用于減弱牲畜體內牛支原體肺炎的豬肺炎支原體疫苗和方法

專利名稱：用于減弱牲畜體內牛支原體肺炎的豬肺炎支原體疫苗和方法
技術領域：
本發明涉及通過給藥動物有效量的豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，M.hyo)疫苗來治療或預防動物體內由牛支原體(Mycoplasmabovis，M.bovis)感染所致的疾病或病癥的方法。所述豬肺炎支原體疫苗可以是滅活后的完整細胞或該細胞的一部分，或者是經過修飾的活的制品，亞單位疫苗，或者核酸或DNA疫苗。依照本發明給藥的豬肺炎支原體疫苗可以是合成的或重組制備的。
背景技術：
牛支原體是一種圈養的或集中飼養(intensively reared)的產肉牲畜(cattle)或產奶牲畜體內的牛病原體。報道最多的臨床表現是小牛(calves)的肺炎，其常伴有關節炎，又稱肺炎-關節炎綜合征。其病原學作用還與乳腺炎，耳炎以及母牛(cow)和公牛(bull)的生殖疾病或病癥有關。牛呼吸疾病所導致的死亡率中高達36％與牛支原體有關，所以牛支原體誘導的呼吸疾病與重大經濟損失相關聯。為了降低死亡率，常使用抗生素治療，因為目前尚無完全得到許可的疫苗。對牛支原體疾病的預防也可以降低動物對其它呼吸疾病的易感性。所以，有必要開發有效且安全的抗牛支原體的疫苗。豬肺炎支原體是一種細菌性病原體，可導致豬的地方性動物病性肺炎。大多數已知的抗豬肺炎支原體的疫苗是基于滅活的完整豬肺炎支原體細胞制品。其它的抗豬肺炎支原體疫苗包括亞單位疫苗(其由豬肺炎支原體衍生的蛋白，多肽或這些蛋白或多肽的免疫原性片段組成)和DNA疫苗(其由編碼一種或多種豬肺炎支原體衍生蛋白或多肽及其免疫原性片段的DNA組成)。
滅活的完整細胞形式的豬肺炎支原體疫苗的實例包括RESPISURE和STELLAMUNE，它們可從Pfizer Inc.，USA購置。
已報道過多種豬肺炎支原體蛋白。國際專利申請WO 96/28472描述了6種豬肺炎支原體蛋白抗原，它們的分子量是46-48，52-54，60-64，72-75，90-94和110-114千道爾頓，該文獻還公開了52-54，60-64和72-75千道爾頓抗原的部分蛋白序列和46-48千道爾頓抗原的全長核苷酸和氨基酸序列。
對編碼豬肺炎支原體蛋白P46的基因，即p46進行的克隆可參見Futo等，J.Bacteriol 1771915-1917(1995)和歐洲專利申請0 475 185 A1。
Wise和Kim(1987，J.Bacteriol.1695546-5555)報道了豬肺炎支原體中的四種完整(integral)膜蛋白，命名為p70，p65(P65，出處同上)，p50和p44，后三種有脂質共價附著，能誘導很強的體液免疫應答。但對這種免疫應答的保護性效果沒作研究。編碼P65蛋白的基因已經克隆出，其序列以及在疫苗和診斷試劑中的用途可參見美國專利5,788,962。
國際專利申請WO 91/15593描述了豬肺炎支原體的5種蛋白，它們的表觀分子量為105，90，85，70和43千道爾頓。編碼85千道爾頓蛋白(蛋白C)的基因的全長序列，以及編碼其它四種蛋白的部分核苷酸序列也已公開。
Faulds的美國專利5,252,328公開了多種免疫反應性豬肺炎支原體蛋白的氨基末端序列，其分子量是36，41，44，48，64，68，74.5，79，88.5，96和121千道爾頓。基于電泳遷移率鑒定的但沒有公開其蛋白序列的其它蛋白的表觀分子量是22.5，34和52千道爾頓。美國專利5,252,328建議在抗豬肺炎支原體感染的疫苗制劑中使用這些蛋白，但沒有報道疫苗試驗的結果。
國際專利申請WO 95/09870公開了純化豬肺炎支原體粘附素的生物化學方法，所述粘附素是支原體的完整膜蛋白，負責粘附到宿主上呼吸道上皮的纖毛上。WO 95/09870也建議了針對這些蛋白進行的檢測和應用，例如在疫苗和診斷試劑中的應用。
