糖半抗原和聚集的蛋白載體的免疫原性結合物的制作方法

專利名稱：糖半抗原和聚集的蛋白載體的免疫原性結合物的制作方法
本申請是2001年8月14日提交的在先臨時申請60/311,850的非臨時申請，結合其全部內容作為參考。
背景技術：
發明領域本發明涉及免疫治療，其中引發針對糖表位的免疫應答。它預示了糖半抗原和聚集的(多聚的)蛋白載體的免疫原性結合物(conjugate)的應用。STn與匙孔血藍蛋白(KLH)多聚體的結合物是特別令人感興趣的。
背景描述免疫系統脊椎動物抗感染性微生物、毒素、病毒或其他外源大分子以保護它們自身的能力被定義為免疫。該領域可分為天然的和獲得性或特異性免疫(Abbas等，Cellular and Molecular Immunology，W.B.Saunders Company，1991；Hood，等，Immunology，2ndEdition，The Benjamin/CummingsPublishing Company Inc.，1984)。
天然免疫由防御機制組成，所述防御機制在暴露于微生物或外源大分子之前是活躍的，不被這種暴露加強，而且對于機體是外源的大部分物質不加以區分。天然免疫的效應器是物理屏障如皮膚或粘膜，吞噬細胞如巨噬細胞或嗜中性粒細胞，一類稱為天然殺傷細胞的淋巴細胞，和補體系統。補體是一種血清蛋白復合物，它對由特異的補體固定的抗體致敏的某些細菌和其他細胞而言是破壞性的；其活性通過一系列導致蛋白裂解的相互作用來實現，并從事至少兩種途徑的一種或另一種(Illustrated Stedman’s Medical Dictionary，第24版，Williams和Wilkins，Baltimore/London，1982)。
獲得性或特異性免疫包含通過暴露給外源物質而被誘導或刺激的防御機制。
在脊椎動物中，天然免疫和特異性免疫機制在宿主防御系統，即免疫系統中，協同作用來消除外源侵入者。除了微生物、癌細胞、寄生物和病毒感染的細胞，免疫系統也識別和消除從同種(同種異體移植)的遺傳上不同的個體或不同種(異種移植)移植到受試者中的細胞或組織。
由特異性免疫機制所參與的抵制侵略的微生物癌細胞等的防御所產生的事件稱為免疫應答。脊椎動物有兩種基本的免疫應答體液免疫和細胞免疫。體液免疫是由B淋巴細胞提供，B淋巴細胞在增殖和分化后產生在血液和淋巴液中循環的抗體。細胞免疫是由淋巴系統的T細胞所提供。細胞免疫應答對抵抗真菌、寄生物、細胞內病毒感染、癌細胞和外源物質特別有效，而體液應答主要抵抗細胞外狀態的細菌和病毒感染。
“抗原”是一種由抗體或T細胞受體所識別(特異性結合)的外源物質，但不管它是否能誘導免疫應答。誘導特異性免疫的外源性物質稱為“免疫性抗原”或“免疫原”。“半抗原”是指一種本身不能引發免疫應答(盡管幾個分子半抗原的結合物，或半抗原與大分子載體的結合物可引發免疫應答)的抗原。因為本申請涉及引發免疫應答，除非特別說明，術語“抗原”將指免疫性抗原。
腫瘤相關的糖抗原決定簇。許多具有臨床意義的抗原具有糖決定簇。這類抗原的一組包含腫瘤相關的粘蛋白(Roussel，等，Biochimie 70，1471，1988)。
一般來說，粘蛋白是存在于唾液、胃液等中的糖蛋白，它形成粘性溶液，在機體外部和內部的表面作為潤滑劑或保護劑來發揮作用。粘蛋白典型地具有高的分子量(通常＞1,000,000道爾頓)，而且是高度糖基化的。粘蛋白的多糖鏈是O—連接的(連接到絲氨酸或蘇氨酸殘基上)，而且可以占糖蛋白分子質量的80％以上。粘蛋白由管狀上皮細胞和相同來源的腫瘤產生，可以被分泌出來或作為整合膜蛋白結合到細胞上(Burchell，等，Cancer Res.47,5476,1987；Jerome，等Cancer Res.，51，2908，1991)。
癌組織產生異常的粘蛋白，已知它比其正常配對物(counter parts)的糖基化相對少一些(Hull，等，Cancer Commun.，1，261，1989)。由于在癌細胞中蛋白糖基化機制發生功能改變，腫瘤相關的粘蛋白典型地包含短的不完整的多糖。因此，與人乳脂肪球相關的正常粘蛋白主要由四糖多糖，gal β-4 glcNAcp1-6(gal β-3)galNAc-α及其唾液酸化的類似物(sialylated analogs)組成(Hull，等)，腫瘤相關的Tn半抗原僅由單糖殘基，α-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃半乳糖基，和二糖β-吡喃半乳糖基-(1-3)α-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃半乳糖基的T-半抗原組成。其他腫瘤相關粘蛋白的半抗原，如唾液酸-Tn和唾液酸-(2-6)T半抗原，是由末端的唾液酸殘基連接到短的Tn及T多糖上產生的(Hanisch，等，Biol.Chem.Hoppe-Sevler，370，21，1989；Hakormori，Adv.Cancer Res.，52257，1989；Torben，等，Int.J.Cancer，45666，1980；Samuel，等Cancer Res.，50，4801，1990)。
已發現T和Tn抗原(Springer，Science，224，1198，1984)在大多數原代癌細胞及其轉移細胞(大于所有人癌癥的90％)的外表面膜上以免疫活性形式存在。作為癌癥標志物，T和Tn可對一些癌癥的侵染力進行早期免疫組化檢測和預測(Springer)。唾液酸-Tn半抗原在腫瘤組織上的存在已經被鑒定為一種不利的預示參數(Itzkowitz，等Cancer，66，1960，1990；Yonezawa，等，Am.J.Clin.Pathol.，98，167，1992)。有幾種類型的腫瘤相關糖抗原在普通人癌中是高表達的。Tn、T和STn半抗原作為粘蛋白類型的(O-連接的)糖出現。另外，癌相關的鞘糖脂，如GM2和GD3在許多人癌中表達。
由癌相關的粘蛋白所呈現的改變的多糖決定簇被患者的免疫系統識別為非自我的或外源的(Springer)。實際上，在大部分患者中觀察到了對T半抗原強烈的自免疫應答。這些應答可以很容易地被測量，并允許以更高的靈敏度和特異性比先前可能地更早地來檢測癌癥。最后，T和Tn的表達程度常常與癌的分化程度相關(Springer)。
糖-蛋白結合物。因為腫瘤相關抗原在診斷和檢測很多類型癌癥中是有用的，并且在治療中可能也是有用的，許多工作人員已經合成了糖半抗原的糖苷及其唾液酸化類似物的糖苷，并已使用這些糖苷將半抗原連接到蛋白或合成的肽載體上。這些糖苷一般都包括一個糖苷配基部分，從那里可產生高應答功能而不改變各自半抗原糖苷的多糖部分。隨后，“活化的”半抗原糖苷與蛋白或合成肽載體的氨基部分發生反應，以形成席夫堿連接。席夫堿基團可通過用氫硼化物還原形成仲胺連接來穩定；然后將整個偶聯過程稱為還原性胺化作用(Gray，Arch.Biochem.Biophys.，163，426，1974)。
關于這些結合物的例子，參見Lemieux，等，USP 4,866,045；Naicker等，USP 4,935,503；Kolar，USP 4,42_,284；Feizi，USP 4,563,445；Koganty，USP 5,055,562；Jennings，USP4,356,170；Roy，USP 5,034,516。
Wong，USP 6,013,779公開了一種形成糖半抗原與蛋白載體結合物的方法。首先，通過烯醇，如巴豆醇的Fisher-型糖基化作用來制備α-烯式糖苷。將α-烯式糖苷進行臭氧分解，產生半抗原醛(第二種醛作為副產物)。副產物優選是乙醛或更高的醛，不是甲醛。
然后將半抗原醛連接到載體蛋白如KLH上。
STN-KLH結合物Biomira開發的Theratope疫苗由合成的與KLH連接的STn半抗原組成，用帶有佐劑的乳劑形式進行遞送。在I期和II期臨床試驗中所用的疫苗具有半抗原取代水平，其導致唾液酸(NANA)含量大約為重量的2.5-3％。而II期臨床試驗正在進行，改善了連接方法，使得NANA的含量可達到約7％。在鼠中，高的結合產物誘導產生相當更高滴度的抗-STn抗體，而在人的小型過渡研究中，產生顯著更高的抗-STn的IgG滴度。因為在II期臨床試驗中，較高的抗-STn IgG滴度似乎與提高的存活率相關，因此，開始了大量的使用NANA含量約為7％的STn-KLH結合物的III期臨床試驗。
表位簇糖表位簇已在文獻中有所報道，但是其重要性并沒有很清楚地闡明。參見Reddish，等，Glycoconjugate J.，14549-60(1997)(成簇的STn)，Ragapathi，等Cancer Immunol.Immunother.481-8(1999)。同樣，O-糖基化位點簇也已有報道。參見Gendler，等，J.Biol.Chem.，26312820(1988)。
