/10基準劑量(0.2mg/ml相對于2mg/ml)的DDS載體的性能與基準相同。
表8.體外基因轉染

基因轉染載體的缺點之一是陽離子聚合物或陽離子類脂具有毒性。在每種細胞系中，已觀察到上述兩種已建立的載體的毒性，與未處理的對照組相比，活細胞在24小時時的水平低于50％。與此形成對照的是，DDS載體沒有毒性。細胞存活力保持與對照細胞相同的高水平。先前部分報道的毒性數據表明，即使DDS的劑量提高至已建立的載體的水平(2mg/ml)也沒有毒性。
數據明確支持新的DDS在基因療法中的潛在應用。這明顯是優于競爭性非病毒載體兩個優點(1)在兩種不同的細胞系中，10倍低的濃度即可達到與已建立的載體相同的蛋白質表達水平，表明相同載體濃度的DDS系統顯著優于其競爭者；和(2)在兩種不同的細胞系，DDS載體系統未表現出毒性，而其他兩種載體具有相當大的毒性。
治療MDR腫瘤在供評價包封藥物的靶向載體的細胞毒性(與相同劑量游離藥物相比)的細胞培養物研究設計中，實驗設計與其結果通常是與游離藥物有偏差。這是由于在體外是靜態的，而在體內是動態的。在體外實驗期間(一般為24小時或更長)，游離藥物與細胞連續接觸。以游離形式施用的藥物在腫瘤部位的體內持續時更短，這是由于其有限的施用間隔和天然清除進程。與游離藥物相比，藥物/載體制劑(即使靶向載體)的體外表現(溫育24小時或更長)沒有明顯差異。與此形成對照的是，與游離藥物相比，如果載體在體內與靶體附著并駐留而成為持續釋放貯庫，則向腫瘤部位供應的藥物非常高(劑量和持續時間)，由此增強了細胞毒性。
為了減少與游離藥物的體外偏差，細胞與下述治療劑型接觸4小時游離藥物、包封于DDS中的藥物和不含藥物的DDS(free DDS)。然后，用加有血清細胞生長介質(不含藥物或載體)替換處理介質，并于20小時后(自開始后24小時)測定活細胞數量。如果一些載體劑型與細胞附著，即使改變介質它也會駐留成為貯庫，并連續向細胞供給藥物，而一旦介質改變，給予游離藥物的細胞則不能再與任何藥物接觸。
細胞死亡增加(與未處理的對照組比較)隨治療劑型變化的典型結果如附圖11所示(細胞系C26)。這來源于鼠結腸癌的為固有多藥耐藥(MDR)系。附圖11A為藥物絲裂霉素C(MMC)的結果。如在先體外毒性研究一致(附圖2)，不含藥物的DDS(測試劑量為1mg/ml)沒有毒性。兩種劑量(30和50μg/ml)游離MMC幾乎沒有作用，其細胞死亡百分率低于15％。這種相當高劑量下的低響應是由這些細胞.之MDR特性的表現。與此形成對照的是，當用包封于DDS中的相同劑量的藥物處理時，80-100％細胞被殺死。載體介導的藥物與游離藥物之間的差異非常顯著(p＜0.001)。相似結果如附圖11B的另一藥物阿霉素(DOX)所示。游離藥物(每種藥物具有不同的劑量范圍)是無效的，而包封于載體中相同劑量的藥物非常有效，導致80-100％細胞殺死。兩種其他細胞系-C6和PANC-1獲得的結果相似。所有待試的3種細胞系均含有HA受體。
實施例9體內研究體內研究I腫瘤化學療法對8周齡雌性BALB/c小鼠進行了實驗。所用腫瘤模型為C-26細胞(來源于鼠結腸癌)，皮下注射到右后足墊中。化學治療藥物為游離或包封于LLG納米微粒DDS中的絲裂霉素C(MMC)。MMC劑量為2mg/kg體重，游離和DDS制劑和DDS劑量均為1mg/ml。
第1輪實驗設計對20只動物進行了實驗，分成4組，每組5小鼠，接受如下表9的特定處置。
