作為佐劑的霍亂全毒素的突變體形式的制作方法

專利名稱：作為佐劑的霍亂全毒素的突變體形式的制作方法
與其它申請的相互參照本申請要求提交于2001年6月7日的美國臨時專利申請號60/296,537的優先權利益。
發明的背景身體免疫系統激活各種攻擊病原的機制(Janeway，Jr，CA.和Travers P.編，《免疫生物學》，“健康和疾病中的免疫系統”(The Immune System in Health and Disease)，第二版，Current Biology有限公司，倫敦，英國(1996))。然而，不是所有這些機制在免疫后必須激活。免疫誘導的保護性免疫取決于免疫原性組合物引起適當免疫應答的能力，免疫應答抵抗或去除病原。這取決于病原可能需要細胞-介導和/或體液免疫應答。
當許多抗原本身施用時免疫原性或非免疫原性差。對抗原的強適應免疫應答幾乎總是要求抗原和佐劑一起施用，佐劑是增強免疫應答的物質(Audbert，F.M和Lise，L.D.1993 Immunology Today，14281-284)。
相對于傳染性生物對有效免疫過程的需要特別強烈，傳染性生物引起急性感染或進入身體、腸胃、肺部、鼻咽或生殖泌尿的表面。這些區域浸沒在含免疫球蛋白的粘液中，免疫球蛋白主要由分泌型免疫球蛋白IgA組成(Hanson，L.A.，1961Intl.Arch.Allergy Appl.Immunol.，18，241-267；Tomasi，T.B.和Zigelbaum，S.，1963 J.Clin.Invest.42，1552-1560；Tomasi，T.B.等，1965 J.Exptl.Med.，121，101-124)。此免疫球蛋白來源于大量的IgA-產生漿細胞，該細胞滲透粘膜下的固有層區域(Brandtzaeg，P.和Baklein，K，1976 Scand，J.Gastroenterol.，11(Suppl.36)，1-45；Brandtzaeg，P.，1984“人鼻粘膜和扁桃體在健康和疾病中的免疫功能”(Immune Functions of Human NasalMucosa and Tonsils in Health and Disease)，28頁以及下列等，《肺和上呼吸道的免疫學》(Immunology of the Lung and Upper Respiratory Tract)，Bienenstock，J.編，McGraw-Hill，紐約，NY)。分泌型免疫球蛋白IgA通過分泌成分的作用特異運送至腔表面(Solari，R和Kraehenbuhl，J-P，1985 Immunol.Today，6，17-20)。
腸胃外免疫通常在誘導分泌型IgA應答中無效。分泌免疫最常通過直接免疫粘膜相關淋巴組織來獲得。它們在一個粘膜部位誘導后，IgA-產生漿細胞的前體溢出并散布到不同粘膜組織，在粘膜組織中最終分化成高速IgA合成(Crabbe，P.A.等，1969 J.Exptl.Med.，130，723-744；Bazin，H.等，1970 J.Immunol.105，1049-1051；Craig，S.W.和Cebra，J.J.，1971 J.Exptl.Med.，134，188-200)。大量研究證明粘膜免疫誘導此共同粘膜免疫系統的可行性(Mestecky，J.等，1978 J.Clin.Invest.，61，731-737)，但極少的例外，獲得有效免疫所需的大劑量抗原使此方法對于純化的抗原不實際。
研究克服此問題的策略是使用粘膜佐劑。一些增強抗原免疫應答的佐劑在現有技術中已知(Elson，C.O.和Ealding，W.，1984 J.Immunol.132，2736-2741)。這些佐劑與抗原混合時產生抗原顆粒，有助于在體內更長時間段維持抗原，從而促進巨噬細胞吸收增加并增強免疫應答。然而許多佐劑引起的不利反應或它們在誘導粘膜免疫中的無效使開發更好佐劑用于傳遞免疫原性組合物成為必要。遺憾的是，迄今佐劑開發主要是根據經驗的操作(小Janeway等，上面引用的12-25到12-35頁)。因此需要合理和更直接方法以開發有效佐劑用于傳遞抗原組合物。
已報導革蘭氏-陰性細菌霍亂弧菌(Vibrio cholerae)(V.cholerae)分泌的毒素是腸胃疾病霍亂的病因，它作為佐劑極有效。已報導霍亂毒素(CT)為382個氨基酸序列(SEQ ID NO1)(Mekalanos，J.J.等，1983 Nature，306，551-557)，有18個氨基酸信號(SEQID NO1的氨基酸1到18)。霍亂毒素全毒素分子是名為CT-A肽亞基(SEQ ID NO2或SEQ ID NO1的氨基酸19到258)組成的六異聚(hexaheteromeric)復合體，它產生毒素的酶活性，五個各名為CT-B(每個有21個氨基酸信號(SEQ ID NO1的氨基酸259到379)，接著是CT-B肽亞基(SEQ ID NO1的氨基酸280-382)的相同肽亞基參與毒素結合到腸上皮細胞以及表面含神經節苷脂GM1的其它細胞(Gill，D.M.，1976 Biochem.，15，1242-1248；Cuatrecasas，P.，1973 Biochem.，12，3558-566)。霍亂弧菌(CT)產生的CT在單個二硫鍵環內成熟CT-A(SEQ ID NO2)的氨基酸位置187和199的半胱氨酸之間有蛋白酶解切割的CT-A亞基以產生酶活性A1多肽(Kassis，S.等，1982 J.Biol.Chem.，257，12148-12152)和較小的多肽A2，A2連接片段A1到CT-B五聚體(Mekalanos，J.J.等，1979 J.Biol.Chem.，254，5855-5861)。當酶活性片段CT-A1產生的毒性進入腸細胞時，ADP核糖基化調節G蛋白(Gsα)。這引起腺苷酸環化酶的組成性活化，使cAMP的細胞內濃度增加，流體分泌且電解液進入小腸腔，從而引起毒性(Gill，D.M.和Meren，R.，1978 Proc.Natul.Acad.Sci.，USA，75，3050-3054)。在體外，CT的ADP-核糖基轉移酶活性被稱為ARFs的輔助蛋白的存在刺激，已知GTP-結合蛋白參與真核細胞內小泡運輸(Welsh，C.F.等，“ADP-核糖基化因子活化霍亂毒素并調節小泡運輸的鳥嘌呤核苷酸-結合蛋白家族”(ADP-Ribosylation FactorsA Family of Guanine Nucleotide-Binding Proteins that ActivateCholera Toxin and Regulate Vesicular Transport)，《天然毒素手冊疾病中的細菌毒素和毒性因子》第8卷(Handbook of Natural ToxinsBacterial Toxins and VirulenceFactors in Disease卷8)第257-280頁(Moss，J.等編，Marcel Dekker公司，紐約，NY(1995))。
已報導與不相關抗原共施用CT導致同時循環的誘導和粘膜抗體對該抗原的應答(Mekalanos，J.J.等，1983 Nature，306，551-557)。為使人中野生型CT引起的不良癥狀如腹瀉減少到最低程度，優選使用顯著降低毒性的CT全毒素形式作為佐劑。CT突變體建議作為獲得更有用佐劑的方式。合理設計顯著降低毒性的突變霍亂毒素全毒素(CT-CRMs)的一種方法是鑒定和改變毒素分子中的氨基酸殘基，它們在霍亂(CT)家族和相關大腸桿菌(E.Coli)的不耐熱腸毒素(LT-I、LT-IIa和LT-IIb)中完全保守。產生顯著降低毒性的突變型CT-CRMs的另一種合理方法是改變全毒素分子中的氨基酸殘基，它們被鑒定為對在CT骨架結構排列基礎上的NAD-結合與具有ADP-核糖基轉移酶活性如白喉毒素(DT)和百日咳毒素(PT)的相關毒素的骨架重要，(Holmes，R.K，“不耐熱腸毒素(大腸桿菌)”(Heat-labile enterotoxins(Escherichiacoli)，《蛋白毒素及其在細胞生物中使用的指南》(Guidebook to Protein Toxins andtheir Use in Cell Biology)，Montecucco，C.和Rappnoli，R.編，牛津大學出版社，牛津，英格蘭(1997)；Holmes，R.K.等，“革蘭氏陰性菌的霍亂毒素和相關腸毒素”，《天然毒素手冊疾病中的細菌毒素和毒性因子》第8卷，第225-256頁，Moss，J.等編，Marcel Dekker公司，紐約，NY 1995)。
最近，揭示了合理設計、遺傳-解毒的CT突變體，其中通過改變A亞基中29位上的氨基酸(名為CT-CRME29H)導入單個非保守氨基酸取代(谷氨酸到組氨酸)。所得突變體霍亂全毒素顯示顯著降低的酶毒性，但有較好的佐劑和免疫原性性質(國際專利出版號WO 00/18434，全部納入本文作為參考)。
因此，需要鑒定和/或合理設計顯著降低毒性的CT全毒素的另外突變體形式，但仍具有與所述野生型CT全毒素相同或增強的佐劑性。
發明概述一方面，本發明提供霍亂全毒素(CT-CRMs)的新突變體、免疫原性形式，與所述野生型CT相比，毒性顯著降低但保持它們作為免疫系統強有力刺激物的能力。具體的是，本發明涉及四種突變體霍亂全毒素(CT-CRMs)，最好是由定點誘變產生且與所述野生型CT相比，毒性顯著降低但沒有喪失佐劑性。
在一個實施方案中，本發明的新CT-CRM包括CT亞基A的氨基酸序列或其片段，其中A亞基的氨基酸16位上的氨基酸殘基由另一個氨基酸取代，取代導致毒性顯著降低。在本發明較佳實施方案中，A亞基的氨基酸16位上的氨基酸異亮氨酸由丙氨酸取代。為確定氨基酸位置，CT-A序列作為SEQ ID NO2中的例子。然而也可使用CT-a的其它變體和片段。
在另一個實施方案中，本發明的新CT-CRM包括CT亞基A的氨基酸序列或其片段，其中A亞基的氨基酸72位上的氨基酸殘基由另一個氨基酸取代，取代導致毒性顯著降低。在本發明較佳實施方案中，A亞基的氨基酸72位上的氨基酸纈氨酸由酪氨酸取代。
在又一個實施方案中，本發明的新免疫原性突變型CT-CRM顯著降低CT毒性并包括CT的亞基A的氨基酸序列或其片段，其中A亞基的氨基酸16位和68位上的氨基酸殘基都由與所述野生型CT的氨基酸16位和68位上存在的不同氨基酸取代，取代導致毒性顯著降低。在本發明較佳實施方案中，在A亞基的氨基酸16位上氨基酸丙氨酸取代異亮氨酸，在A亞基的氨基酸68位上氨基酸酪氨酸取代絲氨酸。
在另外一個實施方案中，本發明的新免疫原性突變型CT-CRM顯著降低CT毒性并包括CT的亞基A的氨基酸序列或其片段，其中A亞基的氨基酸68位和72位上的氨基酸殘基都由與所述野生型CT的氨基酸68位和72位上存在的不同氨基酸取代，取代導致毒性顯著降低。在本發明較佳實施方案中，在A亞基的氨基酸68位上氨基酸酪氨酸取代絲氨酸，在A亞基的氨基酸72位上氨基酸酪氨酸取代纈氨酸。
另一方面，發明提供了上述產生新CT-CRMs的方法，用常規技術定點突變編碼野生型CT中A亞基的DNA，這樣誘變的CT現在毒性顯著降低而沒有損害毒素刺激免疫應答的能力。
發明的又一方面中，提供的免疫原性組合物包括選擇的抗原、上述作為佐劑在脊椎動物宿主中增強對抗原免疫應答的突變型CT-CRM、藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體。優選的是，CT-CRM用于在脊椎動物宿主中產生或提高對選擇抗原的全身和/或粘膜抗原免疫應答。選擇抗原可以是來自致病病毒細菌、真菌或寄生蟲的多肽、肽或片段。選擇抗原可以是來自癌細胞或腫瘤細胞的多肽、肽或片段。選擇抗原可以是來自變應原的多肽、肽或片段以干擾IgE產生來緩和對變應原的變應性反應。選擇抗原可以是來自其分子部分的多肽、肽或片段，此部分代表宿主(自身分子)以不需要的方式、量或位置產生，如來自淀粉樣前體蛋白，從而防止或治療脊椎動物宿主中以淀粉樣沉積為特征的疾病。
另外一方面，本發明提供了使用這些CT-CRMs作為免疫原性組合物中佐劑的方法或提高含上述選擇抗原的抗原組合物引起脊椎動物宿主中免疫應答的能力的方法，這是通過包括有效佐劑量的一個或多個上述新的解毒突變型霍亂全毒素(CT-CRMs)。
發明的進一步方面中，提供了編碼上述顯著降低毒性的新免疫原性突變型CT-CRMs的DNA序列。優選的是，DNA序列編碼毒性降低的突變A亞基和亞基B。另外，DNA序列只可編碼毒性降低的突變體A亞基，其中突變型CT-A與其它結合域融合，或用LT-B共表達并可共裝配。
發明的又一方面中，提供了含分離和純化DNA序列的質粒，包括編碼本文所述免疫原性、解毒、突變型霍亂全毒素的DNA序列，其中這種DNA序列操作連接于指導宿主細胞中CT-CRM表達的調節序列。調節序列優選包括阿拉伯糖可誘導啟動子。在此方面的一個實施方案中，發明涉及名為pLP903的質粒，含分離和純化DNA序列，包括編碼顯著降低毒性的免疫原性突變型CT-CRM的DNA序列，其中在A亞基的氨基酸16位上氨基酸丙氨酸取代異亮氨酸。在此方面的第二個實施方案中，發明涉及名為pLP905的質粒，含分離和純化DNA序列，包括編碼顯著降低毒性的免疫原性突變型CT-CRM的DNA序列，其中在A亞基的氨基酸72位上氨基酸酪氨酸取代纈氨酸。在此方面的第三個實施方案中，發明涉及名為pLP904的質粒，含分離和純化DNA序列，包括編碼顯著降低毒性的免疫原性突變型CT-CRM的DNA序列，其中在A亞基的氨基酸16位上氨基酸丙氨酸取代異亮氨酸，且在氨基酸68位上氨基酸酪氨酸取代絲氨酸。在此方面的其它實施方案中，發明涉及名為pLP906的質粒，含分離和純化DNA序列，包括編碼顯著降低毒性的免疫原性突變型CT-CRM的DNA序列，其中在A亞基的氨基酸68位上氨基酸酪氨酸取代絲氨酸，在氨基酸72位上氨基酸酪氨酸取代纈氨酸。
發明的另一方面中，提供了合適的宿主細胞系，用本文所述質粒轉化、感染、轉導或轉染。免疫原性、解毒、突變型霍亂全毒素是通過用上述一個質粒轉化、感染、轉導或轉染合適的宿主細胞并在允許所述顯著降低毒性的重組免疫原性、突變體霍亂全毒素蛋白的宿主細胞表達的培養條件下培養宿主細胞產生的。
發明的這些和其它方面對于讀過下列發明詳細描述的本領域技術人員是顯而易見的。
發明詳述霍亂全毒素的突變體形式表現出毒性降低，但保持它們較多佐劑性和這些CTs的突變體形式作為本文所述免疫原性組合物中的佐劑使用。
A.突變體、解毒的霍亂毒素全毒素與野生型CT相比，本發明的新突變體、解毒免疫原形式的霍亂毒素全毒素(CT-CRMs)的特征為毒性顯著降低。然而這種CT-CRMs保持它們作為免疫系統強有力刺激物的能力。本發明的CT-CRMs特征為在霍亂毒素的CT-A亞基中一個或幾個氨基酸取代。本發明的多種突變型CT-A亞基也保持它們與CT-B亞基裝配形成突變型CT全毒素的能力，突變型CT全毒素在佐劑性上類似野生型CT，但與野生型CT相比毒性顯著降低。本發明的CT-CRMs可使用與所述野生型CT-B亞基相關的突變或改變的CT-A亞基以產生功能性的全毒素。另外，本發明的CT-CRMs可包括與改變或突變型CT-B亞基相關的改變或突變型CT-A亞基。
為確定描述本發明CT-CRMs中氨基酸取代位置的氨基酸位置號，成熟CT-A序列作為SEQ ID NO2的例子，即野生型CT序列SEQ ID NO1的氨基酸19-258。編碼霍亂全毒素A亞基的核苷酸序列列于國際專利出版號WO 93/13202。類似的，合適的成熟CT-B序列可由SEQ ID NO1的氨基酸280-382闡明。然而，霍亂弧菌CT-A和CT-B的其它變體、生物型和片段也可用作含本文所述氨基酸取代的序列。參見例如ELTOR生物型，C.Shi等，1993生物化學雜志，9(4)395-399；NCBI基因座數據庫號AAC34728和霍亂弧菌毒素變體的其它來源。
優選的是，本發明的CT-CRMs中的氨基酸取代來自用具類似結構和/或化學性質的其它氨基酸取代一個氨基酸，即保守氨基酸取代。“保守”氨基酸取代可在有關殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩性性質的相似性基礎上進行。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性/中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本發明由CT-CRMs作為例子，如表1總結，它們在氨基酸16位或氨基酸72位上有單個氨基酸取代或氨基酸16位和68位或68位和72位上有雙重氨基酸取代。
表1單個和雙重CT-CRM突變體
因此，在一個實施方案中，本發明的新CT-CRM包括CT亞基A的氨基酸序列或其片段，其中A亞基的氨基酸16位上的氨基酸殘基由另一個氨基酸取代，取代導致毒性顯著降低。在本發明的一個較佳實施方案中，A亞基的氨基酸16位上的氨基酸異亮氨酸由丙氨酸取代。此CT-CRMI16A顯示較好的佐劑性。
在另一個實施方案中，本發明的新CT-CRM包括CT亞基A的氨基酸序列或其片段，其中A亞基的氨基酸72位上的氨基酸殘基由另一個氨基酸取代，取代導致毒性顯著降低。在本發明的一個較佳實施方案中，A亞基的氨基酸72位上的氨基酸纈氨酸由酪氨酸取代，產生CT-CRMV72Y。此CT-CRMV72Y顯示較多的佐劑性。
在又一個實施方案中，本發明的新免疫原性突變型CT-CRM顯著降低CT毒性并包括CT亞基A的氨基酸序列或其片段，其中A亞基的氨基酸16位和68的氨基酸殘基都由與所述野生型CT的氨基酸16位和68位上存在的不同氨基酸取代，取代導致毒性顯著降低。在本發明的一個較佳實施方案中，A亞基的氨基酸16位上的氨基酸丙氨酸取代異亮氨酸，A亞基的氨基酸68位上的氨基酸酪氨酸取代絲氨酸，產生CT-CRMI16A，S68Y。此CT-CRMI16A，S68Y顯示較好的佐劑性。
