控釋組合物及其制備方法

專利名稱：控釋組合物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生理活性物質的控釋組合物及其制備方法，及其作為藥物的用途等。
背景技術：
具有控釋特性的生物可降解聚合物可用作諸如微囊等的基質(base)材料，用以包含生理活性物質。已知可用的生物可降解聚合物包括聚乳酸、乳酸及甘醇酸共聚物等(JP-A No.11-269094等)。
目前使用的生物可降解聚合物以傳統合成方法制備、原形使用的聚合物，然而，發現這些聚合物自身由于末端羧基含量低無法用作控釋的基質材料。因而，在用作控釋制劑的基質材料之前，研究了將上述較高分子量的生物可降解聚合物水解以將其重均分子量控制在合適水平。
然而，以水解或水洗得到的聚合物易致生理活性物質的初始崩解，即使其重均分子量及末端羧基含量合適，也不適于用作基質控釋材料。因而有必要改進目前這種狀況。
JP-A No.7-97334公開了一種控釋制劑，及其制備方法，該制劑由具有生理活性的肽或其鹽及包含末端游離羧基的生物可降解聚合物組成。
GB2209937、GB2234169、GB2234896、GB2257909及EP626170A2公開了一種組合物及其制備方法，該組合物包含一種用作基質材料的生物可降解聚合物，包含一種水溶性鹽，例如分別制備的肽及蛋白的pamoates。
WO95/15767公開了一種西曲瑞克(LH-RH拮抗劑)的embonate(pamoate)及其制備方法，并同時描述，即使該pamoate包封在生物可降解聚合物中，該肽的釋放性質與單用pamoate相同。
發明目的本發明的目的是提供一種新穎組合物，該組合物包含大量的生理活性物質，并通過抑制可藥用物質的初始過度釋放實現長期的穩定釋放速度，及其制備方法。
發明概述為解決上述難題，本發明的發明人通過深入研究，最終成功地制備一種乳酸聚合物或其鹽，通過降低生物可降解聚合物中較低分子量的乳酸聚合物的含量，特別是重均分子量為5000或更小的聚合物的含量，不易導致物質的初始過度釋放，并且發現，包含該乳酸聚合物或其鹽的控釋制劑可以意想不到的含量包括生理活性物質，并且通過抑制活性物質的初始過度釋放，實現長期的穩定釋放速度。
本發明的發明人進一步發現，組合物若包含大量生理活性物質，通過將生理活性物質與羥基萘甲酸共存形成組合物，然后將兩者以乳酸聚合物或其鹽包被，則，生理活性物質的釋放速率與其在不含乳酸聚合物或其鹽情況下自僅由其與羥基萘甲酸的組合物中釋放的速率不同，其釋放速度由生物可降解聚合物的性質以及羥基萘甲酸的加入量控制，即使以高含量存在時，初始釋放速率也可被有效抑制，并實現長期的緩釋。
基于該認識，本發明的發明人進一步研究并最終完成了本發明。
即，本發明提供了(1).一種控釋組合物，包括(1)一種生理活性物質或其鹽，約占組合物總重的14％(w/w)～約24％(w/w)，(2)選自3-羥基-2-萘甲酸及1-羥基-2-萘甲酸或其鹽的羥基萘甲酸，及(3)一種乳酸聚合物或其鹽，具有15000～50000的重均分子量，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量為約5％重量或更小，其中該羥基萘甲酸或其鹽與生理活性物質或其鹽的摩爾比為3∶4～4∶3，(2).根據(1)中所述的控釋組合物，其中乳酸聚合物的重均分子量為15000～30000，(3).根據(1)中所述的控釋組合物，其中生理活性物質為LH-RH衍生物，4).根據(3)中所述的控釋組合物，其中LH-RH衍生物為下式所示的肽5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z[其中，Y表示Dleu、Dala、DTrp、DSer(tBu)、D2Nal或DHis(ImBzl)，且Z表示NH-C2H5或Gly-NH2]，或其鹽，(5).根據(1)中所述的控釋組合物，其中生理活性物質或其鹽為下式所示的LH-RH衍生物
5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5或其乙酸鹽，且羥基萘甲酸為3-羥基-2-萘甲酸或1-羥基-2-萘甲酸，(6).一種包括(1)中所述的控釋組合物的藥物，(7).一種預防或治療前列腺癌、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、子宮纖維瘤、性早熟、痛經或乳腺癌的藥物或一種避孕藥物，包括(3)中所述的控釋組合物，(8).一種預防絕經前乳腺癌術后乳腺癌復發的藥物，包括(3)中所述的緩釋組合物，(9).一種預防或治療前列腺癌、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、性早熟、痛經、乳腺癌的方法或避孕的方法，包括對哺乳動物施用有效量的(3)中所述的控釋組合物，(10).一種預防絕經前乳腺癌術后乳腺癌復發的方法，包括對哺乳動物施用有效量的(3)中所述的緩釋組合物，(11).一種控釋組合物，包括生理活性物質或其鹽，及具有15000～50000的重均分子量的乳酸聚合物或其鹽，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量為約5％重量或更小，(12).一種控釋組合物，包括生理活性物質或其鹽，及羥基萘甲酸或其鹽，其具有15000～50000的重均分子量，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量為約5％重量或更小，(13).根據(11)中所述的控釋組合物，包括(1)一種生理活性物質或其鹽，約占組合物總重的3％(w/w)～約24％(w/w)，以及(2)一種乳酸聚合物或其鹽，其具有15000～50000的重均分子量，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量為約5％重量或更小，(14).根據(11)～(13)中任何一項所述的控釋組合物，其中乳酸聚合物中分子量為3000或更小的聚合物的含量為約1.5％重量或更小，(15).根據(11)～(13)中任何一項所述的控釋組合物，其中乳酸聚合物中分子量為1000或更小的聚合物的含量為約0.1％或更小，(16).根據(11)～(15)中任何一項所述的控釋組合物，其中乳酸聚合物重均分子量為15000～40000，(17).根據(11)～(15)中任何一項所述的控釋組合物，其中乳酸聚合物重均分子量為17000～26000，
(18).根據(12)中所述的控釋組合物，其中羥基萘甲酸為3-羥基-2萘甲酸或1-羥基-2-萘甲酸，(19).根據(11)或(13)中所述的控釋組合物，其中生理活性物質為具有生理活性的肽，(20).根據(12)中所述的控釋組合物，其中生理活性物質為具有生理活性的肽，(21).根據(19)中所述的控釋組合物，其中生理活性物質為LH-RH衍生物，(22).根據(20)中所述的控釋組合物，其中生理活性物質為LH-RH衍生物，(23).根據(21)或(22)中所述的控釋組合物，其中LH-RH衍生物為下式所述的肽5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z[其中，Y表示Dleu、Dala、DTrp、DSer(tBu)、D2Nal或DHis(ImBzl)，且Z表示NH-C2H5或Gly-NH2]，或其鹽，(24).根據(21)中所述的控釋組合物，其中LH-RH衍生物或其鹽在控釋組合物中的含量為3％(w/w)～24％(w/w)，(25).根據(22)中所述的控釋組合物，其中羥基萘甲酸或其鹽與LH-RH衍生物或其鹽的摩爾比為3∶4～4∶3，(26).根據(22)所述的控釋組合物，其中LH-RH衍生物或其鹽在控釋組合物中的含量為14％(w/w)～24％(w/w)，(27).根據(11)～(13)中任何一項所述的控釋組合物用作注射劑，(28).一種制備(11)中所述的控釋組合物的方法，包括自生理活性物質或其鹽及乳酸聚合物或其鹽的混合溶液中除去溶劑，該聚合物或其鹽具有15000～50000的重均分子量，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量為約5％重量或更小，(29).一種制備(12)中所述的控釋組合物的方法，包括自生理活性物質或其鹽、羥基萘甲酸或其鹽及乳酸聚合物或其鹽的混合溶液中除去溶劑，該聚合物或其鹽具有15000～50000的重均分子量，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量約5％重量或更小，(30).根據(29)中所述的控釋組合物的制備方法，包括混合及分散生理活性物質或其鹽于包含羥基萘甲酸或其鹽以及乳酸聚合物或其鹽的有溶劑中并除去溶劑，乳酸聚合物或其鹽具有15000～50000的重均分子量，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量為約5％重量或更小，(31).一種制備(30)中所述的控釋組合物的方法，其中生理活性物質或其鹽為包含生理活性物質或其鹽的水溶液，(32).一種制備(30)中所述的控釋組合物的方法，其中生理活性物質的鹽為與游離堿或酸形成的鹽，(33).一種包含(11)～(13)中任何一項所述的控釋組合物的藥物，(34).一種預防或治療前列腺癌、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、子宮纖維瘤、性早熟、痛經或乳腺癌的藥物或避孕的藥物，包括(21)或(22)中所述的控釋組合物，(35).一種預防絕經前乳腺癌術后乳腺癌復發的藥物，包括(21)或(22)所述的控釋組合物，(36).一種預防或治療前列腺癌、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、性早熟、痛經、乳腺癌的方法或避孕的方法，包括對哺乳動物施用有效量的(21)或(22)中所述的控釋組合物，及(37).一種預防絕經前乳腺癌術后乳腺癌復發的方法，包括對哺乳動物施用有效量的權利要求21或22所述的控釋組合物。