我們用一種對簇具有特異性的Mab和與單體或簇反應的另一種對各種STn-KLH制劑的“STn簇”含量進行調查。所有疫苗制品均有可檢測到的簇含量，但半抗原檢測上限很低，這可能是因為Mabs的空間位阻比半抗原的大得多。由于簇的密度太高不能被測量，所以提高的效力并不能特定地歸因于在更高的取代水平上空間排列(簇)的產生。在這些研究的過程中，我們發現通過如下所述對過程變量(process variables)進行一定的改變，可將疫苗中NANA含量提高到7％，而效力提高很少。這提示在以下所描述的系統中所觀察到的效力提高并不僅僅歸因于形成半抗原“簇”。
也參見Sloan-Kettering，WO98/46246；Sloan-Kettering，WO97/34921；Sloan-Kettering，WO99/15201(巖藻糖基GM1-KLH結合物；所述KLH MW為5×106)；Kjeldsen，USP 5,660,834；Zhang，等，Cancer Res.553364-8(1995年8月1日)；Swiss Prot P04253；Swiss-ProtP80888；Swiss-Prot P02768；Kjeldsen，USP 5,747,048。
以下美國專利使用短語“成簇表位”6,376,4636,258,9376,180,3715,929,2205,888,9745,859,2045,744,446以下美國專利引用“成簇”和“糖表位”6,365,1246,287,5746,013,7795,965,544
5,268,3644,837,306發明概述本發明涉及一種具有免疫原性的由多個糖半抗原與聚集的多聚蛋白載體組成的結合物。
聚集產生于蛋白載體的各個單體相互作用形成多聚的實體。相互作用可以通過結合和/或通過各個蛋白鏈纏結而成(在糖半抗原附著前、過程中或之后)。如果結合有助于寡聚化，則它可以是共價和/或非共價的。
優選地，聚集與糖半抗原附著到蛋白或多或少同時地發生。
認為這些制品的免疫效力歸因于高的半抗原取代比及蛋白載體聚集形成多聚實體的結合。
多聚實體優選地是蛋白載體單體單元的二聚體、三聚體、四聚體和/或五聚體。
附圖簡述

圖1所示的是Lot PD020105-08的尺寸排阻色譜(9,500kDa，6.8％NANA)。
圖2所示的是Lot 211299-01的尺寸排阻色譜(590kDa，3.2％NANA)。
圖3所示的是Lot 040400-RT的尺寸排阻色譜(460kDa，7.0％NANA)。
圖4所示的是Lot 260100RT的尺寸排阻色譜(500kDa，7.2％NANA)。
圖5所示的是Lot 040400-RT與260100RT的尺寸排阻色譜的重疊。
圖6所示的是Lot 201299-01的尺寸排阻色譜(4000kDa，3％NANA)。
圖7所示的是Lot 011299-03的尺寸排阻色譜(2600kDa，5.1％NANA)。
圖8所示的是Lot STNK0055的尺寸排阻色譜(1200kDa，7.8％NANA)。
圖9所示的是Lot PD029910-03的尺寸排阻色譜(1,500kDa，7.9％NANA)。
圖10是分子量(kDa)相對于相對滯留時間％的回歸曲線(甲狀腺球蛋白＝100)。
發明優選實施方案的詳細描述糖半抗原；表位本發明的糖半抗原是包含(優選地相同于)糖表位的糖。
術語“糖”包括單糖、寡糖和多糖，及通過還原蒈酮基(糖醇)、氧化一個或多個末端基團為羧酸、或由氫原子、氨基、巰基或類似的雜原子基團取代一個或多個羥基從單糖所衍生的物質。也包括上述物質的衍生物。
正常情況下，糖半抗原不是一種多糖，因為多糖通常很大，本身就具有免疫原性。然而寡糖和多糖的界限并不固定，我們定義寡糖由2-20單糖(糖)單元組成。
半抗原可以是單糖(無糖苷連接到另一個這樣的單元)或寡糖。如果是寡糖，優選它不多于10個糖單元。
單糖是具有三個或多個碳原子的多羥基醛(H[CHOH]n-CHO)或多羥基酮(H-[CHOH]n-CO-[CHOH]m-H)。
每個單糖單元可以是一個醛醣(具有一個醛式羰基或潛在的醛式羰基)或酮糖(具有一個酮式羰基或潛在的酮式羰基)。單糖單元進一步可以具有多于一個的羰基(或潛在羰基)，因此可以是二醛糖、二酮糖或醛酮糖。術語“潛在的醛式羰基”是指由產生環合的半縮醛基團，和酮式配對物(半縮酮結構)。
單糖單元可以是環狀半縮醛或半縮酮。具有三元環的環狀形式是三環糖(oxiroses)；四個環是四環糖(oxetoses)；五個環是呋喃糖；六個環是吡喃糖；七個環是七環糖；八個環是octaviruses等等。閉合位置的位標可以改變。
單糖單元可進一步是脫氧糖(由氫原子取代的醇式羥基)、氨基糖(由氨基取代的醇式羥基)、巰基糖(由巰基取代醇式羥基、或由C＝S取代的C＝)、或由硫取代的環狀形式的環氧)、硒代糖(seleno sugar)、碲代糖(telluro sugar)、取代的單糖、不飽和單糖、氮雜糖(由氮取代的環狀碳)、氨基糖(由氮取代的環狀氧)、糖醇(由CHOH基團取代的羰基)、醛糖酸(由羧基取代的醛基)、酮醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸(aldaric acid)等等。
唾液酸，也已知為N-乙酰基神經氨酸(NANA)是特別令人感興趣的。它是幾種腫瘤相關的糖表位的末端糖。
腫瘤相關的糖表位是特別令人感興趣的。
根據本發明，可以連接多種糖，以特別用于檢測和治療腫瘤。Tn、T、唾液酸Tn和唾液酸(2-＞6)T半抗原是特別優選地。
特別地，為了檢測和治療腫瘤，將三類在一般人類腫瘤中高表達的腫瘤相關糖表位連接到胺化的化合物上。這些特別包括乳糖系列1型和2型鏈，癌相關的神經節鏈(ganglio chains)和中性糖鞘脂。
乳糖系列1型和2型鏈的例子如下乳糖系列A型和2型鏈Lewis aFucα 1↓4Galβ1→3GlcNAcβ1→二聚的Lewis a Fucα 1 Fucα1↓ ↓44Galβ1→3GlcNAcβ1→Galβ1→3GlcNAcβ1→Lewis b Fucα 1↓4Galβ1→3GlcNAcβ1→2↑Fucα 1Lewis b/Lewis a Fucα 1Fucα1↓↓4 4Galβ1→3GlcNAcβ1→Galβ1→3GlcNAcβ1→2↑Fucα 1
Lewis xGalβ1→4GlcNAcβ1→3↑Fucα 1Lewis y Galβ1→4GlcNAcβ1→2 3↑ ↑Fucα 1 Fucα 1Lewis a/Lewis x Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ→3↑Fucα 1Lewis x/Lewis x(二聚的Lex)Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ3 3↑ ↑Fucα 1 Fucα 1Lewis y/Lewis xGalβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ→2 33↑↑ ↑Fucα 1 Fucα 1 Fucα 1三巖藻糖基Lewis yGalβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→2 3 3↑ ↑ ↑Fucα 1 Fucα 1 Fucα 1三巖藻糖Lewis bFucα 1↓Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→2 3↑ ↑Fucα 1 Fucα 1唾液糖基(sialosyl)LexNeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3↑Fucα 1
唾液糖基LeaFucα 1↓4NeuAcα2→3Gal β1→3GlcNAcβ1→唾液糖基二聚LexNeuAcα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3 3↑↑Fucα 1 Fucα 1Tn GalNAcα1→唾液糖基-TnNeuAcα→6GalNAcα1→唾液糖基-TNeuAcα→6(Galβ1→3)GalNAcα1→NeuAcα→6GalNAcα1→3↓Galβ 1TGalβ1→3GalNAcα1→根據本發明可連接到胺化的化合物上的癌癥相關的神經節鏈的例子如下癌癥相關的神經節鏈GM3 NeuAcα2→3Galβ1→4Glcβ1→GD3 NeuAcα2→8NeuAcα2→3Galβ1→4Glcβ1→GM2 GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ1→3↑NeuAcα 2GM4 NeuAcα2→3Galβ1→GD2 GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ1→3↑NeuAcα2→8NeuAcα 2