在另外一個實施方案中，本發明的新免疫原性突變型CT-CRM顯著降低CT毒性并包括CT亞基A的氨基酸序列或其片段，其中A亞基的氨基酸68位和72位上的氨基酸殘基都由與所述野生型CT的氨基酸68位和72位上存在的不同氨基酸取代，取代導致毒性顯著降低。在本發明的一個較佳實施方案中，A亞基的氨基酸68位上的氨基酸酪氨酸取代絲氨酸，A亞基的氨基酸72位上的氨基酸酪氨酸取代纈氨酸。此CT-CRMS68Y，V72Y顯示較好的佐劑性。
評估表1中新CT-CRMs對CT結構和功能的表型效果。通過定點誘變CT-編碼基因產生的突變A亞基在亞基B存在時也能裝配到免疫反應性的全毒素中，這由非-變性凝膠電泳分析確定(參見表3，實施例2)。各突變全毒素也在Y-1腎上腺腫瘤細胞試驗中測試以確定其與野生型CT全毒素比較的剩余毒性(參見表4和5，實施例3)。表4所示結果證明突變型CT-CRMs與所述野生型霍亂全毒素相比毒性顯著降低。有單個和雙重氨基酸取代的CT-CRMs的剩余毒性與所述野生型CT相比顯著降低。
各突變型CT-CRMs也與ADP-核糖基轉移酶活性試驗中的野生型CT相比(參見實施例4)。結果一般與Y-1腎上腺細胞試驗中的毒性數據一致，表明多種CT-CRMs的ADP-核糖基轉移酶活性與所述野生型CT相比顯著減小(表6)。具有最大ADP-核糖基轉移酶活性的突變體似乎是雙重突變體CT-CRMI16A，S68Y。此活性僅約為野生型CT的3.3％。CT-CRMs、CT-CRMV72Y、CT-CRMI16A和CT-CRMS68Y，V72Y的酶活性分別為野生型CT活性的1.1％、2.4％和1.2％。
本發明的其它CT-CRMs可包含上述至少一個或雙重突變和除了一個或多個上列氨基酸殘基16、68或72位的位置上至少一個附加的突變。納入本文作為參考的國際專利出版號WO 93/13202描述一系列CT-A亞基的突變，突變用于減少霍亂全毒素的毒性。這些突變包括取代氨基酸7位的精氨酸、9位的天冬氨酸、11位的精氨酸、29位的谷氨酸、44位的組氨酸、53位的纈氨酸、54位的精氨酸、61位的絲氨酸、63位的絲氨酸、70位的組氨酸、97位的纈氨酸、104位的酪氨酸、106位的脯氨酸、107位的組氨酸、110位的谷氨酸、112位的谷氨酸、114位的絲氨酸、127位的色氨酸、146位的精氨酸和192位的精氨酸。納入本文作為參考的國際專利出版號WO 98/42375描述在A亞基的氨基酸109位上取代絲氨酸，用來減少霍亂全毒素的毒性。
用于本發明的其它有用的CT-CRM突變蛋白包括具有一個或多個上面提供的特異性突變的全長全毒素、多肽或其含上述誘變殘基的片段，蛋白、多肽或片段保持來源于野生型CT的佐劑活性，但有毒性降低的特征。
這些酶活性減少的CT-CRMs免疫活性片段也可用于在本發明的方法和組合物。片段通常包含至少約25個CT-CRM蛋白的毗連氨基酸，蛋白含上述誘變位點。更具代表性的CT-CRM片段包含至少約75個毗連氨基酸。其它CT-CRM片段含至少約100個毗連氨基酸。CT-CRM亞基A的另外實施方案包含至少約150個毗連氨基酸長度。
本文所述CT-CRMs片段如果產生或增強脊椎動物宿主中對選擇抗原的免疫應答，它在下述方法和組合物中有用。片段包括CT-CRMs的羧基末端區域截短。例如，截短為僅含CT-A突變亞基的CT-CRM是理想的片段。類似地，在約殘基240或250上截短的CT-A亞基是理想的片段。可選擇本發明的CT-CRMs的其它片段。CT-CRM全毒素的另外片段可包含少于五個CT-B亞基的重復或截短的CT-B亞基。前述片段也可包含一個或多個上述特異性突變。
其它合適的CT-CRM蛋白可包括一個或多個含取代基團的氨基酸殘基。另一合適的CT-CRM全毒素蛋白是其中CT-CRM多肽與其它化合物融合，如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)。又一合適的CT-CRM蛋白是其中其它氨基酸融合到多肽中，如前導序列或分泌序列或用來提高CT-CRM蛋白的免疫原性的序列。CT-CRMs的其它修飾包括缺失上述CT-A信號或CT的N末端的前導序列，即SEQID No1的氨基酸1-18，和/或在SEQ ID No.1氨基酸259-279上缺失CT-B信號或前導序列，和/或缺失其它不影響免疫原性的區域。類似地，修飾本文所述CT-CRMs包括用另外信號或前導序列取代信號或前導序列。參見如納入本文參考文獻的美國專利號5,780,601。
合適的CT-CRM蛋白的另一個例子是其中任選氨基酸(如-Gly-Ser-)或其它氨基酸或化學化合物間隔子可包括在多肽末端用于連接多種全毒素蛋白在一起或連接到載體。例如，有用的CT-CRMs可包括一個或多個上述偶聯到載體蛋白的CT-CRMs。另外，有用的CT-CRM可存在于含多種CT-CRMs的融合蛋白中，任選地偶聯到載體蛋白。
對于這些實施方案，載體蛋白理想是可提高選擇的CT-CRM免疫原性的蛋白或其它分子。這種載體可以是也有佐劑效果的較大分子。示范性常規蛋白載體包括但不限于，大腸桿菌DnaK蛋白、半乳糖激酶(GalK，催化細菌中半乳糖代謝的第一步)、泛素、α-交配因子、β-半乳糖苷酶和流感NS-1蛋白。類毒素(即編碼天然產生的毒素的序列，具有充分修飾以去除其毒性)也可用作載體，如白喉類毒素和破傷風類毒素、它們各自的毒素和這些蛋白的任何突變體形式如CRM197(白喉毒素的一種非毒性形式，參見美國專利號5,614,382)。其它載體包括銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A、大腸桿菌的不耐熱毒素和輪狀病毒顆粒(包括輪狀病毒和VP6顆粒)。另外，可使用載體蛋白或其它免疫原性蛋白的片段或抗原表位。例如，半抗原可偶聯到細菌毒素的T細胞抗原表位。參見美國專利號5,784,973。類似地可使用多種細菌熱激蛋白，如分枝桿菌hsp-70。谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)是另一種有用載體。本領域技術人員可選擇一種適當載體用于此方面。融合蛋白可通過標準技術形成用于偶聯蛋白質物質。融合可從融合基因構建物表達，構建物由下述重組DNA技術制備。
本文所述其它合適的CT-CRMs可不同于具體例示的CT-CRMs，這是通過不恢復酶毒性、不減少佐劑活性的修飾或這些特征的組合。例如可進行保守氨基酸變化，盡管它們改變CT-CRM蛋白的主要序列，但一般不改變其功能。在作出這些變化中，可考慮氨基酸的親水指標。親水氨基酸指標在賦予多肽相互作用生物功能中的重要性一般在本領域中了解(Kyte&Doolittle，1982 J.Mol.Biol.，157(1)105-132)。已知某些氨基酸可取代其它有類似親水指標或分數的氨基酸，并仍導致有相似生物活性的多肽。各氨基酸在其疏水性和電荷特性基礎上確定親水指標。那些指標是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
相信氨基酸殘基的相對親水特性確定所得多肽的二級和三級結構，從而明確多肽與其它分子的相互作用，如酶、底物、受體、抗體、抗原等。在本領域已知氨基酸可由另一個具類似親水指標的氨基酸取代且仍獲得功能相當的多肽。在這些電荷中，取代氨基酸的親水指標優選在+/-2內，尤其優選在+/-1內，更尤其優選在+/-0.5內。
取代相似氨基酸也可在親水性基礎上進行，具體是生物功能相當的多肽或因此產生的肽用于免疫學實施方案。納入本文作為參考的美國專利號4,554,101指明由相鄰氨基酸的親水性決定的多肽最大局部平均親水性與其免疫原性和抗原性相關，即與多肽生物性質相關。
如美國專利號4,554,101中詳述，下列親水性值分配給氨基酸殘基精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；蘇氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。據說氨基酸可取代具類似親水性值的另外氨基酸，且仍獲得生物學相當具體是免疫學相當多肽。在這些變化中，優選取代親水性值在±2內的氨基酸，尤其優選在+/-1內，更尤其優選在+/-0.5內。
如上概括，氨基酸取代一般以氨基酸側鏈取代的相對類似性為基礎，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。考慮各種前述特征的示范性取代對本領域技術人員熟知并包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；纈氨酸；亮氨酸和異亮氨酸。
此外，一般不改變CT-CRM蛋白主要序列的修飾包括多肽的體內或體外化學衍生化，如乙酰化、甲基化或羧化。同樣包括作為本發明的CT-CRMs是糖基化修飾的蛋白，如通過在合成和加工或進一步加工步驟中修飾多肽的糖基化模式制成；或通過使多肽暴露于影響糖基化的酶制成，如哺乳動物糖基化酶或去糖基化酶。也包括作為CT-CRMs的是上面鑒定有磷酸化氨基酸殘基的突誘變序列，如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸。
同樣包括作為本發明CT-CRMs的是用普通分子生物技術修飾的上述序列，以便改進它們耐分解蛋白的降解或最優化溶解性質。在這些CT-CRMs中包括那些含除了天然產生的L-氨基酸外的殘基，如D-氨基酸或非天然產生合成氨基酸。可存在于本發明CT-CRMs中的其它已知修飾沒有限制，是酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共價附著黃素、共價附著血紅素部分、共價附著核苷酸或核苷酸衍生物、共價附著脂質或脂質衍生物、共價附著磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)、交聯、環化、二硫鍵形成、去甲基化、形成共價交聯、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆寇酰化、氧化、蛋白水解加工、異戊二烯化、外消旋化、硒基化(senenoylation)、硫化、轉移-RNA介導的氨基酸加入蛋白質如精氨酰化和泛素化。
因此本發明突變型CT-CRMs是全毒素并表現出毒性降低或比野生型CT毒性顯著小。如本文所用，術語和短語“全毒素降低毒性”或“毒性顯著減小”或等等指本發明CT-CRM突變體與野生型CT相比顯示每單位純化的毒素蛋白較低毒性，如本文所述四種CT-CRM突變體(CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、CT-CRMI16A，S68Y和CT-CRMS68Y，V72Y)。此“降低的毒性”使各突變體能用作免疫原性組合物中的佐劑而不引起顯著副作用，特別是那些已知與CT相關的副作用如腹瀉。如下面更詳細描述，本發明突變型CT-CRMs在Y-1小鼠腎上腺細胞試驗中表現出顯著低于野生型CT的毒性水平，且與所述野生型CT比較ADP-核糖基轉移酶活性顯著降低。
根據本發明的免疫原性突變型CT-CRMs表現毒性降低和保持佐劑活性的平衡，這樣所得突變型CT蛋白在其導入的脊椎動物宿主中安全地耐受時作為佐劑發揮功能。如以下例子所示，鼠模型試驗系統中的結果表明本文所示突變型CT-CRMs能在鼻內施用不同抗原后顯著增強粘膜和全身免疫應答。此外，即使存在先存在的抗-CT免疫應答，突變體CT-CRMs能用作有效的粘膜佐劑。支持本發明CT-CRMs的這些特征的研究在下面總結，并在實施例中更具體說明。
為評估突變型CT-CRMs作為組合物粘膜佐劑的效率，組合物含包括在免疫原性組合物中鑒定作為候選物的細菌或病毒抗原，檢測了三種不同模型抗原系統(1)非典型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)(NTHi)的重組P4外膜蛋白(也稱為蛋白“e”(rP4))(參見美國專利號5,601,831)，(2)粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)的天然UspA2外膜蛋白(國際專利出版號WO 98/28333)，(3)呼吸道合胞病毒(RSV)的天然融合糖蛋白(F蛋白)(參見美國專利號5,223,254)。突變型CT-CRMs作為NTHirP4的佐劑與CT-CRME29H和野生型CT互相比較。在第一個研究中，評估突變型CT-CRMI16A提高全身和粘膜抗體對rP4誘導的佐劑活性能力，并與所述野生型CT和CT-CRME29H相比。結果表明CT-CRMI16A像野生型CT和CT-CRME29H，增加rP4蛋白引起全身和體液免疫應答的能力(參見表8和9)。例如第三次IN免疫后六周，用CT-CRMI16A或CT-CRME29H制成的rP4蛋白免疫小鼠的抗rP4 IgG抗體效價比單獨PBS中用重組蛋白免疫的小鼠大40倍。初次IN免疫六周后，施用重組蛋白加1μg濃度野生型CT全毒素的小鼠抗體效價(IgG)比單獨在鹽水中施用重組rP4的小鼠抗體效價提高67倍。用1μg突變體CT-CRME29H免疫小鼠的抗體效價比單獨用rP4免疫小鼠的抗體效價提高48倍。相比之下，用1μg和0.1μg突變體CT-CRMI16A免疫小鼠的抗體效價分別比鹽水中單獨用rP4免疫小鼠的抗rP4抗體效價增加15倍和27倍。
第三次免疫后兩周檢測粘膜分泌中蛋白-特異抗體進一步表明，CT-CRMI16A促進產生局部免疫應答抗rP4蛋白。此外，抗rP4抗體效價可與所述野生型CT佐劑免疫原性組合物誘導的相比(表9)。
為測試及比較含1μg重組rP4和1μg突變型CT-CRMs(CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y)的制劑和含1μg rP4和1μg CT-CRME29H或鹽水中單獨1μg rP4的制劑中突變型CT-CRMs的佐劑效果。多種組合物鼻內傳送給雌性BALB/c小鼠，并在3和5周以及第5周第六天測量抗rP4 IgG和IgA效價。數據表明CT-CRMs、CT-CRMI16A和CT-CRMV72Y在誘導全身以及粘膜抗rP4抗體反應中與CT-CRM一樣有效(表10和11)。含rP4和CT-CRMI16A制劑誘導的抗rP4抗體的血清IgG效價在第5周第六天比rP4單獨誘導大22倍，且是CT-CRME29H誘導IgG水平的一半。然而，含rP4和CT-CRMV72Y制劑誘導的抗rP4抗體的血清IgG效價比CT-CRME29H誘導大1.2倍，且比rP4單獨誘導大53倍。盡管CT-CRMI16A，S68Y和CT-CRMS68Y，V72Y誘導的rP4-特異IgG效價僅約為CT-CRMI16A和CT-CRMV72Y誘導的五分之一，這些水平仍顯著高于鹽水中單獨rP4誘導。
用CT-CRMs、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y免疫小鼠血清中的蛋白-特異IgA抗體效價比單獨用rP4免疫IN小鼠大6到23倍。
用CT-CRMs、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y免疫小鼠的支氣管肺泡洗液、鼻洗液、唾液和陰道洗液中的蛋白-特異IgA抗體效價可與用CT-CRME29H免疫小鼠的粘膜洗液收集中的IgA水平相比，但顯著大于單獨用rP4免疫的小鼠(見表11)。
在以上研究中，也評估了六組中各單獨小鼠血清中的抗rP4抗體效價。具體是，IN施用后41天，IgA和包括IgG亞類IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的IgG終點效價通過ELISA確定。結果表明，在接受含rP4和四種突變體CT-CRMs之一的制劑的各單獨小鼠中IgA和IgG亞類效價顯著高于僅接受鹽水中rP4抗原的動物中IgA和IgG效價(見表12-17)。結果進一步表明，在接受rP4和突變體CT-CRMs、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y和CT-CRMV72Y之一的動物中IgA和IgG效價可與接受rP4加上CT-CRME29H小鼠中檢測到的IgA和IgG效價相比。
本發明CT-CRMs增加全身和粘膜免疫應答抗呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白的能力用純化的天然融合(F)蛋白檢測。先前證明用CT或CT-CRME29H輔助的F蛋白免疫IN的BALB/c小鼠產生全身和局部IgG和IgA效價，(Tebbey等，上面引用)。此研究也表明前-存在抗CT抗體對局部或全身抗F蛋白IgA和IgG抗體的水平沒有副作用。確實，研究表明，先存在的抗CT抗體有益于產生增強的抗F蛋白抗體反應。另外，數據也顯示包括通過IN免疫操作應答中刺激的粘膜或體液免疫球蛋白，免疫操作含F/CT-CRME29H。在本研究中，鹽水或制劑中單獨的純化F蛋白(3μg/劑量)中和感染性病毒的機制IN施用給BALB/c小鼠，制劑含0.1或1μg野生型CT或者0.1或1μg突變體CT-CRMs(CT-CRME29H、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y)之一。確定小鼠的支氣管肺泡洗液、鼻洗液和陰道洗液中的蛋白-特異IgG和IgA抗體效價。用1μg CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y，V72Y免疫小鼠的支氣管肺泡洗液、鼻洗液和陰道洗液中的蛋白-特異IgG和IgA抗體效價可與用所述野生型CT或CT-CRME29H免疫小鼠的粘膜洗液收集中的IgG和IgA水平相比(見表19)。用0.1μg CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y，V72Y免疫小鼠中粘膜蛋白-特異IgG水平盡管顯著高于用鹽水中F蛋白免疫小鼠中檢測到的水平，仍比用1μg CT-CRMs免疫小鼠中檢測到的水平低三分之一到十分之一。相反，粘膜洗液中IgA水平顯著提高僅在用1μg突變型CT-CRMs免疫小鼠中觀察到。