King等的研究報告(1997；Vaccine 1525-35)公開了Mhp1，這是一種124千道爾頓的粘附素，是P97的一種株變體。
P97的94千道爾頓變體由Wilton等鑒定(1998，Microbiology 1441931-1943)。另外，有證據表明p97基因是一種操縱子的一部分，該操縱子也編碼預計分子量為102千道爾頓、命名為P102的第二種蛋白(Hsu et al.，1998，Gene 21413-23)。Minion和Hsu在國際專利申請WO 99/26664中提示了P102在抗豬肺炎支原體感染的疫苗中的應用，但沒有報告疫苗試驗。
在本發明之前，尚無人認識到豬肺炎支原體疫苗能對牛提供抗御牛支原體所導致的疾病的保護性作用。
發明概述本發明提供一種治療或預防動物體內由牛支原體感染所導致的疾病或病癥的方法，該方法包括給藥動物有效量的豬肺炎支原體疫苗。
本發明進一步提供了一種能抗御動物(如產奶的牲畜，尤其是牛)的肺炎的保護方法，例如預防和降低肺損傷。
本發明進一步提供了一種使用豬肺炎支原體疫苗進行免疫接種的方法，該方法增加小牛的免疫能力，從而增加對其它BRD病原體的抗性，例如降低對下列病原體所導致的感染和疾病的易感性，所述病原體包括但不限于牛皰疹病毒1型(bovine herpesvirus type 1(BHV-1))，牛病毒性腹瀉病毒(bovineviral diarrhea virus(BVDV))，牛呼吸道合胞病毒(bovine respiratory syncitialvirus(BRSV))，副流感病毒(parainfluenza virus(P13))，多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)，睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)，蕈狀支原體(Mycoplasma mycoides)，無乳支原體(Mycoplasma agalactiae)，加利福尼亞支原體(Mycoplasma californicum)，牛鼻支原體(Mycoplasma bovirhinis)，殊異支原體(Mycoplasma dispar)，犬支原體(Mycoplasma canis)以及Manheimiahaemolytica。本發明也涉及豬肺炎支原體疫苗，以及涉及給藥動物有效量的豬肺炎支原體疫苗和可藥用載體、以便從感染的牛群(herds)中去除牲畜支原體的方法。
本發明方法中所用的豬肺炎支原體疫苗可以是完整或部分細胞的制品(例如菌苗或經過修飾的活制品)，亞單位疫苗(例如，由豬肺炎支原體衍生的蛋白，多肽或其免疫原性片段組成的亞單位疫苗)，DNA疫苗(例如編碼豬肺炎支原體衍生的蛋白，多肽或其免疫原性片段的DNA)。豬肺炎支原體多肽，蛋白，其免疫原性片段，以及提供在豬肺炎支原體疫苗中的基因或核酸可使用本領域已知技術進行人工合成或重組制備。
依照本發明給藥的豬肺炎支原體疫苗還可包括另外的成分，如佐劑，還可以有第二種或更多種在組合疫苗中用到的抗原。所述第二種抗原可選自如下，包括但不限于這些牛皰疹病毒1型(BHV-1)，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，副流感病毒(P13)，多殺巴斯德氏菌，睡眠嗜血菌，蕈狀支原體，無乳支原體，加利福尼亞支原體，牛鼻支原體，殊異支原體，犬支原體以及Manheimia haemolytica。


圖1描述在即將進行實驗性牛支原體攻擊之前和剛剛攻擊之后小牛的平均體溫。在攻擊之前A組小牛接種了兩劑豬肺炎支原體菌苗。B組小牛在攻擊之前接種的是安慰劑。