此外，本發明還提供了(38).根據(12)所述的控釋組合物，其中以1mol具有生理活性的肽或其鹽為基準，羥基萘甲酸或其鹽的量約1～約7mol，優選地約1～約2mol，(39).根據(29)中所述的制備控釋組合物方法，包括制備一種W/O型乳液，其中包含生理活性物質或其鹽的液體為內層水相，包含乳酸聚合物或其鹽及羥基萘甲酸或其鹽的溶液為油相，然后，除去溶劑，(40).根據(29)中所述的制備控釋組合物方法，包括制備一種W/O型乳液，其中，包含羥基萘甲酸或其鹽的液體為內層水相及包含生理活性物質或其鹽及乳酸聚合物或其鹽的溶液為油相，然后，除去溶劑，及(41).根據(39)或(40)中所述的制備控釋組合物的方法，其中除去溶劑的方法為帶水干燥(in-water drying)等。
發明詳述用于本發明的生理活性物質并不受具體局限，只要其可藥用，可為非肽化合物或肽化合物。合適的非肽化合物實例包括激動劑、拮抗劑及具有酶抑制活性的化合物。另外，肽化合物為例如，優選具有生理活性的肽。具有生理活性的肽具有約300～約40000的分子量，優選約400～約30000，更優選約500～約20000。
具有生理活性的肽的實例包括促黃體素釋放激素(LH-RH)、胰島素、抑生長激素、生長激素、促生長激素釋放激素(GH-RH)、催乳素、促紅細胞生成素、腎上腺皮質激素、促黑素細胞激素、促甲狀腺激素釋放激素、促甲狀腺激素、促黃體素、促卵泡激素、加壓素、催產素、降鈣素、胃泌素、腸泌素、促胰酶素、縮膽囊肽、血管緊張素、人胎盤催乳素、人絨毛膜促性腺素、腦啡肽、內啡肽、京都啡肽(kyotrophin)、促吞噬肽、胸腺生成素、胸腺素thymotimurin、胸腺體液因子、血液胸腺因子、腫瘤壞死因子、促集落形成因子、促胃動素、強啡肽、鈴蟾肽、神經降壓肽、蛙皮素(cerulein)、緩激肽，心鈉素、、神經生長因子、細胞生長因子、神經營養因子、具有拮抗內啡肽(endoserine)活性的肽及其衍生物，及其片段及片段衍生物等。
本發明使用的生理活性物質可為其自身或其可藥用鹽。
當生理活性物質含有堿性基團，如氨基，該類鹽的實例包括與無機酸(也即游離的無機酸)(例如，碳酸、碳酸氫鹽、鹽酸、硫酸、硝酸、硼酸等)及有機酸(也即游離的有機酸)(例如，琥珀酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸等)等形成的鹽。
當生理活性物質含有酸性基團，如羧基等，該類鹽的實例包括與無機堿(也即游離的無機堿)(例如，堿金屬如鈉、鉀等，堿土金屬如鈣、鎂等)，及有機堿(也即游離的有機堿)(例如，有機胺如三乙胺等，堿性氨基酸如精氨酸等)形成的鹽。此外，具有生理活性的肽可形成金屬絡合物(例如，銅絡合物、鋅絡合物等)。
具有生理活性肽的優選實例包括LH-RH衍生物或其鹽，其可有效治療激素依賴性疾病，特別是性激素依賴性癌癥(例如，前列腺癌、子宮癌、乳腺癌、垂體腺瘤等)，性激素依賴性疾病，如前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、性早熟、痛經、無月經、經前綜合征、多房卵巢綜合征等，避孕(或者，應用藥物停用后的反彈活性，不孕)，以及絕經前乳腺癌術后乳腺癌復發。實例還包括可有效治療良性或惡性腫瘤的LH-RH衍生物或其鹽，這些腫瘤不依賴于性激素，但對LH-RH敏感。
LH-RH衍生物或其鹽的具體實例包括肽，其如Treatment with GnRHanalogsControversies and perspectives[Parnon Publishing group Ltd.，1996出版]及日本專利申請國家公開(公開文本)No.3-503165、JP-A No.3-101695、A7-97334及8-259460等所述。
LH-RH衍生物的實例包括LH-RH激動劑及LH-RH拮抗劑。LH-RH拮抗劑的實例使用如下式[I]所示的具有生理活性的肽X-D2Nal-D4ClPhe-D3Pal-Ser-A-B-Leu-C-Pro-DAlaNH2[其中分別地X指N(4H2-furoyl)Gly或NAc，A指選自NheTyr、Tyr、Aph(Atz)及NMeAph(Atz)的殘基，B指選自DLys(Nic)、Dcit、DLys(azaglyNic)、DLis(azaglyFur)、DhArg(Et2)、DAph(Atz)及DhCi的殘基，及C分別指Lys(Nisp)、Arg或hArg(Et2)]，或其鹽等。
LH-RH激動劑的實例，使用如下式[II]所示的具有生理活性的肽5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z[其中Y指選自Dleu、Dala、DTrp、DSer(tBu)、D2Nal及DHis(ImBzl)的殘基，及Z分別指NH-C2H5或Gly-NH2]或其鹽等。特別是，合適的肽為其中Y指DLeu及Z指NH-C2H5(即，5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH-C2Hs表示的肽A；Leuproline)的肽或其鹽(例如，乙酸鹽)。
這些肽可以上述文獻或公開的方法或類似方法進行制備。
本說明書使用的簡稱的意義如下


關于其它氨基酸的簡稱，基于IUPAC-IUB生物化學命名委員會的規定(European JournaL Biochemistry，Vol.138，pp.9-37(1984))或本領域常規的簡稱。此外，當氨基酸具有光學異構體時，除非另外說明，其指L-氨基酸。
本發明使用的羥基萘甲酸的制備為以一個羥基及一個羧基與萘上不同碳原子成鍵。因而，一共存在14個異構體，羥基的位置視羧基在萘環1位及2位的位置而定。可使用任何異構體及其任意比例的混合物。如后所述，優選酸離解常數較大或pKa值(pKa＝-log10Ka，Ka表示酸離解常數)小的異構體。優選微溶于水的異構體。
進一步優選可在醇里(例如，乙醇、甲醇等)溶解的異構體。術語″可溶于醇″表示在甲醇中溶解度為10g/L或更大。
至于上述羥基萘甲酸異構體的pKa值，僅知3-羥基-2-萘甲酸的值(pKa＝2.708，Chemical Handbook，Base II，Chemical Society of Japan，1969年9月25日)，然而，通過比較羥基苯甲酸的三種異構體的pKa值可獲得一些有益的知識。也即，間羥基苯甲酸及對羥基苯甲酸為4或更大，然而鄰羥基苯甲酸(水楊酸)的pKa極小(＝2.754)。因而，在上述14種異構體中，優選3-羥基-2-萘甲酸、1羥基-2-萘甲酸及2-羥基-1-萘甲酸，其中，羧基及羥基與萘環上相鄰碳原子成鍵。此外，3-羥基-2-萘甲酸也合適，其中，羥基與萘環的3位碳原子成鍵，羧基與萘環2位碳原子成鍵。
羥基萘甲酸可為鹽。鹽的實例如與無機堿(例如，堿金屬如鈉、鉀等，堿土金屬如鈣、鎂等)，及有機堿(例如，有機胺如三乙胺等，堿性氨基酸如精氨酸等)形成的鹽，或與過渡金屬形成的鹽及絡合物(例如，鋅、鐵、銅絡合物等)等。
下面例舉了一種為生理活性物質制備羥基萘甲酸鹽的方法。
(1)將羥基萘甲酸的含水有機溶劑的溶液通過弱堿性離子交換樹脂柱吸附，并飽和。然后，將過量的羥基萘甲酸通過用含水有機溶劑的溶液洗脫除去，然后，通過生理活性物質或其鹽的含水有機溶劑溶液進行離子交換，可便利地自所得洗脫液中除去溶劑。含水有機溶劑的有機溶劑實例，如可以使用醇(例如，甲醇、乙醇等)、乙氰、四氫呋喃，二甲基甲酰胺等。清除溶劑以沉積鹽的方法可采用已知或類似的方法。例如，可采用控制真空度以旋轉蒸發儀等及其它方法濃縮溶劑。
(2)強堿性離子交換樹脂柱上的離子交換可預先交換成氫氧根離子，然后通過生理活性物質或其鹽的含水有機溶劑溶液進行離子交換，將堿性基團交換成氫氧型基團。加入不超過等當量的羥基萘甲酸，使溶于收集的洗脫液中，濃縮后得到沉淀的鹽，必要時以水洗滌并干燥。
用于本發明的乳酸聚合物(此后，在部分情況下簡稱為本發明乳酸聚合物)，包括僅包含乳酸聚合物或乳酸及其它單聚體(例如，甘醇酸等)的共聚物，其中通常分子量為5000或更小的聚合物含量為約5％重量或更小，優選地分子量為5000或更小的聚合物含量為約5％重量或更小及分子量為3000或更小的聚合物含量為約1.5％或更小，進一步優選地分子量為5000或更小的聚合物含量為約5％重量或更小，分子量為3000或更小的聚合物含量為約1.5％或更小的聚合物，分子量為1000或更小的聚合物含量為約0.1％或更小的。
本發明乳酸聚合物的重均分子量通常為15000～50000，優選15000～30000，更優選17000～26000，特別優選17500～25500。
此外，當本發明控釋制劑不含羥基萘甲酸時，本發明乳酸聚合物重均分子量通常為15000～50000，優選15000～40000。
本發明乳酸聚合物的原材料的高分子量的乳酸聚合物，可可購得商品或可以已知方法聚合的聚合物，其重均分子量通常為15000～500000，優選30000～100000。此處提及的已知聚合方法的實例如，其中將乳酸及必要時的甘醇酸縮聚的方法；例如，在催化劑如路易斯酸或金屬鹽，例如二乙基鋅、三乙基鋁、辛基錫(tinoctylate)等存在的條件下，將丙交酯以及必要的時候與乙交酯一起開環聚合的方法；以及進一步采用前述方法(例如，國際專利公開WO00/35990等)，在羧基被保護的羥基羧酸衍生物存在的情況下，將丙交酯開環聚合；另外，在加熱條件下向丙交酯中加入催化劑引起開環聚合的方法(例如，J.Med.Chem.，16，897(1973)等)；例如，丙交酯及乙交酯共聚的方法及其它方法。
至于聚合模式，列舉了由熔解丙交酯并進行聚合反應的大規模聚合，及將丙交酯等溶于合適的溶劑并進行溶液聚合，其中，從工業生產角度考慮，本發明的乳酸聚合物以溶液聚合提供原材料。
溶液聚合中溶解丙交酯的溶劑實例如，芳香烴例如苯、甲苯、二甲苯等、萘烷、二甲基甲酰胺等。
上述得到的高分子量的乳酸聚合物的水解方法，可采用已知方法，例如，有利地將高分子量乳酸聚合物溶于合適的溶劑，然后將水及必要時加入酸誘導反應。