檢測了突變型CT-CRMs增強小鼠中全身和粘膜免疫應答抗粘膜炎莫拉氏菌的天然UspA2外膜蛋白的能力。10μl鹽水或10μl制劑中單獨的純化UspA2(5μg/劑量)在0、7和14天施用IN，制劑含0.1μg/劑量的突變型CT-CRM(CT-CRME29H、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y，V72Y)。血清和粘膜灌洗中蛋白-特異IgG和IgA水平在第28天檢測。僅在用CT-CRME29H、CT-CRMI16A，S68Y和CT-CRMV72Y免疫動物血清中檢測到統計學顯著水平。還在用CT-CRME29H、CT-CRMI16A，S68Y和CT-CRMV72Y免疫動物的支氣管洗液中檢測到顯著水平的IgG。
B.編碼CT-CRMs的核酸分子本發明的另一個方面包括分離、合成或重組核酸分子以及編碼上述CT-CRMs的序列，CT-CRMs具有指定的定點突變或可進一步含一個或多個那些突變的片段。
一種包括編碼CT-CRM的蛋白核酸序列的分離核苷酸分子可優選在調節序列的控制下，調節序列指導宿主細胞中CT-CRM的表達。如本文所述，這種核酸分子可用來體外表達CT-CRM蛋白或允許在人中體內表達CT-CRM蛋白。
如本文所用，術語“分離的核苷酸分子或序列”指沒有其它生物成分污染的核酸部分或片段，這些生物成分可與分子或序列在其天然環境中相關。例如，本發明分離的核苷酸分子或序列的一個實施方案是從天然產生狀態側翼序列分離的序列，如從正常鄰近片段的序列取出的DNA片段，例如鄰近基因組中天然產生的片段的序列。此外，改變本發明的核苷酸酸序列和分子以編碼本發明的CT-CRM蛋白。因此，術語“分離的核酸分子或序列”也用于從其它成分中大量純化的核酸序列或分子，這些成分天然伴隨未誘變的核酸，如細胞中的RNA或DNA或蛋白質。本發明分離的核苷酸分子或序列也包括由其它常規方法制備的序列和分子，如重組方法、合成方法如誘變，或這些方法的組合。本發明的核苷酸序列或分子構建不應僅限于本文所列具體核苷酸序列，但應構建包括任何和所有與本文所示核苷酸序列有同源性的核苷酸序列(即有序列同一性)。
術語“基本同源性”或“基本相似性”當指核酸或其片段時，表明與插入或缺失其它核酸(或其互補鏈)的適當核苷酸最佳排列時，至少約70％核苷酸堿基有核苷酸序列同一性，這是由任何熟知的序列同一性的算法如GCG版6.1中的程序FASTA測量的。如本文所用，術語“同源的”指兩個聚合分子間的序列相似性，如在兩個核酸分子間，如兩個DNA分子或兩個RNA分子或兩個多肽分子間。當兩個分子中核苷酸或氨基酸位置都由相同單體核苷酸或氨基酸占據時，例如如果兩個DNA分子中各自的位置由腺嘌呤占據，它們在此位置是同源的。兩個序列間的同源是匹配或同源位置數的直接函數，例如如果兩個化合物序列中半數(如十個亞基長度聚合物中的五個位置)位置同源，那么兩個序列是50％同源。如果90％位置如10個中9個匹配或同源，那么兩個序列有90％同源性。作為例子，DNA序列3’ATTGCC5’和3TATGCG5’有50％同源性。如本文所用，術語“基本同源”指與所需核酸約70％同源的DNA或RNA，更優選約80％同源且最優選約90％同源。
本發明也針對分離的核苷酸分子，它包括的核酸序列與編碼本發明CT-CRM蛋白的核酸序列至少70％、80％或90％同源，本發明CT-CRM蛋白與野生型CT蛋白相比酶毒性降低且保持野生型CT的佐劑活性。此外，由于遺傳密碼的簡并性，本文描述的任何編碼CT-CRM的突變氨基酸殘基的三核苷酸密碼子在本發明范圍內。
如本文所討論，CT-CRMs、突變型CT-A亞基或突變型CT-B亞基和/或編碼它們的DNA序列或其它本文所述核酸分子或組合物中有用的序列由它們與鑒定序列的同源性或同一性百分比定義，用于計算同源性或同一性百分比的算法包括下列Smith-Waterman算法(J.F.Collins等，1988，Comput.Appl.Biosci.，467-72；J.F.Collins等，分子序列比較和排列(Molecular Sequence Comparison and Alignment)(M.J.Bioshop等編)，實用方法系列核酸和蛋白質序列分析XVIII(Practical ApproachSeriesNucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII)，IRL Press牛津，英格蘭，UK(1987)417頁)和BLAST和FASTA程序(E.G.Shpaer等，1996，Genomics，38179-191)。這些參考書目納入本文作為參考。
如本文所用描述兩個DNAs為“可操作連接”，是指單鏈或雙鏈DNA包括全部兩個DNAs物各個，且兩個DNAs用這樣的方式在DNA內排列即至少一個DNA序列能對另一個施加生理效果。
優選的是，為用于產生本發明的CT-CRM蛋白或施用此蛋白在細胞中體內產生，編碼序列的各CT-CRM蛋白和必要調節序列存在于不同病毒或非病毒重組載體(包括傳送核酸分子到細胞中的非病毒方法)。另外，編碼CT-CRM蛋白雙份拷貝或編碼多種不同本發明CT-CRMs的兩個或多個這些核酸序列可包含在多順反子轉錄物中，即設計表達多種基因產物的單個分子。
本發明進一步涉及載體，具體是含分離和純化DNA序列的質粒，序列包括編碼免疫原性突變型霍亂全毒素的DNA序列。理想的實施方案包括含編碼CT-CRMs的DNA序列的質粒，CT-CRMs在氨基酸16位或72位有單個氨基酸取代或者分別在氨基酸16位和68或68位和72位有雙重氨基酸取代。如本文所用，術語“載體”指衍生自病毒或非病毒的DNA分子，如細菌、設計為編碼外源或異源核酸序列的種類。因此，術語包括常規細菌質粒。這種質粒或載體可包括來自病毒或噬菌體的質粒序列。這種載體包括染色體、游離型形體或病毒來源的載體，如來源于細菌質粒、噬菌體、酵母游離體、酵母染色體元件和病毒的載體。載體也可來源于它們的組合，如來源于質粒和噬菌體遺傳因子、粘粒和噬菌粒。術語也包括將基因從一個細胞轉移到另一個細胞的非復制病毒。術語也應該包括非質粒和非病毒化合物，它們促進核酸轉移到細胞中，如聚賴氨酸化合物等。
本發明的核酸分子包括非病毒載體或根據本發明將編碼CT-CRM蛋白的序列傳遞到宿主細胞的方法。多種非病毒載體在本領域已知，并包括但不限于質粒、細菌載體、噬菌體載體、“裸露”DNA和用陽離子脂類或聚合體凝聚的DNA。
細菌載體的例子包括但不限于來自卡介苗(bacille Calmette Guerin)(BCG)、沙門氏菌(Salmonella)、志賀氏菌(Shigella)、大腸桿菌和李斯特菌(Listeria)的序列。合適的當質粒載體包括例如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pK37、pKC101、pAC105、pVA51、pKH47、pUB110、pMB9、pBR325、ColE1、pSC101、pBR313、pML21、RSF2124、pCR1、RP4、pBAD18和pBR328。
合適的可誘導大腸桿菌表達載體的例子包括pTrc(Amann等，1988 Gene，69301-315)、阿拉伯糖表達載體(如pBAD18，Guzman等，1995 J.Bacteriol.，1774121-4130)和pETIId(Studier等，1990 Methods in Enzymology，18560-89)。來自pTrc載體的靶基因表達取決于來自雜合trp-lac融合啟動子的宿主RNA聚合酶轉錄。來自pETIId載體的靶基因表達取決于來自T7 gn10-lac融合啟動子的轉錄，此啟動子由共表達的病毒RNA聚合酶T7 gn1介導。此病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS I74(DE3)在lacUV5啟動子的轉錄控制下提供，宿主菌株來自含攜帶T7 gn1基因的定居原噬菌體。pBAD系統取決于araC基因調節的可誘導阿拉伯糖啟動子。啟動子在阿拉伯糖存在下誘導。
在一個例子中，名為pLP903的質粒包含分離和純化DNA序列，包括的DNA序列編碼顯著降低毒性的免疫原性突變型CT-CRM，其中氨基酸丙氨酸在A亞基中氨基酸16位上取代異亮氨酸。第二種名為pLP905的質粒包含分離和純化DNA序列，包括的DNA序列編碼顯著降低毒性的免疫原性突變型CT-CRM，其中氨基酸酪氨酸在A亞基中氨基酸72位上取代纈氨酸。另一種示范質粒名為pLP904。此質粒包含分離和純化DNA序列，包括的DNA序列編碼顯著降低毒性的免疫原性突變型CT-CRM，其中氨基酸丙氨酸在A亞基中氨基酸16位上取代異亮氨酸，且氨基酸酪氨酸在A亞基中氨基酸68位上取代絲氨酸。本發明中另一個作為例子的質粒名為pLP906。它包含分離和純化DNA序列，包括的DNA序列編碼顯著降低毒性的免疫原性突變型CT-CRM，其中氨基酸酪氨酸在A亞基中氨基酸68位上取代絲氨酸，且氨基酸酪氨酸在A亞基中氨基酸72位上取代纈氨酸。
另一類型的有用載體是單鏈或雙鏈噬菌體載體。例如合適的克隆載體包括但不限于載體如噬菌體λ載體系統、λgt11、μgtμWES.tB、Charon 4、λgt-WES-λB、Charon 4A、λgt-1-λBC、λgt-1-λB、M13mp7、M13mp8或M13mp9。
在其它實施方案中，表達載體是酵母表達載體。用于酵母如釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達的載體例子包括pYepSecI(Baldari等，1987 ProteinEng.，1(5)433-437)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982 Cell，30(3)933-943)、pJRY88(Schultz等，1987 Gene，61(2)123-133)和pYES2(Invitrogen Corporation，SanDiego，CA)。
另外，使用桿狀病毒表達載體。用于在培養昆蟲細胞(如Sf9或Sf21細胞)中表達蛋白的桿狀病毒載體包括pAC系列(Smith等，1983 Biotechnol.，24434-443)和pVL系列(Luckow和Summers，1987 Virol.，170(1)31-39)。在另一個實施方案中，哺乳動物表達載體用于在哺乳動物中表達。哺乳動物表達載體的例子包括pCDM8(Seed，1987 Nature，329840-842)和pMT2PC(Kaufman等，1987 EMBOJ，6(1)187-93)。當用于哺乳動物細胞時，表達載體的控制功能通常由病毒調節因子提供。
一種重組載體是重組單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。多種病毒載體系統在本領域已知。這種載體的例子包括但不限于重組腺病毒載體、基于單純皰疹病毒(HSV)的載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、雜合腺病毒/AAV載體、重組逆轉錄病毒或慢病毒、重組痘病毒載體、重組痘苗病毒載體、SV-40載體、昆蟲病毒如桿狀病毒以及構建攜帶或表達感興趣的選擇核酸組合物的載體。
可使用的逆轉錄病毒載體包括那些描述于EP 0415731；國際專利出版號WO90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698和WO 93/25234；美國專利號5219,740；國際專利出版號WO 93/11230和WO 93/10218；Vile和Hart，1993 Cancer Res.533860-3864；Vile和Hart，1993 Cancer Res.53962-967；Ram等，1993 Cancer Res.5383-88；Takamiya等，1992 J.Neurosci.Res.33493-503；Baba等，1993 J.Neurosurg.79729-735；美國專利號4,777,127；GB專利號2,200,651和EP 0345 242。適合的重組逆轉錄病毒的例子包括在國際專利出版號WO 91/02805中描述的那些。
基于甲病毒的載體也可用作編碼CT-CRM蛋白的核酸分子。這種載體可從多種病毒構建，包括例如辛德比斯病毒載體、Semliki森林病毒(ATCC VR-67；ATCCVR-1247)、羅斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委內瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532)。這種載體系統的代表例子包括在美國專利號5,091,309；5,217,879和5,185,440；國際專利出版號WO 92/10578；WO 94/21792；WO 95/27069；WO 95/27044和WO 95/07994中描述的那些。
腺病毒載體例子包括在Berkner，1988 Biotechniques 6616-627；Rosenfeld等，1991Science 252431-434；國際專利出版號WO 93/19191；Kolls等，1994 PNAS 91215-219；Kass-Eisler等，1993 PNAS 9011498-11502；Guzman等，1993 Circulation882838-2948；Guzman等，1993 Cir.Res.731202-1207；Zabner等，1993 Cell 75207-216；Li等，1993 Hum.Gene Ther.4403-409；Cailaud等，1993 Eur.J.Neurosci.51287-1291；Vincent等，1993 Nat.Genet.5130-134；Jaffe等，1992 Nat.Genet.1372-378；Levrero等，1991 Gene 101195-202中描述的那些。示范腺病毒載體包括在國際專利出版號WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655中描述的那些。其它腺病毒載體包括那些來源于黑猩猩腺病毒的，如在美國專利號6,083,716中描述的那些。
另一個病毒載體以細小病毒為基礎如腺伴隨病毒(AAV)。代表例子包括AAV載體描述于國際專利出版號WO 93/09239，Samulski等，1989 J.Virol.633822-3828；Mendelson等，1988 Virol.166154-165和Flotte等，1993 PNAS 9010613-10617。其它特別理想的AAV載體包括那些以AAV1為基礎的；參見國際專利出版號WO00/28061，2000年5月18日出版。其它理想的AAV載體包括假型載體，即含由AAV 5’ITRS、轉基因、AAV 3’ITRs組成的小基因，它們包裝在與AAV ITRs異源的AAV血清型的衣殼中。產生這種假型AAV載體的方法詳細描述于國際專利出版號WO 01/83692。
在一個實施方案中，本發明的核酸分子是“裸露DNA”，它可結合的聚合物包括傳統聚合物和非傳統聚合物如含環糊精的聚合物和保護、相互作用的非凝聚聚合物。“裸露”DNA和用陽離子脂質或聚合物凝聚的DNA一般用化學方法傳遞給細胞。一些化學方法在細胞傳遞領域已知并包括使用脂質、聚合物或蛋白質與DNA絡合，任選地凝聚相同物到顆粒中并傳遞給細胞。另外非病毒化學方法包括使用陽離子凝聚DNA，DNA然后置于脂質體中并根據本發明使用。參見C.Henry，2001Chemical and Engineering News，79(48)35-41。
編碼本發明CT-CRM的核酸分子作為“裸露”DNA直接導入細胞(美國專利號5,580,859)或和試劑制成組合物，試劑促進免疫如布比卡因和其它局部麻醉劑(美國專利號6,127,170)。
上述所有病毒和非病毒載體的成分可從本領域已知材料和制藥工業中選擇。選擇載體成分和調節序列不認為是對本發明的限制。根據本發明的編碼CT-CRM蛋白的各核酸序列優選在調節序列的控制下，調節序列指導哺乳動物或脊椎動物細胞中各核酸序列產物的復制和產生。術語“啟動子/調節序列”指表達可操作連接于啟動子/調節序列的核酸所需的DNA序列。在一些情況中，啟動子/調節序列可以組織特異方式發揮功能。例如，啟動子/調節序列僅能在具體組織類型的細胞中驅動表達。在一些情況中，此序列可以是核心啟動子序列和在其它情況中，此序列還可包括增強子序列，和其它組織特異方式表達所需的調節因子。
優選的是，編碼本發明CT-CRM蛋白的核酸分子和/或重組載體進一步包括調節序列。例如，這種調節序列包括驅動CT-CRM蛋白表達的啟動子。啟動子/調節序列優選位于編碼序列的5’末端，這樣它驅動細胞中CT-CRM蛋白的表達。
合適的啟動子可選擇自組成型啟動子、可誘導啟動子、組織-特異啟動子和其它。組成型啟動子有非特異活性并用于編碼本發明CT-CRM蛋白的核酸分子，例子包括但不限于逆轉錄病毒勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子、逆轉錄病毒LTR啟動子(任選地具有RSV增強子)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(任選地具有CMV增強子)(參見例如Boshart等，Cell，41521-530(1985))、SV 40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子和EF1α啟動子(Invitrogen)。