發明詳述本發明提供了一種治療或預防動物體內由牛支原體感染所導致的疾病或病癥的方法，該方法是給藥所述動物有效量的豬肺炎支原體疫苗。
在一些實施方案中，本發明方法中所用的疫苗包含滅活的部分或完整豬肺炎支原體細胞的制品(菌苗)或經過修飾的活疫苗以及可藥用載體，或者是滅活的部分或完整豬肺炎支原體細胞的制品(菌苗)或經過修飾的活疫苗以及佐劑。
在其它具體實施方案中，本發明所用的疫苗包含免疫原性蛋白或多肽或其片段以及可藥用載體，或者免疫原性蛋白或多肽或其片段以及佐劑。
為清楚地公開，而非旨在限制，將本發明的詳細描述分為以下多個部分，以描述或舉例說明本發明的一些特征，實施方案或應用。
定義或縮寫本文所用的針對牛支原體感染而言的術語“治療或預防”是指抑制牛支原體細菌的繁殖，抑制牛支原體的排出或傳播，或防止牛支原體在其宿主中定居下來，以及減輕由牛支原體感染所導致的疾病或病癥的癥狀，或加速牛支原體從所述動物宿主中清除。如果細菌量下降，肺感染減弱，直腸溫度下降和/或攝食量增加和/或有所長大，那就可認為治療是有效果的。本發明的方法在，例如以下方面有效預防或降低肺損傷，降低直腸溫度，以及使肺中通常可見于牛支原體感染的牛支原體水平降低。
本發明通過給藥豬肺炎支原體疫苗來治療或預防牛支原體感染的方法在本文中也稱為免疫接種方法。
本發明所用的術語“豬肺炎支原體疫苗”可包括，例如，滅活的完整或部分豬肺炎支原體細胞的制品，經過修飾的活疫苗，具有一種或多種豬肺炎支原體衍生蛋白、多肽或所述蛋白或多肽的免疫原性片段的亞單位疫苗，或者一種或多種編碼一種或多種豬肺炎支原體衍生的蛋白、多肽或其免疫原性片段的豬肺炎支原體基因或核酸，且所述基因或核酸能夠在所述動物體內表達。所述豬肺炎支原體多肽、蛋白、這些多肽和蛋白的免疫原性片段，或者豬肺炎支原體的基因或核酸，可利用本領域已知技術合成或重組制備。優選，本發明方法中所用的豬肺炎支原體疫苗是菌苗。
本文所用的術語“免疫原性片段”是指來自豬肺炎支原體的蛋白的片段，該片段在宿主動物中能誘導免疫應答。所述免疫應答可包含，但不限于誘導細胞免疫和/或體液免疫。
本文所用術語“動物”是指所有的非人動物，包括哺乳動物。
本文所用術語“牲畜”是指牛類，包括但不限于菜牛(steer)、公牛、母牛以及小牛。優選，本發明的方法應用于非人哺乳動物，最優選小牛。
本文所用術語“菌苗”是指適合用作疫苗的滅活的豬肺炎支原體完整細胞或細胞的一部分的制品。
術語“免疫有效量”是指豬肺炎支原體疫苗的量足以引發所給藥動物體內的免疫應答。所述免疫應答可包括，但不限于，誘導細胞免疫和/或體液免疫。豬肺炎支原體疫苗的有效量是指，例如，該菌苗預防支原體肺炎或降低其嚴重程度。
本文所用術語“佐劑”是指免疫應答的增效劑。
術語“可藥用載體”是指這樣的載體介質，其不干擾活性成分的生物活性的有效性，本身是化學惰性的且對所給藥個體而言是沒有毒性的。
滅活的(部分或完整的細胞)和經過修飾的活疫苗用于本發明方法中的豬肺炎支原體滅活疫苗或經過修飾的豬肺炎支原體活疫苗可利用本領域已知的多種方法制備。
例如，豬肺炎支原體菌苗可從豬肺炎支原體分離物制備。多種豬肺炎支原體分離物對本領域技術人員而言是已知的，且可從，例如美國典型培養物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209獲得。這些菌株包括，例如ATCC保藏號為25095，25617，25934，27714，和27715的菌株。
豬肺炎支原體分離物也可以用已知技術直接從已感染的豬(porcine)的肺部損傷處獲得。
豬肺炎支原體分離物可用各種已知技術滅活，例如，用美國專利5,565,205所述的二元吖丙啶(binary ehtyleneimine，BEI)處理細菌分離物，或用福爾馬林，戊二醛，加熱，輻射，BPL，或本領域已知的其它滅活劑來滅活。