用于溶解高分子量乳酸聚合物的溶劑有利地地是能溶解10倍或更小重量百分比的乳酸聚合物，具體而言，鹵代烴，例如氯仿、二氯甲烷等，芳香烴例如甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯等，環醚例如四氫呋喃等，丙酮、N，N-二甲基甲酰胺等。使用可用于聚合高分子量乳酸聚合物的溶劑為可用于高分子量乳酸聚合物的水解的溶劑時，聚合與水解操作可依次地進行而不必分離聚合的高分子量乳酸聚合物。
以溶質乳酸聚合物為基準，溶解高分子量乳酸聚合物的溶劑用量通常為0.1～100倍，優選1～10倍。
以高分子量乳酸聚合物為基準，加入的水量通常為其重量百分比的0.001～1倍，優選地0.01～0.1倍。
必要時加入酸，例如，無機酸，例如鹽酸、硫酸、硝酸等，有機酸，例如乳酸、乙酸、三氟乙酸等，優選乳酸。
以高分子量乳酸聚合物為基準，加入的酸通常為其重量百分比的0～10倍，優選地0.1～1倍。
水解反應的溫度通常為0～150℃，優選地20～80℃。
水解反應的時間視高分子量乳酸聚合物的重均分子量及反應溫度而定，通常為10分鐘～100小時，優選地1～20小時。
水解處理的終點時刻基于水解產物的重均分子量進行判斷。即，在水解處理過程中通過適當的取樣分析，樣品中水解產物的重均分子量以凝膠滲透色譜(GPC)分析，若確定分子量為15000～50000，優選地約15000～30000，更優選地約17000～26000，特別優選地17500～25500可停止水解處理。
從包括得到的水解產物的溶液中沉淀所得的預期乳酸聚合物的方法包括，將該含水解產物的溶液與能夠沉淀預期的乳酸聚合物的溶劑相接觸，以及其它方法，水解產物的溶液為將高分子乳酸聚合物進行以如上所述的水解操作。
包含水解產物溶液的優選實施方案如，通過溶解約10～50wt％的乳酸聚合物于能夠溶解高分子量乳酸聚合物溶劑中得到，該聚合物的重均分子量為15000～50000，優選為15000～30000，更優選為17000～26000，特別優選為17500～25500，所述溶劑如鹵代烴，例如氯仿、二氯甲烷等，芳香烴例如甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯等，環醚例如四氫呋喃等，丙酮、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二甲苯等。當本發明控釋組合物不含羥基萘甲酸時，包含約10～50wt％已溶的乳酸聚合物，其重均分子量為15000～50000，優選地為15000～40000。
可沉積包含在水解溶液中預期乳酸聚合物的溶劑的實例，如醇，例如甲醇、乙醇等，鏈醚例如異丙醚等，脂肪烴例如己烷等，水等。
以含水解產品溶液中的溶劑為基準，用來沉積預期乳酸聚合物的溶劑用量通常為其重量百分比的0.1～100倍，優選重量百分比的1～10倍。
這些溶劑及其用量的優選具體實例，如在含水解產物的溶液中，以溶質為基準，二氯甲烷的用量為其重量百分比的1～5倍，以該二氯甲烷用量為基準，用于降低溶解度的異丙醚的用量為其重量百分比的2～10倍，及其它當將沉積預期乳酸聚合物溶質的溶劑與含水解產物的溶液接觸時，溶劑溫度通常為-20～60℃，優選地0～40℃，及含水解產物的溶液的溫度通常為0～40℃，優選地10～30℃。
含水解產物的溶液與溶劑接觸方法的實例，包括將含水解產物的溶液一次性加入溶劑中的方法；將包含水解產物的溶液滴加入溶劑中的方法；將溶劑一次性加入包含水解產物的溶液中的方法；將溶劑滴加入包含水解產物的溶液中的方法等。
如上述得到的乳酸聚合物，由于末端羧基的量在控釋組合物的基質材料的合適范圍之內，本發明乳酸聚合物適用于控釋組合物的基質材料。
本發明組合物中生理活性物質的重量比視生理活性物質種類、預期的藥效及其持續時間等而定，當為具有生理活性的肽或其鹽時，以總組合物為基準，為約0.001～約50％重量，優選約0.02～約40％重量，更優選約0.1～約30％重量，更優選約0.1～約24％重量，最優選約3～約24％重量，當生理活性物質不是肽或其鹽時，為約0.01～約80％重量，優選約0.1～約50％重量。
包含羥基萘甲酸或其鹽的本發明組合物的生理活性物質重量比視生理活性物質種類、預期的藥效及其持續時間等而定，當控釋組合物包含生理活性物質或其鹽、羥基萘甲酸或其鹽以及乳酸聚合物或其鹽，以三種組分的總量為基準，其比為約0.001～約50％重量，優選約0.02～約40％重量，更優選約0.1～約30％重量，最優選自約14～約24％重量，當生理活性物質為非肽或其鹽時，重量比為約0.01～約80％重量，優選約0.1～約50％重量。
即使包含生理活性物質羥基萘甲酸鹽，也使用同樣的重量比例。當控釋組合物包含具有生理活性的肽(暫稱為(A))的鹽及羥基萘甲酸(暫稱為(B))，以(A)及(B)的鹽為基準，(A)的比通常約5～約90％重量，優選約10～約85％重量，更優選約15～約80％重量，特別優選約30～約80％重量。
當控釋組合物包含生理活性物質或其鹽、羥基萘甲酸或其鹽及乳酸聚合物或其鹽時，以1mol生理活性物質或其鹽為基準，羥基萘甲酸或其鹽的量為約1/2～約2mol，約3/4～約4/3mol，特別優選約4/5～約6/5mol。
下面將描述本發明組合物的設計，控釋組合物包括生理活性物質、羥基萘甲酸及乳酸聚合物，其中生理活性物質為堿性的。在該種情況下，用作堿的生理活性物質及用作酸的羥基萘甲酸在組合物中共存，它們在組合物中或以游離體的形式結合，或以鹽的形式結合，在制備組合物的某一確定點時，在有水或微量水的條件下達到離解平衡。由于羥基萘甲酸生成的鹽微溶于水，生理活性物質據信微溶于水，盡管后者視生理活性物質的性質而定，離解平衡移向生成微溶于水的鹽的一側。
為制備含高含量的堿性生理活性物質的組合物，從上述離解平衡的角度考慮，理想地絕大多數生理活性物質皆質子化生成上述微溶于水的鹽。為此，理想地將至少一種生理活性物質或其鹽與大致等當量的羥基萘甲酸或其鹽相混合。
其次，下面將描述組合物中生理活性物質的控釋機制。在上述組合的組合物中，絕大多數生理活性物質皆質子化，并與相反離子共存。絕大多數相反離子為羥基萘甲酸(優選，羥基萘甲酸)。當組合物施用于有機體后，乳酸聚合物解離形成寡聚體及單聚體，然而當聚合物為乳酸-甘醇酸聚合物時，產生的寡聚體(乳酸-甘醇酸寡聚體)及單聚體(乳酸或甘醇酸)必須地含有一個羧基，其也可為生理活性物質的反離子。生理活性物質的釋放并不伴隨電荷的移動，也即其是以保持反離子的鹽的形式釋放，作為可移動的反離子，有如羥基萘甲酸、乳酸-甘醇酸寡聚體(可移動的分子量)及單聚體(乳酸或甘醇酸)，如上所述。
當多種酸共存時，強酸鹽通常為主要存在形式，盡管這視組成的比例而異。至于羥基萘甲酸的pKa，例如3-羥基-2-萘甲酸的pKa為2.708(CHEMICALHANDBOOK，BASIC BOOK II，Chemical Society of Japan，1969年9月25日出版)。另一方面，盡管不知乳酸-甘醇酸寡聚體羧基的Ka，可基于乳酸或甘醇酸的pKa(＝3.86或3.83)推算，可根據原則“遵循添加法則引入的取代基可近似改變自由能”。已發現取代基對離解常數的貢獻并可應用(″pKaPrediction for Organic acids and bases″中的表4，D.D.Perrin，B.Dempsey和E.P.Serjeant，1981)。由于羥基及酯鍵的pKa分別為ΔpKa(OH)＝-0.90及ΔpKa(酯鍵)＝-1.7，計算出乳酸-甘醇酸寡聚體羧基的pKa，最靠近離解基團的酯鍵的貢獻如下pKa＝pKa(乳酸或甘醇酸)-ΔpKa(OH)+ΔpKa(酯鍵)＝3.06或3.03。結果，由于羥基萘甲酸的酸性強于乳酸(pKa＝3.86)、甘醇酸(pKa＝3.83)以及乳酸-甘醇酸寡聚體。可進一步推測在上述組合物中，主要形成羥基萘甲酸及生理活性物質的鹽，該鹽的性質主要地決定了組合物中生理活性物質的控釋性質。上述生理活性物質的實例，為如上述列出的生理活性物質等。
在此，鹽由羥基萘甲酸與生理活性物質生成，該鹽微溶于水而非水溶性，且優選對控釋機制發揮作用。即，如上述酸離解常數所示，羥基萘甲酸該酸酸性強于上述乳酸-甘醇酸寡聚體及單聚體的鹽，在釋放的初始階段主要以生理活性物質的可水解的鹽的形式存在，結果，該鹽在體內組織的溶解度及分配性質成為生理活性物質釋放速度的決定因素，因而，藥物的初始釋放模式可以羥基萘甲酸結合的量控制。然后，隨著羥基萘甲酸的減少及通過水解乳酸聚合物產生的寡聚體及單聚體的增加，以寡聚體及單聚體作為反離子的生理活性物質的釋放機制逐漸成為主導形式，并且即使″組合物″中羥基萘甲酸基本上消失后，生理活性物質仍保持穩定速度釋放。此外，也解釋了在制備控釋組合物時生理活性物質的結合效率的增強，以及應用生理活性物質后對初始過度釋放的抑制能力。
上述機制還可解釋羥基萘甲酸在包含具有生理活性肽的羥基萘甲酸鹽控釋組合物中的作用。
該說明書中的術語″不溶于水″表示在40℃或更低溫度的蒸餾水攪拌4小時，在1L該溶液中溶解25mg或更小的物質的情形。
該說明書中的術語″微溶于水″表示在上述條件下溶解的重量超過25mg及5g或更小。當上述物質為生理活性物質的鹽時，生理活性物質的重量用于在上述定義的操作。
盡管該說明書中控釋組合物的形式沒有特別限制，優選微粒(fineparticle)及特別優選微球(microsphere)(當控釋組合物包含乳酸聚合物時，也稱作微囊(microcapsule))。術語微球表示一種可注射的微小顆粒，呈球狀，可分散于溶液中。其形式可驗證，例如，以掃描電鏡觀察。
下面舉例說明為制備控釋組合物(例如，微囊)的方法，該組合物包含本發明生理活性物質或其鹽及本發明乳酸聚合物或其鹽。
在下述的制備方法中，可加入支持藥物的物料(例如，明膠，水楊酸等)，必要時可采用已知方法。
(I)帶水干燥方法(i)O/W方法在本方法中，首先制備本發明乳酸聚合物(此后，在本發明部分地方描述為生物可降解聚合物)的有機溶劑溶液。用于制備本發明控釋組合物的有機溶劑的沸點優選為120℃或更低。
有機溶劑的實例，如鹵代烴(例如，二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)，醚(例如，乙醚、異丙醚等)，脂肪酸酯(例如，乙酸乙酯、丁酸乙酯等)，芳香烴(例如，苯、甲苯、二甲苯等)，醇(例如，乙醇、甲醇等)，及乙氰等。其中，優選鹵代烴，二氯甲烷特別適合，可使用其適當比例的混合溶劑，此時，優選鹵代烴及醇的混合溶液，特別是優選二氯甲烷與乙醇的混合溶劑。