由外源提供化合物調節的可誘導啟動子包括但不限于阿拉伯糖啟動子、鋅-可誘導的綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(Dex)-可誘導的小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088)；蛻皮激素昆蟲啟動子(No等，1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，933346-3351)、四環素-可誘導系統(Gossen等，1995Science.2681766-1769，也參見Harvey等，1998 Curr.Opin.Chem.Biol.，2512-518)、RU486-可誘導系統(Wang等，1997 Nat.Biotech，15239-243和Wang等，1997 GeneTher.，4432-441)和拉帕霉素-可誘導系統(Magari等，1997 J.Clin.Invest.，1002865-2872)。用于CT-CRMs表達系統的特別優選的啟動子是阿拉伯糖可誘導的啟動子。
可用于此方面的其它種類的可誘導啟動子是由具體生理狀態調節的，如溫度或急性期或僅在復制細胞中。有用的組織-特異啟動子包括的啟動子來自基因編碼骨骼β-肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈2A、肌養蛋白、肌肉肌酸激酶以及活性高于天然產生的啟動子的合成肌肉啟動子(參見Li等，1999 Nat.Biotech.，17241-245)。已知的組織-特異啟動子的例子有肝臟(清蛋白，Miyatake等，1997 J.Virol.，715124-32；乙肝炎病毒核心啟動子(hepatitis B virus core promoter)，Sandig等，1996 Gene Ther.，31002-9；α-胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等，1996 Hum.Gene Ther.，71503-14)、骨(骨鈣蛋白，Stein等，1997 Mol.Biol.Rep.，24185-96；骨唾液蛋白，Chen等，1996 J.Bone Miner.Res.，11654-64)、淋巴細胞(CD2，Hansal等，1998 J.Immunol.，1611063-8；免疫球蛋白重鏈；T細胞受體a鏈)、神經元(神經元特異性烯醇化酶(NSE)啟動子，Anderson等，1993 Cell.Mol.Neurobiol.，13503-15；神經絲輕鏈基因，Piccioli等，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，885611-5；神經元特異性B ngf基因，Piccioli等，1995 Neuron，15373-84)。參見例如國際專利出版號WO 00/55335，用于此方面已知的啟動子的附加列表。
其它包括在本發明核酸序列、分子或載體中的調節序列包括但不限于增強子序列、聚腺苷酸化序列、剪接供體序列和剪接供體序列、分別位于待翻譯多肽開始和末端的轉錄起始和終止位點、用于在轉錄區域翻譯的核醣體結合位點、抗原表位標簽、核定位序列、IRES元件、Goldberg-Hogness“TATA”元件、限制酶裂解位點、可選擇標記等。增強子序列包括如S40 DNA的72bp串聯重復或逆轉錄病毒長末端重復序列或LTRs等，且用于提高轉錄效率。啟動子和其它普通載體元件的選擇是常規的，且有許多這種序列用來設計本發明中有用的核苷酸分子和載體。參見例如Sambrook等，《分子克隆.實驗室手冊》(Molecular Cloning.A Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor Laboratory，紐約(1989)和本文所引用參考文獻，例如3.18-3.26頁和16.17-16.27頁和Ausubel等，《新編分子生物學實驗指南》(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley&Sons，紐約(1989)。本領域技術人員可從這些已知調節序列中選擇以制備本發明的分子。這種調節序列的選擇不是本發明的限制。
C.產生本發明的CT-CRM蛋白和核苷酸分子的方法考慮到突變型CT-CRMs被證明作為抗原組合物佐劑的效用，產生合適量的突變型CT-CRMs是需要的。制備或合成核苷酸序列和CT-CRMs以及含本文所示發明核苷酸分子或CT-CRMs蛋白的組合物在本領域使用現有材料的普通技術人員的能力范圍內。本發明不限制合成方法。下面例子詳述了合成編碼本發明CT-CRMs序列的較佳實施方案。
本發明CT-CRMs和核苷酸分子和序列的產生可通過化學合成方法、重組遺傳工程方法、定點誘變和這些方法的組合。例如本發明核苷酸序列/CT-CRMs可采取已知化學合成技術來常規制備，例如固相化學合成，如Merrifield，1963 J.Amer.Chem.Soc.，852149-2154；J.Stuart和J.Young，固相肽合成，Pierce Chemical Company，Rockford，IL(1984)；Matteucci等，1981 J.Amer.Chem.Soc.，1033185；Alvarado-Urbina等，1980 Science，214270；Sinha，N.D.等，1984 Nucl.Acids Res.，134539描述。也可參見《蛋白質-結構和分子性質》(PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES)，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman和Company，紐約，1993；Wold，F.，“翻譯后蛋白質修飾觀點和前景”(Posttranslational Protein ModificationsPerspective and Prospects)，1-12頁，《翻譯后蛋白質的共價修飾》(POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS)，B.C.Johnson編，Academic Press，紐約，1983Seifter等，1990 Meth.Enzymol.，182626-646和Rattan等，1992 Ann.N.Y.Acad.Sci.，66348-62。
另外，本發明組合物可用常規分子生物技術、定點誘變、遺傳工程或聚合酶鏈式反應來重組構建，如通過克隆和表達編碼CT-CRM蛋白的核苷酸分子，CT-CRM蛋白有任選其它免疫原和任選宿主微生物內的載體蛋白等，并利用本文提供的信息(參見例如Sambrook等，《分子克隆.實驗室手冊》，Cold Spring Harbor Laboratory，紐約(1989)；Ausubel等，《新編分子生物學實驗指南》，John Wiley&Sons，紐約(1997))。CT-CRMs和任選免疫原的編碼序列可合成制備(W.P.C.Stemmer等，1995Gene，16449)。
大體上，重組DNA技術包括通過合成或分離編碼上述CT-CRM蛋白的DNA序列獲得，將它導入在其中表達的適當載體/宿主細胞表達系統，優選在阿拉伯糖可誘導啟動子控制下。任何描述將DNA插入表達載體的方法可用于連接啟動子和其它調節控制元件到選擇重組載體內的特定部位。然后通過常規技術用這種載體或質粒轉化、感染、轉導或轉染合適的宿主細胞。
多種宿主細胞-載體(質粒)系統可用于表達免疫原性突變型霍亂全毒素。優選包括阿拉伯糖可誘導啟動子的載體系統與所用宿主細胞相容。編碼突變型CT-CRMs的DNA插入表達系統，且啟動子(優選是阿拉伯糖可誘導啟動子)和其它控制元件連接到載體內的特定部位從而當載體插入宿主細胞中時(通過轉化、轉導或轉染，這取決于所用宿主細胞-載體系統)，編碼CT-CRM的DNA由宿主細胞表達。
載體可選擇自上述一種病毒載體或非病毒載體，但必須與所用宿主細胞相容。重組DNA載體可通過轉化、轉導或轉染(取決于載體/宿主細胞系統)導入適當宿主細胞(細菌、病毒、酵母、哺乳動物細胞等)中。宿主-載體系統包括但不限于轉化噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA的細菌；微生物如含酵母載體的酵母；感染病毒(如牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳動物細胞系統和感染病毒(如桿狀病毒)的昆蟲細胞系統。
克隆和表達本發明CT-CRMs和其它組合物的系統使用合成核酸分子，包括使用多種重組技術中熟知的微生物和細胞。宿主細胞可選擇自任何生物，包括原核(如細菌)細胞和包括哺乳動物、昆蟲細胞、酵母細胞的真核細胞。優選的是，本發明不同方法和組合物中所用細胞是細菌細胞。合適的細菌細胞包括例如大腸桿菌、桿菌(Bacillus)和鏈霉菌(Streptomyces)的不同菌株。酵母細胞如酵母(Saccharomyces)和畢赤酵母、昆蟲細胞如Sf9和Sf21細胞也是用于生產目的的有用宿主細胞。哺乳動物細胞包括但不限于中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、雞胚成纖維細胞、幼倉鼠腎細胞、NIH3T3、PERC6、NSO、VERO或COS細胞，它們也是合適的宿主細胞以及其它常規和非常規的生物和植物。
選擇其它合適的宿主細胞和用于轉化、培養、擴增、篩選和產物生成和純化的方法可由本領域技術人員參考已知技術進行，參見例如Gething和Sambrook，1981Nature，293620-625。
典型，宿主細胞在培養條件下維持一段足夠表達的時間。培養條件在本領域熟知并包括離子組成和濃度、溫度、pH等。通常，轉染細胞在培養條件下維持在培養基中。用于多種細胞類型的合適介質在本領域中熟知。在一個較佳實施方案中，溫度從約20℃到約50℃，更優選從約30℃到約40℃，更加優選約37℃。
優選pH從約6.0到約8.0，更優選從約6.6到約7.8，最優選約7.4。優選滲量濃度從約200毫摩爾滲透壓/升(mosm/L)到約400mosm/L，更優選從約290mosm/L到約310mosm/L選。轉染和表達編碼蛋白的其它生物學條件在本領域熟知。
重組CT-CRM蛋白回收或收集自宿主細胞或它的膜或者來自培養那些細胞的培養基。回收包括分離和純化重組CT-CRM蛋白。用于多肽的分離和純化技術在本領域熟知并包括步驟如沉淀、過濾、層析、電泳等。
當通過常規重組方法產生時，本發明的CT-CRMs可用常規方法分離和純化自細胞或其培養基，包括層析(如離子交換、親和性和定大小柱層析)、離心、差別溶解性，或通過其它標準技術純化蛋白。存在一些技術用于從原核細胞純化異源蛋白。參見美國專利號4,518,526；4,599,197和4,173,362。但產生的純化制備應該基本上沒有可能對人有害的宿主毒素。具體是，當在革蘭氏陰性菌宿主細胞如大腸桿菌中表達時，純化的肽或蛋白應該基本上沒有內毒素污染。參見例如Sambrook等，《分子克隆·實驗室手冊》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，紐約(1989)。
本發明方法和組合物中所用CT-CRMs不限于本文所列任何具體示范過程的產物。事實上，蛋白可通過上面所引用內容的方法或此說明書其它地方所引用內容的方法來制備。分離和產生這種用途的重組或合成蛋白組合物在本領域技術范圍內。
表1的四個示范CT-CRMs中，兩個帶有單個氨基酸取代，兩個帶有雙重氨基酸取代，它們如實施例1中詳細所述使用上述一些方法產生。具體的是，一組突變體CT克隆(CT-CRMs)通過標準定點誘變操作在大腸桿菌中產生，定點誘變操作用于編碼已知CT全毒素分子的質粒。
前面顯示純化CT-CRME29H全毒素的所得產量約50μg每升培養基(參見國際專利出版號WO 00/18434)。通過修飾原始質粒來增加CT-CRME29H產量的最初嘗試顯示很少或沒有效果。產量的適度增加通過質粒pIIB29H和衍生物與霍亂弧菌DsbA和大腸桿菌RpoH共表達來獲得。共表達和純化修飾提高CT-CRME29H產量到約2mg/升。
為了增加本發明CT-CRMs的表達，質粒中的乳糖可誘導啟動子用阿拉伯糖可誘導啟動子替代(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，阿拉伯糖可誘導啟動子可操作連接于編碼CT-CRMs的DNA序列。在克隆期間，確定質粒pIIB29H包含的ctxA基因編碼來自霍亂弧菌菌株569B的CT亞基A，質粒連接到編碼來自霍亂弧菌菌株2125的CT亞基A的ctxB基因。這些基因的交叉排列表明兩個ctxB基因間的七個堿基取代和ctxA基因間的單個堿基變化。幾個這些堿基取代導致成熟亞基中的氨基酸變化。特別指出的是，ctxA基因間的取代導致A-2部分或A亞基的全毒素裝配結構域內的氨基酸變化。不知道這些基因間異源性是否對毒素表達或全毒素裝配有負的影響。然而，從進化觀點優先認為毒素亞基基因來自相同來源。阿拉伯糖可誘導系統構建中所用ctxA和ctxB基因都來自霍亂弧菌菌株569B。質粒pLP903、pLP904、pLP905和pLP906的構建描述于實施例1。免疫原性突變體霍亂全毒素通過用上述質粒轉化、感染、轉導或轉染宿主細胞來產生，并在允許宿主細胞表達所述重組免疫原性解毒蛋白的條件下培養宿主細胞。從pLP903、pLP904、pLP905和pLP906產生的CT-CRMs約為10mg純化物質每升培養物。
所得CT-CRM蛋白或核酸分子可制成具有任何數量的選擇抗原的免疫原性組合物并用體內分析篩選佐劑功效，如在以下列例子中描述的那些。
D.免疫原性組合物根據發明一種有效的免疫原性組合物包括本發明的突變型霍亂全毒素。優選的是，突變型霍亂全毒素CT-CRM與所述野生型霍亂全毒素相比毒性降低。此“降低的毒性”使各突變體能用作免疫原性組合物中的佐劑而不引起顯著副作用，特別是那些已知與所述野生型CT相關的副作用，如腹瀉。更優選的是，本發明免疫原性組合物中的CT-CRM在全毒素的A亞基中氨基酸16位或72位上有單個氨基酸取代，或在霍亂全毒素的A亞基中氨基酸16位和68位或68位和72位上有雙重氨基酸取代。在一個實施方案中，CT-CRM可有一個或多個其它上述修飾。在另一個實施方案中，組合物包括選擇抗原和合適有效佐劑量的CT-CRM，其中所述全毒素顯著增強脊椎動物宿主對所述抗原的免疫應答。本發明組合物通過改進對施用組合物的脊椎動物宿主抗體應答和細胞介導的免疫應答來調節免疫應答，組合物施用包括上述選擇抗原。
如本文所用，術語“有效佐劑量”指有效引起脊椎動物宿主中免疫應答增加的一種本發明CT-CRM突變體的劑量。在一個更具體的定義中，術語“有效佐劑量”指有效引起脊椎動物宿主中免疫應答增加的本文所述四種CT-CRM突變體之一(CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMS68Y，V72Y)的劑量。具體是，在鼻內使用不同抗原后，本文所示CT-CRMs增強粘膜和全身免疫應答。此外，即使存在先存在的抗CT免疫應答，突變型CT-CRMs能作為有效粘膜佐劑。根據本發明的免疫原性突變型CT-CRMs表現出毒性降低和保持佐劑活性的平衡，這樣所得突變型CT蛋白在被其導入的脊椎動物宿主安全地耐受時作為佐劑發揮功能。具體“有效佐劑劑量或量”取決于宿主的年齡、重量和醫療狀況以及施用方法。合適劑量由本領域技術人員確定。
免疫原性組合物包含本發明的突變型霍亂全毒素作為佐劑，也含至少一種選自各種抗原的抗原。抗原可包括全細胞或病毒、或一種或多種糖類、蛋白質、蛋白質亞基、多肽、肽或片段、多或寡核苷酸、或其它大分子成分。如果需要，抗原組合物可包含不止一種來自相同或不同致病微生物的抗原。
因此，在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物包括來原于致病細菌的多肽、肽或片段作為選擇抗原。合乎需要的細菌免疫原性組合物包括CT-CRM突變體作為佐劑，包括那些預防和/或治療疾病的組合物，疾病不限于由流感嗜血桿菌(典型和非典型)、睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus)、粘膜炎莫拉氏菌、肺炎鏈球菌(Steptococcus pneumoniae)、釀膿鏈球菌(Steptococcus pyogene)、無乳鏈球菌(Steptococcus agalactiae)、糞鏈球菌(Steptococcus faecalis)、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、耳炎差異球菌(Alloiococcus otiditis)、傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)、大腸桿菌、志賀氏菌、霍亂弧菌、白喉桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、鳥分枝桿菌-胞內復合體分枝桿菌、奇異變形菌、普通變形菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、破傷風桿菌(Clostridium tetani)、問號鉤端螺旋體、伯氏疏螺旋體、溶血巴斯德氏菌、多殺巴斯德氏菌、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)和雞敗血枝原體引起。
在另一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物包括來源于致病病毒的多肽、肽或片段作為選擇抗原。合乎需要的病毒免疫原性組合物包含CT-CRM突變體作為佐劑，包括那些針對預防和/或治療疾病的組合物，疾病不限于由呼吸道合胞病毒、副流感病毒1-3型、人肺炎后病毒、流感病毒、單純皰疹病毒、人巨細胞病毒、人免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、脊髓灰質炎病毒、輪狀病毒、杯狀病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風疹病毒、腺病毒、狂犬病病毒、犬瘟熱病毒、牛瘟病毒、禽肺病毒(以前的火雞鼻氣管炎病毒)、Hendra病毒、Nipah病毒、冠狀病毒、細小病毒、傳染性鼻氣管炎病毒、貓白血病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、禽傳染性囊病病毒、新城疫病毒、馬立克氏病病毒、豬呼吸道和生殖綜合癥病毒、馬動脈炎病毒和各種腦炎病毒。