除了滅活的細菌分離物外，菌苗產品也可以包含適量的一或多種常用佐劑。適當的佐劑包括，但不限于，無機膠，例如，氫氧化鋁；表面活性物質如溶血卵磷脂；糖苷類物質，例如，皂角苷和皂角苷衍生物如Quil A或GPI-0100；陽離子表面活性劑，如DDA(四烴鹵化銨、pluronic多元醇；聚陰離子(polyanions)和多原子離子(polyatomic ions)；聚丙烯酸，非離子型封閉聚合物，例如，Pluronic F-127(B.A.S.F.，USA)；阿夫立定(Avridine)和雷尼替丁(Rantidine)；肽；不穩定毒素的重組突變體，例如，淋巴毒素(LT)或霍亂毒素(CT)；化學結合的或緊密接近的分子運輸體；礦物油，例如MontanideISA-50(Seppic，Paris，法國)，聚羰乙烯(carbopol)，Amphigen(Hydronics，USA)，Omaha，NE.USA，Alhydrogel，(Superfbs Biosector，Frederikssund，丹麥)油性乳劑，例如，礦物油乳劑如BayolF/Arlacel A和水，或植物油乳劑，水和乳化劑如卵磷脂；明礬，膽固醇細胞因子以及上述佐劑的組合。多原子離子也可起分散劑，增稠劑和抗結塊劑(anticaking agents)的作用，使所述疫苗在較長時間放置后可重新懸浮成為一種單分散(mondisperse)懸浮液。所述佐劑的組合可以呈水性，膠囊形式(控釋或緩釋)或微膠囊形式。適合用于本發明方法中的豬肺炎支原體菌苗也可以通過多種商業途徑獲得。這樣的商業途徑包括但不限于RESPIFEND(Fort Dodge，American Home Products)，HYORESP(Merial Ltd)，M+PAC(Schering Plough)，PROSYSTEM M(Intervet)，INGLEVAC M(Boehringer)，RESPISURE(Pfizer Inc)和STELLAMUNE MYCOPLASMA(Pfizer Inc)。
用于本發明方法中的豬肺炎支原體菌苗的優選來源是RESPISURE，RESPISURE ONE和STELLAMUNE MYCOPLASMA。
用于本發明方法中的豬肺炎支原體菌苗的尤其優選來源是RESPISURE(PFIZER INC.)，包含菌株NL1042。
優選，菌株NL1042用BEI滅活，并用可商購的佐劑，優選AMPHIGEN(Hydronics，USA)輔佐。優選劑量是約2.0ml。常規應用的保存劑包括硫柳汞/EDTA。疫苗可配制成液體劑型，或者可出現在由可溶性成分或微粒組成的固體劑型中，在使用前將其重懸在可藥用稀釋劑中。制備可溶性成分或微粒的方法包括，但不限于，biacervation，congelgation，噴霧干燥(spray drying)，注射發泡(bubble syringes)，沉淀，超臨界溶劑化(supercritical sovlation)/膠囊化(encapsulation)以及冷凍干燥。可以添加載體，優選是PBS。經過修飾的活疫苗的制備是本領域已知的，如通過進行傳代培養使毒力株減毒來制備。
滅活的豬肺炎支原體分離物也可與包括但不限于以下的細菌和病毒組合牛皰疹病毒1型(BHV-1)，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，副流感病毒(P13)，多殺巴斯德氏菌，睡眠嗜血菌，蕈狀支原體，無乳支原體，加利福尼亞支原體，牛鼻支原體，殊異支原體，犬支原體以及Manheimia haemolytica。
亞單位疫苗本發明的方法可用亞單位疫苗來進行，所述亞單位疫苗由純化的豬肺炎支原體免疫原性蛋白，多肽，或這些蛋白和多肽的免疫原性片段組成。所述蛋白和多肽可用本領域已知的技術制備，例如用表面作用劑制備的提取物，或熱、化學和機械的提取物。蛋白的純度或均一性可用本領域熟知的方法來確定，所述方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳及之后的適當凝膠染色，HPLC或本領域已知的其它類似方法。