本發明可生物降解厄聚合物在有機溶劑中的濃度隨本發明生物可降解聚合物分子量及有機溶劑而定。例如，當以二氯甲烷作為有機溶劑時，例如，其濃度通常約0.5～約70％重量，更優選濃度約1～約60％重量，特別優選為約2～約50％重量。
當乙醇用作與二氯甲烷有機混合溶劑時，兩種有機溶劑的比例通常為約0.01～約50％(v/v)，更優選約0.05～約40％(v/v)，特別優選約0.1～約30％(v/v)將生理活性物質加入到得到的本發明生物可降解聚合物的有機溶劑溶液中，溶解或分散。在該過程中，控制生理活性物質的加入量，生理活性物質與本發明生物可降解聚合物重量比至多為約1∶1，優選至多為約1∶2。
隨后，將包括生理活性物質或其鹽及本發明生物可降解聚合物的有機溶液加入至水相，形成O(油相)/W(水相)乳液，然后將油相中的溶劑經蒸發制得微囊。在此種情況下，水相體積通常為約1～約10,000倍，更優選約5～50,000倍，特別優選約10～2,000倍油相體積。
可向上述外層水相加入乳化劑。只要可形成穩定O/W乳液的乳化劑，皆可使用。具體而言，例如，使用陰離子表面活性劑(油酸鈉、硬脂酸鈉、月桂硫酸鈉等)，非離子表面活性劑(聚氧乙烯山梨醇脂肪酯(吐溫80，吐溫60，Atlas Powder制造)，聚氧乙烯蓖麻油衍生物(HCO-60，HCO-50，NikkoChemical K.K制造)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纖維素、卵磷脂、明膠及透明質酸酸。其可單用或聯用。其使用濃度優選約0.0001～10％重量，更優選濃度約0.001～5％重量。
可向上述水相加入滲透壓調節劑。，任何當制備成水溶液后可產生滲透壓的滲透壓調節劑皆可使用。
滲透壓調節劑的實例包括多羥基醇、單羥基醇、單糖、二糖、寡糖及氨基酸或其衍生物。
多羥基醇實例，如優選使用三羥基醇，如甘油等，五羥基醇，如阿糖醇、木糖醇、核糖醇等，及六羥基醇，如甘露醇、山梨醇、己六醇等。優選六羥基醇，特別是甘露醇合適。
上述單羥基醇的實例包括甲醇、乙醇及異丙醇等，其中，優選乙醇。
單糖的實例，例如，使用戊糖，如阿拉伯糖、木糖、核糖、2-脫氧核糖等，及己糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、海藻糖等，其中，優選己糖。
寡糖的實例，例如，使用三糖，如麥芽三糖、棉子糖等，及四糖，如水蘇糖等，其中，優選三糖。
單糖、二糖及寡糖衍生物的實例，例如，使用葡糖胺、半乳糖胺、葡萄糖醛酸及半乳糖醛酸。
氨基酸的實例，可使用任何L-氨基酸，例如甘氨酸、亮氨酸及精氨酸。其中，優選L-精氨酸。
滲透壓調節劑可單用或混用。
這些滲透壓調節劑的使用濃度，為在外部水相產生的滲透壓為生理鹽水的滲透壓的約1/50～約5倍，優選約1/25～約3倍。當甘露醇用作滲透壓調節劑，其濃度優選為0.5％～1.5％。
除去有機溶劑可采用已知的方法或類似方法。這些方法的實例包括，在保持螺旋狀攪拌器、磁力攪拌器攪拌下，常壓或逐漸減壓蒸發有機溶劑的方法，以旋轉蒸發儀控制一定的真空度情況下蒸發有機溶劑的方法。
離心或過濾得到微囊，然后，游離的生理活性物質或其鹽、乳化劑以及吸附在微囊表面的其他物質可用蒸餾水反復洗滌幾次，然后再分散于蒸餾水中，凍干。
在制劑過程中，可加入阻凝劑以為防止顆粒相互凝聚。阻凝劑的實例，如水溶性多糖，如甘露醇、乳糖、葡萄糖及淀粉(例如，玉米淀粉等)，氨基酸如甘氨酸，及蛋白質如血纖蛋白及膠原質。其中，優選甘露醇。
以微囊總重為基準，阻凝劑例如甘露醇等的加入量通常為0～約24％重量。
凍干后，必要時可在不引起膠囊相互融溶的條件下減壓加熱除去膠囊中的水及有機溶劑。優選地加熱溫度為或略高于微囊的中點玻璃轉換溫度(intermediate point glass transition temperature)，其可通過示差掃描熱量計測定，溫度升高的速度為每分鐘10～20℃。更優選地，在微囊的中點玻璃轉換溫度附近或在中點玻璃轉換溫度到中點玻璃轉換溫度高30℃的范圍加熱。具體而言，當使用乳酸甘醇酸聚合物作為生物可降解聚合物時，更優選地，在中點玻璃轉換溫度到中點玻璃轉換溫度高10℃的范圍之間的溫度加熱。更優選地，在中點玻璃轉換溫度到中點玻璃轉換溫度高5℃的范圍之間的溫度加熱。
盡管加熱時間可視膠囊的量等而定，在膠囊自身達到規定溫度之后，通常加熱約12小時～168小時，優選約24小時～120小時，特別優選約48小時～96小時。
只要微囊是均一地加熱，其加熱方法無特別限制。
加熱干燥的實例如，在恒溫室，流化室，移動槽或爐(kiln)中加熱及干燥的方法，以及微波加熱的方法。其中，優選恒溫室加熱的方法。
(ii)W/O/W方法首先，制備本發明生物可降解聚合物的有機溶劑溶液。
有機溶劑的實例，如鹵代烴(例如，二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)，醚(例如，乙醚、異丙醚等)，脂肪酸酯(例如，乙酸乙酯、乙酸丁酯等)，芳香烴(例如，苯、甲苯、二甲苯等)，醇(例如，乙醇、甲醇等)，及乙氰等。其中，優選鹵代烴，二氯甲烷特別適合。可使用其適當比例的混合溶劑。此時，優選鹵代烴及醇的混合溶液，特別是優選二氯甲烷與乙醇的混合溶劑。
本發明可生物降解的聚合物在有機溶劑中的濃度視分子量及有機溶劑而定。例如，當以二氯甲烷作為有機溶劑時，濃度通常為約0.5～約70％重量，更優選約1～約60％重量，特別優選約2～約50％重量。
隨后，將包括生理活性物質或其鹽[溶劑的實例如，水、水及醇(例如，甲醇、乙醇等)的混合溶液]的溶液加入至本發明生物可降解聚合物的有機溶液(油相)中。以已知方法如勻漿器或超聲等乳化形成O(油相)/W(水相)乳液。
相對于內層水相的體積，將要混合的油相體積為約1～約1000倍，優選2～100倍，更優選約3～10倍。
在12～25℃下，所得W/O乳液的粘度范圍一般為約10～10,000cp，優選約100～5,000cp，特別優選約500～2,000cp。
然后，將由生理活性物質及乳酸-甘醇酸聚合物組成的W/O乳液加入水相中生成W(內層水相)/O(油相)/W(外層水相)，將油相溶劑經蒸發制得微囊。制備時，外層水相的體積一般為約1倍～約10,000倍，更優選約5倍～約50,000倍，特別優選約10倍～約2,000倍油相體積。
還可加入上述提及的乳化劑及滲透壓調節劑，隨后制劑方法同上部分(I)(i)所述。
(II)相分離方法當以本方法制備微囊時，在攪拌條件下，將凝聚劑(coacervation agent)逐漸加入到包含組合物的有機溶劑溶液中，所述組合物由(I)帶水干燥的方法中所述的生理活性物質以及本發明生物可降解聚合物組成，以沉淀并固化微囊。凝聚劑的量為約0.01～1,000倍，優選約0.05～500倍，特別優選約0.1～200倍的油相體積。
凝聚劑的選擇無特別的限制，只要其選自聚合物系列、礦物油系列或植物油系列化合物，這些化合物可溶于有機溶劑，但不溶解本發明生物可降解聚合物。使用的具體實例如，硅油、芝麻油、豆油、玉米油、棉籽油、椰子油、亞麻籽油，礦物油、正己烷或正庚烷等。可使用兩種或多種混合溶劑。
分離所得微囊，然后以庚烷反復洗滌以從組合物除去凝聚劑等，以及不是生理活性物質以及可生物降解聚合物組成的組合物的其他物質等。將殘留物經減壓干燥。或者，以上述(I)(i)所述的帶水干燥的方法洗滌，然后凍干后再進一步加熱干燥。
(III)噴霧干燥方法當以本方法制備微囊時，以噴霧干燥器(機)的噴嘴將包含組合物的有機溶液或分散溶液噴入干燥室中，在極短時間內揮發精細分散的有機液滴中的溶劑制得微囊，所述組合物由可生物降解聚合物以及生理活性物質組成，如上述部分(I)中帶水干燥方法所述。噴嘴的實例如雙流體噴嘴型、壓力噴嘴型、轉盤型。此后，必要時，可以上述部分(I)帶水干燥方法中同樣的方式洗滌微囊，然后，凍干及進一步加熱干燥。
至于除上述的微囊以外其它的物質形式，將包含組合物的有機溶劑溶液或分散液應用通旋轉蒸發儀控制真空度過蒸發有機溶劑或水干燥至固體，然后，再以噴氣磨等碾碎得精細粉末(微粒)，該組合物由微囊制備方法(I)帶水干燥方法中所述的生理活性物質及本發明生物可降解聚合物組成。
此外，將碾碎的精細粉末可以微囊制備方法(I)所述的帶水干燥方法洗滌，凍干及進一步加熱干燥。
下面例舉了一種制備控釋組合物(例如，微囊)的方法，該組合物包含生理活性物質或其鹽，羥基萘甲酸或其鹽及本發明的乳酸聚合物或其鹽，然而，也可在不含羥基萘甲酸或其鹽的情況下，以同樣方式制備。
(I)帶水干燥方法(i)O/W方法在本方法中，首先制備羥基萘甲酸或其鹽以及乳酸聚合物或其鹽的有機溶劑。用于制備控釋組合物的本發明有機溶劑的沸點為優選120℃或更低。
有機溶劑的實例，如鹵代烴(例如，二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)，醚(例如，乙醚、異丙醚等)，脂肪酸酯(例如，乙酸乙酯、乙酸丁酯等)，芳香烴(例如，苯、甲苯、二甲苯等)，醇(例如，乙醇、甲醇等)，及乙氰等。用于乳酸-甘醇酸聚合物或其鹽等的有機溶劑，優選二氯甲烷。
優選醇作為羥基萘甲酸或其鹽有機的溶劑。既可于混合前分別溶解，也可將兩種物質溶解于一種以合適比例混合的有機溶劑中。其中，混合溶液優選鹵代烴及醇，特別優選二氯甲烷及乙醇混合溶液。
當乙醇與二氯甲烷用作有機混合溶劑時，乙醇在兩種有機溶劑的比例通常約0.01～約50％(v/v)，更優選約0.05～約40％(v/v)，特別優選約0.1～約30％(v/v)乳酸聚合物在有機溶液中的濃度視乳酸聚合物分子量及有機溶劑的種類而定，例如，當以二氯甲烷作為有機溶劑，濃度通常為約0.5～約70％重量，更優選約1～約60％重量，特別優選約2～約50％重量。
羥基萘甲酸或其鹽在有機溶液中的濃度，當以二氯甲烷和乙醇的混合物作為有機溶劑，其濃度通常為約0.01～約10％重量，更優選約0.1～約5％重量，特別優選約0.5～約3％重量。