在另一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物包括來源于致病真菌的多肽、肽或片段作為選擇抗原。合乎需要的抗真菌病原體的免疫原性組合物包括CT-CRM突變體作為佐劑，包括針對預防和/或治療疾病的組合物，疾病不限于由曲霉菌(Aspergillis)、芽生菌(Blastomyces)、假絲酵母(Candida)、球孢子菌(Coccidiodes)、隱球菌(Cryptococcus)和組織胞漿菌(Histoplasma)引起。
在又一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物包括來源于致病寄生蟲的多肽、肽或片段作為選擇抗原。合乎需要的抗寄生蟲的免疫原性組合物包括CT-CRM突變體作為佐劑，包括那些針對預防和/或治療疾病的組合物，疾病不限于由利什曼蟲(Leishmania major)、蛔蟲(Ascaris)、鞭蟲(Trichuris)、賈第蟲(Giardia)、血吸蟲(Schistosoma)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)、毛滴蟲(Trichomonas)、鼠弓形體(Tixoplasma gondii)和卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)。
針對抗非傳染性疾病的理想免疫原性組合物包括CT-CRM突變體作為佐劑，它們也在本發明范圍內。這種免疫原性組合物包括那些針對脊椎動物抗原的組合物，具體針對抗原的組合物用于預防和/或治療疾病，疾病不限于如變態反應、自身免疫疾病、阿爾茨海默氏病和癌癥。
例如，本發明的免疫原性組合物可包含來源于癌細胞或腫瘤細胞的多肽、肽或片段。引起脊椎動物宿主中治療或預防抗癌效果的理想免疫原性組合物包含本發明的CT-CRM突變體，包括那些使用癌抗原或腫瘤-相關抗原的組合物，抗原不限于前列腺特異抗原、癌-胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125、MAGE-3、激素類似物等。
本發明的其它免疫原性組合物對于緩和脊椎動物宿主中變應原反應是理想的。這種組合物包含本發明的CT-CRM突變體和來源于變應原或其片段的多肽、肽或片段。這些變應原的例子描述于納入本文作為參考的美國專利號5,830,877和國際專利出版號WO 99/51259，包括花粉、昆蟲毒液、動物皮屑、真菌孢子和藥物(如青霉素)。免疫原性組合物干擾已知引起變應反應的IgE抗體的產生，從而緩和對變應原的變應性反應。
在另一實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含來源于抗原的分子部分的多肽、肽或片段作為選擇抗原，抗原是由宿主(自身分子)以不合乎需要的方式、量或位置產生的，如那些來自淀粉樣前體蛋白以預防或治療脊椎動物宿主中以淀粉樣沉積為特征的疾病。緩和脊椎動物宿主中對自身分子反應的理想組合物包含本發明的CT-CRM突變體，包括含自身分子或其片段的組合物。這種自身分子的例子包括參與糖尿病的β-鏈胰島素、參與胃食管反流病的G17分子和疾病中負調節自身免疫應答的抗原如多發性硬化、狼瘡和類風濕性關節炎。
本發明的其它免疫原性組合物對于預防或治療脊椎動物宿主中以淀粉樣沉積為特征的疾病是理想的。這種組合物包含本發明的CT-CRM突變體以及淀粉樣前體蛋白(APP)的部分。該病有不同的名稱，稱為阿爾茨海默氏病、淀粉樣變性病或淀粉樣產生疾病(？amyloidogenic)。β-淀粉樣肽(也稱為Aβ肽)是的APP的42個氨基酸片段，通過β和γ分泌酶加工APP來產生且有下列序列Asp Ala Glu Phe ArgHis Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly SerAsn Lys Gly Ala Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO3)。在一些病人中，淀粉樣沉積采用聚集的Aβ肽形式。令人驚訝的是，現在發現施用分離的Aβ肽在脊椎動物宿主中誘導抗淀粉樣沉積的Aβ肽成分的免疫應答(國際專利出版號WO 99/27944)。因此本發明實施方案包括本發明的CT-CRM突變體加上Aβ肽以及Aβ肽的片段和Aβ肽或其片段的抗體。Aβ肽的一個這種片段是具有下列序列的28個氨基酸肽(美國專利號4,666,829)Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser GlyTyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys(SEQ IDNO4)。
這種免疫原性組合物進一步包括免疫學上可接受的稀釋劑或藥學上可接受的載體，如無菌水或無菌等滲鹽水。抗原組合物也可以常規方式與這種稀釋劑或載體混合。如本文所用，術語“藥學上可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質、包被、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收阻滯劑等，與施用給人或其它脊椎動物宿主相容。合適的載體對于本領域技術人員是明顯的，且很大程度上取決于施用途徑。
免疫原性組合物也可包括但不限于懸浮液、溶液、在油或水介質中的乳劑、糊和可移植緩釋或可生物降解的制劑。這種制劑可進一步包括一種或多種其它成分，包括但不限于懸浮劑、穩定劑或分散劑。在用于腸胃外施用的制劑的實施方案中，活性成分以干燥(即粉末或顆粒)形式提供用于在腸胃外施用重構組合物前以合適的載體(如無菌無熱原水)重建。其它有用的腸胃外可施用的制劑包括那些在脂質體制備中含微晶形式的活性成分或作為可生物降解聚合物系統的組成部分。用于緩釋或移植的組合物可包括藥學上可接受的聚合或疏水材料如乳劑、離子交換樹脂、少量可溶性聚合物或少量可溶性鹽類。
可存在于本發明的蛋白免疫原性組合物中的另外成分是除了CT-CRMs、防腐劑、化學穩定劑或其它抗原蛋白的佐劑。通常，最優化穩定劑、佐劑和防腐劑以確定最佳制劑在目標人或動物中的功效。合適的示范防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、棓酸丙酯、乙基香蘭系甘油、苯酚和對氯酚。合適的可使用的穩定成分包括例如酪蛋白氨基酸、蔗糖、明膠、酚紅、N-Z胺、磷酸二氫鉀、乳糖、乳白蛋白水解產物和奶粉。
本發明的抗原組合物可進一步包括除突變型CT-CRMs以外的佐劑。用于增強免疫應答的常規非CT-CRM佐劑包括但不限于MPLTM(3-O-脫酰基單磷酰脂質A；Corixa，Hamilton，MT)，它描述于納入本文作為參考的美國專利號4,912,094。同樣適合用作佐劑的是合成的脂質A類似物或氨烷基葡萄糖胺磷酸化合物(AGP)或其衍生物或類似物，它們來源于Corixa(Hamilton，MT)并描述于納入本文作為參考獻的美國專利號6,113,918。一個這種AGP是2-[(R)-3-十四烷酰氧十四烷酰氨基]-乙基-2-脫氧-4-O-磷酰基-3-0-[(R)-3-十四烷酰氧十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰氧十四烷酰-氨基]-b-D-吡喃葡糖苷，也稱為529(以前稱為RC529)。此529佐劑制成含水形式或穩定乳劑。
其它非CT-CRM佐劑包括礦物油和水乳劑、鋁鹽類(明礬)如氫氧化鋁和磷酸鋁等、Amphigen、Avridine、L121/鯊烯、D-丙交酯-聚交酯/糖苷、普盧尼克多元醇、胞壁酰二肽、滅活的博德特氏菌(Bordetella)、皂角苷如StimulonTM QS-21(Antigenics，Framingham，MA)，它們描述于納入本文作為參考的美國專利號5,057,540，佐劑也包括從此產生的顆粒如ISCOMS(免疫刺激復合體)、結核分枝桿菌、細菌脂多糖、合成多核苷酸如含CpG基序的寡核苷酸(納入本文作為參考的美國專利號6,207,646)、百日咳毒素(PT)或大腸桿不耐菌熱毒素(LT)，具體是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129；參見例如納入本文作為參考的國際專利出版號WO 93/13302和WO 92/19265。
各種細胞因子和淋巴因子也適合于包括在本發明的免疫原性組合物中。一個這種細胞因子是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，其核苷酸序列描述于納入本文作為參考的美國專利號5,078,896。含GM-CSF cDNA的質粒轉化入大腸桿菌中并由美國模式培養物保藏所(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209保存，登記號39900。細胞因子白介素-12(IL-12)是另一種佐劑，描述于納入本文作為參考的美國專利號5,723,127(來源于Genetics Institute，Inc.，Cambridge，MA)。其它細胞因子或淋巴因子顯示有免疫調節活性，包括但不限于適合用作佐劑的白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18、干擾素α、β和γ、粒細胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α和β。
本發明的免疫原性組合物的其它合適任選成分包括但不限于表面活性物質(如十六烷基胺、十八烷基胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基-二十八烷基溴化銨(dioctadecylammonium bromide))、甲氧基十六烷基甘油和普盧尼克多元醇；聚胺如吡喃、葡聚糖硫酸酯、聚IC、carbopol；肽如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬肽；油乳劑；礦物凝膠如磷酸鋁等和免疫刺激復合體。CT-CRM和抗原也可摻入到脂質體或與多糖、脂多糖和/或其它用于免疫原性組合物的聚合物的綴合。
本發明的免疫原性組合物包括CT-CRM突變體或編碼本發明所需CT-CRM的DNA序列和分子，它們還用作多核苷組合物(也稱為DNA免疫原性組合物)或用編碼選擇抗原的多核苷酸施用。例如，前面證明BALB/c小鼠施用編碼單純皰疹病毒(HSV)2型(gD2)全長糖蛋白的質粒DNA的制劑以及皮內途徑的CT-CRME29H，產生的平均細胞反應高于通過皮內途徑自身接受編碼HSV gD2的質粒DNA的小鼠。此外，接受質粒DNA HSV gD2組合物以及CT-CRME29H的小鼠平均血清抗體效價約與接受沒有佐劑的質粒DNA HSV gD2組合物的小鼠相同。類似的，有CT-CRME29H佐劑的質粒DNA HSV gD2組合物也在陰道洗液樣品中產生gD2-特異抗體應答，其水平可與通過皮內途徑或肌肉內途徑傳遞無佐劑組合物后觀察到的水平相比。小鼠用有CT-CRME29H或CT佐劑的質粒DNA HSV gD2組合物并通過皮內途徑傳遞，同樣產生的γ干擾素和IL-5水平顯著高于接受沒有佐劑的質粒DNAHSV gD2組合物的小鼠。因此，當用抗HSV的質粒DNA組合物施用時，CT-CRMs提高增殖和γ干擾素反應。
除了上述載體，免疫原性組合物包括的多核苷酸分子需含任選多核苷酸促進劑或“共作用劑”如局部麻醉劑、肽、包括陽離子脂質、脂質體或脂顆粒的脂質、聚陽離子如聚賴氨酸、分支的三維聚陽離子如樹狀聚體、碳水化合物、陽離子兩性分子、去垢劑、苯甲銨表面活性劑或促進多核苷酸轉移到細胞的其它化合物。這種促進劑包括布比卡因(參見納入本文作為參考的美國專利號5,593,972)。這種本發明中有用的促進劑或共作用劑的其它非排除例子描述于美國專利號5,703,055；5,739,118；5,837,533；出版于1996年4月4日的國際專利出版號WO 96/10038和出版于1994年8月8日的國際專利出版號WO 94/16737，它們都納入本文作為參考。
最優選的是，局部麻醉劑以形成一個或多個與核酸分子復合的量存在。當局部麻醉劑混合本發明的核酸分子或質粒時，形成多種包裝DNA的小復合體或顆粒且是類似的。因此，在本發明免疫原性組合物的一個實施方案中，復合體通過混合局部麻醉劑和至少一種本發明的質粒來形成。來自此混合物的任何單個復合體可包含多種不同質粒的組合。另外，本發明組合物的另一實施方案中，如果所有質粒要以單個藥丸施用，局部麻醉劑可與各質粒分別預混合，然后在單個組合物中結合單獨混合物以確保理想比例的質粒存在于單個免疫原性組合物中。另外，局部麻醉劑和各質粒可分別混合并單獨施用以獲得理想比例。然后術語“復合體”或“一個或多個復合體”或“幾個復合體”用于定義此免疫原性組合物的實施方案，要理解的是術語包括一個或多個復合體，各復合體含CT-CRM-編碼質粒和抗原-編碼質粒的混合物，或者形成的復合體的混合物，其中各復合體僅含一種類型質粒，或者一個或復合體的混合物，其中各復合體含多順反子DNA。優選的是，復合體直徑在約50到約150nm間。當所用促進劑是局部麻醉劑時，優選布比卡因，量從約0.1重量百分比到約1.0重量百分比，重量以多核苷酸組合物總重量為基礎。也參見納入本文作為參考的國際專利出版號WO 99/21591，它教授了將苯甲銨表面活性劑作為共作用劑摻入，施用量優選在約0.001-0.03重量％間。根據本發明，局部麻醉劑存在量與所述核酸分子的比例為0.01-2.5％w/v局部麻醉劑對1-10μg/ml核酸。另一個這種范圍是0.05-1.25％w/v局部麻醉劑對100μg/ml到1mg/ml核酸。
如本文所用，這種多核苷酸免疫原性組合物在體內瞬時表達CT-CRM和抗原；沒有遺傳物質插入或整合到宿主染色體中。因此此使用區別于基因治療，其目標是將感興趣的遺傳物質插入或整合到染色體中。使用分析來確定通過免疫施用的多核苷酸在宿主中沒有產生轉化表型(美國專利號6,168,918)。
免疫原性組合物也可包含其它適合選擇組合物施用模式的添加劑。本發明組合物也可包括凍干的多核苷酸，它可與其它藥學上可接受賦形劑一起使用來開發粉末、液體或懸浮液劑量形式。參見例如《Remington藥學科學和實踐》(The Scienceand Practice of Pharmacy)，第2卷，第19版(1995)，如95章氣霧劑；國際專利出版號WO 99/45966，其教授內容納入本文作為參考。如果需要，這些組合物施用途徑可以是結合或調節的。
這些含核酸分子的免疫原性組合物可含適合通過任何常規施用途徑施用的添加劑。在一些較佳實施方案中，制備本發明免疫原性組合物施用給人受試者，采用形式例如脂質、粉末、氣霧劑、片劑、膠囊、腸溶片劑或膠囊、或者栓劑。
上述本發明免疫原性組合物(無論含蛋白或含核酸分子的組合物)不受常規的生理學上可接受的載體、佐劑或用于上述類型藥物制備中的其它有用成分的限制。從上述成分中制備這些藥學上可接受的組合物在本領域技術范圍內，這些組合物具有適當pH等滲性、穩定性和其它常規特征。
E.本發明組合物的使用方法本發明的免疫原性組合物包括單獨的CT-CRM或CT-CRM與選擇抗原的組合，組合物通過多種途徑施用給人或非人脊椎動物以增強對抗原的免疫應答，優選上面鑒定的引起疾病的抗原。本發明組合物通過改進施用組合物后脊椎動物宿主抗體反應和細胞介導的免疫來調節免疫應答，組合物包括上述選擇抗原和有效佐劑量的突變型CT-CRM，其中突變型CT-CRM與野生型CT相比毒性顯著降低，其中毒性降低是單個氨基酸取代、雙重氨基酸取代或氨基酸插入的結果。
在一個實施方案中，含CT-CRM(作為蛋白或由核酸分子編碼)的免疫原性組合物在施用含選擇抗原(作為蛋白或核酸分子)的組合物前施用。在另一個實施方案中，免疫原性組合物與抗原同時施用，在含抗原和CT-CRM的組合物中施用或作為含抗原組合物的單獨組合物形式。在又一個實施方案中，含CT-CRM的組合物在含抗原的組合物后施用。盡管不要求，優選抗原和突變型CT-CRM同時施用。
如上所述，含CT-CRM的免疫原性組合物可作為蛋白或編碼蛋白的核酸分子施用。含CT-CRM的免疫原性組合物可作為蛋白與用作蛋白的選擇抗原組合施用。另外如上所述，CT-CRM免疫原性組合物可作為蛋白和編碼抗原的核酸分子施用。另一種包括施用CT-CRM和抗原作為編碼這些蛋白的核酸序列。
也可使用任何合適途徑施用含CT-CRM的免疫原性組合物。如果CT-CRM和抗原在分開的組合物或不同形式如蛋白或核酸中施用，途徑可以相同或不同于選擇施用含選擇抗原組合物的途徑。合適施用途徑包括但不限于鼻內、口頭、陰道、直腸、腸胃外、皮內、經皮(參見例如納入本文作為參考的國際專利出版號WO98/20734)、肌肉內、腹膜內、皮下、靜脈內和動脈內。合適途徑的選擇取決于所用免疫原性組合物的性質、病人年齡、重量、性別和總體健康的評估以及免疫原性組合物中存在的抗原、參與醫師的類似因素。
一般，選擇合適“有效量”或劑量用于本發明CT-CRM和/或免疫原性組合物的抗原成分是以來自CT-CRM和抗原的蛋白質或核酸、所用免疫原性組合物中抗原的同一性以及受試者的身體情況為基礎，身體情況最主要包括免疫受試者的總體健康、年齡、重量。施用方法和途徑以及免疫原性組合物中存在的其它成分也可影響CT-CRM和抗原的劑量和量。這種選擇和向上或向下調節有效劑量在本領域的技術內。CT-CRM和抗原誘導免疫應答或在病人中產生外源效果且沒有顯著副作用所需的量取決于這些因素而變化，免疫應答優選保護性反應。合適劑量由本領域技術人員確定。