表9.動物組

C-26細胞于細胞培養燒瓶中生長以提供腫瘤。于0天，收集細胞并洗滌幾次，計數并立即注射。注射劑量為8×105細胞30μl。
于5、12和19天進行處理。經尾靜脈注射施用。所有注射體積為0.1ml。
第2輪實驗設計實驗設計基本上同第1輪實驗，不同之處在于a.藥物劑量提高至5mg/ml；b.腫瘤接種量為8×105細胞30μl；c.實驗采用2組動物。一組接受不含藥物的DDS(free DDS)和另一組接受MMC/DDS，每組分別為3和5小鼠；d.于14、17、20和23天進行處理；
e.開始處理時腫瘤大小為75mm3。
第1輪測量的參數是循環中保留、腫瘤發生、腫瘤體積、存活。第2輪測量的參數是存活。
第1輪結果循環中保留網狀內皮系統(RES)的一項正常生理作用即是相當迅速地從循環中除去外源性微粒物質。除非經靜脈內(iv)施用的微粒載體的靶點在RES內，否則這種清除是所有經靜脈內施用的微粒載體所要面臨的主要問題，這降低了足量藥物以有效方式抵達其目的靶點的可能性。這種問題并不是腫瘤治療特異性的，任何需要靜脈內給藥的病理學病癥通常要遇到這一問題。
通過廣泛的研究，對阻滯這一清除進程從而使微粒物質長循環的手段總結如下顆粒應很小，并應具有親水性包衣(一般富含羥基殘基)。納米級的球形微粒載體(毫微球)--一般包被有聚合物例如泊洛沙姆(poloxomar)或poloxamine。小脂質體的表面通常負載聚乙二醇(PEG)，稱為例如“隱形(stealth)脂質體”、“PEG化脂質體”和“立體穩定化的脂質體”。
在著手進行本發明和研發本發明DDS的過程中，推測是由于顆粒表面的主要組分-透明質酸富含羥基殘基而提供了固有的循環中的長保留能力和靶向能力。同時具有的靶向和“隱形”特性使DDS明顯優于其他競爭性載體。
在注射一段時間后，取接受含藥物制劑的動物放血，并按照已建立的方案處理試樣。HPLC分析法測定MMC濃度。對游離MMC和包封于載體中的MMC(MMC/DDS)作了比較，其在循環中保留的典型結果如附圖12所示。數據表明，游離MMC從循環快速消失，而經載體施用中的MMC具有更長的循環時間。這一發現在另一實驗中得以重現，即經載體注射施用長達72小時后，仍在循環發現了藥物。游離藥物的快速消失表明，在接受MMC/DDS制劑動物的循環中發現的MMC是載體中的MMC。這些結果證實了上述假說，即這些DDS具有內在的“隱形”能力。當然，上述有關載體的積極蘊義不限于在此試驗的特定病理學。
第1輪結果腫瘤發生和腫瘤體積如附圖13所示，為所有4組的腫瘤體積增加結果和首次探測到腫瘤的平均天數。在單獨接受鹽水的所有動物中，于第7天檢測到腫瘤，腫瘤呈指數形式快速增加。在接受游離藥物的所有動物中，也于第7天檢測到腫瘤。與鹽水組相比，盡管接受了3種劑量化學治療藥物的腫瘤的體積增加也沒有明顯差異。這表示體外所見的細胞系MDR性質(附圖3)在體內也存在。令人驚奇的是，用不含藥物的DDS(free DDS)處理的效力強于鹽水以及游離藥物。其腫瘤出現的平均天數為第9天(相對于7天)，并且腫瘤生長速度明顯減慢。與相比鹽水和游離藥物組相比，腫瘤也顯著小。