將生理活性物質或其鹽加入并溶解或分散于如上得到的羥基萘甲酸或其鹽以及乳酸聚合物的有機溶液中。隨后，將得到的有機溶液加入到水相以形成O(油相)/W(水相)乳液，將油相中的溶劑蒸發或分散于水相中形成微囊，所述的有機溶劑包含組合物，所述的組合物由生理活性物質或其鹽、羥基萘甲酸或其鹽以及乳酸聚合物或其鹽。在這種情況下，水相體積通常為約1～約10,000倍，更優選約5～50,000倍，特別優選約10～2,000倍油相體積。
可上述向外層水相加入乳化劑。乳化劑只要為可形成穩定O/W乳液的任何化合物。具體而言，例如，使用陰離子表面活性劑(油酸鈉、硬脂酸鈉、月桂硫酸鈉等)，非離子表面活性劑(聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐溫80、吐溫60，Atlas Powder制造)，聚氧乙烯蓖麻油衍生物(HCO-60、HCO-50，NikkoChemical K.K制造)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纖維素、卵磷脂、明膠及透明質酸酸。其可單用或聯用。使用濃度范圍為約0.001～10％重量，更優選為約0.05～5％重量。
可向上述外層水相加入滲透壓調節劑。任何當制備成水溶液后可產生滲透壓的滲透壓調節劑皆可使用。
滲透壓調節劑的實例包括多羥基醇、單羥基醇、單糖、二糖、寡糖及氨基酸及其衍生物等。
多羥基醇實例，如三羥基醇，如甘油等，五羥基醇，如阿糖醇、木糖醇、核糖醇等，及六羥基醇，如甘露醇、山梨醇、己六醇等。優選六羥基醇，特別優選甘露醇。
上述單羥基醇的實例包括甲醇、乙醇及異丙醇等，其中，優選乙醇。
單糖的實例，例如，使用戊糖，如阿拉伯糖、木糖、核糖、2-脫氧核糖等，及己糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、鼠李糖、海藻糖等，其中，優選己糖。
寡糖的實例，例如，使用三糖，如麥芽三糖、棉子糖等，及四糖，如水蘇糖等，其中，優選三糖。
單糖、二糖及寡糖衍生物的實例，例如，使用葡糖胺、半乳糖胺、葡萄糖醛酸及半乳糖醛酸。
氨基酸的實例，可使用任何L-氨基酸，例如甘氨酸、亮氨酸及精氨酸。其中，優選L-精氨酸。
滲透壓調節劑可單用或混用。
這些滲透壓調節劑的使用濃度，為在外部水相產生的滲透壓為生理鹽水的滲透壓的約1/50～約5倍，優選約1/25～約3倍。當甘露醇用作滲透壓調節劑，其濃度優選為0.5％～1.5％。
除去有機溶劑可采用已知的方法或類似方法。這些方法的實例包括，在保持螺旋狀攪拌器、磁力攪拌器或超聲波發生裝置攪拌下，常壓或逐漸減壓蒸發有機溶劑的方法，以旋轉蒸發儀保持一定的真空度情況下蒸發有機溶劑的方法，以及使用滲析膜逐漸除去有機溶劑的方法。
離心或過濾得到微囊，然后，將游離的生理活性物質或其鹽、羥基萘甲酸或其鹽、支持藥物的物料，吸附在微囊表面的乳化劑等反復以蒸餾水洗滌幾次，然后在分散于蒸餾水等中，并凍干。
在制劑過程中，可加入阻凝劑以為防止顆粒相互凝聚。阻凝劑的實例，如水溶性多糖，如甘露醇、乳糖、葡萄糖及淀粉(例如，玉米淀粉等)，氨基酸如甘氨酸，及蛋白質如血纖蛋白及膠原質。其中，優選甘露醇。
以微囊總重為基準，阻凝劑例如甘露醇等的加入量通常為0～約24％重量。
凍干后，必要時可在不引起膠囊相互融溶的條件下減壓加熱除去膠囊中的水及有機溶劑。優選地加熱溫度為或略高于微囊的中點玻璃轉換溫度，其可通過示差掃描熱量計測定，溫度升高的速度為每分鐘10～20℃。更優選地，在微囊的中點玻璃轉換溫度附近或在中點玻璃轉換溫度到中點玻璃轉換溫度高30℃的范圍加熱。具體而言，當使用乳酸甘醇酸聚合物作為生物可降解聚合物時，更優選地，在中點玻璃轉換溫度到中點玻璃轉換溫度高10℃的范圍之間的溫度加熱。更優選地，在中點玻璃轉換溫度到中點玻璃轉換溫度高5℃的范圍之間的溫度加熱。
盡管加熱時間可視膠囊的量等而定，在膠囊自身達到規定溫度之后，通常加熱約12小時～168小時，優選約24小時～120小時，特別優選約48小時～96小時。
只要微囊是均一地加熱，其加熱方法無特別限制。
加熱干燥的實例如，在恒溫室，流化室，移動槽或爐中加熱及干燥的方法，以及微波加熱的方法。其中，優選恒溫室加熱的方法。
(ii)W/O/W方法(1)首先，制備乳酸聚合物或其鹽的有機溶劑溶液。
有機溶劑溶液中的有機溶劑及乳酸聚合物或其鹽的濃度與上述部分(I)(i)相同。當使用混合有機溶劑時，兩種物質的比例如上述部分(I)(i)中一樣。
將生理活性物質或其鹽溶解或分散于如上得到的乳酸聚合物或其鹽的有機溶液中。然后，向包含組合物的有機溶液加入有機溶液(油相)中，加入羥基萘甲酸或其鹽的溶液[溶劑的實例，如水、醇(例如，甲醇、乙醇等)的水溶液、吡啶水溶液、二甲基乙酰胺水溶液等]，該組合物包含生理活性物質或其鹽及乳酸聚合物或其鹽。然后將該混合物以已知方法，如勻漿器或超聲等形成W(水相)/O(油相)乳液。
然后，將所得包含生理活性物質或其鹽、羥基萘甲酸或其鹽及乳酸聚合物或其鹽的W/O乳液加入到水相以形成W(內層水相)/O(油相)/W(外層水相)的乳液，油相溶劑經蒸發制得微囊。在此操作中，外層水相體積通常為約1～約10,000倍，更優選約5～5,000倍，特別優選約10～2,000倍油相體積。
可向外層水相加入上述乳化劑、滲透壓調節劑，隨后的制劑方法與部分(I)(i)相同。
(iii)W/O/W方法(2)首先，制備羥基萘甲酸或其鹽及乳酸聚合物或其鹽的有機溶液，所得的溶液稱為油相。制劑方法與上述的部分(I)(i)相同。或者，將羥基萘甲酸或其鹽及乳酸聚合物于混合前分別制成有機溶液。有機溶劑溶液中乳酸聚合物的濃度依據乳酸聚合物的分子量及有機溶劑類型而定，例如，當使用二氯甲烷為有機溶劑時，濃度通常為約0.5～約70％重量，更優選約1～約60％重量，特別優選約2～約50％重量。
其次，制備生理活性物質或其鹽的溶液或分散液[溶劑的實例，如水，水及醇(例如，甲醇，乙醇等)混合液等]。
生理活性物質或其鹽的加入濃度通常為0.001mg/ml～10g/ml，更優選0.1mg/ml～5g/ml，進一步優選10mg/ml～3g/ml。
當生理活性物質含有堿性基團，如氨基，鹽的實例包括與無機酸(也即游離的無機酸)(例如，碳酸、碳酸氫鹽、鹽酸、硫酸、硝酸、硼酸等)及有機酸(也即游離的有機酸)(例如，琥珀酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸等)形成的鹽。
當生理活性物質含有酸性基團，如羧基等，鹽的實例包括與無機堿(也即游離的無機堿)(例如，堿金屬如鈉、鉀等，堿土金屬如鈣、鎂等)及有機堿(也即游離的有機堿)(例如，有機胺如三乙胺等，堿性氨基酸如精氨酸等)形成的鹽。具有生理活性的肽可進一步形成金屬絡合物(例如，銅絡合物、鋅絡合物等)。當生理活性物質為LHRH衍生物時，特別優選加入乙酸。
可使用已知的增溶劑及穩定劑。為溶解或分散生理活性物質或添加劑，可在不影響活性的情況下加熱、振搖及攪拌以得到稱為內層水相的水溶液。
內層水相以及上述的油相可用已知方法如勻漿及超聲波生成W/O乳液。
混合的油相體積為其約1～約1000倍，優選2～100倍，更優選約3～10倍的內層水相體積。
在約12～25℃，所得W/O乳液的粘度通常為約10～10000cp，優選約100～5000cp，更優選約500～2000cp。
將包括生理活性物質或其鹽、羥基萘甲酸或其鹽及乳酸聚合物或其鹽的W/O乳液加入水相以生成W(內層水相)/O(油相)/W(外層水相)的乳液，油相溶劑經濃縮或分散于外層水相制得微囊。在該操作，外層水相的體積一般為約1倍～約10,000倍，更優選約5倍～約50,000倍，特別優選約10倍～約2,000倍油相體積。
可向外層水相中加入上述乳化劑、滲透壓調節劑，并且及隨后的制劑方法與部分(I)(i)相同。
(II)相分離方法當以本方法制備微囊時，攪拌的同時將凝聚劑逐漸加入到含組合物的有機溶劑溶液中，以使沉淀并固化膠囊，所述的組合物由生理活性物質或其鹽及乳酸-甘醇酸聚合物或其鹽組成，如以上述(I)所述的帶水干燥的方法中所述。凝聚劑的體積為約0.01～1,000倍，優選約0.05～500倍，特別優選約0.1～200倍油相體積。
凝聚劑的選擇無特別限制，只要其為聚合物系列、礦物油系列或植物油系列化合物，這些化合物可與有機溶劑相容，但不溶解生理活性物質或其鹽、羥基萘甲酸或其鹽及乳酸聚合物或其鹽。具體的實例如，硅油、芝麻油、豆油、玉米油、棉籽油、椰子油、亞麻籽油，礦物油、正己烷或正庚烷。或其中2種或多種的混合物。
分離所得微囊，然后以庚烷反復洗滌以從組合物除去凝聚劑等，以及不是生理活性物質以及可生物降解聚合物組成的組合物的其他物質等。將殘留物經減壓干燥。或者，以上述(I)(i)所述的帶水干燥的方法洗滌，然后凍干后再進一步加熱干燥。
(III)噴霧干燥方法當以本方法制備微囊時，以噴霧干燥器(機)的噴嘴將有機溶劑溶液噴入干燥室中，在極短時間內揮發精細分散的有機液滴中的溶劑制得微囊，所述有機溶劑溶液含生理活性物質或其鹽、羥基萘甲酸或其鹽以及乳酸聚合物或其鹽，如上述部分(I)中帶水干燥方法所述。噴嘴的實例如雙流體噴嘴型、壓力噴嘴型、轉盤型。此后，必要時，可以上述部分(I)帶水干燥方法中同樣的方式洗滌微囊，然后，凍干及進一步加熱干燥。
至于除上述的微囊以外其它的物質形式，將有機溶劑溶液應用通旋轉蒸發儀控制真空度過蒸發有機溶劑或水干燥至固體，然后，再以噴氣磨等碾碎得精細粉末(微粒)，該有機溶劑溶液包含由微囊制備方法(I)帶水干燥方法中生理活性物質或其鹽、羥基萘甲酸或其鹽以及乳酸聚合物或其鹽。
此外，將碾碎的精細粉末可以微囊制備方法(I)所述的帶水干燥方法洗滌，凍干及進一步加熱干燥。
如上得到的微囊或精細粉末可提供相應于所用的乳酸聚合物或乳酸-甘醇酸聚合物降解速度的藥物釋放。
然后，下面舉例說明制備包含羥基萘甲酸鹽控釋組合物的方法，該鹽為本發明中生理活性物質。在該制備方法中，具有生理活性的肽優選用作生理活性物質。
(IV)二步法將生理活性物質或其鹽加入羥基萘甲酸或其鹽的有機溶劑溶液中，以使上述的生理活性物質的結合量的重量比滿足，以制得包含生理活性物質羥基萘甲酸鹽的有機溶劑溶液。
該有機溶劑溶液與上述部分(I)(i)相同。當使用混合有機溶劑時，兩種溶劑的比例如上述部分(I)(i)一樣。