一個實施方案中用于含蛋白成分的例子，如上述CT-CRM變體蛋白和/或抗原，各劑量可包括約1μg到約20mg蛋白質/mL無菌溶液。其它劑量范圍也可由本領域技術人員決定。初次劑量后如果需要可任選的進行反復強化。在另一個例子中，DNA和載體組合物中核苷酸酸分子的量可由本領域技術人員選擇和調整。在一個實施方案中，各劑量可包括約50μg到約1mg CT-CRM編碼或抗原編碼的核酸如DNA質粒，每mL無菌溶液。
組合物的劑量和劑量方案也可由本領域技術人員確定。除了在稍后時間加大劑量以維持保護，保護可由單劑量含CT-CRM的免疫原性組合物給與，或需要一些劑量與或不與選擇抗原施用。在一些情況中，突變型CT-CRM的佐劑性可減少含所需抗原的劑量數或可減少劑量方案的時間過程。即使還需要可監控免疫水平以確定還需要強化。
為更好理解本發明，提供下列實施例。實施例僅用于描述目的而不是限制發明的范圍。
本文引用的所有文獻納入本文作為參考。
實施例1.CT突變體的表達A.細菌菌株、質粒和生長條件大腸桿菌TG1(Amersham-Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)和TX1用作克隆重組質粒和表達突變蛋白的宿主，TX1是TG1的萘啶酸抗性衍生物，攜帶來自XL1blue(Stratagene，LaJolla，CA；CJ236(FTc，lacIq)(Bio-Rad，Hercules，CA)的FTc、lacIq。含質粒菌株用所需抗生素(50μg/ml氨芐青霉素；25μg/ml卡那霉素；10μg/ml四環素)維持在LB瓊脂平板上。來自霍亂弧菌0395的完整CT操縱子亞克隆到lac啟動子控制下的噬菌粒載體pSKII-中，產生名為pMGJ67的IPTG可誘導質粒(Jobling，M.G.和Holmes，R.K.，1992 Infect.Immun.，60，4915-4924)。
B.ctxA基因的誘變Kunkel，T.A.，1985 Proc.Nat.Acad.Sci.USA，82，488-492的方法用于選擇質粒pMGJ67中產生的來源于寡核苷酸的突變體。用于產生突變型CT-CRMs的寡核苷酸和突變型CT-CRMs中的不同氨基酸取代列于表2。
表2導入ctxA中的寡核苷酸序列
a下劃線是改變的堿基。S代表G或C；Y代表C或T。
簡言之，CT-CRMs突變體用QuickChange誘變試劑盒如廠商(StratageneInc.，LaJolla，CA)所述直接在pMGJ142中建立。含CT-CRMS68Y，V72Y取代的雙重突變質粒通過PCR產生，用表2所示誘變引物以產生大引物，接著克隆突變的ctxA-編碼XbaI-ClaI片段到pMGJ142中。CT-CRMI16A，S68Y雙重突變體通過含克隆的I16a的PCR產生，用誘變引物產生大引物，接著克隆突變的ctxA-編碼XbaI-ClaI片段到pMGJ142中。CT-CRMV72Y和CT-CRMI16A，S68Y突變體用QuickChange誘變試劑盒通過CT-CRMS68Y，V72Y雙重突變體在氨基酸68位回復到野生型來產生。磷酸化各單鏈寡核苷酸并用于在含尿嘧啶單鏈DNA模板上指導第二條鏈合成，DNA模板來自大腸桿菌dut ung菌株CJ236(F’Tc，pMGJ67)。連接和轉化ung+菌株TX1后，單鏈DNA來源于AmpR轉化子并通過雙脫氧鏈終止方法(Kunke，上面引用)來測序。
C.阿拉伯糖啟動的CT-CRM表達載體的構建前面用CT-CRME29H試驗(國際專利出版號WO 00/18434)顯示可通過取代ctxA基因上游合成Shine-Delgamo序列和使操縱子在阿拉伯糖啟動子系統控制下來在大腸桿菌中獲得最大產量。含A亞基中定點突變的CT操縱子如上所述建立(同上)。CT-CRMs最初在βlac啟動子控制下且在大腸桿菌中表達水平低。PCR用于修飾CT-A亞基的ATG的5’區域并在5’末端插入NheI位點。相應3’引物在CT-B基因的3’末端加入HindIII位點。
所用引物序列是正向CT5’TTTTTTGGGCTAGCATGGAGGAAAAGATGAGC(SEQ ID NO.9)；反向CT5’CGAGGTCGAAGCTTGCATGTTTGGGC(SEQ ID NO.10)。
PCR在各突變型CT-CRM操縱子上進行，且PCR產物根據廠商說明書連接到pCR2.1-Topo(Invitrogen)中并轉化入Top10F’細胞中。重組大腸桿菌在含卡那霉素(25μg/ml)和X-gal(40μg/ml)的SOB瓊脂平板上培養。通過EcoRI消化篩選來自白色克隆的質粒用于插入。含正確大小的插入的質粒根據廠商說明書用NheI和HindIII消化，且含CT操縱子的DNA片段從低熔點瓊脂糖中分離。質粒pBAD18-Cm(Invitrogen)用NheI-HindIII消化，且從低熔點瓊脂糖中分離線性DNA。消化的pBAD18和CT操縱子在12℃連接并轉化入Top10F大腸桿菌中。來自氯霉素抗性克隆的質粒通過限制性分析篩選用于插入，測序代表性克隆以確定定點突變的存在。質粒轉化到DH5α中用于表達CT-CRMs。在16位和72位攜帶單個氨基酸取代的編碼突變型CT-CRMs的質粒分別命名為pLP903和pLP905，在16位和68位及68位和72位攜帶雙重氨基酸取代的編碼突變型CT-CRMs質粒分別命名為pLP904和pLP906。質粒包含編碼CT的霍亂弧菌基因ctxA和ctxB的多順反子。
D.大腸桿菌中CT-CRMs的表達含質粒pLP903、pLP904、pLP905或pLP906的大腸桿菌DH5α細胞以及分別表達CT-CRMs、CT-CRMI16A、CT-CRMS68Y，I16A、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y的細胞在磷酸緩沖的Hy-Soy培養基中37℃通氣生長，培養基含氯霉素(25μg/ml)和甘油(0.5％)。當培養物到達約4.5-5.5的OD600時，它們通過加入L-阿拉伯糖到0.5％的終濃度來誘導。誘導后3小時培養物在37℃通氣培養，然后通過離心收集細胞。細胞沉淀貯存在-20℃。
E.CT-CRMs的制備和純化細胞沉淀在室溫融化并以9％初始培養物體積重懸浮于10mM NaPO4和1mMEDTA(pH7.0)。細胞懸浮液在微流化器(microfluidizer)中機械破裂并以8,500×g離心10分鐘。細胞裂解物進一步以160,000×g澄清1小時。澄清的細胞裂解物以2ml/min的流速裝入10mM NaPO4(pH7.0)平衡的羧甲基(CM)-瓊脂糖TM柱(300ml CM-瓊脂糖TM每101培養物)(Amersham，Pharmacia)。柱用＞10體積的10mM NaPO4(pH7.0)以5ml/min流速洗。CT-CRME29H全毒素用4柱體積的10mM NaPO4(pH8.3)洗脫。純化的CT-CRMs通過PBS中透析來更換緩沖液并貯存在4℃。完整全毒素和各亞基的存在分別通過天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和SDS-PAGE確定。天然PAGE表明存在86kDa的純化分子(數據沒有顯示)、完整霍亂全毒素的預期分子量(Tebbey等，2000 Vaccine，18(24)2723-2734)。
此外，SDS-PAGE顯示與CT-A(27kDa)CT-B(12kDa)亞基排列的兩條帶，亞基包括完整全毒素(數據沒有顯示)。
實施例2；非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳突變型CT-CRMs、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析以確定純化后CT-CRMs作為完整全毒素存在的百分比。15μl各純化的CT-CRMs(以不同蛋白質濃度)通過6％聚合的非變性聚丙烯酰胺凝膠。三種不同濃度(300、600和1200ng)的CT-B用作標準。電泳后凝膠用考馬斯藍染色。凝膠然后用光密度計掃描，全毒素的百分比從CT-CRMs和CT-B標準的光密度計讀數計算。數據表明97.8％CT-CRMI16A，S68Y和99.4％CT-CRMV72Y作為完整全毒素存在(表3)。
表3完整全毒素的天然凝膠分析
實施例3；用于CT-CRMs剩余毒性的Y-1腎上腺細胞分析突變型CT-CRMs毒性在小鼠Y-1腎上腺腫瘤細胞分析中與所述野生型CT相比，此分析在體外用來測量霍亂毒素/不耐熱腸毒素家族中的腸毒素毒性。分析取決于毒素結合到細胞表面受體和毒素的A1亞基隨后進入細胞的細胞質中。
分離自霍亂弧菌的天然霍亂毒素在CT-A1-CT-A2連接處蛋白水解產生切口，導致霍亂毒素的A1和A2亞基僅由一個二硫鍵連接一起。這使A1和A2亞基不穩定并相互容易分離。帶切口CT的A1亞基-結合細胞表面受體就從A2亞基中分離并進入細胞，其中ADP-核糖基化調節G蛋白(Gsα)，使其毒性效果如上面背景中所述。相反，大腸桿菌中產生的腸毒素(CT或LT)不帶切口，因此仍有A1-A2肽連接。因此在Y-1腎上腺細胞分析中，霍亂弧菌中產生的CT毒性顯著大于異源細菌細胞如大腸桿菌中產生的CT。
在第一個Y-1腎上腺細胞分析中，突變型CT-CRMs的毒性與來自霍亂弧菌的切口野生型CT相比。在此分析中，Y-1腎上腺細胞(ATCCCCL-79)以104細胞每孔濃度接種于96孔平底平板。之后，三倍血清稀釋的純化(～90％純度，考馬斯藍染色確定)CT-CRMs加入腫瘤細胞并在37℃培養(5％CO2)18小時。細胞隨后用光學顯微鏡檢測毒性存在(細胞團)。終點效價定義為大于50％細胞團所需的最小毒素濃度。然后計算剩余毒性的百分比，用來自亂弧菌的野生型切口CT(100％毒性)的終點效價除以CT-CRMs引起的效價再乘以100。列于表4的數據表明四種純化的突變全毒素CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y用Y-1腎上腺細胞分析測試的剩余毒性僅為0.37％。
表4Y-1腎上腺細胞分析
在第二個單獨研究中，在Y-1腎上腺細胞分析中比較大腸桿菌細胞(TG1)的粗周質提取物的剩余毒性與大腸桿菌中表達的無切口野生型CT全毒素，TG1表達水平提高的突變型CT-CRMs。Y-1腎上腺細胞在多孔盤(含10％胎牛血清的RPMI培養基)中培養，培養時存在粗大腸桿菌細胞裂解物。
細胞毒性如以前一樣監控。在此研究中，一個毒性單位定義為過夜培養后引起孔中75-100％細胞團的最小量毒素或上清液。此研究結果列于下表5。
表5Y-1腎上腺細胞分析
此研究結果表明，CT-CRMI16A和CT-CRMS68Y，V72Y的毒性顯著降低(5％)，CT-CRMV72Y和野生型CT一樣毒。不受理論的束縛，第二個研究中的變體結果(表5)是由于第二個研究中所用粗周須大腸桿菌細胞裂解物包含無切口的突變型CT-CRMs，由于毒性測量為大腸桿菌產生的野生型無切口CT毒性的百分比。相反，來自大腸桿菌的無切口野生型CT在Y-1細胞分析中有6250pg/ml的50％細胞團劑量(數據沒有顯示)。在第一個研究中，突變型CT-CRMs的剩余毒性表示為霍亂弧菌產生的野生型、切口CT毒性的百分比，其中切口全毒素在Y-1細胞分析中有125pg/ml的50％細胞團劑量。因此，第二個研究中報導的剩余毒性比第一個研究中獲得的高50倍。
實施例4ADP-核糖基轉移酶試驗NAD+精胺ADP-核糖基轉移酶活性作為來自放射性標記NAD+的[羰基-14C]煙酰胺的釋放測量。簡言之，CT和CT-CRMs用胰蛋白酶活化，并用在TEAN緩沖液(Tris/EDTA/疊氮化鈉/氯化鈉)(pH8.0)中的50mM甘氨酸/20mM二硫蘇糖醇30℃培養30分鐘。之后，下列物質加入反應0.1μg大豆胰蛋白酶抑制劑、50mM磷酸鉀、10mM精胺、20mM二硫蘇糖醇、10mM氯化鎂、100μM GTP、3mM二豆蔻酰磷脂酰膽堿、0.2％膽酸鹽、0.03mg卵清蛋白、100μM[腺嘌呤-U-14C]NAD(Dupont NENTM，Boston，MA)和水到300μl終體積。30℃培養90分鐘后，100μl樣品加入AG1-X2(Bio-Rad)柱(0.64×5cm)，柱用1.0ml蒸餾/去離子水洗五次。收集含[14C]ADP-核糖基精胺的洗脫物用于放射性分析。洗脫物中14C的平均回收表示為加入柱的洗脫物百分比。結果列于表6。
表6NAD+精胺ADP-核糖基轉移酶活性
ADP-核糖基轉移酶活性也用二乙基氨基(亞芐基-氨基)胍(DEABAG)作為底物單獨確定。在此試驗中，來自純化細胞裂解物的25μl等份突變型CT-CRMs用1/50/w/w胰蛋白酶30℃活化30分鐘，用0.1M K2PO4，pH7.5、10μM NAD、4mM DTT中的200μl 2mM DEABAG培養2小時。反應通過加入800μl勻漿緩沖液結合未反應底物來終止，緩沖液含400mg DOWEX AG50-X8樹脂。上清液中的ADP-核糖基化DEABAG在用DEABAG校準的DyNA Quant熒光計中用熒光發射來定量。除突變型CT-CRMV72Y以外，突變型CT-CRMs的ADP-核糖基轉移酶活性比野生型顯著下降(表7)。用CT-CRMV72Y觀察到的高水平ADP-核糖基轉移酶活性是因為此研究的不同試驗方案中使用不同底物測量突變型CT-CRMs的ADP-核糖基轉移酶活性。
表7使用二乙基氨基(亞芐基-氨基)胍(DEABAG)的CT-CRMs的ADP-核糖基轉移酶活性
實施例5BALB/C小鼠的免疫應答，小鼠單獨用非典型流感嗜血桿菌(NTHI)的重組P4外膜蛋白(RP4)免疫或與CT-CRMS結合在第一個實驗中，評估突變型CT-CRMI16A提高誘導重組P4外膜蛋白(rP4)的全身和粘膜抗體的能力。評估突變型CT-CRMI16A誘導的血清和粘膜抗P4抗體效價并與所述野生型CT和突變型CT-CRME29H(WO 00/18434)比較。在此研究中，BALB/c小鼠在0、3、5周和第5周第6天用制劑鼻內免疫，制劑含1μg鹽水中的重組P4蛋白或1μg P4與1μg野生型CT、1μg CT-CRME29H或0.1、1或10μg CT-CRMI16A一起。
結果表明CT-CRMI16A像野生型CT和CT-CRME29H增強rP4蛋白引起全身和粘膜免疫應答的能力(表8)。例如，初次IN免疫后六周，rP4蛋白免疫的小鼠的抗rP4IgG抗體效價比單獨PBS中重組蛋白免疫的小鼠大40倍，rP4蛋白用CT-CRMI16A或CT-CRME29H制成。施用重組蛋白加1μg濃度野生型CT全毒素的小鼠的抗體效價(IgG)比施用鹽水中單獨重組rP4的小鼠的抗體效價提高67倍。1μg突變型CT-CRM、CT-CRME29H免疫小鼠的抗體效價比單獨rP4免疫小鼠的抗體效價提高55倍。相比之下，1μg和0.1μg突變型CT-CRM、CT-CRMI16A免疫小鼠的抗體效價分別比鹽水中單獨rP4免疫小鼠的抗rP4抗體效價提高15和27倍。
表8對重組P4蛋白的血清抗體反應
BALB/c小鼠在0、3、5周免疫IN，第三次免疫后兩周檢測粘膜分泌中的蛋白-特異抗體。在第5周第6天收集來自陰道洗液(VW)、鼻洗液(NW)；支氣管肺泡灌洗(BAL)和唾液(SAL)的粘膜樣品。列于表9的這些結果進一步表明CT-CRMI16A促進抗rP4蛋白的局部免疫應答產生。此外，抗rP4抗體效價可與由野生型CT作為佐劑的免疫原性組合物誘導的相比。
表9對rP4蛋白的粘膜抗體反應
在第二個實驗中，每組五只BALB/c小鼠在0、21、35天用15μl劑量免疫IN，劑量含1μg單獨rP4或1μg rP4加1μg一種突變型CT-CRMs、CT-CRME29H、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y，V72Y作為如表10所示佐劑。抗rP4 IgA和IgG抗體效價通過對收集樣品進行ELISA來確定，結果列于表10，樣品在0、3和5周和在第5周第6天收集。結果表明小鼠中血清抗rP4、IgA和IgG效價顯著增加，小鼠同時施用抗原和一種突變型CT-CRMs。對rP4的粘膜抗體反應也在最后一次免疫后一周測量。
表10突變霍亂毒素對鼻內傳遞給雌性BALB/c小鼠a的NTHi rP4蛋白的免疫應答的佐劑效果
a1μg NTHi rP4在0、3和5周以15μl體積傳遞IN給雌性BALB/c小鼠。
bNTHi rP4組合物用鹽水或1μg不同突變霍亂毒素配制。
c血清在0、3和5周以及第5周第6天收集；收集樣品代表n＝5。
表11分別列出來自鼻、支氣管肺泡和陰道洗液、唾液的IgA和IgG效價。這些結果也表明施用rP4抗原和一種突變型CT-CRMs的小鼠中粘膜抗rP4、IgA和IgG效價比施用鹽水中rP4的小鼠顯著提高。
表11粘膜洗液收集a的抗NTHi rP4 ELISA終點效價
a1μg NTHi rP4在0、3和5周以15μl體積傳遞IN給雌性BALB/c小鼠。
bNTHi rP4組合物用鹽水或1μg不同突變霍亂毒素配制。
c粘膜樣品在第6周收集；收集樣品代表n＝5。
在第5周第6天IN施用后，六組單獨小鼠血清中的IgA和IgG包括IgG亞類IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3終點效價也通過ELISA確定(表12-17)。在表12-17報導數據中，統計分析使用JMP，SAS Institute，Inc.；單向方差分析在p＜0.001水平顯著；用Tukey-Kramer HSD，α＝0.5進行多次比較。
表12第5周第6天各單獨小鼠中IgA抗NTHi rP4 ELISA終點效價
*來自鹽水組的值顯著不同+來自CT-CRMS68Y，V72Y組的值顯著不同表13第5周第6天各單獨小鼠中IgG抗NTHi rP4 ELISA終點效價
*來自鹽水組的值顯著不同表14第5周第6天各單獨小鼠血清中IgG1抗NTHi rP4 ELISA終點效價
*來自鹽水組的值顯著不同表15第5周第6天各單獨小鼠中IgG2a抗NTHi rP4 ELISA終點效價