GM1 Galβ1→3GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ1→3↑NeuAcα 2GD-1a NeuAcα2→3Galβ1→3GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ1→3↑NeuAcα 2GD→1b Galβ1→3GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ1→3↑NeuAcα2→8NeuAcα 2除了上述化合物，根據本發明中性糖鞘脂也可連接到胺化的化合物上所選擇的中性糖鞘脂GlobotrioseGalα→4Galβ1→4Glcβ1→Globotetraose GalNAcβ1→3Galα→4Galβ1→4Glcβ1→Globopentaose GalNAcα1→3GalNAcβ1→3Galα→4Galβ1→4Glcβ1→Isoglobotriose Galα→3Galβ1→4Glcβ1→Isoglobotetraose GalNAcβ1→3Galα1→3Galβ1→4Glcβ1→粘丙糖(Mucotriose) Galβ1→4Galβ1→4Glcβ1→粘丁糖(Mucotetraose) Galβ1→3Galβ1→4Galβ1→4Glcβ1→乳丙糖(Lactotriose)GalNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→乳丁糖(Lactotetraose) GalNAcβ1→3GalNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→新乳丁糖(Neolactotetraose) Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→神經節丙糖(Gangliotriose) GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ1→神經節丁糖(Gangliotetraose)Galβ1→GlcNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ1→半乳二糖(Galabiose)Galα→4Galβ1→9-0-乙酰基-GD3 9-O-Ac-NeuAcα2→8NeuAcα2→3Galβ1→4Glcβ1→蛋白載體蛋白載體是一種單體形式的大分子，分子量至少為10kD，并包含一個或多個賴氨酸殘基。優選地，至少為3％賴氨酸(摩爾量)。
優選的蛋白載體是血藍蛋白，如節肢動物或軟體動物的血藍蛋白。最優選地是腹足動物的，尤其是Fissurellidae(匙孔)的血藍蛋白，特別是匙孔(Megathura crenulata)血藍蛋白。
血藍蛋白是許多節肢動物和軟體動物的氧運輸蛋白。天然的匙孔血藍蛋白是一個多聚體，總分子量大約為8000kDa。單體約400kDa。它包括兩個免疫上和生理上不同的異構體，KLH1和KLH2。二者作為圓柱形雙十聚體(didecamer)存在于血淋巴中。每個異構體單體包含8個功能單位(FUs)，從N-到C-末端依次稱為“a”到“h”。KLH1的FUs“b”到“g”共有2141個氨基酸，KLH2的FUs“b”到“h”共有2473個氨基酸。見Altenheim等“匙孔血藍蛋白的序列”摘要，http//www.sb-roscoff.fr/IO2BiP/IO2B 1PP.PDF；Swerdlow，Comp.Biochem.Biophys.113B537-48(1996)；Stoeva，Biochem.Biophys.Acta 143594-109(1999)；Harris和Markl，Micron.，30597-623(1999)。Swerdlow報道KLH-A是449kDa，KLH-B是392kDa。Sohngen，等，Eur.J.Biochem.，248602-1491997)報道KLH1是400kDa，KLH2是345kDa。Ebert，USP 5,855,919使用的數值是400kDa。
優選地，在本發明的結合物中，如果載體部分的單體單元是KLH單體，則結合物不是KLH單體的取代的十聚體，雙十聚體或多十聚體。
天然KLH富含銅，但在還原性氨基化過程中銅丟失，KLH是糖基化的，具有大約4％分子質量的糖含量。見上文的Harris。
優選地，如果使用KLH單體，至少有一個糖半抗原部分是本身與KLH不相關的。優選地，至少糖半抗原部分的一個糖組分是本身與KLH不相關的。
聚集的程度本發明中優選的免疫原是一種聚集的糖半抗原取代的KLH。每個單體單元可以是KLH1、KLH2或一些其他KLH單體。
此處所用的術語“取代的KLH單體”是指由多個糖半抗原，除了那些本身是相關的以外，取代的KLH。它們可以是存在的天然糖鏈的復制品，但更通常包括本身與KLH不相關的半抗原。KLH可以，但不必在半抗原取代前特異或非特異地去糖基化以除去一些或所有天然的糖。
取代的KLH單體分子量比非取代的KLH更大。如果后者是400kDa(文獻報道為345-449kDa)，那么取代的KLH將具有更大的分子量。增量依賴于每個半抗原部分(包括連接物)的分子量和每個單體中半抗原部分的數量。
如果非取代的KLH單體是400kDa，那么取代的二聚體的分子量必須大于800kDa。因此，取代的聚合體優選地具有一個大于800kDa，更優選地大于1,200kDa，還更優選地大于1,600kDa的表觀分子量。
在優選的糖半抗原取代的單體形式中的KLH的分子量大約為500kD；如果沒有附加的糖(和連接物)，則大約為400kD。因此，半抗原取代可以使分子量相對于非取代的KLH單體增加25％或更多。由此可見，取代的聚合體也優選具有至少1,000kDa，更優選至少1,500kDa，甚至更優選至少2,000kDa的表觀分子量。
可以理解，制品可包含n-聚體，如單體、二聚體、三聚體、四聚體等的非均勻混合物，使得表觀分子量實際是每個大小類別的n-聚體的表觀分子量的權重平均。
理論上制品可通過分子量進行分級，以確定歸屬于每個大小類別的n-聚體的級分。優選地，單體少于制品的50％(重量)，更優選地是少于25％，還更優選地是少于10％，最優選地是少于5％。為了去除主要的單體級分從而富集多聚體，也可將制品級分。
聚合程度的最大限度是聚合物不能太大，以致于在溶液中沉淀出來。然而，優選地表觀分子量小于5,000kDa(相當于取代的十聚體)，更優選地小于25,00kDa(相當于取代的五聚體)。
表觀分子量優選地通過激光散射來測定。見Wyatt，Anal.Chim.Acta，2721-40(1993)。它通過尺寸排阻(分子篩)色譜進行推定，見以下描述。一般來說，RRT值為0.97或更小是理想的。
圖12所示的是在Shodex上進行尺寸排阻色譜所得到的分子量(kDa)相對于相對滯留時間(RRT％)的回歸曲線。
回歸線提供分子量和RRT的初步關系，它可用于解釋表1中的數據。回歸線是MW(D)＝30，455.378-(302.626*RRT％)，所示的RRT％表示相對于甲狀腺球蛋白為100。注意MW反比于RRT。RRT％＝100*RRT。
用于回歸的R2為0.719。回歸是基于92-100的RRT％值。回歸總結MW(kDa)對RRT(％)計數 12丟失數目(Num.Missing)4|R| .848R平方.719調整的R平方 .690RMS殘余 576.442ANOVA表MW(kDa)對RRT(％)
回歸系數MW(kDa)對RRT(％)
置信區間MW(kDa)對RRT(％)
優選地，RRT％不高于99，更優選地不高于98，還更優選地不高于97，甚至更優選地不高于96，如96、95、94、93、92、91、90、89、88或87(最接近于1)。
對于在RRT％的上限，即高于96(RRT＝0.96)的批次，在治療應用前檢測批次的效力是理想的。
優選地，本發明的聚集的免疫原的效力至少是相同半抗原和載體以相同的半抗原載體單體取代比的結合物的200％，其中載體是未聚集的。為了這個目的，通過免疫小鼠的抗體應答來檢測效力。
連接每分子的半抗原都連接到載體上。載體上的連接點通常是易接近的氨基，如載體的氨基末端，或更通常為賴氨酸的ε氨基。
半抗原或者直接或者通過連接物連接到這個附著點上。通常連接物不是糖或肽本身。即使需要連接物，連接物優選地是包括碳、氫，和任選地氧、氮和/或硫的小的脂肪族基團，除氫外不多于12個原子。更優選地，它是不多于12個碳原子的線性或支鏈的烷基。甚至更優選地，是-(CH2)n，其中n＝1-12。最優選地是-CH2CH2-。每個連接物將糖半抗原的氧與氨基氮相連接，如賴氨酸的ε-氮或蛋白載體的氨基末端。
連接物可以是雙官能的(只將一個半抗原聯接到載體單體上)或官能的(即一個連接物可將多個半抗原連接到載體單體上)。
“連接試劑”與A和B反應，形成A-連接物-B的結構，“連接物”在結構上與最初的連接試劑有關。反應可以是同時的，或者連接試劑可首先與A反應，形成A-連接臂的結構，然后后者與B反應，形成A-連接物-B。
如果半抗原-連接臂是半抗原-巴豆基(如STn-巴豆基)，那么臭氧化作用產生具有反應活性的半抗原醛，它可用于載體的還原性氨基化以形成半抗原-CH2CH2-載體，即，優選的二碳連接物。半抗原通常通過O-連接連接到連接物上，但也可能是其他連接。