除去包含羥基萘甲酸鹽的組合物中的有機溶劑的方法實例，該鹽為生理活性物質，可為已知的方法或類似方法。例如，可控制真空度采用旋轉蒸發儀等蒸發有機溶劑。
再制備如上得到的包含為生理活性物質的羥基萘甲酸鹽組合物的有機溶劑溶液，及控釋組合物(微小顆粒的微球)。
有機溶劑的實例，如使用鹵代烴(例如，二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)，醚(例如，乙醚、異丙醚等)，脂肪酸酯(例如，乙酸乙酯、乙酸丁酯等)，芳香烴(例如，苯、甲苯、二甲苯等)等。可使用其適當比例的混合溶劑。其中，優選鹵代烴，二氯甲烷特別適合。
然后，將所得包含含生理活性物質羥基萘甲酸鹽組合物的有機溶液加入水相以形成O(油相)/W(水相)乳液，然后，將油相溶劑蒸發制得微囊。在這種情況下，水相體積通常為約1～約10,000倍，更優選約5～5,000倍，特別優選約10～2,000倍油相體積。
可將上述乳化劑、滲透壓調節劑加入外層水相，并且隨后的制劑方法與部分(I)(i)相同。
除去有機溶劑可采用已知的方法或類似方法。例如，在保持螺旋狀攪拌器或磁力攪拌器攪拌的情況下，在常壓或逐漸減壓下蒸去有機溶劑的方法；在蒸去有機溶劑的時候保持一定的真空度，可采用旋轉蒸發儀的方法等或其它方法。
以離心或過濾方法分離所得微球，然后，以蒸餾水反復洗滌幾次附著于微球表面上游離的生理活性物質、羥基萘甲酸、乳化劑等，再分散于蒸餾水等中并凍干。
在制劑過程中，可加入阻凝劑以為防止顆粒相互凝聚。阻凝劑的實例，如水溶性多糖，如甘露醇、乳糖、葡萄糖及淀粉(例如，玉米淀粉等)，氨基酸如甘氨酸，及蛋白質如血纖蛋白及膠原質。其中，優選甘露醇。
凍干后，必要時，可在不引起微球相互融溶的情況下進一步減壓升溫除去微球中的水及有機溶劑。
盡管加熱時間依微球的量等而異，在微球本身達到給定的溫度后，通常約12小時～168小時，優選約24小時～120小時，特別優選約48小時～96小時。
只要微囊是均一地加熱的，其加熱方法無特別限制。
加熱及干燥的實例如，在恒溫室、流化室、移動槽或爐中加熱及干燥的方法，以及微波加熱的方法。其中，優選恒溫室加熱的方法。生成的微球呈相對均一的球形，不妨礙注射，不會堵塞針孔。由于使用纖細的針頭，患者疼痛更小。
(V)一步法將生理活性物質或其鹽加入到羥基萘甲酸或其鹽的有機溶劑溶液中，以符合上述的生理活性物質的結合量定義中顯示的重量比，以制得包含生理活性物質羥基萘甲酸鹽的有機溶劑溶液，以及控釋組合物(微小顆粒的微球)。
該有機溶劑溶液與上述部分(I)(i)相同。當使用混合有機溶劑時，兩種溶劑的比例如上述部分(I)(i)一樣。
然后，將所得包含具有生理活性物質羥基萘甲酸鹽的有機溶劑溶液加入水相以形成O(油相)/W(水相)乳液，然后，油相溶劑經濃縮制得微囊。在此種情況下，水相體積通常為約1～約10000倍，更優選約5～5000倍，特別優選約10～2000倍油相體積。
可將上述乳化劑、滲透壓調節劑加入外層水相，并且隨后的制劑方法與部分(I)(i)相同。
本發明控釋組合物可為任何形式，如微球、微囊或微小顆粒(微粒)等，優選微囊。
本發明緩釋組合物可原樣使用，或以其作為原料制成給藥前的各種劑型，作為注射劑或可置入靜脈內、皮下及器官內給藥，以及用于鼻腔、直腸或子宮給藥經粘膜吸收藥物、口服制劑(例如，膠囊(例如，硬膠囊、軟膠囊等))，固體制劑如顆粒、粉末等，或液體制劑如糖漿、乳劑、混懸劑)等。
例如，將本發明控釋組合物制成注射劑時，其可制成水懸液，可一起加入的有分散劑(例如，表面活性劑如吐溫80、HCO-60等，及多糖如透明質酸鈉、羧甲基纖維素、精氨酸鈉等)，防腐劑(例如，羥苯甲酸甲酯及羥苯甲酸丙酯)，等張調節劑(氯化鈉、甘露醇、山梨醇、葡萄糖及哺氨酸)，或將其與植物油，如芝麻油或玉米油分散于油懸液中得到可實際使用的控釋注射劑。
當本發明控釋組合物用作注射混懸劑時，其顆粒直徑應滿足一定的分散度及具有較好的穿透性質。例如，平均顆粒直徑約0.1～300μm，優選約0.5～150μm，更優選約1～100μm。
為將本發明緩釋組合物制成無菌制劑，可以使用在制劑中保持各步無菌操作的方法，以γ射線消毒的方法及添加防腐劑的方法等，但是無菌方法不限于這些。
由于本發明控釋組合物毒性低，其可安全用于哺乳動物(例如，人、牛、豬、狗、貓、小鼠、大鼠、兔等)。
本發明控釋組合物的劑量視生理活性物質的類型及含量、劑型、生理活性物質釋放時間、疾病類型及研究的動物及其有效劑量而定，優選地為有效量的生理活性物質。生理活性物質的每次給藥劑量優選約0.01mg～10mg/kg，更優選約0.05mg～5mg/kg成人體重，當使用控釋期為六個月的制劑。
控釋組合物單位劑量優選約為0.05mg～50mg/kg，更優選約0.1mg～30mg/kg成人體重。
合適的給藥頻率視生理活性物質的類型及含量、劑型、生理活性物質釋放時間、疾病類型及研究的動物而定，如數周一次、每月一次、數月(例如，3月、4月、6月)一次等。
本發明控釋組合物視生理活性物質的類型可預防或治療多種疾病疾病，例如，當生理活性物質為LH-RH衍生物時，其可用于預防或治療激素依賴性疾病，特別是，性激素依賴性癌癥(例如，前列腺癌、子宮癌、乳腺癌、垂體腺瘤等)、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、性早熟、痛經、無月經、經前綜合征、多室子宮綜合征等，作為絕經前乳腺癌術后乳腺癌復發的預防藥物。作為阿爾茨海默病或自身免疫疾病的預防或治療藥物，及作為避孕藥(或者，當藥物停用后所致的活性反彈，預防和治療不孕)等。此外，本發明控釋組合物也可用作良性或惡性腫瘤的預防藥物或治療藥物，這些腫瘤不依賴于性激素，但是LH-RH依賴性的。
因而，可預防或治療激素依賴性疾病，特別是，性激素依賴性癌癥(例如，前列腺癌、子宮癌、乳腺癌、垂體腺瘤等)，性激素依賴性疾病如前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、性早熟、痛經、無月經、經前綜合征、多室子宮綜合征等；以及根據本發明，對哺乳動物使用有效量的預防或治療藥物預防懷孕，預防絕經前乳腺癌術后乳腺癌復發。
隨后的實施例及參考例將對本發明進行舉例說明，但不對本發明的范圍有任何限制。
在下述實施例以及參考實施例中的重均分子量及數均分子量指以凝膠滲透色譜(GPC)測定的分子量，在使用聚苯乙烯的情況下，用單一分散聚苯乙烯作為標準物質，聚合物的含量由此推算。以高效GPC儀器(Toso公司制造，HLC-8120GPC)及Super H 4000X2及Super H 2000(所有的色譜柱皆為Toso公司制造)進行測定，THF作為流動相，流速為0.6ml/分鐘。檢測方法基于差視折射率。
參考實施例A1高分子量乳酸聚合物的合成將4.1mL的1.0mol/L二乙基鋅己烷溶液、1.35g乳酸叔丁酯及230g的DL-丙交酯加入至230mL無水二甲苯中，在120～130℃聚反應約2小時。反應結束后，將120mL二氯甲烷傾入反應溶液中，再向其中加入230mL三氟乙酸進行脫保護反應。反應結束后，再向反應液加入300mL二氯甲烷，然后將反應液傾入2800mL異丙醚中得到預期物質的沉淀，再以二氯甲烷/異丙醚反復沉淀，得到重均分子量約為40000的乳酸聚合物。
參考實施例B1將參考實施例A1聚合物溶于600mL二氯甲烷中，以水洗至中性，加入70g的90％乳酸水溶液并于40℃反應。當溶于反應液的重均分子量達到20000時，將反應液冷至室溫，傾入600mL二氯甲烷以終止反應，反應液以水洗至中性。水洗后，濃縮干燥得到乳酸聚合物。所得乳酸聚合物的末端羧基的量約為80μmol/g聚合物，分子量為5000或更小的聚合物的含量為7.29wt％。
參考實施例C1將參考實施例A1中的聚合物溶于600mL二氯甲烷中，以水洗至中性，加入70g的90％乳酸水溶液并于40℃反應。當溶于反應液的重均分子量達到20000時，將反應液冷至室溫，傾入600mL二氯甲烷以終止反應，反應液以水洗至中性，然后將反應液滴加入2800mL異丙醚中產生預期乳酸聚合物的沉淀。將潷出的沉淀溶于600mL二氯甲烷中，溶液經濃縮干燥得160g乳酸聚合物。所得乳酸聚合物的末端羧基的量約70μmol/g聚合物。使用的高分子量乳酸聚合物的重均分子量，水解處理后的乳酸聚合物重均分子量，所得的預期乳酸聚合物的重均分子量以及分子級分如表1所示。
參考實施例C2～6本發明乳酸聚合物的獲取方式如參考實施例C1。使用的高分子量乳酸聚合物的重均分子量，水解處理后的乳酸聚合物重均分子量，所得的預期乳酸聚合物的重均分子量以及分子級分如表1所示。


由表1可知，本發明方法所得的本發明乳酸聚合物含有約5％重量或更小的分子量為5000或更小的聚合物級分，約1.5％重量或更小的分子量為3000或更小的聚合物級分，約0.1％重量或更小的分子量為1000或更小的聚合物。
包含羥基萘甲酸的組合物實施例A1將144.4g的DL-乳酸聚合物(重均分子量22500，標記量化法確定的羧基量66.7μmol/g)溶于111.7g二氯甲烷中得到溶液，與取自將7.5g的3-羥基-2萘甲酸溶于175.1g二氯甲烷及13.5g乙醇中形成的溶液中的147.2g溶液相混合，并控制在28.7℃。然后從中稱出274.4g有機溶劑溶液并與水溶液進行混合，所述的水溶液為將24.89g肽A乙酸鹽溶于23.47g蒸餾水溶液中并加熱到54.5℃形成的，將該混合液攪拌5分鐘得到粗乳液，然后以均漿器于10046rpm條件下乳化5分鐘形成W/O乳液。然后，將該W/O乳液冷卻至15.0℃，傾入25L的0.1％(w/w)聚乙烯醇(EG-40，Nippon Syntic ChemicalIndustry Co.，Ltd.制造)水溶液中，該水溶液預先在15.0℃控制3分鐘26秒，并用HOMOMIC LINE FLOW(Tokushu Kika K.K.制造)在7000rpm攪拌得到W/O/W乳液。該W/O/W乳液于15℃控溫30分鐘，然后，在無控溫下攪拌2小時30分鐘蒸發二氯甲烷及乙醇或將二氯甲烷及乙醇驅散到外層水相中，使油相固化，過75μm篩，以離心分離器(H600S，Kokusanenshinki制造)于2000rpm下持續地沉淀微囊，并將沉淀的微囊收集。將收集的微囊再分散于少量蒸餾水中并過90μm篩，向其中加入15.4g甘露醇使其溶解，將溶液凍干得粉末。微囊粉末的回收重量為101.6g，回收率為72.7％，肽A含量為15.88％，3-羥基-2-萘甲酸含量為2.82％。