*來自鹽水組的值顯著不同表16第5周第6天各單獨小鼠血清中IgG2b抗NTHi rP4 ELISA終點效價
*來自鹽水組的值顯著不同表17第5周第6天各單獨小鼠血清中IgG3抗NTHi rP4 ELISA終點效價
實施例6呼吸道合胞病毒(RSV)的純化天然融合(F)糖蛋白免疫BALB/C小鼠的免疫應答本發明的CT-CRMs增強抗呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白的全身和粘膜反應的能力用純化天然融合(F)蛋白來檢測。前面證明用F蛋白免疫IN的BALB/c小鼠產生全身和局部IgG和IgA效價，F蛋白用CT或CT-CRME29H作為佐劑(Tebbey等，上面引用)。此研究也表明先存在的抗CT抗體對局部或全身抗F蛋白IgA和IgG抗體水平沒有負影響。研究表明先存在的抗CT抗體有益于產生增強的抗F蛋白抗體反應。此外，數據也提示通過粘膜或體液免疫球蛋白中和感染性病毒的機制，免疫球蛋白在對含F/CT-CRME29H的IN免疫操作的應答中被刺激。
BALB/c小鼠(每組5只)在0和3周用單獨在鹽水或制劑中的天然純化F蛋白(3μg/劑量)免疫(IN，0.01ml)，制劑含0.1或1μg一種野生型CT(Sigma)或者0.1或1μg一種遺傳解毒的突變型CT-CRMs(CT-CRME29H、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y)。血清在第二次免疫后2周收集。蛋白-特異IgG、IgA和IgG亞類、血清中和、支氣管肺泡洗液、鼻洗液和陰道洗液中抗體的滴定在96孔微型板中Hep-2細胞單層上雙份進行。此外，免疫小鼠的亞組用活病毒攻擊以確定免疫原性制劑的保護能力。結果列于表20。數字是幾何平均終點抗F蛋白IgG、亞類和IgA抗體效價(±1標準偏差)。
第二次免疫后血清抗體的分析顯示用任何來源于霍亂毒素的佐劑免疫顯著誘導對RSV F蛋白的免疫應答(表18)。以0.1或1μg/劑量使用各霍亂毒素突變型CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y顯著(p＜0.05)誘導RSV F蛋白的血清抗體(總IgG、IgG1、IgG2a和IgA)。對RSV F蛋白的總IgG免疫應答程度通過包含來源于霍亂毒素的佐劑比施用含F/PBS組合物的動物獲得反應提高約25倍。
下表18報導數據的統計顯著性如下。對于總IgGp＜0.05:F/PBS對所有.p＞0.05:F/CT對F/CT-CRME29H對F/CT-CRMI16A對F/CT-CRMI16A，S68Y對F/CT-CRMS68Y，V72Y對F/CT-CRMS68Y，V72Y(0.1和1.0μg/劑量)。對于IgG1p＜0.05:F/PBS對所有.p＞0.05:F/CT對F/CT-CRME29H對F/CT-CRMI16A對F/CT-CRMI16A，S68Y對F/CT-CRMV72Y對F/CT-CRMS68Y，V72Y(0.1和1.0μg/劑量)。對于IgG2ap＜0.05:F/PBS對所有.F/CT(0.1μg)對F/CT-CRMI16A(0.1μg).p＞0.05:在1.0μg劑量，F/CT對F/CT-CRME29H對F/CT-CRMI16A對F/CT-CRMI16A，S68Y對F/CT-CRMV72Y對F/CT-CRMS68Y，V72Y。在0.1μg劑量，F/CT對F/CT-CRME29H對F/CT-CRMI16A，S68Y對F/CT-CRMV72Y對F/CT-CRMS68Y，V72Y。
各新的突變毒素(CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、/CT-CRMV72Y和/CT-CRMS68Y，V72Y)和CTE29H或野生型CT間在總抗IgG或IgG1效價中沒有觀察到顯著差異。通過分析IgG2a和IgA效價觀察到具體組間的統計差異。然而，這些比較沒有顯示關于一種突變體對另一種的免疫性能的一致趨勢。
表18用F蛋白和突變型CT-CRMs鼻內免疫后BALB/c小鼠的體液免疫應答
在另一個實驗中，每組5只BALB/c小鼠在0和3周用天然F蛋白(3μg/劑量)免疫(IN，0.01ml)。F蛋白混合1或0.1μg遺傳解毒的突變體或野生型CT。抗F蛋白抗體反應也在收集的粘膜洗液樣品中分析，樣品來自支氣管肺泡灌洗(BAL)、鼻洗液(NW)和陰道洗液(VW)，在第二次免疫后2周收集。數據代表收集樣品的抗F蛋白IgG和IgA抗體效價。如所預期的，在來自F/PBS免疫小鼠的粘膜洗液中沒有觀察到抗體誘導。然而，各突變型霍亂全毒素的有效粘膜佐劑能力是顯然的。盡管沒有對這些收集樣品進行統計分析，出現了一些趨勢。例如，接受F/CT-CT-CRMV72Y(1.0μg/)的小鼠在各所取的BAL、NW和VW樣品中顯示出提高的IgG和IgA。相比之下，突變毒素CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y和CT-CRMS68Y，V72Y似乎在輔佐對RSV F蛋白的局部免疫應答中可與CT-CRME29H相比。
表19用F蛋白和遺傳解毒的突變體鼻內免疫后BALB/c小鼠的體液免疫應答
在另一個實驗中，BALB/c小鼠在0和3周用天然F蛋白(3μg/劑量)免疫(IN，0.01μl)。F蛋白混合1或0.1μg各遺傳解毒的突變體或野生型CT。在第5周，小鼠用4天后收集的RSV和肺A2菌株攻擊以定量病毒感染性。各突變型霍亂全毒素誘導對RSV攻擊的保護性免疫應答，這是通過病毒性肺荷載測量(表20)。數據表示為平均回收病毒(log10)/g組織。中和病毒在血液中存在5％豚鼠血清作為補體來源(C’)時分析，在第二次免疫后兩周取血。數據顯示平均效價(log10)，表明與對照孔相比pfu/孔中下降60％。
來自病毒感染性試驗的數據統計分析報導為p＜0.05:F/PBS對所有；p＞0.05:F/CT-E29H對F/CT對F/CRM/I16A對F/CRM/I16A對F/CT-CRMV72Y對F/CT-CRMI16A，V72Y對F/CT-CRMS68Y，V72Y，以0.1和1.0μg/劑量。血清中和反應p＜0.05:F/PBS對所有，除了F/CRM/I16A，S68Y(0.1μg).F/CT(1.0)對F/CT-CRM/I16A(0.1).F/CT-CRMI16A，S68Y(0.1)對F/CT-CRMI16A，S68Y(1.0)F/CT(9.0)，F/CT-CRMI16A(1.0)，F/CT-CRME29H(1.0)，F/CT-CRMV72Y(0.1)。
來自F/PBS免疫小鼠的肺明顯有RSV(log103.4pfu/g組織)。相反，那些F蛋白免疫小鼠沒有顯示可檢測病毒，F蛋白與突變型霍亂全毒素共配制。觀察到一些類似模式的血清中和抗體(表20)。那些F/PBS免疫小鼠顯示補體-協助的中和抗體，與以1.0μg每劑量接受突變型霍亂全毒素作為佐劑的所有小鼠相比顯著下降，除了F/CT-CRMI16A，S68Y。在缺乏補體時觀察到中和活性的證據，沒有觀察到統計差異(表20)。這些數據共同表明包括突變型霍亂全毒素CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y，V72Y顯著地影響對RSV F蛋白的功能性免疫應答的程度。
表20用純化F蛋白和突變型CT-CRMs免疫引起的功能性免疫應答
在另一個實驗中，幼稚BALB/c小鼠(8-10周齡，5只/組)在0和3周用天然純化融合(F)蛋白免疫(IN，0.01μl)，蛋白純化自RSV的248/404菌株。蛋白(3μg/劑量)在與1.0或0.1μg所示CT-CRM的混合物中制備。對照小鼠用F蛋白免疫，F蛋白與單獨CT-CRME29H、野生型CT或PBS混合。血清(幾何平均效價±1標準偏差)和支氣管肺泡(BAL)、鼻(NW)和陰道(VW)洗液流體在第二次免疫后兩周收集，用于通過ELISA確定終點抗F蛋白總數和亞類IgG和IgA效價。收集粘膜洗液樣品用于確定終點效價。
來自兩個試驗的結果列于表21和22。
表21.用突變型CT-CRMs制成的F蛋白免疫BALB/C小鼠的幾何血清效價
表22.突變型CT-CRMs制成的F蛋白免疫BALB/c小鼠的收集粘膜洗液樣品的Ig效價，
當本發明的CT-CRM突變體以1.0μg劑量用作粘膜佐劑時，結果類似于使用突變型CT-CRME29H和野生型CT獲得的結果(表21)。F蛋白免疫后沒有觀察到來自抗F蛋白IgG或IgA效價的顯著差異，F蛋白與CT-CRME29H或野生型CT混合。因為收集樣品用于確定粘膜洗液流體中的Ig效價，不能進行統計分析。盡管如此，本發明突變型CT-CRMs引起的效價可與F蛋白誘導的相比，F蛋白與CT-CRME29H或野生型CT混合(表22)。
因此，本發明的所有CT-CRM突變體對F蛋白有佐劑活性。
實施例7粘膜炎莫拉氏菌的USPA2外膜蛋白免疫BALB/C小鼠的免疫應答在此研究中，檢測突變型CT-CRMs增強抗粘膜炎莫拉氏菌的天然UspA2外膜蛋白的全身和粘膜免疫應答的能力。單獨在10μl鹽水或10μl制劑中的純化UspA2(5μg/劑量)在0、7、14天施用給Balb/c小鼠IN，制劑含0.1μg/劑量的突變型CT-CRM(CT-CRME29H、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A，S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y，V72Y)。在第28天檢測血清和粘膜灌洗中的蛋白-特異IgG和IgA水平。所得血清和粘膜IgG效價列于表23。所有突變型CT-CRMs，除了CT-CRMI16A，引起增強的血清IgG抗體反應。測量支氣管、鼻和陰道中的IgG和IgA水平。在任何洗液中沒有檢測到IgA，且IgG僅在幾個洗液中檢測到。
表23UspA2與不同的CT-CRMs鼻內施用小鼠中UspA2引起的UspA2血清效價
實施例8突變霍亂毒素全毒素的佐劑活性為產生全面的有不同毒性、功能性和免疫原性特征的突變型CT-CRMs，上述CT-CRM突變體作為粘膜佐劑分析，并確定各突變體的毒性和酶活性分布。如表24的總結，所有突變型CT-CRMs與所述野生型CT相比有顯著降低的毒性和酶活性。下列數據來自用于評估這些遺傳解毒突變型CTs輔佐免疫應答能力的兩個研究，免疫應答針對來自粘膜炎莫拉氏菌的天然UspA2蛋白。
實驗進行如下BALB/c小鼠(6-8周令，5只小鼠/組)在0、2、4周用5μg純化的天然UspA2蛋白免疫，蛋白在PBS中或與1μg野生型CT或CT-CRME29H或CT-CRMI16A或CT-CRMV72Y或CT-CRMI16A，S68Y或CT-CRMS68Y，V72Y每次免疫共制成。鼻內施用10μl的總體積(5μl每鼻孔)。小鼠在0、2、4或6周放血以試驗血清抗體反應。最后一次免疫(第6周)后兩周，殺死小鼠用于分析粘膜抗體反應。用JMP統計發現軟件(SAS Institute Inc.，Cary，NC)通過Tukey-Kramer HSD多種比較試驗確定組間的顯著差異。
CT-CRMs的佐劑活性可總結如下。第6周的血清抗體分析顯示用UspA2蛋白免疫顯著誘導對UspA2蛋白的IgG抗體反應，蛋白用1μg/劑量濃度的任何CT-CRM突變體制成。對UspA2蛋白的總IgG抗體反應程度通過包含來源于CT的突變體(除了CT-CRMI16A，S68Y)增加約17-38倍(表25)。突變毒素CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、CT-CRMS68Y，V72Y和CT-CRME29H間總抗UspA2 IgG效價中沒有觀察到顯著差異，即使通過Tukey-Kramer HSD試驗它們引起的IgG效價都顯著高于單獨UspA2蛋白(表25)。使用各CT-CRM突變體也提高UspA2蛋白的血清IgG亞類抗體(IgG1、IgG2a和IgG2b)。IgG1和IgG2a或IgG2b效價的比例約為1.0，指示平衡的Th1/Th2型免疫應答。
抗UspA2蛋白抗體反應也在收集的粘膜洗液樣品中分析(表27)。如預期的，在來自UspA2/PBS免疫小鼠的支氣管肺泡灌洗(BAL)、鼻洗液(NW)、陰道洗液(VW)或唾液(SAL)中沒有觀察到抗體的誘導。然而，CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、CT-CRMS68Y，V72Y和CT-CRMI16A，S68Y的有效粘膜佐劑能力是明顯的。在大部分粘膜樣品中檢測到UspA2特異粘膜IgA抗體。盡管對這些收集樣品不能進行統計分析，出現一些趨勢。例如，接受CT-CRMV72Y的小鼠在各測試的NW、VW和唾液樣品中顯示提高的UspA2特異IgA抗體。
CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、和CT-CRMS68Y，V72Y是用于卡他莫拉菌UspA2蛋白的有效粘膜佐劑。血清抗體數據顯示所有1μg的CT-CRMs除了CT-CRMI16A， S68Y，輔佐對UspA2蛋白的免疫應答能力與CT-CRME29H相同(表25和26)。粘膜洗液數據表明所有突變型CT-CRMs保持有效粘膜佐劑性(表27)。此外如表24所示，它們的毒性和酶活性顯著低于野生型CT。因此，CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、CT-CRMS68Y，V72Y和CT-CRMI16A，S68Y是另外的有效粘膜佐劑。
表24.突變霍亂毒素的特征
每組5只雌性BALB/c小鼠在0、2、4周用10μl溶液鼻內免疫，溶液含用1μg CT(Sigma)或CT突變體輔佐的5μg nUspA2。終點抗體效價從第5周第6天收集的血清中確定。數據表示為相互稀釋的幾何平均(±1SD)，結果是OD405為0.1。統計分析是用Tukey-Kramer。結果列于表25。
表25突變型CTs輔佐的nUspA2鼻內免疫后BALB/c小鼠的血清抗nUspA2反應
*顯著高于nUspA2/PBS組Φ顯著低于所有其它輔佐的組每組5只雌性BALB/c小鼠在0、2、4周用10μl溶液鼻內免疫，溶液含用1μg CT(Sigma)或CT突變體輔佐的5μg nUspA2。終點抗體效價從第5周第6天收集的血清中確定。數據表示為相互稀釋的幾何平均(±1SD)，結果是OD405為0.1。統計分析是用Tukey-Kramer。結果列于表26。
表26用突變型CT-CRMs輔佐的nUspA2鼻內免疫后BALB/c小鼠的血清抗nUspA2反應
*顯著高于nUspA2/PBS組每組5只雌性BALB/c小鼠在0、2、4周用10μl溶液鼻內免疫，溶液含用1μg CT(Sigma)或CT突變體輔佐的5μg nUspA2。終點抗體效價從第6周收集的粘膜洗液中確定。數據表示為相互稀釋，結果是OD405為0.1。統計分析用Tukey-Kramer。結果示列表25。
表27用突變型CTs輔佐的nUspA2鼻內免疫后BALB/c小鼠的粘膜抗nUspA2反應
本說明引用的所有出版物和文獻納入本文供參考。盡管發明已描述關于具體較佳實施方案，需理解的是，可不背離本發明的精神作出修改。這些修改在所附的權利要求書范圍內。
序列表<110>美國氰胺公司(American Cyanamid Company)科羅拉多大學(University of Colorado)B.A.格林(Green，Bruce A.)R.K.荷爾姆斯(Holmes，Randall K.)M.G.喬布林(Jobling，Michael G.)D.朱(Zhu，Duzhang)<120>作為佐劑的霍亂全毒素的突變體形式<130>AM100450PCT<150>US 60/296,537<151>2001-06-07<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>382<212>PRT<213>霍亂弧菌(Vibrio cholerae)<400>1Met Val Lys Ile Ile Phe Val Phe Phe Ile Phe Leu Ser Ser Phe Ser1 5 10 15Tyr Ala Asn Asp Asp Lys Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp20 25 30Glu Ile Lys Gln Ser Gly Gly Leu Met Pro Arg Gly Gln Ser Glu Tyr35 40 45Phe Asp Arg Gly Thr Gln Met Asn Ile Asn Leu Tyr Asp His Ala Arg50 55 60Gly Thr Gln Thr Gly Phe Val Arg His Asp Asp Gly Tyr Val Ser Thr65 70 75 80Ser Ile Ser Leu Arg Ser Ala His Leu Val Gly Gln Thr Ile Leu Ser85 90 95