另一種感興趣的連接試劑是MMCCH連接試劑，4-(4-馬來酰亞氨基甲基)環己烷-1-羧基酰肼。見Ragaputhi，等，Cancer Immunol.Immunother.481-8(1999)。
一些基于巴豆基連接化學的多官能連接物在Reddish，等，Glycoconjugate J.，14549-60(1997)的圖1中進行了描述。
半抗原-取代比例在本發明中，糖半抗原連接到載體特別是KLH上。載體也是聚集的。
優選地，半抗原相對于載體的比例是每個載體單體上至少連接有10個分子的半抗原。最大比例通過易于接近的附著點的數量來確定。通常比例的范圍是10-120。
NANA含量在唾液酸化的結合物如STn/KLH結合物中，NANA的含量表現出半抗原取代比例(每個載體單體上唾液酸化的半抗原的數量)。NANA含量可以通過以下闡述的方法進行檢測。
在STn/KLH結合物中，優選的NANA含量是超過3％，更優選是至少4％，還更優選是至少5％，甚至更優選是至少6％，最優選是至少7％。優選的數值包括列于表1和表2中超過3％的數值。
NANA的最大可能含量是KLH上可能的STn附著位點總數量的函數。假設STn與KLH的每個賴氨酸側鏈相連接，NANA的含量將大約占結合物重量的12％。這不包括連接物或Tn的分子量。如果相對于非取代的KLH的分子量進行計算，這個數值將大約是13％。相對于非取代的KLH的分子量，整個半抗原-連接臂的含量大約是19％。
更高的NANA含量主要是通過在糖基化反應中提高半抗原對KLH比例來實現。
如果增加半抗原的數量來提高NANA的含量，但不導致免疫原性的增加，那么多余的半抗原實際上就被浪費掉了。因此，從經濟原因考慮限制NANA的含量不超過10％重量是理想的。
因此，最優選NANA的含量范圍為6-10％重量。
連接反應為了實現連接反應，需要提供糖半抗原(如STn)的醛衍生物。它與蛋白(如KLH)載體進行孵育。縮合反應在半抗原醛和蛋白的賴氨酸側鏈的ε氨基之間發生。反應產物是席夫堿中間體。它用合適的還原劑如氰基硼氫鈉進行還原，以在半抗原和載體之間提供穩定的連接。
半抗原醛可通過提供半抗原的巴豆基衍生物并臭氧化該衍生物以形成臭氧化物來獲得。該臭氧化物可被如二甲硫還原以形成醛衍生物。除去副產物乙醛，因此它不能與蛋白縮合。
影響聚集程度的主要過程參數是反應溫度和時間。
影響半抗原取代比例的主要過程參數是半抗原/載體比例，殘留的乙醛水平和氰基硼氫化物濃度。
反應溫度和時間連接反應溫度優選地是39℃-45℃，反應時間優選地是17小時-25小時。
反應溫度必須足夠高，并持續足夠長時間，以獲得所需的聚集程度。
優選地，溫度高于26℃，更優選地至少30℃，還更優選地至少35℃，最優選地至少39℃。
所用溫度不能太高而使免疫原變性。優選地溫度不高于45℃。更優選地不高于43℃。
反應時間必須足夠長以得到所需的聚集程度，期望更高的溫度需要更少的反應時間是合理的。然而，如果溫度太低，無論溫度是多少，聚集的程度都將不充分。同樣，反應溫度和時間必須足夠長以得到所需的半抗原取代程度。反應溫度越低則需要更長的反應時間來達到給定的半抗原取代水平。
反應時間優選地是大于6小時，更優選地是至少12小時，還更優選地是至少17小時。
對反應時間沒有絕對的限制。但是因為反應位點被半抗原所占據，所以連接反應速率變慢。聚集速率也隨著時間進程而變慢。
因此，通常反應持續時間不超過40小時，更優選地不超過30小時，還更優選地不超過25小時是理想的。
半抗原醛與載體單體的比例半抗原醛與載體單體的重量比影響反應速率和得到的半抗原取代比例。
重量比優選地至少為0.6∶1，更優選地至少為1∶1，還更優選地至少為1.5∶1，甚至更優選地至少為1.75∶1，最優選地至少為2∶1。
優選地，重量比不超過4∶1，更優選地不超過3.25∶1，還更優選地不超過2.75∶1。
最優選地，重量比大約為2.25∶1。
最終的KLH濃度優選地是8mg/mL-11.5mg/mL。
氰基硼氫化物濃度最終氰基硼氫化物濃度優選地是25-125mM，更優選地是45-75mM。可選擇的還原劑包括硼氫化鈉和硼氫化物-吡啶復合物。
表征免疫應答細胞介導的免疫應答可在體外或體內進行測定。傳統的體外檢測是T細胞增殖檢測法。從患有目標疾病、與疾病相關的個體或接種疫苗的個體采取血樣。該個體的T細胞通過增殖將因此被引發對新的暴露于該種抗原的應答。增殖需要胸苷，因為它在DNA復制中起到作用。一般來說，T細胞增殖比B細胞增殖更廣泛，甚至在未分離的細胞群中也有可能檢測到強烈的T細胞應答。然而對T細胞進行純化將會更容易地檢測T細胞應答。可使用任何基本不不利地影響它們的抗原特異性增殖的T細胞純化方法。在我們優選的程序中，整個淋巴細胞群首先通過在特定的密度10.7下的等密度梯度，即Ficoll-Hypague或Percoll梯度收集(從血、脾或淋巴結中)而獲得。然后該混合的細胞群通過多種方法進一步純化成T細胞群。最簡單的分離方法是基于B細胞和單核細胞/巨噬細胞群可結合到尼龍絨(nylon wool)柱上。T細胞群通過尼龍絨，大于90％的純T細胞群在單一通道獲得。其他的方法涉及使用對B細胞和或單核細胞的特異抗體，并在補體蛋白存在下，裂解非T細胞群(負選擇)。另外有一種正選擇技術，其中將抗T細胞抗體(CD3)結合到固相基質(如磁珠)上，從而附著T細胞，并使它們從非T細胞群中分離出來(如通過磁性)。這些細胞可以通過機械或化學分離而從基質中回收出來。
一旦獲得純化的T細胞群，將它們在存在被照射的提呈抗原的細胞(脾巨噬細胞、B細胞、樹突細胞)的條件下培養。(這些細胞被照射以防止它們應答和結合氚化的胸苷)。然后成活的T細胞(在100μl補充20單位IL2的培養基中每孔有100,000-400,000個)與檢測的肽或其他抗原溫育3-7天，檢測抗原濃度為1-100μg/mL。
在抗原刺激的最后階段，可通過幾種方法測定應答。首先收集無細胞上清，并檢測特定的細胞因子的存在。α-干擾素、IL2或IL12的存在是Th輔助1型細胞群應答的提示。IL4，IL6和IL10的共同存在是T輔助2型免疫應答的提示。因此該方法可鑒定輔助T細胞亞群。
第二種方法稱為芽生法，其涉及在抗原刺激最后階段將氚化的胸苷加到培養基中(如每孔1微居里)，然后將細胞與放射性標記的代謝物結合4-16小時，隨后在濾器上收獲并進行閃爍計數。整合的放射性胸苷的水平是T細胞復制活動的一個測量標準。陰性抗原或無抗原的對照孔用于依據刺激指數計算芽生法應答。這是CPM檢測/CPM對照。優選地，達到的刺激指數至少為2，更優選地至少為3，還更優選地至少為5，最優選地至少為10。
CMI也用于在標準實驗動物，例如小鼠中進行體內測量。小鼠用引發抗原(priming antigen)進行免疫。當T細胞應答后，通過腳墊注射(footpad injection)檢測抗原對小鼠免疫。將DTH應答(檢測小鼠的腫脹程度)與注射如鹽溶液的對照小鼠進行比較。
優選地，應答至少是.10mm，更優選地至少是.15mm，還更優選地至少是.20mm，最優選地至少是.30mm。
體內的體液免疫應答通過從免疫小鼠中采血，并測定血液中與感興趣的抗原結合的抗體的存在來進行測量。例如，檢測抗原進行固定并與樣品進行溫育，從而捕獲同種抗體，然后被捕獲的抗體通過與具有標記的抗異種抗體的固相進行溫育而進行測量。
優選地，所需的體液免疫應答至少與抗體滴度至少為1/100，更優選地至少為1/1000，還更優選地至少為1/10,000所代表的強度一樣強。
受試者本發明中疫苗的接受者可以是任何經過體液或細胞免疫應答能夠獲得特異性免疫的脊椎動物。
在哺乳類動物中，優選的接受者是靈長目(Orders Primata)的哺乳動物(包括人、猿和猴)、Arteriodactyla(包括馬、山羊、牛、綿羊、豬)、嚙齒目(Rodenta)(包括小鼠、大鼠、兔和倉鼠)和食肉目(包括貓和狗)。在鳥類中，優選的接受者是火雞、小雞和同目的其他成員。最優選的接受者是人。
本發明優選的動物受試者是靈長類哺乳動物。術語“哺乳動物”是指屬于哺乳綱的個體，當然包括人。雖然本發明也可用于獸醫，但本發明特別適用于人類受試者。術語“非人靈長類”是指除了人科外的任何類人猿亞目成員。這樣的非人靈長類包括Ceboidea總科、捲尾猴科(familyCebidae)(新世界猴包括僧帽猴、吼猴(howlers)、蜘蛛猴和松鼠猴)和狨科(family Callithricidae)(包括狨猴)、狝猴總科(superfamilyCercopithecoidea)、猴科(family Cercopithecidae)(包括短尾猿、大狒狒、狒狒、長鼻猴、白腹長尾猴和印度圣猴(sacred hunaman monkeys))；和人總科(superfamily Hominoidae)、猿科(包括長臂猿、猩猩、大猩猩和黑猩猩)。獼猴是短尾猿的一個成員。
藥物組分本發明中的藥物制劑包含至少一種有效引發保護性免疫應答的劑量的免疫原。應答可以是體液的、細胞的或其組合。組合物可以包含多種免疫原。