不含藥物的DDS(free DDS)的體內性能完全不同于體外。透明質酸是胞外基質(ECM)的關鍵組分，并且已知具有HA受體腫瘤細胞能利用這一特性。通過其HA受體與ECM中的HA相互作用，腫瘤細胞會在腫瘤演進過程中將ECM作為一個平臺。阻斷受體可以延遲腫瘤演進。這可能是不含藥物的DDS(free DDS)發揮作用的主要機制，載體在此與HA受體結合并將其阻斷。其他不互斥的可能機制是不含藥物的DDS(free DDS)可作為抗血管生成因子或促發宿主防御機制。將對DDS本身的這一積極作用機制進一步研究，以理解這些現象，并獲知如何開發而取得更好的治療成果。無論其起源如何，這均是該DDS積極的附加優點，并且是無法由體外數據所預知的。
包封于載體中的藥物表現出最佳結果。由附圖13可見，最先約在第17天才檢測到腫瘤，這明顯遲于用不含藥物的DDS(free DDS)、游離藥物或鹽水處理組。在所有實驗組中，該組腫瘤的生長速度最慢且腫瘤最小。這可能是由于DDS之內在的靶向性所致，其抵達腫瘤的部分在此成為藥物貯庫，并且藥物的細胞毒性可能與載體作用(如同不含藥物的DDS(free DDS)表現的)相結合。與游離藥物不同，體外結果表明這種劑型能殺死MDR細胞，這在體內也得以重現和證實。
第1輪結果存活在整個90天內，監視動物的存活存活，直至最后一只動物死亡。結果如附圖14所示。
接受鹽水組的所有動物在第29-31天之間死亡，和接受游離藥物的動物在第31-33天之間死亡。與鹽水和游離藥物相比，接受不含藥物的DDS(free DDS)的動物的存活期要長2倍，在第59-66天之間死亡。
這種較長的存活期蘊涵著兩種臨床含義。首先，DDS在體內沒有出現體外觀察到的毒性。對于這種技術的所有應用而言，其體內跡象的重要性更為顯著。其次，不含藥物的載體本身即對荷瘤動物的腫瘤發展和大小同時具有有益的治療效力(附圖13)。
在接受DDS包封的藥物完全處理的動物組中，觀察到了最長的存活，即3倍于鹽水和游離藥物組的存活期。最后的動物于第94天死亡。這對于荷瘤小鼠(尤其是具有MDR)來說是格外長的存活期，同時表示該藥物傳遞技術優于其競爭者。
第2輪結果存活在實驗的91天，仍監視動物的存活存活，結果如附圖15所示。用不含藥物的DDS(free DDS)處理的3只荷瘤動物具有最長存活期(長至69天)。用MMC/DDS制劑處理的5只荷瘤動物在接種腫瘤91天后仍能較好地進食，所有動物均存活。
這些數據的趨勢與第1輪相似，表明對新的DDS的出人意料的反應具有重現性的。兩實驗間存在兩個主要差異。首先，在第2輪中，在腫瘤發生后開始治療的(參見上述實驗設計)，這使得其治療與第1輪相比更具挑戰性。其次，在第2輪中，動物接受了較高的累積藥量。共注射4次(而第1輪中為3次)，并且其劑量高出2.5倍(5mg/ml:2mg/ml)。
這些差異所致的積極趨勢表示新的DDS具有產生更佳響應的效力。對于已長至100-150mm3的腫瘤，新穎DDS技術是更具挑戰性、同時也更現實的治療方式。
實施例10體內研究II經鼻內傳遞至腦部治療神經變性疾病需要將藥物通過完整的BBB或繞過(bypass)BBB而傳遞至腦部。進行了兩項實驗(一項采用大鼠和另一項采用小鼠)，用來評價本發明新穎DDS將藥物傳遞至腦部的能力(經鼻內施用繞過BBB)。
第1輪包括大鼠實驗(健康著色(pigmented)鼠)。DDS是納米微粒形式的LLG，和標記物為MMC。待試系統為包封于新的DDS中的標記物。不含藥和含藥的DDS制劑的施用劑量為5mg/kg體重，300μl/動物。DDS劑量為1mg/ml。
實驗中采用4只動物(分成2對)。一對經鼻內(IN)接受游離標記物至右鼻孔中。另一對經鼻內接受標記物/DDS制劑至右鼻孔中。采用適宜的無針注射器，緩慢給藥(用時若干分鐘)。