在一個實施方案中，本發明所用的亞單位疫苗包括至少一種豬肺炎支原體蛋白或多肽。該疫苗中所用的優選的豬肺炎支原體蛋白或多肽包括但不限于P46，P65，P85，P97，P102，P70，P50和P44。這些以及其它的豬肺炎支原體蛋白已在國際專利申請WO96/28472和WO95/09870，歐洲專利申請0 475185 A1，美國專利5,788,962，國際專利申請WO91/15593，美國專利5,252,328，King等(1997；Vaccine 1525-35)，Wilton等(1998，Microbiology 1441931-1943)，以及Hsu等(1998，Gene 21413-23)中描述。
在另一實施方案中，本發明方法中所用疫苗包括至少一種豬肺炎支原體蛋白或多肽的免疫原性片段。根據本發明，包括在所述疫苗中的免疫原性片段具有豬肺炎支原體蛋白或多肽的至少約10至20，優選至少約30至40，或更優選至少50至約100個連續氨基酸的序列。優選，所述免疫原性片段是豬肺炎支原體蛋白或多肽的片段，所述蛋白或多肽包括但不限于P46，P65，P85，P97，P102.P70，P50和P44。
優選，用于疫苗中的豬肺炎支原體蛋白是基本純或均一的。例如，所需的豬肺炎支原體蛋白或多肽可在用編碼該蛋白或多肽的核苷酸序列轉化的宿主細胞中表達，然后用各種本領域已知的方法純化。參見，例如″酶學方法″，1990，Academic Press，Inc.，San Diego，″蛋白的純化原理與實踐″，1982，Springer-Verlag，New York中所述。純化的豬肺炎支原體多肽和蛋白以及它們的免疫原性片段也可用本領域已知的合成方法來制備。
在另一實施方案中，本發明方法中所用的疫苗包括豬肺炎支原體蛋白、多肽或它們的免疫原性片段，以及至少一種其它的免疫原性或抗原性多肽，該多肽不是豬肺炎支原體蛋白、多肽或它們的免疫原性片段，優選是病毒的、細菌的或寄生蟲的多肽。在優選實施方案中，所述抗原是牛皰疹病毒1型(BHV-1)，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，副流感病毒(P13)，多殺巴斯德氏菌，睡眠嗜血菌，蕈狀支原體，無乳支原體，加利福尼亞支原體，牛鼻支原體，殊異支原體，犬支原體或Manheimia haemolytica。這樣的組合物作為組合疫苗是有利的。本發明的亞單位疫苗和組合疫苗可應用在本發明的方法中，以治療或預防由牛支原體感染所導致的疾病或病癥。
牛支原體多肽和蛋白以及它們的免疫原性片段也可以用活的重組病毒和細菌載體，如腺病毒或沙門氏菌來表達并釋放。真正的載體在本領域內也是已知的，且很容易得到，或者可以用熟知的方法由本領域技術人員構建。
核酸疫苗本發明的接種方法可以用豬肺炎支原體基因或核酸分子來操作，所述基因或核酸分子編碼豬肺炎支原體蛋白、多肽或這些蛋白和多肽的免疫原性片段。這樣的基因和核酸可用本領域已知的的技術制備，并向動物給藥以在體內表達所編碼的蛋白、多肽或它們的片段。
在一個實施方案中，本發明中所用的疫苗包括至少一種基因或核酸分子，所述基因或核酸分子編碼豬肺炎支原體蛋白如P46，P65，P85，P97，P102，P70，P50和P44，但不限于這些。
在另一實施方案中，本發明所用疫苗包括至少一種編碼豬肺炎支原體蛋白或多肽的免疫原性片段的基因或核酸分子。將要包括在所述疫苗中的免疫原性片段由豬肺炎支原體蛋白或多肽的至少約10至20，或優選至少約30至40，或更優選至少約100個連續的氨基酸組成，所述蛋白或多肽包括但不限于，P46，P65，P85，P97，P102，P70，P50和P44。