組合物進一步可以包含脂質體。優選的脂質體包括在2000年11月15日提交的Jiang，等，PCT/US00/31281(我們的記事表為JIANG3A-PCT)和1994年8月12日提交的Longenecker，等，08/229,606(我們的記事表為LONGENECKER5-USA)和1995年4月12日提交的PCT/US95/04540(我們的記事表為LONGENECKER5-PCT)中鑒定的那些。
組合物可以包含抗原提呈細胞，在這種情況下，為了更有效的提呈，將免疫原在給藥前先脈沖到細胞上。
組合物可以包含本領域中已知的助劑或賦形劑。參見，例如，Berkow等編輯，The Merck Manual，第15版，Merck和Co.，Rahway，N.J.，1987；Goodman等編輯，Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第8版，Pergamon Press，Inc.，Elmsford，N.Y.，(1990)；Avery’sDrug TreatmentPrinciples and Practice of Clinical Pharmacology andTherapeutics，第3版，ADIS Press，LTD.，Williams和Wilkins，Baltimore，MD.(1987)，Katzung編輯，Basic and Clinical Pharmacology，第15版，Appleton and Lange，Norwalk，Conn.(1992)，這些參考文獻和其中所引用的參考文獻全文結合于此作為參考。
組合物進一步可包含佐劑，用于非特異性增強免疫應答。一些佐劑對體液和細胞免疫應答都進行加強，其它是特異性地針對一種或其中的另一種。一些加強一種應答而抑制另一種應答。因此佐劑的選擇依賴于所需的免疫應答。
組合物可以包括免疫調節物，如促進或抑制細胞或體液免疫應答的細胞因子，或抗這些細胞因子的抑制抗體。
根據本發明的藥物組合物可進一步包含至少一種癌癥化學治療的化合物，如選自抗代謝物、博來霉素肽抗生素、鬼臼素生物堿、長春花生物堿、烷化劑、抗生素、順一鉑、或亞硝基脲的一種。根據本發明的藥物組合物可進一步或附加地包含至少一種病毒化學治療的化合物，其選自γ-球蛋白、金剛胺、胍、羥基苯并咪唑、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、縮氨基硫脲(thiosemicarbarzones)、甲紅硫脲、利福平、ribvirin、嘧啶類似物、嘌呤類似物、磷卡奈、膦乙酸、羥乙氧鳥嘌呤、二脫氧核苷，或甘環核苷。參見，例如，Katzung，上文，和其中引用的參考文獻第798-800頁和680-681頁，這些參考文獻全文結合于此作為參考。
抗寄生蟲的試劑包括適于抗節肢動物、寄生蟲(包括蛔蟲、蟯蟲、線蟲、鉤蟲、絳蟲、鞭蟲和血吸蟲)和原生動物(包括變形蟲、瘧疾蟲、弓蛔蟲(toxoplasmoid)和毛滴蟲生物)的試劑。例子包括噻苯咪唑(thiabenazole)、各種除蟲菊酯、吡喹酮、貝螺殺、甲苯咪唑、鹽酸氯喹、咪唑尼達、雙碘方、達拉匹林，鹽酸甲氟喹和羥氯喹。
藥物用途本發明的目的是保護受試者抵抗疾病。此處所用的術語“保護”，即“保護免受染或疾病”，包含“預防”、“抑制”或“治療”。“預防”涉及透發疾病之前給藥藥物組合物。“抑制”涉及在疾病出現臨床癥狀之前給藥組合物。“治療”涉及在疾病出現后給藥保護性組合物。治療可以是改善性或治愈性治療。
可以理解，在人類和獸醫醫學中，由于最終誘導事件或一些事件可能是未知的、潛在的、或患者直到事件或一些事件發生后才確診的，所以通常不可能區分“預防”和“抑制”。因此，通常使用區別于“治療”的術語“防護”來同時包含“預防”和“抑制”。此處所用的術語“保護”意圖包括“防護”。參見如Berker，上文，Goodman，上文，Avery，上文和Katzung，上文，它們全文結合于此作為參考，包括其中引用的全部參考文獻。
所提供的“保護”不必是絕對的，即疾病不必完全被預防或消除，而是假設相對于對照群體有統計學意義上的顯著改善(p＝0.05)。保護可以限定為減輕疾病癥狀發作的嚴重性或速度。如果其他試劑對特定的個體無效，如果它可與其他試劑聯合使用以加強保護水平，或如果它比競爭性試劑更安全，那么比競爭性試劑提供的保護程度弱的試劑仍然是有價值的。
治療效果可通過與未治療對照組比較治療后疾病的持續時間，嚴重程度等來確定，優選地，與疾病階段相匹配。
防護效果通常通過比較治療組的發病率和對照組的發病率來確定，其中治療組和對照組被認為具有同等的風險，或已對風險的預期差異進行了校正。
一般來說，防護提供給那些由于家族史、個人以前病史或增加暴露于病原體中而處于較高發病危險的人。
給藥至少本發明的一種保護試劑可通過用前述的藥物組合物實現意圖目的的任何方式給藥。
給藥方式可以是口服或腸胃外給藥，如果是腸胃外給藥，則可以是局部或全身的方式。例如，這種組合物的給藥可通過多種腸胃外途徑，如皮下、靜脈內、皮內、肌肉、腹膜內、鼻內、透皮或口腔途徑。腸胃外給藥可以是快速濃注(bolus injection)或隨時間逐步灌注的方式。使用本發明的藥物組合物的優選方式是皮下、肌肉或靜脈內施用。參見，例如，Berker，上文，Goodman，上文，Avery，上文和Katzung，上文，它們全文結合于此作為參考，包括其中引用的參考文獻。
預防、抑制或治療通過活性特異免疫治療引起的免疫應答可減輕的疾病或病癥的典型療法包含在等于和包括1周-約24個月的一段時間，給藥有效劑量的前述藥物組合物，作為單一治療給藥，或作為增強或加強劑量重復給藥。
可以理解，有效劑量依賴于受者的年齡、性別、健康狀況和體重，若有的話，協同治療的種類、治療頻率和所需效果本身。下面提供的有效劑量范圍并不意圖限制本發明和代表優選的劑量范圍。然而，最優選的劑量將適合于個體受試者，如本領域的技術人員所理解和可確定的，在無不適當試驗情況下進行檢測。典型地涉及對標準劑量進行調整，例如，如果患者體重較輕則需降低劑量。參見，例如，Berkow等編輯，TheMerck Manual，第15版，Merck和Co.，Rahway，N.J.，1987；Goodman等編輯，Goodman和Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第8版，Pergamon Press，Inc.，Elmsford，N.Y.，(1990)；Avery’s Drug TreatmentPrinciples and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics，第3版，ADIS Press，LTD.，Williams和Wilkins，Baltimore，MD.(1987)，Ebadi，Pharmacology，Little，Brown和Co.，Boston，(1985)；Chabner等，上文；DeVita等，上文；Salmon，上文；Schroeder等，上文；Sartorelli等，上文和Katsung，上文，其參考文獻和此處引用的參考文獻全文結合于此作為參考。
在應用于人之前，首先要在實驗動物上評估藥物的安全性和有效性。在人的臨床研究中，基于所述藥物的臨床前數據及類似藥物(若有的話)的通常劑量，開始時要使用預期對人是安全的劑量。如果該劑量有效，如有需要，則可降低劑量以確定最小有效劑量。如果該劑量無效，則慎重地增加劑量，同時監測病人的副反應征兆。參見，例如，Berkow等編輯，The Merck Manual，第15版，Merck和Co.，Rahway，N.J.，1987；Goodman等編輯，Goodman和Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第8版，Pergamon Press，Inc.，Elmsford，N.Y.，(1990)；Avery’s DrugTreatmentPrinciples and Practice of Clinical Pharmacolooy and Therapeutics，第3版，ADIS Press，LTD.，Williams和Wilkins，Baltimore，MD.(1987)，Ebadi，Pharmacology，Little，Brown和Co.，Boston，(1985)，其參考文獻和此處引用的參考文獻全文結合于此作為參考。
根據可以預定或特定的免疫程序表，每個治療所需的總劑量可以進行多劑量(其可以相同或不同)或單一劑量給藥。選擇的程序表是使免疫有效的，即，足以引發針對抗原的有效免疫應答，從而可能與其他試劑聯合使用以提供保護。將適于達到這種效果的劑量定義為“治療有效劑量”(注意，即使單獨劑量如果單獨給藥無效，程序表可以是免疫有效的，最好在免疫進程的上下文中對“治療有效劑量”的含義進行解釋)。該應用的有效劑量將依賴于，例如，肽組合物、給藥方式、被治療疾病的階段和嚴重性、患者的體重和一般健康狀況及處方醫生的判斷。