給藥6小時后，處死動物并取出腦部。每個腦均浸于10ml的PBS中1小時，釋放出松散結合的標記物，然后對腦部均質處理。采用HPLC分析法，分析洗液和腦勻漿中的標記物。
所得結果如附圖16所示，其中以“％施用劑量”表示標記物蓄積。雖然每個治療組僅有2只動物，每組間的符合程度足以計算均值。每對的平均和標準偏差，分列于相關條(洗液和腦勻漿)的上部。
對腦勻漿的研究表明，當以游離形式施用時，標記物在腦部的蓄積非常少(與游離小分子處于同一數量級)。與此形成對照的是，當以DDS形式施用時，標記物在腦部有相當高的蓄積(接近10％施用劑量)。這是較高的數值(高于游離藥物80倍)，尤其是當相關藥物也能達到這一數值時。這些結果表示新穎DDS對那些需要藥物傳遞至腦部的病理學病癥有較高的應用潛力。
第2輪包括小鼠實驗(健康C57BL/6小鼠)。DDS是納米微粒形式的LLG。標記物為MMC，待試系統為包封于新的DDS中的標記物。不含藥和含藥的DDS制劑的施用劑量為5mg/kg體重，150μl/動物。DDS劑量為1mg/ml。
實驗中采用4只動物(分成2對)。一對經鼻內(IN)接受游離標記物至右鼻孔中。另一對經鼻內接受標記物/DDS制劑至右鼻孔中。采用適宜的注射器，緩慢給藥(用時若干分鐘)。
給藥6小時后，動物經心臟灌注，然后處死.，取出腦部并進行均質處理，按第1輪方法測定標記物濃度。
灌注后，腦部是清潔的。所得結果以“％施用劑量”，如所示附圖17。由于動物之間變異性，報告每只動物的數據。雖然存在個體變異性，其結果還是相當清楚的。當以游離形式施用時，標記物的蓄積非常少，而當以DDS形式施用時其蓄積顯著。在大鼠實驗中也有積極的發現，與以游離形式施用的標記物相比，經載體施用的標記物的蓄積要高600-2,500倍。這些結果表明，這種藥物傳遞技術經非侵入性施用途徑將藥物傳遞至腦部的潛力并不限于單一物種。
實施例11新的DDS治療荷耐藥腫瘤小鼠腫瘤轉移灶模型動物研究本研究目的是評價腫瘤轉移灶模型中的新的DDS。與采用小鼠和固有MDR的C-26細胞系的在先研究相似，本研究也采用固有MDR的細胞系(B16F10，來源于鼠黑素瘤)。采用本領域已建立的特定方案，用于誘發肺轉移。
實驗開始時采用12周齡的C57BL/6雌性小鼠。腫瘤模型為B16F10，靜脈內注射細胞。所用化學治療藥物為絲裂霉素C(MMC)。DDS系統為納米顆粒形式的LLG。待試系統為包封于本發明新的DDS中的MMC(MMC/DDS)。MMC的注射劑量為5mg/Kg體重和DDS劑量為1mg/ml。
取25只動物實驗，分成5組，每組5只小鼠，接受見表10的特定處置。組1為是未接種腫瘤細胞的健康小鼠對照組。
表10.動物組

B16F10細胞于細胞培養燒瓶中生長。于0天，收集細胞并洗滌幾次，計數并立即注射給2-5組。注射劑量為在50μl PBS中的5×105細胞。
于1、5和19天進行治療。經尾靜脈注射施用。所有注射體積為0.1ml。于腫瘤接種21天后中止實驗。處死動物，取出肺，稱重并固定于Bouin氏溶液中。按下述公式計算肺增重肺重增加(％)＝100×(腫瘤肺重-正常肺重)/正常肺重由專家采用解剖顯微鏡對表面轉移灶進行計數。樣品采用盲法編號，因此專家不知每一動物接受的處置。
采用兩種獨立測量的數據定量評價在肺中的轉移離體并適當固定的肺中轉移灶的實際計數；和/或注射腫瘤細胞的動物中因轉移所致肺增重的測量數據。本研究采用上述兩種技術。