實驗實施例A1將實施例A1所述的45mg微囊分散于0.3mL分散介質(含0.15mg羧甲基纖維素的蒸餾水，0.3mg聚山梨醇酯80及15mg甘露醇溶于其中)中，然后以22G注射針頭施用于7周齡SD雄性大鼠背部皮下。在給藥后的給定時間，處死大鼠并清除給藥部位殘留微囊，將其中包含的肽A定量后除以初始給藥量，得到的殘留率如表2所示。


由表2可知，通過加入3-羥基-2-萘甲酸制備的實施例A1微囊，即使是在125g規模下制備也可包含大量的生理活性物質，并可極其有效地抑制生理活性物質的初始過度釋放。此外，微囊使生理活性物質在較長期內以恒速釋放。
不含羥基萘甲酸的組合物實施例B1將4.00g地DL-乳酸聚合物(重均分子量18300，標記量化法確定的羧基量86μmol/g)溶于6.77g二氯甲烷中制備得到溶液。該溶液經稱重后，與下述溶液混合，所述的溶液為將1.04g肽A乙酸鹽溶于0.92g蒸餾水并加熱到60℃，然后以勻漿器在25000rpm乳化20秒形成W/O乳液。將該W/O乳液傾入1L的0.1％(w/w)聚乙烯醇(EG-40，Nippon Syntic ChemicalIndustryCo.，Ltd.制造)水溶液中，該水溶液預先在18.0℃控制20秒，以homomixer(Tokushu Kika K.K.制造)在7000rpm攪拌生成W/O/W乳液。該W/O/W乳液于室溫攪拌3小時，蒸發二氯甲烷及乙醇或將二氯甲烷及乙醇驅散到外層水相中，使油相固化，過75μm篩，并以純凈水洗滌，以離心分離器(05PR-22HITACHI)于2500rpm下5分鐘沉淀微囊，收集沉淀的微囊。將微囊再分散于少量蒸餾水中，向其中加入0.50g甘露醇使其溶解，將溶液凍干得粉末。微囊粉末的回收重量為2.12g，回收率為38.2％，肽A含量為12.98％。
實驗實施例B2將4.40g的DL-乳酸聚合物(重均分子量18300，標記量化法確定的羧基量86μmol/g)溶于7.40g二氯甲烷中制備得到溶液。該溶液經稱重后，并與水溶液相混合，所述的水溶液為將0.60g肽A乙酸鹽溶入0.552g蒸餾中并加熱至60℃形成，然后以勻漿器于25000rpm乳化20秒形成W/O乳液。將該W/O乳液傾入1L的0.1％(w/w)的聚乙烯醇(EG-40，Nippon SynticChemical Industry Co.，Ltd.制造)水溶液中，該水溶液預先在18.0℃控制20秒，以homomixer(Tokushu Kika K.K.制造)于7000rpm攪拌生成W/O/W乳液。該W/O/W乳液于室溫攪拌3小時，蒸發二氯甲烷及乙醇或將二氯甲烷及乙醇驅散到外層水相中，使油相固化，過75μm篩，并以純凈水洗滌，以離心分離器(05PR-22HITACHI)于2500rpm下離心5分鐘沉淀微囊，將沉淀的微囊收集。將微囊再分散于少量蒸餾水中，向其中加入0.50g甘露醇使其溶解，將溶液凍干，在約50℃真空干燥48小時得粉末。微囊粉末的回收重量為3.04g，回收率為55.3％，肽A含量為9.21％。
實驗實施例B3將8.10g的DL-乳酸聚合物(重均分子量21900，標記量化法確定的羧基量75.8μmol/g)溶于14.15g二氯甲烷中制備得到溶液。該溶液經稱重后，并與水溶液相混合，所述的水溶液為將將0.93g肽A乙酸鹽溶入0.95g蒸餾中并加熱至60℃形成，然后以勻漿器于25000rpm乳化20秒形成W/O乳液。將該W/O乳液傾入1L的0.1％(w/w)的聚乙烯醇(EG-40，Nippon SynticChemical Industry Co.，Ltd.制造)水溶液中，該水溶液預先在18.0℃控制20秒，以homomixer(TokushuKikaK.K.制造)于7000rpm攪拌生成W/O/W乳液。該W/O/W乳液于室溫攪拌3小時，蒸發二氯甲烷及乙醇或將二氯甲烷及乙醇驅散到外層水相中，使油相固化，過75μm篩，并以純凈水洗滌，以離心分離器(05PR-22HITACHI)于2500rpm離心5分鐘沉淀微囊，將沉淀微囊收集。將微囊再分散于少量蒸餾水中，向其中加入1.00g甘露醇使其溶解，將溶液凍干，約50℃下真空干燥30小時得粉末。微囊粉末的回收重量為5.44g，表示回收率為54.17％，肽A含量為8.03％。
實驗實施例B4將205.5g的DL-乳酸聚合物(重均分子量21400，標記量化法確定的羧基量76.1μmol/g)溶于354.3g二氯甲烷中，所得溶液減壓下以0.2μm濾紙(EMFLOW，DFA4201FRP)過濾，并將溫度控制在28.8℃。稱取380.4g該溶液，并與水溶液相混合，所述的水溶液為將16.11g肽A乙酸鹽溶入16.22g蒸餾水中并加熱至60℃形成，攪拌混合液1分鐘得到粗乳化液，然后以minimixer于10150rpm乳化2分鐘形成W/O乳液，將該W/O乳液冷卻至18℃，傾入25L的0.1％(w/w)聚乙烯醇(EG-40，Nippon Syntic Chemical IndustryCo.，Ltd.制造)水溶液中，該水溶液預先在18.7℃控制3分鐘10秒，以HQMOMOMIC LINE FLOW(Tokushu Kika K.K.制造)7001rpm攪拌生成W/O/W乳液。該W/O/W乳液于18.5℃控溫30分鐘，不控溫攪拌2小時30分鐘，以蒸發二氯甲烷及乙醇或將二氯甲烷及乙醇驅散到外層水相中，使油相固化，過75μm過篩，以離心分離器(H600S，Kokusanenshinki制造)于2000rpm持續地沉淀微囊，將沉淀微囊收集。將微囊再分散于少量蒸餾水中并過90μm篩，向其中加入18.85g甘露醇使其溶解，將溶液凍干得粉末。微囊粉末的回收重量為117.6g，表示回收率為68.54％，肽A含量為7.76％。
實驗實施例B5將4.80g的DL-乳酸聚合物(重均分子量28800，標記量化法確定的羧基量78.1umol/g)溶于7.8g二氯甲烷中制備得到溶液。該溶液經稱重后，并與水溶液相混合，所述的水溶液為將1.20g肽A乙酸鹽溶入1.2g蒸餾水中并加熱至60℃形成，然后以勻漿器于25000rpm乳化20秒形成W/O乳液。然后，將該W/O乳液傾入1.2L的0.1％(w/w)的聚乙烯醇(EG-40，Nippon SynticChemical Industry Co.，Ltd.制造)水溶液中，該水溶液預先在15.0℃控制20秒，以homomixer(Tokushu Kika K.K制造)于7000rpm攪拌生成W/O/W乳液。該W/O/W乳液于室溫攪拌3小時，蒸發二氯甲烷及乙醇或將二氯甲烷及乙醇驅散到外層水相中，使油相固化，過75μm篩，并以純凈水洗滌，以離心分離器(05PR-22HITACHI)于2200rpm離心5分鐘沉淀微囊，將沉淀微囊收集。將微囊再分散于少量蒸餾水中，向其中加入0.30g甘露醇使其溶解，將溶液凍干成粉狀物。微囊粉末的回收重量為3.42g，回收率為53.56％，肽A含量為11.08％。
實驗實施例B1將實施例B1所述的約69mg微囊分散于0.3mL分散介質(包含0.15mg羧甲基纖維素、0.3mg聚山梨醇酯80及15mg甘露醇的蒸餾水溶液)中，然后以22G注射針頭對7周齡SD雄性大鼠經背部皮下給藥。在給藥后給定的時間，處死大鼠并清除給藥部位殘留微囊，將其中包含的肽A定量后除以初始給藥量，得到如表3所示的殘留率。


由表3可知，通過加入過量肽A制備的實施例B1微囊，可包含大量生理活性物質，同時，并可極其有效地抑制生理活性物質的初始過度釋放。此外，從另一批同樣的制劑可以看出，該微囊實現了生理活性物質在較長期內的恒速釋放。
實驗實施例B2將實施例B2所述的約73mg微囊分散于0.3mL分散介質(包含0.15mg羧甲基纖維素、0.3mg聚山梨醇酯80及15mg甘露醇的蒸餾水溶液)中，然后以22G注射針頭對7周齡SD雄性大鼠經背部皮下給藥。在給藥后給定的時間，處死大鼠并清除給藥部位殘留微囊，將其中包含的肽A定量后除以初始給藥量，得到如表4所示的殘留率。


由表4可知，僅混合肽A制備的實施例B2微囊，可包含生理活性物質，可充分抑制生理活性物質的初始過度釋放，并長期以近似恒速釋放藥物。
實驗實施例B3將實施例B3所述的約112mg微囊分散于0.3mL分散介質(包含0.15mg羧甲基纖維素、0.3mg聚山梨醇酯80及15mg甘露醇的蒸餾水溶液)中，然后以22G注射針頭對7周齡SD雄性大鼠經背部皮下給藥。在給藥后給定的時間，處死大鼠并清除給藥部位殘留微囊，將其中包含的肽A定量后除以初始給藥量，得到如表5所示的殘留率。


由表5可知，僅混合肽A制備的實施例B3微囊，可包含生理活性物質，可充分抑制生理活性物質的初始過度釋放，并長期以近似恒速釋放藥物。
實驗實施例B4將實施例B4所述的約116mg微囊分散于0.3mL分散介質(包含0.15mg羧甲基纖維素、0.3mg聚山梨醇酯80及15mg甘露醇的蒸餾水溶液)中，然后以22G注射針頭對7周齡SD雄性大鼠經背部皮下給藥。在給藥后給定的時間，處死大鼠并清除給藥部位殘留微囊，將其中包含的肽A定量后除以初始給藥量，得到如表6所示的殘留率。


由表6可知，僅混合肽A制備的實施例B4微囊，可包含生理活性物質，可充分抑制生理活性物質的初始過度釋放，并長期以近似恒速釋放藥物。
實驗實施例B5將實施例B5所述的48.7mg微囊分散于0.3mL分散介質(包含0.15mg羧甲基纖維素、0.3mg聚山梨醇酯80及15mg甘露醇的蒸餾水溶液)中，然后以22G注射針頭對7周齡SD雄性大鼠經背部皮下給藥。在給藥后的給定時間，處死大鼠并清除給藥部位殘留微囊，將其中包含的肽A定量后除以初始給藥量，得到如表7所示的殘留率。


由表7可知，僅混合肽A制備的實施例B5微囊，可包含生理活性物質，并合適地抑制生理活性物質的初始過度釋放，并且該微囊實現了生理活性物質地長期恒速釋放。