典型地，對一個70公斤的成年人來說，藥物的活性成分的日劑量是10ng到10g。對于免疫原來說，對這樣一個病人的更典型的劑量是10ng-10mg，更可能為1μg-10mg。然而，本發明不限定這些劑量范圍。
必須緊記本發明的組合物可通常用于嚴重的疾病狀態，即，危及生命或潛在地危及生命的情況。在這種情況下，考慮到對外來物質最小量和肽的相對無毒性質，治療醫生給藥實質上過量的這些肽組合物是可能的而且是感覺是理想的。
可在任何有效的時間間隔進行給藥。如果時間間隔太短，可能發生免疫麻痹或其他不利反應。如果時間間隔太長，免疫性可能受到損害。如果單獨劑量較大，則最適時間間隔可以較長。典型的時間間隔是1周、2周、4周(或1個月)、6周、8周(或2個月)和1年。考慮到患者的免疫能力(如對相關抗原的抗體水平)，在連續基礎上再評估給藥附加劑量和增加或縮短時間間隔的適合程度。
有多種方法可以制備脂質體，例如在Szoka等，Ann.Rev.Biophvs，Bioeng.9467(1980)，美國專利號4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019369中的描述，它們結合于此作為參考。
合適的劑型依賴于疾病、免疫原和給藥方式；可能包括片劑、膠囊、錠劑、牙膏(dental pastes)、栓劑、吸入劑、溶液、膏劑和parenteral depot。參見，例如，Berker，上文，Goodman，上文，Avery，上文和Ebadi，上文，通過全文結合于此作為參考，包括所有其中引用的參考文獻。
抗原可以以一種增強方式被輸送，例如，將抗原物質遞送到細胞內間隔區以產生抗原提呈的“內源途徑”。例如，抗原可以包裹在脂質體中(該脂質體可與細胞融合)，或整合到病毒載體(其感染細胞)的衣殼蛋白中。
當抗原是多肽時，可應用的另一種方式是將編碼該抗原的裸露DNA肌肉注射到宿主中。該編碼DNA被內源化并被表達。
也可能用本發明的藥物組合物預先制備自體PBLs，并確定該PBLs已表現出所需的應答反應，然后對受試者給藥PBLs或其子集(subset)。
方法結合物的合成STn-KLH合成的一般過程描述STn-KLH的制備需要兩個化學過程，STn-巴豆基的臭氧化作用以產生STn醛，和隨后的STn-醛與KLH的結合。
這些過程必須進行控制以確保產物形成和充分除去反應副產物。臭氧化作用STn-巴豆基(crotyl)(6-O-α唾液酸，N-乙酰基αD-氨基半乳糖基-1-O-2-丁烯)以粉末狀獲自Raylo Chemicals Inc.，Edmonton，Alberta。STn-巴豆基溶解到水中，然后暴露到臭氧中以氧化碳-碳雙鍵，形成臭氧化物結構。然后向溶液中通入氮氣以除去過量的臭氧。通過加入甲硫醚(DMS)來除去殘余的臭氧/氧氣，并還原臭氧化物鍵以形成STn-醛(STN-CHO)。等摩爾量產生的副產物乙醛最初用二乙醚萃取去除。目前主要在乙酸乙酯中萃取來去除，殘余的乙醛和乙酸乙酯的水平通過旋轉蒸發進一步降低。將最終的STn-醛溶液進行過濾，并貯存在-20℃直至需要所用。
STn-醛與KLH的連接將STn-醛和KLH一起在磷酸鹽緩沖液中溫育。STn通過在STn-CHO的醛部分與KLH上的賴氨酸殘基的末端氨基之間進行縮和反應而連接到KLH上。形成的席夫堿中間體通過氰基硼氫鈉還原，從而在STn和KLH之間提供穩定的連接。通過透濾法除去殘余的氰基硼氫鈉和反應副產物STn-醇，以及臭氧化作用后存在的二甲亞砜和任何乙酰乙酯。產物的蛋白濃度通過稀釋進行調節，通過過濾進行滅菌，并貯存在2-8℃。
階段I/II過程的實施例稱量250mg氰基硼氫鈉，溶解在7.8mL PBS中，過濾除菌，得到儲液(40mg/mL)。稱量出含有125mg的KLH溶液(14.1mL濃度為8.85mg/mL的溶液)的等分試樣。將含有150mg半抗原的STn-醛溶液的等分試樣加入到KLH溶液中，在21+/-3℃下混合2.5+/-0.5分鐘(STn/KLH重量比為1.2∶1)。然后將含有125mg氰基硼氫鈉的儲液的等分試樣加到KLH和STn醛混合物中，將反應混合物在21+/-3℃下溫育18+/-0.5小時，并進行溫和搖動。反應副產物用具有YM30膜的Amicon超濾單元通過透濾法除去。產物通過Millipore Millex-GV 0.22微米濾器進行過濾滅菌。
導致產物的NANA含量％增加的過程改變STn/KLH比例增加到3∶1(w/w)，并用0.05M磷酸鉀緩沖液，pH7.5代替PBS。反應溫度增加到39+/-2℃，在3.5小時中每隔15分鐘加入14份等分試樣的氰基硼氫鈉溶液，至終濃度為125mM。溫育時間是21+/-3小時，然后通過透濾法除去反應副產物。
最終的過程改變來制備臨床產物STn/KLH比例降低為2.25∶1(w/w)，氰基硼氫鈉濃度降低為60mM。
對于商品化結合物的過程改變反應參數總結于表1中。
動物效力測定免疫對第一組實驗(結果見表3和4)，將結合了ENHANZYNTM佐劑注射乳劑(Corixa)的0.25μg的劑量每批檢測物質注射每組9或10只小鼠(8-12周齡，雌性，CaF1)。第14天進行第二次注射，第26天收集血清。
對第二組實驗(結果見表5)，每批檢測物質以3水平劑量方案注射到45只小鼠(8-12周齡，雌性，CaF1)中。三個劑量(0.25μg、0.05μg和0.01μg)的檢測物質與ENHANZYNTM佐劑注射乳劑(Corixa)混合，每個劑量注射一組15只小鼠，同時另一組小鼠用相同的3個劑量的STn-KLH疫苗進行免疫，作為內參照(批次STNK 0055)。第14天進行第二次注射，第26天收集血清。
對第三組實驗(結果見表6)，注射方案與第二組相同，除了1)適當選擇檢測批次的劑量(在0.0125μg-1.6μg之間)，以使至少兩個劑量得到的滴度在由參照批次所確定的標準曲線的工作范圍內。
檢測方案對STn應答的特異IgG抗體通過在包被有綿羊下顎粘蛋白(OSM)的平板上進行動力學ELISA來測定。免疫小鼠的血清進行3倍系列稀釋(1/300-1/656,100)，然后加入到OSM包被的孔中，室溫反應1小時。通過洗滌步驟除去未結合的一級抗體后，加入過氧化物酶標記的二級抗體，然后加入顯色底物ABTS。每個稀釋度的Vmax值用帶有SOFTmaxPro軟件的分子設備THERMOmaxTM微孔讀數儀在典型的10分鐘動力學讀取中獲得。雖然在這些研究中進行的是3倍稀釋，但為了可直接與已有的用2倍稀釋得到的動物效力和人免疫應答數據相比較，稀釋數值表示為log2滴度。
每只小鼠的滴定終點根據連續Vmax值的數值差(ΔVmax)通過數學運算而獲得。通過分析已有數據和當前數據，確定了統計上可區分于干擾的ΔVmax值，并如下定義確定終點的工作標準終點滴度是log2滴度，它相應于最后一滴的Vmax值超過6mOD/min，而沒有落下的前一滴的Vmax值低于6mOD/min。
數據分析對第一組實驗，結果表示為各組小鼠抗體應答的平均滴度(表3)。統計學意義的分析見表4。對第二組實驗，相對效力如表5所示進行計算。對第三組實驗，相對效力如表6所示進行計算。
分析方法NANA含量測定連接到KLH上的唾液酸-Tn的量確定為酸解后從結合物釋放的NANA的量。NANA含量通過HPLC在Dionex CarboPac PAl陰離子交換柱上用脈沖電流檢測(AE-HPLC-PAD)定量確定。通過NANA標準濃度對峰面積作圖得到標準曲線，檢測樣品的NANA濃度從標準曲線中獲得。
蛋白濃度的測定通過在280nm的吸收測定蛋白濃度。KLH和STn-KLH的消光系數(1mg/mL)在50mM磷酸鉀緩沖液中測定為A280＝1.37。
分子大小的測定分子大小用1000埃TSKG5000PWXL尺寸排阻柱，以50mM磷酸鉀pH7.5為流動相，在0.5mL/分鐘的流速下進行測定。柱子連接到由三個檢測器UV吸收、折射率(RI)和激光散射(LLS)，監測的Waters 2690Alliance HPLC系統上。精密檢測器激光散射平臺安裝在Waters 2410折射率檢測器的溫控室內部。在分子大小檢測中，聯合使用了差異折射率測定和靜態光散射測定法。在數據獲取和分析中使用了精密度獲得32(PrecisionAcquire32)和精密度分析。
結果和討論發現影響取代水平的反應參數是乙醛的完全去除、半抗原/KLH比例、氰基硼氫化物濃度、反應時間和反應溫度。當反應溫度為39℃而不是室溫時，發生亞單位的交聯。在室溫下反應速率較慢，但通過適當調整反應時間可獲得高的NANA含量。
3個劑量水平檢測的樣品的反應條件、分子大小、NANA含量和相對效力顯示在表5中。結果表明，NANA含量高于5％和三聚體的聚集狀態(可能二聚體是足夠的)合意地達到高的效力。更高的聚集狀態至大約20聚體似乎沒有提供任何優勢。