1-5組中發現的轉移灶數量如附圖18所示。
如所預料的一致，對照動物(沒有接受任何腫瘤細胞)肺中沒有出現轉移灶。所以接受靜脈內注射B16F10細胞的其他組出現了肺轉移。在接受鹽水或游離藥物的動物中出現了最侵略性的轉移。這些組間沒有統計學差異，表明這些細胞在體內也表達其固有MDR特性。
與鹽水相比，用不含藥物的DDS(free DDS)處理使轉移灶數量降低6倍，而用實驗劑型處理使轉移灶數量降低得更多(達17倍)。
所有注射腫瘤的4組，均與正常動物(對照組)比較肺增重。所得結果如附圖19所示。
在未接受任何處置的動物(鹽水組)中，出現了最高肺增重(接近400％)，接受游離藥物處理的動物的狀況也類似。與未接受處置和和接受游離藥物的相比，接受DDS的動物的肺增重較小，但是與對照組的健康動物肺重相比仍增加2倍。在接受包封于DDS的MMC實驗制劑的動物中，觀察到相對(與其他組比較)和絕對(與健康動物比較)最佳的反應。與健康動物相比，其％增加屬于10％數量級，不具有統計學顯著意義，表明該劑型具有破壞(abolish)肺轉移的潛力由于肺轉移可致肺增重，因此兩種獨立測量的參數之間有適當的相關性。可從附圖20中明確地看出這種相關性，該附圖附圖18和19數據(均值)的重繪圖。附圖20也證明了實驗劑型在最具挑戰性的腫瘤治療中的優越性，它能消除MDR腫瘤轉移。
至此，已對新的DDS作為化學治療藥物的載體在兩種獨立動物模型中的性能進行了研究。一種為實體瘤和另一種為肺轉移。在兩種模型中，將來源于C-26和B16F10細胞系的腫瘤細胞注入動物體內，證實了它們在體內也表達先前體外所見的MDR特性。
在兩種模型中，與游離藥物相比，用不含藥物的DDS(free DDS)自身處理表現出良好的臨床反應。然而，在兩種模型中具有最佳臨床反應的是包封化學治療藥物的新的DDS實驗劑型。這表示此種新穎系統具有較高的臨床應用潛力。
實施例12BSA-FITC進入MCF-7細胞用游離形式和包封于DDS中的熒光標記物FITC(BSA-FITC)標記牛血清白蛋白，用于測定DDS是否也能促使大的大分子進入細胞。于25℃，不含藥的和DDS-被包封的BSA-FITC與MCF7細胞(來源于人乳癌)的融合單層溫育60分鐘。據報道，MCF-7細胞具有兩種已知的透明質酸受體(ICAM-1和CD44)。除去蛋白質/DDS系統中的游離蛋白質。游離形式和被包封蛋白質的濃度相同(均3.3mg/ml)。溫育后，用共聚焦顯微鏡觀察細胞。
游離蛋白質的結果如附圖21的上面兩格所示。一些蛋白質進入細胞，并看見與核被膜結合，但沒有進入細胞核內部。已知BSA可與細胞非特異性結合，并且可以通過非特異性受體或通過胞飲作用而進入細胞。
DDS包封BSA-FITC的結果如附圖21下面兩格所示。進入細胞的蛋白質明顯多于游離蛋白質，并且蛋白質也進入了細胞核中。至于被包封的EtBr(附圖2-4)，其確切的相關機制仍無法完全獲知。然而，對于大的蛋白質而言，蛋白質-DDS通過受體介導的胞吞作用而被攝取的可能性，要高于小的EtBr。
前述對特定實施方案的描述旨在充分地說明本發明的一般性質，本領域技術人員可采用當前的知識，根據該特定實施方案的不同應用而容易地進行并不偏離其一般概念的改進和變化，因此，這種借用和改進應當均在此公開實施方案之同等物的精神和范疇之內。在此所用的的措詞或術語應理解為旨在描述而沒有限制作用。