所述基因或核酸分子可以通過已知方法，如通過使用基因槍來向動物給藥。另外，所述基因或核酸也可以與脂質體或本領域已知的其它轉染促進劑一并存在。
表達系統多種宿主表達載體系統都可以用來表達豬肺炎支原體蛋白或多肽。這樣的宿主表達系統可用來制備和純化目的編碼序列，以及表達和純化用于本發明接種方法中的豬肺炎支原體蛋白、多肽或其免疫原性片段。典型的宿主表達系統包括但不限于微生物，如用包含mhp3編碼序列的重組噬菌體DNA，質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的細菌(例如大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(B.subtilis))；用包含豬肺炎支原體基因產物編碼序列的重組酵母表達載體轉化的酵母(例如糖酵母屬，畢赤氏酵母屬)；用包含豬肺炎支原體編碼序列的重組病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用包含豬肺炎支原體編碼序列的重組病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染的植物細胞或用包含豬肺炎支原體編碼序列的重組質粒表達載體(例如Ti質粒)轉化的植物細胞；或包含重組表達構建體的哺乳動物細胞系統(例如COS，CHO，BHK，293，3T3)，所述的表達構建體含有衍生自哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)，或含有衍生自哺乳動物病毒的啟動子(例如腺病毒晚期啟動子，痘苗病毒7.5K啟動子)。
在優選實施方案中，所述表達載體是細菌系統。
劑量和給藥方式根據本發明，給藥小牛豬肺炎支原體疫苗的有效量可提供抗御隨后的牛支原體攻擊的有效免疫力。在一個實施方案中，在小牛約7-28天齡時給藥所述豬肺炎支原體疫苗，更優選，在約21天齡時給藥。
在優選實施方案中，向小牛給藥所述豬肺炎支原體疫苗二次。第一次給藥是在動物約7-28天齡時，優選是在21天齡時。第二次是在動物約35-49天齡時，優選是在約42天齡時。
豬肺炎支原體疫苗達到有效的量取決于疫苗中的成分及給藥的時間安排。通常，疫苗中使用滅活的豬肺炎支原體完整細胞制品時，在約3周期間向動物給藥二次的情況中，每劑含有約1×106至約5×1010集落形成單位(CFU)的疫苗的量是有效的。優選，在約3周期間向動物給藥二次時，提供有效免疫力的豬肺炎支原體疫苗，每劑包含約1×108至5×1010CFU，更優選每劑包含約5×108至5×1010CFU。第一次給藥是在動物約7-28天齡時，優選是在21天齡時。第二次是在動物約35-49天齡時，優選是在約42天齡時。
根據本發明，當給藥的是優選的菌苗制品RESPISURE時，給藥RESPISURE優選二次，每次給藥的量約0.5至約5.0ml，優選約1.5至約2.5ml，更優選約2ml。首次給藥是在動物約7-28天齡時，優選在21天齡時。第二次給藥是在動物約35-49天齡時，優選是在約42天齡時。
包含至少一種豬肺炎支原體蛋白，多肽或它們的免疫原性片段的豬肺炎支原體亞單位疫苗，在給藥二次且每次給藥約0.1μg至約200μg時，所述疫苗的量是有效的。首次給藥是在動物約7-28天齡時，優選在21天齡時。第二次給藥是在動物約35-49天齡時，優選是在約42天齡時。
包含基因或核酸分子(編碼至少一種豬肺炎支原體蛋白，多肽或它們的免疫原性片段，優選DNA)的豬肺炎支原體亞單位疫苗，在給藥二次且每次給藥約0.1μg至約200mg時，所述疫苗的量是有效的。首次給藥是在動物約7-28天齡時，優選在21天齡時。第二次給藥是在動物約35-49天齡時，優選是在約42天齡時。