參考實施例C7將206.6g的DL-乳酸聚合物(重均分子量21900，標記量化法確定的羧基量66.7μmol/g)溶于354.8g二氯甲烷中得到溶液，將形成的溶液溫熱并保持在30℃。稱出381.5g該溶液，并下述溶液混合，該溶液為將15.8g亮丙瑞林(leuproreline)乙酸鹽溶入16.6g冰乙酸溶液(0.6g冰乙酸溶于31.75g蒸餾水中)中并加熱至約55℃形成。然后以minimixer(轉速約10,000rpm)(Tokushu Kika K.K.制造)乳化形成W/O乳液。然后，將該W/O乳液冷卻至18.0℃，傾入25L預先控制在18.0℃的含0.1％(w/w)聚乙烯醇(EG-40，NipponSyntic Chemical Industry Co.，Ltd.制造)及1％甘露醇溶液中，然后以HOMOMIC LINE FLOW(Tokushu Kika K.K.制造)乳化生成W/O/W乳液(渦輪轉速約7,000rpm；循環泵轉速約2,000rpm)。該W/O/W乳液帶水干燥3小時，過75μm標準篩，然后以離心分離器(H-600S，國產離心器)(轉速約2,000rpm；流速約600ml/分鐘)持續地沉淀微囊，并將沉淀微囊收集。將微囊再分散于少量蒸餾水中并過標準90μm篩，向其中加入18.9g甘露醇使其溶解，以凍干機(TRIOMASTER，Kyouwa Sinkuu K.K.制造)將溶液凍干得粉末(微囊粉末)。微囊的亮丙瑞林乙酸鹽含量為8.2％，回收率為75％。添加乙酸可成功地獲得W/O乳液，向外層水相加入甘露醇可提高微囊的可分散性。
實驗實施例C1將參考實施例C7得到約110mg微囊分散于0.3mL分散介質(包含0.15mg羧甲基纖維素、0.3mg聚山梨醇酯80及15mg甘露醇的蒸餾水溶液)中，然后以22G注射針頭對7周齡SD雄性大鼠經背部皮下給藥。在給藥后的給定時間，處死大鼠并將清除給藥部位殘留的微囊，將其中包含的肽A定量后除以初始給藥量，得到如表8所示的殘留率。


由表2可知，僅加入肽A制備的參考實施例C7微囊，可以高捕獲效率包含生理活性物質，并具有良好的分散性，還可抑制生理活性物質的初始過度釋放，此外，該微囊在長期內以恒速釋放生理活性物質。
工業適用性本發明的控釋組合物可包含大量的生理活性物質，可抑制活性物質的初始過度釋放，并實現在長時間內以穩定的速率釋放。
權利要求
1.一種控釋組合物，包括(1)生理活性物質或其鹽，約占組合物總重的14％(w/w)～約24％(w/w)，(2)選自3-羥基-2-萘甲酸及1-羥基-2-萘甲酸或其鹽的羥基萘甲酸，及(3)一種乳酸聚合物或其鹽，具有15000～50000的重均分子量，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量為約5％重量或更小，其中，該羥基萘甲酸或其鹽與生理活性物質或其鹽的摩爾比為3∶4～4∶3。
2.權利要求1中所述的控釋組合物，其中，乳酸聚合物的重均分子量為15000～30000。
3.權利要求1中所述的控釋組合物，其中，生理活性物質為LH-RH衍生物。
4.權利要求3中所述的控釋組合物，其中LH-RH衍生物為下式所示的肽5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z[其中，Y表示DLeu、DAla、DTrp、DSer(tBu)、D2Nal或DHis(ImBzl)，且Z表示NH-C2Hs或Gly-NH2]，或其鹽。
5.權利要求1中所述的控釋組合物，其中生理活性物質或其鹽為下式所示的LH-RH衍生物5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5或其乙酸鹽，且羥基萘甲酸為3-羥基-2-萘甲酸或1-羥基-2-萘甲酸。
6.一種包括權利要求1中所述的控釋組合物的藥物。
7.一種預防或治療前列腺癌、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、子宮纖維瘤、性早熟、痛經或乳腺癌的藥物或避孕藥物，包括權利要求3中所述的控釋組合物。
8.一種預防絕經前乳腺癌術后乳腺癌復發的藥物，包括權利要求3中所述的緩釋組合物。
9.一種預防或治療前列腺癌、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、性早熟、痛經、乳腺癌的方法或避孕方法，包括對哺乳動物施用有效量的權利要求3中所述的控釋組合物。
10.一種預防絕經前乳腺癌術后乳腺癌復發的方法，包括對哺乳動物施用有效量的權利要求3中所述的緩釋組合物。
11.一種控釋組合物，包括生理活性物質或其鹽，及具有15000～50000的重均分子量的乳酸聚合物或其鹽，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量為約5％重量或更小。
12.一種控釋組合物，包括生理活性物質或其鹽，及羥基萘甲酸或其鹽，以及具有15000～50000的重均分子量的乳酸聚合物或其鹽，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量為約5％重量或更小。
13.權利要求11中所述的控釋組合物，包括(1)一種生理活性物質或其鹽，約占組合物總重的3％(w/w)～約24％(w/w)，(2)一種乳酸聚合物或其鹽，其具有15000～50000的重均分子量，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量為約5％重量或更小。
14.權利要求11～13中任何一項所述的控釋組合物，其中乳酸聚合物中分子量為3000或更小的聚合物的含量為約1.5％重量或更小。
15.權利要求11～13中任何一項所述的控釋組合物，其中乳酸聚合物分子量為1000或更小的聚合物的含量為約0.1％重量或更小。
16.權利要求11～15中任何一項所述的控釋組合物，其中乳酸聚合物分子量為15000～40000。
17.權利要求11～15中任何一項所述的控釋組合物，其中乳酸聚合物重均分子量為17000～26000。
18.權利要求11中所述的控釋組合物，其中羥基萘甲酸為3-羥基-2萘甲酸或1-羥基-2-萘甲酸。
19.權利要求11或13中所述的控釋組合物，其中生理活性物質為具有生理活性的肽。
20.權利要求12中所述的控釋組合物，其中生理活性物質為具有生理活性的肽。
21.權利要求19中所述的控釋組合物，其中生理活性物質為LH-RH衍生物。
22.權利要求20中所述的控釋組合物，其中生理活性物質為LH-RH衍生物。
23.權利要求21或權利要求22中所述的控釋組合物，其中LH-RH衍生物為下式所示的肽5-oxo-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z[其中，Y表示DLeu、DAla、DTrp、DSer(tBu)、D2Nal或DHis(ImBzl)，且Z表示NH-C2H5或Gly-NH2]，或其鹽。
24.權利要求21中所述的控釋組合物，其中LH-RH衍生物或其鹽占組合物總重的3％(w/w)～24％(w/w)。
25.權利要求22中所述的控釋組合物，其中羥基萘甲酸或其鹽與LH-RH衍生物或其鹽的摩爾比為3∶4～4∶3。
26.權利要求22中所述的控釋組合物，其中LH-RH衍生物或其鹽占組合物總重的14％(w/w)～24％(w/w)。
27.權利要求11～13中任何一項所述的控釋組合物用作注射劑。
28.一種制備權利要求11中所述的控釋組合物的方法，包括自生理活性物質或其鹽及乳酸聚合物或其鹽的混合溶液中除去溶劑，該乳酸聚合物或其鹽具有15000～50000的重均分子量，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量約5％重量或更小。
29.一種制備權利要求12中所述的控釋組合物的方法，包括自生理活性物質或其鹽，羥基萘甲酸或其鹽及乳酸聚合物或其鹽的混合溶液中除去溶劑，該乳酸聚合物或其鹽具有15000～50000的重均分子量，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量約5％重量或更小。
30.一種制備權利要求29中所述的控釋組合物的方法，包括混合及分散生理活性物質或其鹽于包含羥基萘甲酸或其鹽及乳酸聚合物或其鹽的有機溶液中，并除去溶劑，所述的乳酸聚合物或其鹽具有15000～50000的重均分子量，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量為約5％重量或更小。
31.一種制備權利要求30中所述的控釋組合物的方法，其中生理活性物質或其鹽為包含生理活性物質或其鹽的水溶液。
32.根據權利要求30的制備方法，其中生理活性物質的鹽為與游離堿或酸形成的鹽。
33.一種包含權利要求11～13中任何一項所述的控釋組合物的藥物。
34.一種預防或治療前列腺癌、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、子宮纖維瘤、性早熟、痛經或乳腺癌的藥物或避孕藥物，包括權利要求21或22中所述的控釋組合物。
35.一種預防絕經前乳腺癌術后乳腺癌復發的藥物，包括權利要求21或22所述的控釋組合物。
36.一種預防或治療前列腺癌、前列腺肥大、子宮內膜異位、子宮肌瘤、性早熟、痛經、乳腺癌的方法或避孕方法，包括對哺乳動物施用有效量的權利要求21或22中所述的控釋組合物。
37.一種預防絕經前乳腺癌術后乳腺癌復發的方法，包括對哺乳動物施用有效量的權利要求21或22所述的控釋組合物。
全文摘要
本發明提供了一種控釋組合物，該組合物包含高含量的生理活性物質，可抑制活性物質的初始過度釋放，實現長期的穩定釋放速率。控釋組合物包含(1)生理活性物質或其鹽，約占組合物總重的14％(w/w)～約24％(w/w)，(2)羥基萘甲酸，選自3－羥基－2－萘甲酸及1－羥基－2－萘甲酸或其鹽，及(3)乳酸聚合物或其鹽，其具有15000～50000的重均分子量，其中分子量為5000或更小的聚合物的含量為約5％重量或更小，其中該羥基萘甲酸或其鹽與所述生理活性物質或其鹽的摩爾比為3∶4～4∶3。
文檔編號A61P25/28GK1535168SQ0281306
公開日2004年10月6日 申請日期2002年6月28日 優先權日2001年6月29日
發明者山本一路, 山田明子, 畑善夫, 子 申請人:武田藥品工業株式會社