批次PD020105-08首先作為疫苗安慰劑，也就是說，在沒有任何半抗原存在下，它經歷與疫苗相同的連接過程并變成聚合狀態(在2,0000kD的范圍)。隨后在23℃與半抗原再次經過該過程以產生6.8％NANA。通常在23℃的反應條件下不會導致聚集，但在這種情況下，確實發生進一步的聚合，并通過尺寸排阻色譜獲得了復雜的分子大小模式。該樣品的效力與其他“良好的”批次相當。
分子篩洗脫圖譜和跨越(across)峰的水力半徑計算的實施例顯示在圖1-9中。在圖5中，批次040400-RT和260100RT的圖譜重疊放置以進行詳細比較。這2個批次在所有分析檢測中幾乎完全相同，但效力表現出一定的差異。注意，水力半徑(大小的量度標準)跨越峰而改變，因此聚集和非聚集的樣品大小并不重疊。加權平均MW并不能判別大小的范圍，但可通過重新計算峰的“部分(slice)”來獲得。
在最初研究中通過1水平劑量檢測的樣品的分子大小、NANA含量和相對效力顯示在表3中。一些樣品在兩種研究中均進行了檢測。表5和6包括表3中未報道的樣品特性。
表2所報道的樣品的數據分析顯示在表3、4、5和6中。用含有約7％NANA的亞單位或聚集的疫苗免疫小鼠后，對OSM上的抗半抗原抗體滴度的比較結果顯示在表3中。制備了每種類型的3個批次。數據經過整合后進行統計分析。含有約3％NANA的疫苗批次的類似的比較結果顯示在表3中。
抗OSM滴度差異的統計意義顯示在表14中。具有3％NANA的STn-KLH聚集沒有顯著效果。同樣，增加NANA含量至7％而沒有聚集也沒有顯著效力。當％NANA增加且產物聚集時，效力的提高很顯著，與其他組比較，P值＜.0001。
參數的范圍和注釋(a)乙醛除去至＜1％(mol/mol；acet-CHO/STn-CHO)的規格。這通過RP-HPLC限制試驗來確定。未加工的反應產物有50％mol/mol。殘余乙醛的數量效應是，對每摩爾acet-CHO/STnCHO而言，大約降低0.3％的NANA含量。此處所檢測的所有樣品都符合乙醛去除的規格。
(b)半抗原/KLH的比例是重量/重量。
(c)氰基硼氫化物的濃度是毫摩爾級的。所測值的范圍是20到200mM。
(d)溫度主要影響大小和反應速度。增加溫度不一定增加最終的％NANA。在39℃超過3％NANA的最短反應時間大約是6小時。在39℃，反應時間超過48小時產生更高的聚集。
(e)我們估計在24小時內達到聚集需要溫度＞30℃。我們在43℃進行反應沒有任何問題，但更高的溫度則使產物難以加工(可能因為聚合體太大，不容易處理)。
％NANA含量是100*(作為自由糖的唾液酸除以由280nm的光吸收確定的蛋白含量)。它是重量/重量計算。
表2.用于動物效力實驗的STn-KLH批次的反應條件和物理性質LoID溫度 時間 S.W.R， NaCNBH3 MW R.R.T， NANA，t# ℃小時 STn/KL ， ， Shode ％C H mM kDax1 STNK005539233.0 125 1200 0.977.82 STNK005839212.25125 1500 0.968.13 270100-39 3918.5 2.2560 1300 0.936.74 050400-39 39202.2560 2100 0.938.25 029910-03 39212.2560 1500 0.957.96 BH01003 39212.2560 1900 0.947.47 020105-08 39210.0 60*7 23483.0 60 9500 --- 6.8*8 020202-09-3 39201.3 50 2100 --- 6.39 020202-09-2 39201.1 50 2100 --- 5.810 011299-03 39200.8 50 2500 0.925.111 020202-09-1 39200.8 50 2500 --- 4.812 201299-01 3918.5 0.3 80 4000 0.923.013 260100-RT 23482.2560 5000.987.214 040400-RT 23482.2560 4600.997.015 SR1328-36 23482.2560 5000.997.416 211299-01 236 1 35 5901.003.2*安慰劑疫苗通過在無半抗原存在時，將KLH在39℃進行反應，然后在有半抗原時在23℃重新進行反應而制備。
MW和Shodex二者在任何可獲得的時間均進行報告。Shodex工作范圍很窄，但該點是“亞單位”MW通常相應于0.98-1.00的Shodex值。在這方面，請注意在表1中，0.98的Shodex值僅在反應時間(21小時)和溫度(39℃)分別從特定的條件下降低到17小時和35℃時才發生。所有其他反應條件導致0.97或更小的Shodex值，并且被認為是代表聚集的產物。運行#8(表1中第一項，Shodex值為0.98)估計含有約25％聚集的物質(通過TSK色譜/激光散射測定)。
表3.通過平均log2抗體滴度測定疫苗效力。檢測了6個具有高NANA的批次(3個為聚集的，3個為亞單位)，一組測定2次，共使用79只小鼠。檢測了2個具有低NANA的批次(1個為聚合的，1個為亞單位)，共使用18只小鼠。
組別類型批次號MW，kDaNANA，％平均log2滴度高NANA2 1500 8.1 15.13 1300 6.7 15.9，16.2聚集的4 2100 8.2 15.6組平均 15.6高NANA135007.2 11.9，13.3亞單位 144607.0 12.4155007.4 13.1組平均 12.4低NANA 124000 3.0 9.4聚集的低NANA 165903.2 10.9亞單位表4.組間log2抗體滴度差異的統計意義組1 組2 p值高NANA，聚集的高NANA，亞單位＜0.0001高NANA，聚集的低NANA，聚集的＜0.0001高NANA，聚集的低NANA，聚集的＜0.0001高NANA，亞單位低NANA，亞單位0.35高NANA，亞單位低NANA，聚集的0.05低NANA，聚集的低NANA，亞單位0.88
表5.通過在3個劑量水平測定疫苗效力并評估適于劑量—應答曲線的平行線的取代。對于批次1，計算基于來自3個獨立實驗的3個劑量上log2滴度的等級來計算等級相對藥力。將同時適合所有點的最好的用于定義參照劑量—應答曲線(相對效力為1.00)。對檢測批次在3個劑量上計算等級相對效力，并將從參照的劑量—應答曲線取代平行合適的劑量—應答曲線用于計算相對效力(實驗/參照)。
批次# MW，kDa NANA，％相對效力 p-值1(Ref.，3運行) 12007.8 1.00 515007.9 0.70 0.326 19007.4 1.55 0.237 95006.8 1.22 0.5810 25005.1 0.15 ＜0.000112 40003.0 0.07 ＜0.000113 500 7.2 0.33 0.002414 460 7.0 0.18 ＜0.000116 590 3.2 0.04 ＜0.0001表6通過在中值滴度(median titer)的5點參照劑量—應答曲線上內插(interpolation)測定疫苗效力。檢測批次以多劑量進行給藥，以使至少2個中值log2滴度落在標準曲線的工作范圍內。相對效力表示為從標準曲線獲得的平均值除以由蛋白含量確定的疫苗濃度。
批次號MW，kDa NANA，％相對效力6(參照) 19007.4 1.00215008.1 0.94112007.8 0.89795006.8 1.09821006.3 1.45921005.8 0.5710 25005.1 0.1511 25004.8 0.1712 40003.0 0.0613 500 7.2 0.4114 460 7.0 0.0615 500 7.4 0.3216 590 3.2 0.01
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權利要求
1.一種非天然存在的免疫原性結合物，其包含多個可以相同或不同的糖半抗原部分和多個包含賴氨酸的免疫原性蛋白載體部分的單體單元，所述半抗原部分直接或間接附著到所述載體部分的單體單元的賴氨酸上。
2.權力要求1的結合物，其中所述載體部分是匙孔血藍蛋白。
3.權力要求1或2的結合物，其具有大于800kD的表觀分子量。
4.權力要求1或2的結合物，其具有大于1,200kD的表觀分子量。
5.權力要求1或2的結合物，其具有大于1,600kD的表觀分子量。
6.權力要求1或2的結合物，其具有至少1,000kD的表觀分子量。
7.權力要求1或2的結合物，其具有至少1,500kD的表觀分子量。
8.權力要求1或2的結合物，其具有至少2,000kD的表觀分子量。
9.權力要求1-8任一項的結合物，其具有不超過5,000kD的表觀分子量。
10.權力要求1-8任一項的結合物，其具有不超過2,500kD的表觀分子量。
11.權力要求1-10任一項的結合物，其免疫效力至少參照結合物的200％，所述參照結合物由所述半抗原部分和所述載體部分的單一單體單元所組成，并具有相同的預期的每個載體的單體單元上的半抗原部分數目。