根據本發明，可以通過已知的途徑給藥，包括口腔途徑，鼻內途徑，粘膜局部途徑，經皮途徑以及腸胃外途徑(例如，靜脈內，腹腔，皮內，皮下或肌肉內)。也可以用無針的傳輸設備給藥(needle-free delivery devices)。給藥也可以通過多種途徑的組合來實現，例如，首次給藥使用腸胃外途徑，之后給藥利用粘膜途徑。優選的給藥途徑是皮下或肌肉內給藥。
本發明也涉及單劑疫苗接種的方法，該方法不再需要給藥小牛額外的劑量便可以產生和/或維持抗御牛支原體的免疫力。
依照本發明給藥的豬肺炎支原體疫苗可以包括額外的成分，如佐劑(例如無機膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質如溶血卵磷脂；糖苷，例如，皂角苷衍生物如Quil A或GPI-0100；膽固醇，pluronic多元醇；聚陰離子；非離子型封閉聚合物，例如Pluronic F-127；肽；礦物油，例如Montanide ISA-50，聚羰乙烯，Amphigen，Alhydrogel，油性乳劑，例如礦物油乳劑如BayolF/Arlacel A和水，或植物油乳劑，水和乳化劑如卵磷脂；明礬，細胞因子，以及佐劑組合)。
依照本發明，向大約3和6周齡的小牛給藥有效量的豬肺炎支原體菌苗可提供抗御呼吸道感染(包括肺炎)的免疫力，降低肺臟中的牛支原體水平。
本發明提供了一種免疫小牛，使其抗御牛支原體感染的方法，該方法包括給藥所述小牛至少一劑，優選二劑豬肺炎支原體菌苗以免疫小牛，來抗御牛支原體的感染。在優選實施方案中，所述菌苗通過皮下給藥。而且，優選所述菌苗的劑量包含約2ml的菌苗，每毫升包含約2.5×108CFU的豬肺炎支原體。優選向小牛給藥所述菌苗二次；一次在小牛出生后約3周時，另一次在小牛出生后約6周時。
本發明也包含向動物，優選向牲畜，給藥有效量的豬肺炎支原體菌苗以治療或預防所述動物的疾病，包括肺炎，關節炎，乳腺炎，耳炎和生殖疾病。
本發明通過以下實施例進行進一步描述，但這些實施例不構成對本發明的限制。
實施例1材料與方法動物健康的雜種產奶小牛在約14天齡時進行疫苗接種。在開始研究之前使這些小牛適應7天。所有小牛每日接受濃縮的沒有加入藥物的飲食，沒有任何已知的污染物或殺蟲劑，但可自由攝水。
疫苗用來免疫接種小牛的菌苗，每劑包含適當濃度的經BEI滅活的豬肺炎支原體完整細胞。另外，所述疫苗制品包含磷酸鹽緩沖的鹽溶液(PBS)和水包油佐劑。安慰劑包含PBS。
攻擊方法每只小牛鼻內途徑連續3天接受12ml的新鮮的牛支原體培養物(大約1×108至1×1010集落形成單位(CFU/ml))。在每次實驗性攻擊完成后，即刻確定所述攻擊接種物的存活數(CFU/ml)。
實驗步驟每只小牛由獨特的耳部標簽號來鑒別。所有的動物根據年齡被隨機分配到對照(pens)和治療組。
在第0天(左側頸部)和第21天(右側頸部)給動物皮下接種2.0ml疫苗或2.0ml安慰劑。
在攻擊前1天早晨，立即攻擊前，以及攻擊后20天的每天早晨測量直腸溫度。
實驗性牛支原體攻擊的約3周后對所有動物進行尸檢。使小牛安樂死，并對除中樞神經系統外的所有主要器官進行總體檢查。
取出肺臟，總體評估那些可以由牛支原體感染導致的特征性損傷。將損傷繪制到標準的肺臟圖上。用以下每個肺葉與總肺重之比來加權(weight)每個肺葉的總體受累百分數。

然后將肺葉加權值匯總，以便確定整個肺臟總體損傷的百分比(Pointon等1992)。另外，下式可用來計算下降百分數。
100-治療組的肺損傷百分比均值＝下降的百分數對照組的肺損傷百分比均值另外，各肺用50ml PBS灌洗。努力從支氣管灌洗液中分離出有活力的牛支原體，并確定其數量。有活力的牛支原體的數量(CFU/ml)通過制備支氣管灌洗液的適當的連續稀釋液，并將該樣品在適當的瓊脂培養基上鋪板培養來確定。
實施例2在該實施例中，在年幼的小牛體內評估豬肺炎支原體菌苗的效力。將30個健康的雜種小牛根據年齡隨機分組。