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權利要求
1.類脂化糖胺聚糖顆粒，包括至少一種糖胺聚糖與至少一種含有伯氨基的類脂的反應產物。
2.根據權利要求1的類脂化糖胺聚糖顆粒，其中糖胺聚糖選自透明質酸、硫酸角質蛋白、硫酸角質素、硫酸軟骨素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、其片段、鹽類及混合物。
3.根據權利要求1的類脂化糖胺聚糖顆粒，其中糖胺聚糖為透明質酸。
4.根據權利要求1的類脂化糖胺聚糖顆粒，其中類脂為磷脂酰乙醇胺。
5.根據權利要求1的類脂化糖胺聚糖顆粒，其中顆粒的粒徑約為2-5微米。
6.根據權利要求1的類脂化糖胺聚糖顆粒，其中顆粒的粒徑約為50-200納米。
7.根據權利要求1的類脂化糖胺聚糖顆粒，其中活性成分被包封在顆粒中。
8.根據權利要求7的類脂化糖胺聚糖顆粒，其中活性成分選自抗感染藥、化療藥物、蛋白質、激素、酶、細胞和核酸。
9.根據權利要求8的類脂化糖胺聚糖顆粒，其中活性成分是用于治療癌癥的化療藥物。
10.一種制備類脂化糖胺聚糖顆粒的方法，包括至少一種糖胺聚糖與至少一種含有伯氨基的類脂反應，使糖胺聚糖的羧酸基殘基與伯氨基交聯。
11.根據權利要求10的方法，其中糖胺聚糖選自透明質酸、硫酸角質蛋白、硫酸角質素、硫酸軟骨素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、其片段、鹽類及混合物。
12.根據權利要求11的方法，其中糖胺聚糖是透明質酸。
13.根據權利要求10的方法，其中類脂是磷脂酰乙醇胺。
14.一種制備包封有活性成分的類脂化糖胺聚糖顆粒的方法，包括在水中重建凍干的糖胺聚糖顆粒，并加入粉末狀活性成分，由此使活性成分被包封于類脂化糖胺聚糖顆粒中。
15.一種治療患有癌癥的動物的方法，包括向所述動物施用有效量的不含藥物的類脂化糖胺聚糖顆粒。
16.根據權利要求15的方法，其中所述癌癥是轉移癌。
17.根據權利要求15的方法，其中口服施用所述顆粒。
18.根據權利要求15的方法，其中經靜脈內施用所述顆粒。
19.根據權利要求15的方法，其中經鼻內施用所述顆粒。
20.根據權利要求15的方法，其中局部施用所述顆粒。
21.根據權利要求15的方法，其中所述癌癥是動物中樞神經系統的癌癥。
22.根據權利要求21的方法，其中所述中樞神經系統癌癥是神經神經膠質瘤。
23.一種治療患有病理學病癥的動物的方法，包括將包封于類脂化糖胺聚糖顆粒中的有效量的生物活性物質給予所述動物，其中病理學病癥選自癌癥、細菌感染、真菌感染、病毒感染、寄生蟲感染和朊病毒感染。
24.根據權利要求23的方法，其中病理學病癥是癌癥和所述生物活性物質是抗癌藥物。
25.根據權利要求24的方法，其中口服施用所述藥物。
26.根據權利要求24的方法，其中經靜脈內施用所述藥物。
27.根據權利要求24的方法，其中經鼻內施用所述藥物。
28.根據權利要求24的方法，其中局部施用所述藥物。
29.根據權利要求24的方法，其中所述癌癥是動物中樞神經系統的癌癥。
30.根據權利要求29的方法，其中所述中樞神經系統癌癥是神經膠質瘤。
31.根據權利要求24的方法，其中所述癌癥是轉移癌。
32.根據權利要求23的方法，其中病理學病癥是細菌感染和所述生物活性物質是抗菌藥。
33.根據權利要求32的方法，其中細菌感染是創傷。
34.根據權利要求32的方法，其中細菌感染是燒傷。