Gly His Ser Thr Tyr Tyr Ile Tyr Val Ile Ala Thr Ala Pro Asn Met100 105 110Phe Asn Val Asn Asp Val Leu Gly Ala Tyr Ser Pro His Pro Asp Glu115 120 125Gln Glu Val Ser Ala Leu Gly Gly Ile Pro Tyr Ser Gln Ile Tyr Gly130 135 140Trp Tyr Arg Val His Phe Gly Val Leu Asp Glu Gln Leu His Arg Asn145 150 155 160Arg Gly Tyr Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Asn Leu Asp Ile Ala Pro Ala165 170 175Ala Asp Gly Tyr Gly Leu Ala Gly Phe Pro Pro Glu His Arg Ala Trp180 185 190Arg Glu Glu Pro Trp Ile His His Ala Pro Pro Gly Cys Gly Asn Ala195 200 205Pro Arg Ser Ser Met Ser Asn Thr Cys Asp Glu Lys Thr Gln Ser Leu210 215 220Gly Val Lys Phe Leu Asp Glu Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg Gln Ile225 230 235 240Phe Ser Gly Tyr Gln Ser Asp Ile Asp Thr His Asn Arg Ile Lys Asp245 250 255Glu Leu Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu260 265 270Ser Ser Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys275 280 285Ala Glu Ser His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe290 295 300Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr305 310 315 320Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Ser Ser Gln His325 330 335
Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg340 345 350Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn355 360 365Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn370 375 380<210>2<211>240<212>PRT<213>霍亂弧菌(Vibrio cholerae)<400>2Asn Asp Asp Lys Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp Glu Ile1 5 10 15Lys Gln Ser Gly Gly Leu Met Pro Arg Gly Gln Ser Glu Tyr Phe Asp20 25 30Arg Gly Thr Gln Met Asn Ile Asn Leu Tyr Asp His Ala Arg Gly Thr35 40 45Gln Thr Gly Phe Val Arg His Asp Asp Gly Tyr Val Ser Thr Ser Ile50 55 60Ser Leu Arg Ser Ala His Leu Val Gly Gln Thr Ile Leu Ser Gly His65 70 75 80Ser Thr Tyr Tyr Ile Tyr Val Ile Ala Thr Ala Pro Asn Met Phe Asn85 90 95Val Asn Asp Val Leu Gly Ala Tyr Ser Pro His Pro Asp Glu Gln Glu100 105 110Val Ser Ala Leu Gly Gly Ile Pro Tyr Ser Gln Ile Tyr Gly Trp Tyr115 120 125Arg Val His Phe Gly Val Leu Asp Glu Gln Leu His Arg Asn Arg Gly130 135 140Tyr Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Asn Leu Asp Ile Ala Pro Ala Ala Asp145 150 155 160
Gly Tyr Gly Leu Ala Gly Phe Pro Pro Glu His Arg Ala Trp Arg Glu165 170 175Glu Pro Trp Ile His His Ala Pro Pro Gly Cys Gly Asn Ala Pro Arg180 185 190Ser Ser Met Ser Asn Thr Cys Asp Glu Lys Thr Gln Ser Leu Gly Val195 200 205Lys Phe Leu Asp Glu Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg Gln Ile Phe Ser210 215 220Gly Tyr Gln Ser Asp Ile Asp Thr His Asn Arg Ile Lys Asp Glu Leu225 230 235 240<210>3<21l>42<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>β-淀粉樣肽<400>3Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>4<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>α-β-淀粉樣肽
<400>4Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys20 25<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>S可以是G或C<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>Y可以是C或T<400>5cctcctgatg aagsycaagc agtcagg 27<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>6gtttgagatc tgcccact 18<210>7
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>7gtttgaccca ctaagtgggc 20<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>8gtttgagata tgcccactta tatggtcaac 30<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物序列<400>9ttttttgggc tagcatggag gaaaagatga gc32<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物序列
<400>10cgaggtcgaa gcttgcatgt ttgggc 2權利要求
1.一種包括野生型霍亂毒素(CT)的亞基A氨基酸序列的免疫原性、突變型霍亂全毒素(CT-CRM)，其特征在于，所述亞基A包括至少一個在野生型CT亞基A氨基酸16位或72位上的氨基酸取代，所述突變型CT-CRM與所述野生型CT相比毒性降低。
2.如權利要求1所述的CT-CRM，其特征在于，所述CT-CRM包括單個氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸16位。
3.如權利要求2所述的CT-CRM，其特征在于，所述CT-CRM包括單個氨基酸取代，其中A亞基中氨基酸16位上的氨基酸異亮氨酸由丙氨酸取代。
4.如權利要求1所述的CT-CRM，其特征在于，所述亞基A與所述野生型CT的不同在于位于氨基酸16位的一個氨基酸取代和位于氨基酸68位的一個氨基酸取代。
5.如權利要求4所述的CT-CRM，其特征在于，A亞基中氨基酸16位上的氨基酸異亮氨酸由丙氨酸取代，A亞基中氨基酸68位上的氨基酸絲氨酸由丙氨酸取代。
6.如權利要求1所述的CT-CRM，其特征在于，所述CT-CRM包括單個氨基酸取代，其中所述取代位于氨基酸72位。
7.如權利要求6所述的CT-CRM，其特征在于，所述CT-CRM包括單個氨基酸取代，其中A亞基中氨基酸72位上的氨基酸纈氨酸由酪氨酸取代。
8.如權利要求1所述的CT-CRM，其特征在于，所述亞基A與所述野生型CT的不同在于位于氨基酸72位的一個氨基酸取代和位于氨基酸68位的一個氨基酸取代。
9.如權利要求8所述的CT-CRM，其特征在于，A亞基中氨基酸68位上的氨基酸絲氨酸由丙氨酸取代，A亞基中氨基酸72位上的氨基酸纈氨酸由酪氨酸取代。
10.如權利要求1所述的CT-CRM，其特征在于，所述CT-CRM進一步包括至少一個在霍亂全毒素的A亞莖中氨基酸位置上的添加突變除A亞基中氨基酸16位、68位和72位以外。
11.如權利要求10所述的CT-CRM，其特征在于，一種添加突變是取代A亞基的氨基酸，氨基酸選自氨基酸7位的精氨酸、氨基酸9位的天冬氨酸、氨基酸11位的精氨酸、氨基酸29位的谷氨酸、氨基酸44位的組氨酸、氨基酸53位的纈氨酸、氨基酸54位的精氨酸、氨基酸61位的絲氨酸、氨基酸63位的絲氨酸、氨基酸70位的組氨酸、氨基酸97位的纈氨酸、氨基酸104位的酪氨酸、氨基酸106位的脯氨酸、氨基酸107位的組氨酸、氨基酸109位的絲氨酸、氨基酸110位的谷氨酸、氨基酸112位的谷氨酸、氨基酸114位的絲氨酸、氨基酸127位的色氨酸、氨基酸146位的精氨酸和氨基酸192位的精氨酸。
12.如權利要求1-11中任一項所述的包括突變型霍亂全毒素(CT-CRM)的免疫原性組合物，其特征在于，突變型霍亂全毒素增強脊椎動物宿主中對抗原的免疫應答。
13.如權利要求12所述的組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括的抗原不源于致病細菌、病毒、真菌或寄生蟲、癌細胞、腫瘤細胞、變應原和自身分子。
14.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，選擇的細菌抗原是蛋白質、來源于蛋白質的多肽、肽或片段。
15.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，細菌抗原選自細菌種類典型和非典型流感嗜血桿菌、睡眠嗜血桿菌、粘膜炎莫拉氏菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、無乳鏈球菌、糞鏈球菌、幽門螺桿菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、沙眼衣原體、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體、百日咳博德特氏菌、耳炎差異球菌、傷寒沙門氏桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌、霍亂弧菌、白喉桿菌、結核分枝桿菌、鳥分枝桿菌-胞內復合體結核分枝桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破傷風桿菌、問號鉤端螺旋體、伯氏疏螺旋體、溶血性巴斯德菌、多殺巴斯德菌、胸膜肺炎放線桿菌和雞敗血支原體。
16.如權利要求15所述的抗原組合物，其特征在于，流感嗜血桿菌抗原選自流感嗜血桿菌P4外膜蛋白、流感嗜血桿菌P6外膜蛋白和流感嗜血桿菌粘附和穿透蛋白(Haps)。
17.如權利要求15所述的組合物，其特征在于，幽門螺桿菌抗原是幽門螺桿菌尿素酶蛋白。
18.如權利要求15所述的組合物，其特征在于，腦膜炎奈瑟氏球菌抗原選自腦膜炎奈瑟氏球菌B組I型菌毛蛋白(rpilin)和腦膜炎奈瑟氏球菌B組I型外膜蛋白(PorA)。
19.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括致病病毒的抗原。
20.如權利要求19所述的組合物，其特征在于，選擇的病毒抗原是蛋白質、來源于蛋白質的多肽、肽或片段。
21.如權利要求20所述的組合物，其特征在于，病毒抗原選自病毒種類呼吸道合胞病毒、副流感病毒1-3型、人肺炎后病毒、流感病毒、單純皰疹病毒、人巨細胞病毒、人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、脊髓灰質炎病毒、輪狀病毒、杯狀病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風疹病毒、腺病毒、狂犬病病毒、犬瘟熱病毒、牛瘟病毒、禽肺病毒(以前的火雞鼻氣管炎病毒)、Hendra病毒、Nipah病毒、冠狀病毒、細小病毒、傳染性鼻氣管炎病毒、貓白血病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、禽傳染性囊病病毒、新城疫病病毒、馬立克氏病病毒、豬呼吸道和生殖綜合癥病毒、馬動脈炎病毒和腦炎病毒。
22.如權利要求21所述的組合物，其特征在于，呼吸道合胞病毒抗原是呼吸道合胞病毒融合蛋白。
23.如權利要求21所述的組合物，其特征在于，單純皰疹病毒(HSV)抗原是單純皰疹病毒(HSV)2型糖蛋白D(gD2)。
24.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括來自致病真菌的抗原。
25.如權利要求24所述的組合物，其特征在于，選擇的真菌抗原是蛋白質、來源于蛋白質的多肽、肽或片段。
26.如權利要求24所述的組合物，其特征在于，真菌抗原來自的真菌選自致病真菌曲霉菌、芽生菌、假絲酵母、球孢子菌、隱球菌和組織胞漿菌。
27.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括來自致病寄生蟲的抗原。
28.如權利要求27所述的組合物，其特征在于，選擇的寄生蟲抗原是蛋白質、來源于蛋白質的多肽、肽或片段。
29.如權利要求27所述的組合物，其特征在于，寄生蟲抗原來自的寄生蟲選自致病寄生蟲利什曼蟲、蛔蟲、鞭蟲、賈第蟲、血吸蟲、似隱孢子蟲、毛滴蟲、鼠弓形體和卡氏肺囊蟲。
30.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述抗原來源于癌細胞或腫瘤細胞。
31.如權利要求30所述的組合物，其特征在于，所述癌細胞或腫瘤細胞抗原選自前列腺特異抗原、癌-胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125、MAGE-3、激素和激素類似物。
32.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述抗原是來源于淀粉樣前體蛋白的多肽、肽或片段或者變應原。
33.如權利要求32所述的組合物，其特征在于，淀粉樣前體蛋白抗原是Aβ肽，它是淀粉樣前體蛋白的42個氨基酸片段或Aβ肽的片段。
34.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括稀釋劑、賦形劑或載體。
35.如權利要求12所述的組合物，其特征在于，所述組合物除了突變型霍亂全毒素進一步包括第二種佐劑。
36.一種增強脊椎動物宿主對抗原免疫應答的方法，其特征在于，所述方法包括給宿主施用權利要求12或13的組合物。
37.一種分離和純化的DNA序列，其特征在于，所述序列編碼權利要求1-11中任一項所述的免疫原性、突變型霍亂全毒素。
38.一種包括分離和純化的核酸序列的核酸分子，其特征在于，核酸序列編碼權利要求1-11中任一項所述的免疫原性、突變型霍亂全毒素，其中編碼免疫原性、突變型霍亂全毒素的序列操作連接于能在宿主細胞中表達所述突變全毒素的調節序列。
39.如權利要求38所述的分子，其特征在于，所述調節序列是可誘導啟動子。
40.如權利要求38所述的分子，其特征在于，所述啟動子是阿拉伯糖可誘導啟動子。
41.如權利要求38所述的分子，其特征在于，所述分子是病毒或非病毒載體。
42.如權利要求41所述的分子，其特征在于，所述非病毒載體是DNA質粒。
43.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞用權利要求38所述的核酸分子轉化、轉導、感染或轉染。
44.一種產生免疫原性、突變型霍亂全毒素的方法，其特征在于，霍亂全毒素與所述野生型霍亂全毒素相比毒性降低，且在霍亂全毒素a的亞基中有單個氨基酸取代，包括用權利要求38所述的核酸分子轉化、感染、轉導或轉染宿主細胞，在允許宿主細胞表達所述重組免疫原性解毒蛋白的條件下培養宿主細胞。
45.如權利要求1-11中任一項所述的有效佐劑量的突變型霍亂全毒素的使用，其特征在于，結合的選擇抗原來自致病細菌、病毒、真菌、寄生蟲、癌細胞、腫瘤細胞、變應原、自身分子或脊椎動物抗原以制備免疫原性組合物，其中所述突變型霍亂全毒素增強脊椎動物宿主對所述抗原的免疫應答。
全文摘要
突變型霍亂全毒素包括霍亂毒素亞基(A)在氨基酸位置(16或72)有單個氨基酸取代或者雙重氨基酸位置(16和68)或(68和72)與所述野生型霍亂全毒素相比毒性降低。突變型霍亂全毒素用作免疫原性組合物中的佐劑以提高脊椎動物宿主對選擇的抗原的免疫應答，選擇的抗原來自致病細菌、病毒、真菌或寄生蟲、癌細胞、腫瘤細胞、變應原或自身分子。
文檔編號A61K39/002GK1538854SQ02815412
公開日2004年10月20日 申請日期2002年6月5日 優先權日2001年6月7日
發明者B·A·格林, R·K·荷爾姆斯, M·G·喬布林, D·朱, B A 格林, 喬布林, 荷爾姆斯 申請人:惠氏控股有限公司, 科羅拉多大學董事會