12.權力要求1-12的結合物，其中每個載體的單體單元的預期的半抗原部分的數目至少為10。
13.權力要求1-12的結合物，其中一個或多個所述糖半抗原部分提供唾液酸Tn表位。
14.權力要求13的結合物，其中所述NANA含量超過3％，以唾液酸作為所述結合物的所述蛋白含量的百分比的量來測定(重量/重量)。
15.權力要求13的結合物，其中所述NANA含量至少為4％。
16.權力要求13的結合物，其中所述NANA含量至少為5％。
17.權力要求13的結合物，其中所述NANA含量至少為6％。
18.權力要求13的結合物，其中所述NANA含量至少為7％。
19.權力要求1-18的結合物，其中每個糖半抗原部分通過一個連接物附著到所述載體部分的單體單元上。
20.權力要求19的結合物，其中所述連接物是由不多于12個不同于氫的原子組成的脂肪族基團。
21.權力要求20的結合物，其中所述連接物是烷基基團。
22.權力要求19-21的結合物，其中所述連接物將所述半抗原部分的氧連接到氨基氮上。
23.權力要求19-22的結合物，其中連接物將單一的半抗原部分連接到所述單體單元的單一附著位點上。
24.權力要求19-22的結合物，其中連接物將多個半抗原部分連接到所述單體單元的單一附著位點上。
25.權力要求1-24任一項的結合物，其中至少一個所述糖半抗原部分與KLH不天然相關。
26.一種包含權力要求1-25任一項的結合物分子的組合物，其中所述結合物分子在所述包含所述糖半抗原部分的組合物中是所有結合物分子的至少50％重量。
27.一種包含權力要求1-25任一項的結合物分子的組合物，其中所述結合物分子在所述包含所述糖半抗原部分的組合物中是所有結合物的至少75％重量。
28.一種包含權力要求1-25任一項的結合物分子的組合物，其中所述結合物分子在所述包含所述糖半抗原部分的組合物中是所有結合物分子的至少90％重量。
29.一種包含權力要求1-25任一項的結合物分子的組合物，其中所述結合物分子在所述包含所述糖半抗原部分的組合物中是所有結合物分子的至少95％重量。
30.一種制備權力要求1-25任一項的結合物的方法，其包含一個結合步驟，所述結合步驟包含將一個或多個試劑與所述單體單元，或與預聚集的包含多個所述單元的載體部分反應，以獲得所述結合物，所述試劑每個包含至少一個所述糖半抗原部分。
31.權力要求30的方法，其中所述試劑是所述糖半抗原的醛衍生物。
32.權力要求31的方法，其中所述醛衍生物通過提供所述半抗原的巴豆基衍生物，臭氧化該巴豆基衍生物以獲得臭氧化物，并還原該臭氧化物以形成所述醛衍生物來獲得。
33.權力要求32的方法，其中乙醛作為產生所述半抗原醛的副產物而被提供。
34.權力要求30-33的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應溫度是39℃-45℃，和反應時間是17小時-25小時。
35.權力要求30-33的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應溫度高于26℃。
36.權力要求30-33的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應溫度至少為30℃。
37.權力要求30-33的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應溫度至少為35℃。
38.權力要求30-33的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應溫度至少為39℃。
39.權力要求30-38的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應溫度不高于45℃。
40.權力要求30-38的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應溫度不高于43℃。
41.權力要求30-40的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應時間多于6小時。
42.權力要求30-40的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應時間至少為12小時。
43.權力要求30-40的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應時間至少為17小時。
44.權力要求30-43的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應時間不超過40小時。
45.權力要求30-43的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應時間不超過30小時。
46.權力要求30-43的方法，其中在所述連接步驟中，所述反應時間不超過25小時。
47.權力要求30-43的方法，其中所述半抗原醛與所述載體單體的重量比例至少為0.6∶1。
48.權力要求30-43的方法，其中所述半抗原醛與所述載體單體的重量比例至少為1∶1。
49.權力要求30-43的方法，其中所述半抗原醛與所述載體單體的重量比例至少為1.5∶1。
50.權力要求30-43的方法，其中所述半抗原醛與所述載體單體的重量比例至少為1.75∶1。
51.權力要求30-43的方法，其中所述半抗原醛與所述載體單體的重量比例至少為2∶1。
52.權力要求30-51的方法，其中所述半抗原醛與所述載體單體的重量比例不高于4∶1。
53.權力要求30-51的方法，其中所述半抗原醛與所述載體單體的重量比例至少為3.25∶1。
54.權力要求30-51的方法，其中所述半抗原醛與所述載體單體的重量比例至少為2.75∶1。
55.權力要求30-51的方法，其中所述半抗原醛與所述載體單體的重量比例為約2.25∶1。
56.權力要求30-51的方法，其中所述結合步驟包含產生席夫堿中間體，和用還原劑還原所述中間體。
57.權力要求56的方法，其中所述還原劑是氰基硼氫鈉。
58.權力要求57的方法，其中所述還原劑以25-125mM的終濃度使用。
59.權力要求57的方法，其中所述還原劑以45-75mM的終濃度使用。
60.一種在受試者中引發糖半抗原特異免疫應答的方法，其包含對所述受試者給藥免疫有效量的權力要求1-25任一項的結合物或權力要求26-29任一項的組合物。
61.權力要求59的方法，其中引發體液免疫應答。
62.權力要求59的方法，其中引發細胞免疫應答。
63.權力要求59的方法，其中所述糖半抗原是腫瘤相關的。
64.權力要求60-63 58-61任一項的方法，其中所述的結合物或組合物對抗疾病是保護性的。
65.權力要求64的方法，其中所述疾病是癌癥。
66.權力要求1-25任一項的結合物或權力要求26-28任一項的組合物在制備使受試者免受疾病的組合物中的應用。
67.權力要求64的應用，其中所述疾病是癌癥。
68.權力要求1或2的結合物，其中所述結合物包含至少3個所述載體部分的單體單元。
69.權力要求1或2的結合物，其中所述結合物包含至少4個所述載體部分的單體單元。
70.權力要求26的組合物，其包含至少一個權力要求68的結合物。
71.權力要求26的組合物，其包含至少一個權力要求69的結合物。
72.權力要求1的結合物，其中所述載體部分的單體單元是血藍蛋白單體單元。
73.權力要求72的結合物，其中所述血藍蛋白是節肢動物的血藍蛋白。
74.權力要求72的結合物，其中所述血藍蛋白是軟體動物的血藍蛋白。
75.權力要求72的結合物，其中所述血藍蛋白是腹足動物的血藍蛋白。
76.權力要求72的結合物，其中所述血藍蛋白是Fissurellidae的血藍蛋白。
77.權力要求2的結合物，其中所述結合物的載體部分不是KLH單體單元的十聚體、雙十聚體或多十聚體。
78.權力要求2或77的結合物，其中所述結合物的載體部分不是KLH單體單元的二聚體。
79.權力要求2的結合物，其中所述結合物的載體部分是KLH單體單元的二聚體、三聚體、四聚體或五聚體。
80.權力要求1或2的結合物，其中至少一個糖半抗原部分包含TF二糖。
81.權力要求1或2的結合物，其中至少一個糖半抗原部分包含Tn。
82.權力要求1或2的結合物，其中至少一個糖半抗原部分是唾液酸化的糖。
全文摘要
提供一種多個糖半抗原和載體部分的單體單元的聚合體(多聚體)的結合物。該結合物可用于引發免疫應答。該結合物優選是糖取代的KLH單體的聚合體，特別是聚集的二聚體、三聚體或四聚體。聚集的STn－KLH結合物是特別令人感興趣的。
文檔編號A61K49/00GK1543350SQ02816071
公開日2004年11月3日 申請日期2002年8月5日 優先權日2001年8月14日
發明者馬克·J·克蘭茨, 邁克爾·B·朗格內克, 拉奧·R·科根泰, 希廷翁, B 朗格內克, R 科根泰, 馬克 J 克蘭茨 申請人:博奧米拉公司