35.根據權利要求32的方法，其中細菌感染位于動物的中樞神經系統。
36.根據權利要求32的方法，其中口服施用所述藥物。
37.根據權利要求32的方法，其中經靜脈內施用所述藥物。
38.根據權利要求32的方法，其中經鼻內施用所述藥物。
39.根據權利要求32的方法，其中局部施用所述藥物。
40.根據權利要求23的方法，其中病理學病癥是真菌感染和所述生物活性物質是抗真菌藥。
41.根據權利要求40的方法，其中真菌感染是創傷。
42.根據權利要求40的方法，其中真菌感染是燒傷。
43.根據權利要求40的方法，其中真菌感染位于動物的中樞神經系統。
44.根據權利要求40的方法，其中口服施用所述藥物。
45根據權利要求40的方法，其中經靜脈內施用所述藥物。
46.根據權利要求40的方法，其中經鼻內施用所述藥物。
47.根據權利要求40的方法，其中局部施用所述藥物。
48.根據權利要求23的方法，其中病理學病癥是病毒感染和所述生物活性物質是抗病毒藥。
49.根據權利要求48的方法，其中病毒感染位于動物的中樞神經系統。
50.根據權利要求48的方法，其中口服施用所述藥物。
51根據權利要求48的方法，其中經靜脈內施用所述藥物。
52.根據權利要求48的方法，其中經鼻內施用所述藥物。
53.根據權利要求48的方法，其中局部施用所述藥物。
54.根據權利要求23的方法，其中病理學病癥是寄生蟲感染和所述生物活性物質是抗寄生蟲藥。
55.根據權利要求54的方法，其中口服施用所述藥物。
56.根據權利要求54的方法，其中經靜脈內施用所述藥物。
57.根據權利要求54的方法，其中經鼻內施用所述藥物。
58.根據權利要求54的方法，其中局部施用所述藥物。
59.根據權利要求23的方法，其中病理學病癥是朊病毒感染和所述生物活性物質是抗朊病毒藥。
60.根據權利要求59的方法，其中口服施用所述藥物。
61.根據權利要求59的方法，其中經靜脈內施用所述藥物。
62.根據權利要求59的方法，其中經鼻內施用所述藥物。
63.一種類脂化糖胺聚糖顆粒，其中包封有成像用的標記物。
64.根據權利要求63的顆粒，其中標記物是放射性同位素。
65.根據權利要求64的顆粒，其中放射性同位素選自99Tc、127I和67Gd。
66.根據權利要求63的顆粒，其中標記物是熒光分子。
67.一種診斷成像方法，包括將診斷劑給予患者并對患者進行成像，其特征在于所述診斷劑是如權利要求63所述的類脂化糖胺聚糖顆粒。
68.根據權利要求8的類脂化糖胺聚糖顆粒，其中活性成分是核酸。
69.一種基因傳遞和短期表達用于治療目的核酸的方法，包括將有效量的治療目的核酸給予對此有需要的動物，其特征在于所述核酸經制劑而包封于如權利要求68所述的糖胺聚糖顆粒中。
70.一種組織工程學用支架，包括包封有全細胞和/或細胞系的類脂化糖胺聚糖顆粒。
71.根據權利要求23的方法，其中經眼內、肌內或皮下施用所述顆粒。
全文摘要
公開了一種類脂化糖胺聚糖顆粒，它是通過糖胺聚糖與至少一種類脂反應，使糖胺聚糖的羧酸基團與類脂的伯氨基交聯而形成的。所述顆粒可用于包封活性成分，例如用于治療動物病理學狀態的藥物。
文檔編號A61K31/737GK1564678SQ02819660
公開日2005年1月12日 申請日期2002年8月9日 優先權日2001年8月14日
發明者R·毛爾高利特, D·佩爾 申請人:特拉維夫大學未來技術研發有限公司