在第0天(左側頸部)和第21天(右側頸部)，給動物皮下接種2ml所述疫苗或安慰劑。所用的實驗性治療組和疫苗如表1中所示。
表1 試驗治療組

在第二次接種的3周后如上所述攻擊小牛。每只小牛通過鼻內途徑連續3天接受12ml新鮮的牛支原體培養物。
在完成牛支原體實驗性攻擊后的1小時內，確定每份攻擊接種物的存活數(CFU/ml)。結果示于表2。
表2牛支原體攻擊接種物的存活數(CFU/ml)

在實驗性牛支原體攻擊的前一天，即將開始攻擊之前和攻擊的20天后，每天早晨測定直腸溫度。結果總結于圖1中。接種豬肺炎支原體菌苗的小牛(治療組A)，在第7天，第9-18天和第20天，體溫平均值較接種安慰劑的動物(治療組B)低。
對所有動物在實驗性牛支原體攻擊的大約3周后進行尸檢。取出肺臟，總體評估那些可以由牛支原體感染導致的特征性損傷。肺損傷分值的百分數和肺損傷的下降百分數總結于表3中。治療組A(豬肺炎支原體菌苗)中動物的總體肺損傷比安慰劑組(治療組B)的下降45.1％。
表3肺損傷分值百分數的總結平均加權百分數±標準差

每個肺臟用50ml PBS灌洗。在實驗性牛支原體攻擊的約21天后，從支氣管灌洗液樣品中分離牛支原體，結果總結于表4中。豬肺炎支原體菌苗接種組(治療組A)的小牛與安慰劑組(治療組B)比較，分離自肺灌洗液樣品中的有活力牛支原體的水平下降。
表4從肺灌洗液分離牛支原體的總體情況

總而言之，與安慰劑接種組(治療組B)比較，用豬肺炎支原體接種二次的小牛(治療組A)的總體肺損傷下降，直腸溫度下降，分離自肺灌洗液樣品中的有活力牛支原體的水平下降。這些結果提示，用豬肺炎支原體菌苗進行接種，可賦于牲畜對實驗性牛支原體攻擊的交叉保護。
權利要求
1.一種治療或預防動物體內由牛支原體感染導致的疾病或病癥的方法，其包含向動物給藥有效量的豬肺炎支原體疫苗。
2.權利要求1的方法，其中所述豬肺炎支原體疫苗制劑是滅活的豬肺炎支原體完整細胞或細胞一部分的制劑。
3.權利要求2的方法，其中所述豬肺炎支原體疫苗每劑包含約1×106至約5×1010個集落形成單位(CFU)。
4.權利要求2的方法，其中所述疫苗的給藥量是約0.5ml至約5.0ml。
5.權利要求2的方法，其中所述豬肺炎支原體細胞制劑是RESPISURE。
6.權利要求1的方法，其中所述豬肺炎支原體疫苗包含至少一種來自豬肺炎支原體的蛋白或其免疫原性片段。
7.權利要求6的方法，其中所述蛋白選自P46，P65，P85，P97，P102，P70，P50或P44。
8.權利要求1的方法，其中所述豬肺炎支原體疫苗包含編碼來自豬肺炎支原體的至少一種蛋白或多肽，或該蛋白的免疫原性片段的核苷酸序列。
9.權利要求6的方法，其中所述蛋白選自P46，P65，P85，P97，P102，P70，P50或P44。
10.權利要求6的方法，其中將約0.5ml至5.0ml的所述豬肺炎支原體疫苗給藥至所述動物。
11.權利要求1的方法，其中所述豬肺炎支原體疫苗進一步包含佐劑。
12.權利要求1的方法，其中所述豬肺炎支原體疫苗進一步包含可藥用載體。
13.權利要求1的方法，其中所述豬肺炎支原體疫苗給藥至約21日齡的動物。
14.權利要求1的方法，其中所述豬肺炎支原體疫苗以單劑形式給藥至所述動物。
全文摘要
本發明涉及通過給藥動物有效量的豬肺炎支原體疫苗來治療或預防動物體內由牛支原體感染所致的疾病或病癥的方法。所述豬肺炎支原體疫苗可以是滅活后的完整或部分的細胞，或者是經過修飾的活的制品，亞單位疫苗，或核酸，或DNA疫苗。依照本發明給藥的豬肺炎支原體疫苗可以是合成的或重組制備的。
文檔編號A61K39/04GK1612749SQ02813431
公開日2005年5月4日 申請日期2002年5月30日 優先權日2001年7月2日
發明者亞歷山大·C·古迪, 安德魯·R·彼得斯, 羅賓·L·凱奇 申請人:輝瑞產品公司